专利名称：：改进的核黄素生产方法用重组细菌生产核黄素在本
技术领域：
内是已知的，例如参见欧洲专利申请公开No.(EP)405,370。然而目前需要一种改进的核黄素生产方法。因而本发明的一个目的是提供一种重组细菌，它包括用三或四种载体进行了转化的细菌，其中的两种载体每种都含有编码枯草芽孢杆菌的核黄素合成酶活性的DNA序列或基本上同源的DNA序列以及一种或多种转录因子，而第三种和/或第四种载体含有编码枯草芽孢杆菌的ribA基因产物的DNA序列或基本上同源的DNA序列以及选择性地进一步含有转录因子，借此每一种上述载体以一个或多个拷贝的形式整合在该细菌的染色体上的三或四个不同的位点上。更优选地，本发明的一个目的是提供一种如上所述的重组细菌，其中含有编码枯草芽孢杆菌的核黄素合成酶活性的DNA序列或基本上同源的DNA序列的两种载体中的每一种都进一步含有两种转录因子，优选是启动子，而第三种和/或第四种载体含有编码枯草芽孢杆菌的ribA基因产物的DNA序列或基本上同源的DNA序列以及一种转录因子，优选是启动子。另外，本发明的一个目的是提供一种如上所述的重组细菌，其中含有编码枯草芽孢杆菌的核黄素合成酶活性的DNA序列或基本上同源的DNA序列的两种载体以多个拷贝在染色体的两个不同位点上被整合，第三种和/或第四种载体作为单个拷贝在第三个和/或第四个位点上被整合。另外，本发明的一个目的是提供一种重组细菌，其特征在于，附加的编码枯草芽孢杆菌的ribA基因产物的DNA序列或基本上同源的DNA序列不在染色体中的第三和/或第四个位点上被整合，而是被整合在与具有编码核黄素合成酶活性的DNA序列的两种载体中的一种相同的位点上，并且在这个位点上与这种载体一同被扩增。这种构建物可由本领域的技术人员基于其一般知识制造出来，详细的方法，举例来说，在EP405370中给出。另外，本领域的技术人员知道，为了进行转化，所使用的DNA序列没有必要必须以载体的形式存在，它也可以在没有附加载体DNA时被使用。另外，本发明的一个目的是提供一种如上所述的重组细菌，它是大肠杆菌(E.coli)或芽孢杆菌(Bacillus)，优选是枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、蓝细菌(Cyanbacter)或棒杆菌(Corynebacteria)。另外，本发明的一个目的是提供一种用于核黄素的生产的方法，其特征在于，如上所述的重组细菌在合适的生长条件下生长，分泌到培养基中的核黄素用本领域已知的方法分离。本发明还有一个目的是提供一种用于制备食品或饲料组合物的方法，其特征在于，实施上述生产方法而且由此所得到的核黄素被用本领域已知的方法转化为食品或饲料组合物。词组“基本上同源的DNA序列”，在本发明的上下文中表示一种DNA序列，它编码一种氨基酸序列，与其所参照的DNA序列编码的氨基酸序列相比，该氨基酸序列含有超过60％，优选是超过70％，更优选是超过80％以及最优选是超过90％的相同的氨基酸，并且这种DNA序列编码来自于相同或不同生物体的相同的酶，它或者是部分或全部合成来源的。可用于本发明目的的DNA序列包括编码蛋白质的DNA序列，该蛋白质具有与用前述DNA序列编码的蛋白质相同类型的酶活性，该DNA序列从下面选出(a)一种DNA序列，它在标准条件下与上面定义的序列杂交；(b)一种DNA序列，由于遗传密码的简并性，它不与序列(a)杂交，但它编码与用这些DNA序列编码的多肽具有完全相同的氨基酸序列的多肽；(c)一种DNA序列，它是(a)或(b)中规定的DNA序列的一个片断。用于杂交的“标准条件”在本文的上下文中是指本领域的技术人员通常使用的检测特定杂交信号的条件，举例来说，Sambrook等人在“MolecularCloning”secondedition，ColdSpringHaborLaboratoryPressl989，NewYork中对这些条件进行了描述；该“标准条件”或者优选地是指本领域的技术人员所熟悉的所谓严格杂交和非严格清洗条件，或者更优选地是指所谓严格杂交和严格清洗条件，例如Sambrook等人(无日期)对其进行的描述。“DNA序列的片段”在本文的上下文中是指这样一种片段，它编码一种仍然具有上面所规定的酶活性的多肽。可用于本发明目的的DNA序列被公开于例如EP405,370的说明书中。这类序列的序列信息也可以从任何已知的序列数据库中获得，例如theEuropeanBioinformaticsInstitute(HinxtonHall，Cam-bridge，GB)。然后就可以使用例如本
技术领域：
已知的PCR方法在这些序列信息的基础上制备DNA序列，这被描述于例如实施例中，或采用本领域已知的其它分子克隆方法，描述于例如EP405,370中。一旦可以得到这些DNA序列，为进行进一步操作可以将它们整合到本
技术领域：
已知的合适的载体中，这描述于例如EP405,370的实施例中。优选那些用于整合到宿主染色体中的载体，优选载体是芽孢杆菌，更优选是枯草芽孢杆菌，如果需要的话，随后进行扩增。这些载体被描述于例如实施例中或在本
技术领域：
内是已知的，例如参见EP405,370。这些载体可以进一步携带所谓的转录因子，如增强子和/或启动子，如veg-增强子和/或天然或合成核糖体结合位点和/或终止子，例如本
技术领域：
已知的cryT-终止子，例如参见EP405,370。然后就可以用例如描述于实施例中或本
技术领域：
已知的方法用这些载体将所需的宿主细胞转化，参见例如EP405,370，并使这些细胞在合适的培养基中生长并且分泌到该培养基中的核黄素可以用描述于实施例中或本
技术领域：
已知的方法进行分离。至此已对本发明进行了大体的描述，下面的图和实施例是为了对本发明进行详细说明，它不在任何程度上限制本发明。图1表达载体pDSNdeHis。A由亲本载体pDS/RBSII，6xHis(-2)构建pDSNdeHis。所存在的NdeI位点通过切开、粘性末端的填补和重新连接而被除去。所得到的质粒用BamHI和HindIII切开，含有限制位点ClaI、NdeI、SalI、BamHI和HindIII的合成的多接头被引入。B显示的是从Shine-Delgarno序列(S/D盒)到多克隆位点的pDSNdeHis序列以及用于纯化重组蛋白的具有连续组氨酸残基的肽。图2质粒pXI12和pXI16。质粒pXI12用一个环表示。用于一些限制酶的识别部位用标准的缩略语列出。载体的重要元件被标记如下PvegI中度强度，来自枯草芽孢杆菌的组成型启动子；RBS合成的核糖体结合位点；cryT来自苏云金杆菌(B.thuringiensis)的转录终止子；ermAM组成性地表达的抗红霉素基因；sacB-3′和sacB-5′通过同源重组用于整合的同源区域，得自枯草芽孢杆菌的果聚糖蔗糖酶(levansucrase)基因；amp来自pBR322的抗氨苄青霉素基因；ori来自pBR322的复制起点；rop来自pBR322的rop基因。一些元件的方向用箭头表示。在该质粒的上部显示了具有-35和-10区域的启动子。箭头指向的是T至C的突变，引入该突变是为了在pXI16中产生ApaI位点(中间那条线中的盒子)。最上面那条线显示的是pXI16的启动子中断序列和引入的限制位点。图3将ribA基因整合到枯草芽孢杆菌的sacB基因座中。上面的部分是sacB基因座的示意图。指出了限制性核酸内切酶EcoRI和EcoRV的位点。出现于pXI克隆中的同源区域用阴影部分表示。下面的部分显示不包含从pBR322得到的部分和克隆在NdeI和BamHI位点之间的ribA基因的线型pXI质粒。指出了通过双交换进行的由pXI得到的DNA的整合。图4将ribA、ribA-M或ribA-C基因引入RB50∷(pRF69)n∷(pRF93)m的sacB基因座后对细胞生长和核黄素生产的影响。发酵过程在RB50∷(pRF69)n∷(pRF93)m或它的衍生物存在的情况下进行，该衍生物具有ribA(ribA-M)的编码变位酶的部分、ribA(ribA-C)的编码环化水解酶II的部分或插入到sacB基因座中的整个ribA。所有菌株的修饰后的操纵子pRF69和pRF93都被扩增。图A显示发酵过程中所取样品的OD540值，相应的核黄素效价画于图B中。实施例1枯草芽孢杆菌菌株RB50∷[pFR69]∷[pRF93]的构建核黄素生产菌株RB50∷[pRF69]是一种枯草芽孢杆菌的经过遗传修饰的菌株。RB50指的是枯草芽孢杆菌的宿主菌株，它包含几个引入的突变以促进核苷酸和核黄素的生产。pRF69是指一种rib操纵子，对它的修饰通过引入强噬菌体启动子实现，该启动子在pRF50的rib基因座被引入。修饰后的操纵子pRF69可被扩增至很高的拷贝数。对菌株RB50∷[pRF69]的详细描述列于EP0405370。为进一步增加rib操纵子的数量，将具有修饰过的rib操纵子和抗四环素基因的第二个质粒在bpr基因座处引入(基本上描述于EP0405370，实施例8，第二个位点的整合)。这个第二个质粒pRF93是由pRF89(EP0405370，图14)构建的，方法是用一个抗四环素基因取代抗氯霉素基因(EP0405370，实施例8，第二个位点的整合)。所得到的菌株就是RB50∷[pRF69]n∷[pRF93]m(n和m指修饰过的操纵子的拷贝数量)。实施例2克隆载体pDSNdeHis、pXI12和pXI16NdeI是具有以ATG为末端的6碱基对识别部位的限制酶。因此选择该酶用于克隆通常以翻译起始密码子ATG开始的开放阅读框(ORFs)。载体pDSNdeHis、pXI12和pXI16都含有一个NdeI克隆位点。在pXI载体中，NdeI位点的ATG的位置与翻译的起始密码子相对应，而在pDSNdeHis中，一个组氨酸标签被加入到所表达的蛋白质的氨基末端(参见下面内容)。pDSNdeHis的构建表达载体pDS/RBSII，6xHis(-2)(Stüber，D.，Matile，H.和Garotta，G.，1990。Systemforhigh-levelproductioninEscherichiacoliandrapidpurificationofrecombinantproteinsapplicationtoepi-topemapping，preparationofantibodiesandstructure-functionanal-ysis.Immunol.Meth.vol.IV，P.121-152)被作为亲本质粒用于构建pDSNdeHis。pDS/RBSII，6xHis(-2)与pDS/RBSII，6His是相同的(Stüber等人，1990；也可参见AccessionNo.DSM5298)，除了在BamHI位点的前面有一个附加的G核苷酸之外。通过切开、粘性末端的填补和重新连接将存在于质粒的非必需区域的NdeI位点除去。所得到的质粒用BamHI和HindIII切开，带有用于限制性内切酶ClaI、NdeI、SalI、BamHI和HindIII的位点多接头被引入(图1)。由这个载体表达的蛋白质具有一个N-末端，它包含6个连续的组氨酸残基，从而可以进行一步纯化(Stüber等人，1990)。pXI12的构建(图2)载体的主链是pBR322的EagI-AatII片段，它包括抗氨苄青霉素基因、复制的起点和rop基因(Bolivar，F.，Rodriguez，R.L.，Greene，P.J.，Betlach，M.C.，Heynecker，H.L.，Boyer，H.W.，Crosa，J.H.和Falkow，S.，1977。新的克隆载体的构建和特征描述。II.一个多目标克隆系统。Gene2，95-113)。pBR322序列的侧面是从枯草芽孢杆菌的果聚糖蔗糖酶基因(sacB)中提取出来的两个序列，该序列由聚合酶链反应(PCR)得到。通过PCR引物将用于限制性内切酶AatII、EagI和NheI的识别位点引入(图4)。sacB-5′序列在果聚糖蔗糖酶序列的729位置开始(基因文库的数据库登记号X02730或EuropeanBioinformaticsInstitute的数据库，HinxtonHall，Cambridge，GB)而且在1266位置结束。sacB-3′片段包括位置1336至1794间的序列。作为一种可选择的标记，来自质粒pAMβ1的抗红霉素基因ermAM(基因文库数据库登记号Y00116或EuropeanBioinformaticsInstitute的数据库，HinxtonHall，Cam-bridge，GB)被引入。也通过PCR获得的这个序列开始于登记号为Y00116的序列的107位置，结束于1091位置。侧翼AatII和PmeI位点由PCR引物产生。驱动克隆后的基因转录的启动子是中等强度的、来自枯草芽孢杆菌的组成型vegI启动子，它对应于已公开的序列的30至101位置(基因文库数据库登记号J01552或EuropeanBioinformaticsInstitute的数据库，HinxtonHall，Cambridge，GB)。启动子侧面的限制性位点EagI和XhoI由PCR引物产生。cryT转录终止子来自苏云金杆菌而且对应于序列的268至380位置，该序列在基因文库数据库中登记号为M13201或在EuropeanBioinfor-maticsInstitute的数据库中，HinxtonHall，Cambridge，GB。侧翼的PmeI和SmaI位点还是得自引物。核糖体结合位点(划线部分)和NdeI位点(粗体部分)内的包括转录起始位点的多接头延伸被作为具有如下序列的合成DNACTCGAGAATTAAAGGAGGGTTTCATATGAATTCGGATCCCGGG.被引入。在各种元件的连接处的序列列于表1。pXI16的构建克隆于pXI12中的基因的表达可能在大肠杆菌中不能被其耐受。为防止潜在的问题，创造了pXI12的一个变种，其中veg启动子被一个短序列所阻碍。为构建这个名为pXI16的修饰的载体，将一个点突变引入veg启动子的-35至-10区域以产生一个ApaI位点，然后引入一个30个碱基对的多接头(图2)。实施例3ribA基因的克隆使用引物ribA5和ribA3通过聚合酶链反应(PCR)将ribA基因从质粒pRF2(EP0405370，图6)中分离。该方法能够在基因的起始密码子处引入一个NdeI限制性内切酶位点，在终止密码子后引入一个BamHI位点。该引物具有下列序列ribA55＇GAAGATTcatATGTTTCATCribA35＇TATggaTccTTAGAAATGAA下面划线部分的序列对应于限制性内切酶位点NdeI(CATATG)和BamHI(GGATCC)，小写字母表示与枯草芽孢杆菌rib操纵子的序列相比变化了的核苷酸，粗体的序列标明的是翻译起启密码子(ATG)和终止密码子的反向补体(TTA)。得自PerkinElmerCetus的GeneAmpDNA扩增试剂盒根据生产商的说明被用于PCR反应。反应条件为1分钟94℃，1分钟45℃和2分钟72℃，25次循环。每一种引物的浓度为1μM，模板DNA以大约1pM的浓度加入。通过琼脂糖凝胶电泳将PCR反应产物从引物中分离出来，而且含有ribA的PCR片段也被分离(Heery，D.M.，Gannon，F.和Powell，R.，1990.用于亚克隆来自凝胶切片的DNA片段的一种简单方法。TrendsinGenetics6，173；Vaux，D.L.，1992.从琼脂糖凝胶中快速回收DNA。TrendsinGenetics8，81)，用NdeI和BamHI切开并克隆进载体pDSNdeHis中，产生了质粒pDSribA。实施例4菌株VB2XL1的构建用NdeI和BamHI将ribA基因从pDSribA中切除并将其亚克隆进用NdeI-BamHI酶切的pXI16中。从大肠杆菌中分离出质粒后，用ApaI切割DNA，将30个碱基对的插入片段除去并通过连接重建veg启动子。然后通过用FspI切开使质粒线性化，该FspI只在从pBR322得到的序列中进行酶切(图2)，根据所描述的两步方法(Cutting，S.M.和VanderHorn，P.B.，1990.见MolecularbiologicalmethodsforBacillus(HarwoodandCutting，eds.)，P.67-71，JohnWiley&SonsLtd.，Chichester，England)将克隆化基因引入转化感受态的枯草芽孢杆菌细胞中。由于生产菌株RB50∷[pRF69]∷[pRF93]不能够被制成用于转化的感受态细胞，选择枯草芽孢杆菌1012菌株(Saito，H.，Shibata，T.和Ando，T.，1979.Mappingofgenesdeterminingnonpermissivenessandhost-specificrestrictiontobacteriophagesinBacillussubtilisMarburg.Mol.Gen.Genet.170，117-122)作为一个中间宿主。抗红霉素克隆具有ribA基因和通过在同源区域sacB-3′和sacB-5′(图3)的双交换插入sacB基.因座中的抗红霉素基因ermAM。然后根据所描述的液体培养基方法(Cut-tingandVanderHorn，1990)，通过用噬菌体PBSl转导将修饰后的sacB基因座引入RB50∷[pRF69]∷[pRF93]中。实施例5在SacB基因座中用ribA-M或ribA-C构建RB50∷[pRF69]∷[pRF93]菌株RibA编码两种酶活性，即GTP环化水解酶II和变位酶(3，4-二羟基-2-丁酮4-磷酸合酶)，它们被大肠杆菌中两个分开的基因编码(Richter，G.，Ritz，H.，Katzenmeier，G.，Volk，R.，Kohnle，A.，Lottspeich，F.，Allendorf，D.andBacher，a.，1993.Biosynthesisofriboflavincloning，sequencing，mappingandexpres-sionofthegenecodingforGTPcyclohydrolaseIIofEscherichiacoli.J.Bact.175，4045-4051)。变位酶活性位于枯草芽孢杆菌ribA的氨基末端部分，GTP环化水解酶II活性位于羧基末端部分。ribA的编码变位酶的部分称作ribA-M，它被用NdeI和HincII从pDSribA中切除并被克隆进用NdeI和SmaI酶切的pXI16载体中。单个HincII位点被方便地置于ribA的中部，酶切发生在两个密码子之间，将基因的两个编码活性的部分分开。如上所述将ribA-M引入RB50∷[pRF69]∷[pRF93]的sacB基因座中。ribA的编码GTP环化水解酶的部分称作ribA-C，用HincII和BamHI将它从pDSribA中切除并引入用HincII-BamHI酶切的pDSNdeHis中。应注意pDSNdeHis中的单一HincII识别位点与SalI位点(GTCGAC，图1)相同，而且HincII的酶切产生了一个从识别位点中部切开的平端。然后将得到的质粒用NdeI和BamHI切开并将ribA-C克隆进用NdeI和BamHI切开的pXI12中。除了将ApaI的酶切和重新连接步骤省略外，按照上述步骤将ribA-C引入RB50∷[pRF69]∷[pRF93]的sacB基因座中，省略的原因是使用了具有一个不中断的veg启动子的pXI12(图2)。实施例6修饰后的操纵子pRF69和pRF93的扩增修饰后的操纵子的扩增对于高核黄素效价是重要的(EP0405370)。使用了下述扩增方法使用含有20μg/ml的四环素和10μg/ml的氯霉素的生长于VY(25g/L的veal浸出培养液(Dif-co)，5g/L的酵母提取物，15g/L的葡萄糖)中的过夜培养基接种含有3mlVY和30、60或75μg/ml的四环素的三支试管。在37℃和200rpm的条件下8-9小时以后，使用30-50μl具有最高四环素浓度而仍能导致良好生长的培养基接种在含有3mlVY和30、45或60μg/ml氯霉素的试管中。在37℃和200rpm条件下培养过夜后，使用30-50μl具有最高四环素浓度而仍能导致良好生长的培养基接种在含有3mlVY和60、75、90或120μg/ml的四环素的试管中。用同样的方法，在含有45、60或80μg/ml氯霉素的VY、含有75、90、120或140μg/ml四环素的VY以及含有60或80μg/ml氯霉素的VY中继续生长。最后的转接是将200μl培养基接入含有15mlVY和120或140μg/ml四环素的两个试管中。细胞生长至OD600值大约为0.8，然后分为1ml的等分试样。加入甘油，使其最终浓度为15％，将细胞在70℃下贮藏。菌株VB2XL1达到了140μg/ml四环素和80μg/ml氯霉素的最高抗生素浓度。核黄素的发酵生产通过使用如上所述的转化了的枯草芽孢杆菌菌株按描述于EP405370中的限制葡萄糖的进料法进行了核黄素发酵生产。实施例7第四个位点的整合除了一个附加的ribA基因被引入amyE基因座以进一步提高ribA水平外，菌株VB2XL3与VB2XL1大体相同。VB2XL3的构建基本上按照上述用于VB2XL1的方法进行。简而言之，pXI6中的红霉素标记(图2)被一个抗新霉素基因所取代，sacB同源性区域被amyE同源性序列所取代产生载体pXI191。抗新霉素基因是从质粒pBEST501中得到的(M.Itaya等人，Nucl.AcidsRes.，1989，P.4410)，同时原有的ApaI位点被用一个沉默点突变消除。由枯草芽孢杆菌基因组采用引物用PCR法将amyE同源性区域扩增，该引物是根据已知的序列(登记号X02150)设计的。然后基本上按照上述方法，将ribA基因克隆进pXI191中，将得到的质粒用作载体以将ribA基因引入VB2XL1的amyE基因座中。新的菌株称作VB2XL3。表1pXI12中在各种元件结合部位的序列</tables>*Ac#GenBank(release93.0)或EMBL数据库(release46.0)登记号权利要求1.一种重组细菌，它包括用三种载体或DNA序列进行了转化的细菌，其中的两种载体或DNA序列每种都含有编码枯草芽孢杆菌的核黄素合成酶活性的DNA序列或基本上同源的DNA序列以及一种或多种转录因子，第三种载体或DNA序列含有编码枯草芽孢杆菌的ribA基因产物的DNA序列或基本上同源的DNA序列以及选择性地进一步含有转录因子，借此每一种上述载体以一个或多个拷贝的形式整合在该细菌的染色体上三个不同的位点上。2.根据权利要求1的一种重组细菌，其中含有编码枯草芽孢杆菌的核黄素合成酶活性的DNA序列或基本上同源的DNA序列的两种载体或DNA序列中的每一种载体都进一步含有两种转录因子，优选是启动子，而第三种载体或DNA序列含有编码枯草芽孢杆菌的ribA基因产物的DNA序列或基本上同源的DNA序列以及一种转录因子，优选是启动子。3.根据权利要求1或2的一种重组细菌，其中含有编码枯草芽孢杆菌的核黄素合成酶活性的DNA序列或基本上同源的DNA序列的两种载体或DNA序列以多个拷贝的形式整合在染色体的两个不同位点上，第三种载体或DNA序列以单个拷贝的形式被整合在第三个位点。4.根据权利要求1至3中任一项的一种重组细菌，它是大肠杆菌或芽孢杆菌，优选是枯草芽孢杆菌。5.一种生产核黄素的方法，其特征在于，根据权利要求1至4中任一项的一种重组细菌在合适的生长条件下生长并用本领域已知的方法将分泌到培养基中的核黄素分离。6.一种用于制备食品或饲料组合物的方法，其特征在于，实施根据权利要求5的方法而且由此所得到的核黄素被用本领域已知的方法转化为食品或饲料组合物。全文摘要一种重组细菌,它包括被三种栽体或DNA序列进行了转化的细菌。同时公开了利用该重组细菌生产核黄素的方法。文档编号A23K1/16GK1177004SQ9711716公开日1998年3月25日申请日期1997年7月23日优先权日1996年7月24日发明者H-P·霍曼,M·赫姆伯林,A·宛·龙,W·舒尔特申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司