专利名称：核黄素的生产方法
技术领域：
本发明涉及一种生产核黄素的方法。更具体地，本发明涉及一种用植物油或动物油作为碳源以高生产率高产量生产核黄素的方法，通过使具有油吸附特性的粘土矿物载体及其化学处理的产物或钙化合物在用于生产核黄素的培养基中存在。
背景技术：
很久以来人们已经知道在培养基中培养产核黄素微生物，在其中形成和积累核黄素并从其收集核黄素来生产核黄素的方法。作为产核黄素微生物，已知使用阿舒氏假囊酵母(Eremothecium ashbyii)，棉桃阿舒氏囊霉(Ashbya gossypii)，Candida flareri，Mycocandidariboflavina，丙酮丁醇梭状芽孢杆菌(Clostridiumacetobutylicum)，以及使用产核黄素杆菌微生物(日本未审专利公开(Kokai)No.66894/1974)，Streptomyces testaceus的不同菌株(日本未审专利公开(Kokai)No.116690/1975)，产核黄素无色菌微生物(日本未审专利公开(Kokai)No.54094/1977)，产核黄素previbacterium菌微生物(日本未审专利公开(Kokai)No.110897/1977)，产核黄素酵母微生物(日本未审专利公开(Kokai)No.241895/1985)，Candida phamata(ATCC 20849)(国际专利公开No.509221/1993)。
作为培养基中的碳源，还已知是将糖类例如葡萄糖和蔗糖，淀粉或其水解产物，乙酸，柠檬酸，乙醇或碳氢化合物和安息香酸用于特定微生物。
然而，当油和脂肪被用作碳源时，油和脂肪必须被分散在水性培养基中，为达到此目的，培养基必须被搅拌，或分散剂或乳化剂必须被添加到该系统中。
在搅拌的条件下其中的油被乳化或悬浮在水中，然而，已证实微生物本身被杀死和毁坏从而导致核黄素产量的下降。
按照该方法将分散剂或乳化剂添加到系统中，进一步地，微生物受这些试剂不可避免的不利的影响，此外，加入的试剂混合物混入到形成的核黄素中。
发明的公开在通过利用植物油或动物油作为碳源的培养基中培养产核黄素微生物，在其中形成和积累核黄素并收集其中的核黄素来生产核黄素的方法的研究中，本发明人发现核黄素可被高产量和高生产率制备方法是通过将植物油或动物油稳定地分散在培养基中不要搅拌到破坏微生物的程度，当使具有油吸附特性的粘土矿物载体，其化学处理的产物或钙化合物存在于培养基中时。
在通过利用植物油或动物油作为碳源的培养基中培养产核黄素微生物，在其中形成和积累核黄素并收集其中的核黄素来生产核黄素的方法的研究中，进一步地，本发明人发现待被清除的废植物油或废动物油可通过利用其碳源吸留植物油或动物油的废粘土被有效地利用。
也即，本发明的一个目的是提供一种通过在利用植物油或动物油作为碳源的培养基中培养产核黄素微生物来生产核黄素的方法，其中的植物油或动物油以一种改进的方法被分散在培养基中，从而核黄素可被高产量和高生产率生产。
本发明的另一个目的是提供一种以低成本且不需要繁琐操作例如浓缩和重新回收核黄素的生产核黄素的方法。
本发明的进一步的目的是提供一种通过有效利用待被清除的废植物油或废动物油来回收核黄素的方法。
按照本发明提供了一种通过在利用植物油或动物油作为碳源的培养基中培养产核黄素微生物，在其中形成和积累核黄素并从其中收集核黄素来生产核黄素的方法，其中要使具有油吸附特性的粘土矿物，其化学处理的产物或钙化合物存在于培养基中。
在本发明的生产核黄素的方法中，理想的载体存在量占培养基的重量的0.1-10％。
依照本发明的一个优选的实施方案，载体理想的为链接的粘土矿物，特定地，载体为具有70-400埃的纤维直径和0.2-400μm的纤维长度的粘土矿物。
依照本发明的另一个优选的实施方案，理想的是至少部分载体是绿土粘土矿物和其酸处理的产物。
作为载体，此外，也可以使用钙化合物，理想的为碳酸钙。
在本发明中，对使载体存在于培养基中的方式没有特定的限制。依赖于情况，然而，理想的是使载体存在于培养基中是处于吸留植物油或动物油的状态，或利用废粘土作为载体吸附植物油或动物油。
依照本发明，进一步提供了一种通过在利用植物油或动物油作为碳源的培养基中培养产核黄素微生物在其中形成和积累核黄素并从其中收集核黄素来生产核黄素的方法，其中的碳源是吸留植物油或动物油的废粘土。
依照本发明，进一步提供了一种通过在利用植物油或动物油作为碳源的培养基中培养产核黄素微生物在其中形成和积累核黄素并从其中收集核黄素来生产核黄素的方法，其中的碳源是从吸留植物油或动物油的废粘土中提取的油成分。
附图的简要说明
图1是一个表示在培养时间，油残留量和通过使大豆植物油存在于50cc培养基中产生的核黄素的量之间的关系的曲线图(显示核黄素在开始的48小时以后开始产生)；图2是一个表示培养时间和微生物的重量增加之间的关系的曲线图；图3是显示了48小时后微生物的显微照片(A)(×600倍)以及通过用尼罗红染色微生物的油成分的微生物的荧光显微照片(B)(×600倍)；以及图4是表示培养时间和微生物的重量增加之间关系的曲线图(A)，培养时间和残余的油浓度之间关系的曲线图(B)，以及当1％量的海泡石被加入到培养基中(●)和当其不加入而以600rpm的速度搅拌时(▲)的培养时间和核黄素浓度之间的关系的曲线图(C)。
发明的最佳实施方式在本发明中，产核黄素微生物被培养在培养基中利用植物油或动物油作为碳源，来形成和积累核黄素并从其中收集核黄素。在这里，一种具有吸油特性的粘土矿物，其化学处理的产物或钙化合物置于培养基中。例如，一种pH已被调整并含有植物油或动物油的培养基被灭菌，然后，将预先已培养的产核黄素微生物注入和培养。在此情况下，上述的载体被放入培养基中来促进植物油和动物油的消耗从而来提高核黄素的产量和生产率。
基本上，本发明是基于发现了如果在含有植物油或动物油的培养基中培养产核黄素微生物的时候加入具有油吸附特性的粘土矿物，其化学处理的产物或钙化合物到培养基中会提高核黄素的产量。例如，如果培养基中的核黄素的产量没有混入粘土矿物时被视为100％，则当培养基被混入1％重量的海泡石甚至保持其它的条件相同时核黄素的产量增加至169％(大约1.6倍)(实验的细节，参见实施例1)。
在核黄素的发酵中，作为有机物质的植物油或动物油被产核黄素微生物分解来积累代谢产物核黄素。依照本发明人进行的研究，可以了解导致分解的过程包括一个植物油或动物油首先被微生物摄取的过程，和一个被微生物摄取的植物油或动物油被分解的过程。
图1是一个表示在培养时间，油残留量和通过使大豆植物油存在于50cc培养基中产生的核黄素的量之间的关系的曲线图，图2是一个表示培养时间和微生物的重量增加之间的关系的曲线图。
按照图1，培养基中的油的量是随着培养时间的推移而单调地减少。在这里，在培养基中的油量的减少和核黄素形成的量之间存在一个预定的时间间隔。在此的一个具体的实施例中，在经过开始后的48小时后核黄素开始产生。
图3显示了经过48小时后微生物的显微照片(A)(×600倍)以及通过用尼罗红染色微生物的油成分的微生物用荧光显微镜观察时的荧光显微照片(B)(×600倍)。在图3(B)中，白色箭头指示的部分是被染色的油成分。参照这些照片，在培养基中的植物油，首先被微生物吸收，然后被分解来积累代谢产物核黄素。
具有油吸附特性的粘土矿物或其化学处理的产物被用于本发明中来促进微生物摄取培养基中的植物油或动物油并且，进一步增强核黄素形成的产量。
图4是表示培养时间和微生物的重量增加之间关系的曲线图(A)，培养时间和残余的油浓度之间关系的曲线图(B)，以及当1％量的海泡石被加入到培养基中(●)和当其不加入而以600rpm的速度搅拌时(▲)的培养时间和核黄素浓度之间的关系的曲线图(C)。
结果说明当海泡石被加入时，核黄素形成增加，然而油的吸收几乎是相同的。
像产核黄素微生物一样，用于本发明的稳定存在于培养基水相中的具有油吸附特性的粘土矿物，其化学处理的产物的载体或钙化合物由于其油吸附特性摄取油成分，在水中分散油形成细的颗粒，使得微生物容易摄取油成分，并促进这些作用。
这是通过作为载体的粘土矿物或其化学处理产物的加入获得的作用和优点。
粘土矿物或其化学处理产物以及植物油或动物油可通过各种手段或方法添加到培养基中。例如，粘土矿物或其化学处理产物以及植物油或动物油可单独添加到培养基中或可以组合物的形式添加到培养基中。
在本发明的一个方面，粘土矿物或类似物的载体以吸留植物油或动物油的状态被置于培养基中。废粘土是获得吸留植物油或动物油的载体的最简单的形式。
酸性粘土或通过化学处理酸性粘土获得的活性粘土被广泛的用作漂白和精炼脂肪和油。然而在这种加工时产生的废粘土又产生了如何处理的问题。即废粘土含有大约20-大约60％重量的油。此外，废粘土是一种粘的糊状物形式其非常难于处理。废粘土每年产生的量有50000吨。然而依照本发明，废粘土被利用作为吸留植物油和动物油的载体来用于核黄素的发酵。也就是说，在废粘土中的植物油和动物油被有效地用作一种资源使得重新利用其中植物油和动物油已被去除的粘土成为可能。这一资源的有效再利用使得有效地防止自然环境的污染成为可能。
本发明的核黄素的发酵在产生的核黄素被作为载体的粘土矿物或类似物吸附方面显示出非常有价值的优点。也即，在常规的发酵方法中，能量成本的相当大的量需要用来浓缩，因为形成的核黄素含在培养基中是一种稀释的状态。
依照本发明的发酵方法，另一方面，形成的核黄素被载体粘土矿物或类似物吸附。因此，吸附核黄素的载体可从培养基中分离，而核黄素可由分离出的载体提取；需要简单的操作来实现浓缩和节约所可能涉及的成本。
本发明进一步利用从吸留作为碳源的植物油或动物油的废粘土提取的油成分，此带来有效利用废粘土的优点。
当将钙化合物的代表性实例碳酸钙用作载体时，进一步地，碳酸钙阻止由因油和脂肪的分解产生的脂肪酸引起的pH值的下降，防止微生物被破坏并维持核黄素形成的高产量(参见实施例13)。从比较实施例8可以理解，进一步地，当将镁化合物的氢氧化镁用作与钙相同的碱土金属时，微生物的增殖没有什么问题，然而却没有增加核黄素的产量。此归结于油和脂肪分解形成的脂肪酸没有用于核黄素的产生而用于增殖微生物的能源，然后当没有碳源时用于促进孢子的形成。
用作本发明载体的粘土矿物或化学处理的产物具有油吸附特性且，通常具有纤维状的，鳞片样或层状的外观，以及在水相或油相中有好的分散性。
作为油吸附粘土矿物的优选的实施例，可例举链状的粘土矿物。
用于本发明的链状粘土矿物是纤维状的硅酸镁粘土矿物，代表为海泡石，绿坡缕石，坡缕石。其具有三维的链式结构，与二维的晶体结构例如滑石不同，其为多孔具有链状结构的孔隙形成的小洞的的粘土矿物具有大的比表面面积，通过BET比表面面积方法测定其范围为100-350m2/g且其具有吸附的功能。
与普通的也是多孔的其代表为高岭石的层状粘土矿物不同，海泡石具有明显不同的特征其在水相系统中并不膨大。
由于于链式粘土矿物例如海泡石所具有的的特征，即由于纤维状态和多孔特性，链式粘土矿物与微生物纠缠得较好从而使得微生物稳定和安全，使安全的微生物具有多孔性，使得培养溶液和氧被很好的供应于微生物并提高了过滤的特性。
在本发明中，上述的链式粘土矿物可使用单一的种类，同样也可以与二层结构的例如多水高岭土或石棉结合或与火山纤维性矿物包括kanuma土或Akadama土结合使用。如所需要，进一步地，纤维状粘土矿物可被用于与吸附性的粘土矿物例如沸石或酸性粘土或与岩石例如方石英，石英或长石结合使用。
优选用于本发明的海泡石具有通式(I)表示的化学结构，(OH2)4(OH)4Mg8Si12O30·6-8H2O ---(1)其中的二维晶体结构例如滑石具有链式结构像当砖被交替地堆积一样。
此外，尽管其具有一种由于通过链状孔隙形成的纤维状结构，但海泡石具有明显不同的特征，即，不同于这些或其它的纤维性矿物的大的比表面面积和大的吸附特性。
本发明优选使用具有范围在100-350m2/g比表面积且吸附油量在100-300ml/100g的海泡石。当比表面积小于此范围时，油吸附特性便不充分。另一方面，甚至当比表面积大于此范围时，效果并不相应增加。
此外，优选用于本发明的纤维状海泡石，通常，具有70-400埃的纤维直径，0.2-400μm的纤维长度以及5-500的纵横比。
下面的表1显示了海泡石的基本化学组成(110℃干燥2小时)。
表1海泡石的基本化学组份SiO252.50(％重量)MgO22.8Al2O31.7Fe2O30.8CaO0.8H2O+10.5H2O-11.0在本发明中，蒙脱石粘土矿物例如酸性粘土(高岭土)，膨润土，滑石粉，锂蒙脱石和stevensite及其用酸处理的产物，可被用作载体。
在这些粘土矿物中，高岭土的粘土矿物及其酸处理的产物适用于本发明的目的。这些被广泛使用来漂白和精炼油和脂肪。
高岭土粘土矿物例如酸性粘土是一种铝硅酸盐，其具有作为基本单元的三层结构，其中AlO6八面体层是夹在两个SiO4四面体之间，很多的此种基本单元的三层结构被进一步层压在C-轴方向来组成层状的晶体结构。此层状晶体结构在高岭土粘土矿物中是共有的。
在各种高岭土中，日本广泛生产的酸性粘土是风化的且三层结构中的AlO6的八面体层作为高岭土的基本单元部分被碱土金属例如镁或钙取代，且氢离子与其键合来补偿原子价。因此，如果酸性粘土被悬浮在食盐的水性溶液中来测定其pH值，则显示出酸性，因为氢离子被钠离子所取代。另一方面，膨润土显示出中性到微弱的碱性pH，因为可交换的阳离子大部分为钠离子且进一步显示大的水溶胀特性。在另一方面，酸性粘土从吸收的角度来说是非常有优点的，因为钠离子已经被碱土金属所取代，碱金属组分的量是小的，水溶胀的特性是小的，且硅酸大量存在。因此，作为高岭土，任意的日本生产的酸性粘土被广泛使用。进一步利用称作亚-]膨润土(Ca-型膨润土)的高岭土粘土矿物。
下面的表2显示了酸性粘土的基本化学组成(100℃干燥)。
表2SiO261.0-74.0(％重量)Al2O312.0-23.0Fe2O32.0-3.5MgO3.0-7.0CaO1.0-4.0K2O 0.3-2.0Na2O 0.3-2.0Ig.损失5.0-10.0在使用酸性粘土时，含在其中的岩石例如方石英，石英和长石可被容易地分离，通过利用比重差异的分离方法(此种分离方法例如水选法，空气淘析法等等)。在它们中，晶体硅酸的方石英容易与碱反应且可被转化为碱金属硅酸盐，以及可以，通过此方法被除去。
另一方面，酸性粘土的酸处理产物已知作为活性粘土其可被用作精炼油和脂肪的试剂。酸处理的产物可容易地通过用无机酸溶液例如硫酸或盐酸处理酸性粘土制备，部分地洗脱含在其中的碱性组分并且洗涤。由于用酸处理，酸性粘土的层状晶体结构部分被破坏，但硅酸(SiO2)含量的增加使得增加了比表面面积并改进了某此特性例如吸附特性。酸性粘土的酸处理产物以及，通常市售的活性粘土及其产生的中接产物，用作显示出优良的特性的精炼剂。
酸处理的产物通常具有下表3所显示的组成，然而其可依据起始酸性粘土的种类或用酸处理的条件而变化。
表3SiO265.0-83.0(％重量)Al2O35.0-12.0Fe2O31.0-3.5MgO 1.0-7.0CaO 0.5-4.0K2O 0.2-2.0Na2O0.2-2.0Ig.损失 5.0-10.0理想的是酸性粘土和活性粘土以所谓的废粘土的形式被用在本发明中吸留植物油或动物油。
可被用作载体的钙化合物的具体例子包括天然的碳酸钙(岩基，方解石，文石)，合成的碳酸钙，硅酸钙，氢氧化钙，磷酸钙(磷灰石，等等)。特别优选的是使用碳酸钙。
作为载体，可使用天然的二氧化硅，合成的二氧化硅，中空的二氧化硅，硅藻土，珍珠岩，碳酸镁，硅酸镁，硅酸亚铁镁，水镁石，以及合成的氢氧化镁与上述载体的组合。
在本发明中用作碳源的植物油广泛存在天然的植物世界且主要含有脂肪酸和甘油的酯。例子包括红花油，大豆油，菜油，棕榈油，棕榈仁油，棉子油，椰子油，米糠油，芝麻油，蓖麻油，亚麻子油，橄榄油，桐油，tsubaki油，花生油，爪哇木棉油，可可油，日本蜡，葵花子油以及玉米油。优选的是用于本发明的植物油至少部分含有主要的一种不饱和的脂肪酸和甘油的酯。作为动物油，可使用鱼油例如沙丁鱼油，青鱼油，墨鱼油，竹刀鱼油，以及lever油，鲸脂油，牛油，酪乳，猪油，鸡油，马油和羊油。
用于本发明的方法的废粘土作为通过利用漂白或精炼用的粘土来漂白或精炼油和脂肪的步骤中的副产物被分离出来。用于本发明的废粘土含有油成分且从污染环境的角度其不应被丢弃。因此人们强烈地期望有效利用废粘土。
也就是说，向被用来漂白或精炼的油或脂肪，加入蒙脱石的粘土矿物例如酸性粘土或通过用酸和/或碱处理上述粘土矿物获得的以粉末试剂的形式用于漂白或精炼的活性粘土，使得二者均匀地一起搅拌且含在油和脂肪中的有色组分和杂质组分被吸附在粘土颗粒中。在漂白或精炼后分离的粘土含有大约20％到60％重量的油成分。
油和脂肪在已知的条件下被漂白，例如，通过加入基于油和脂肪重量的0.1到5％的粘土作为漂白或精炼试剂，并在90到150℃的温度下搅拌两种组合物5到30分钟来完成漂白或精炼加工过程。
漂白或精炼后的混合物用任意的过滤器例如压滤器，带式过滤机，奥利弗过滤器，美国过滤器或减压过滤器或增压过滤器如离心滤器提供，来获得精炼油和脂肪以及用作漂白或精炼试剂的所谓的废粘土。废粘土通常含有大约20到大约60％重量的被颗粒吸附的油组分，不过其可依据被用于精炼的起始油的种类而变化。另外一种考虑是该废粘土具有催化的功能。
在本发明中，废粘土可被用作碳源来用于发酵核黄素。
在本发明中任意已知的产生核黄素的微生物均可被用作产核黄素微生物。
作为产核黄素微生物，可以使用阿舒氏假囊酵母(Eremotheciumashbyii)，棉桃阿舒氏囊霉(Ashbya gossypii)，Candida flareri，Mycocandida riboflavina，丙酮丁醇梭状芽孢杆菌(Clostridiumacetobutylicum)，产核黄素杆菌微生物，Streptomyces testaceus的可变菌株，产核黄素无色菌微生物，产核黄素previbacterium菌微生物，产核黄素酵母微生物，Candida phamata(ATCC 20849)，等等。
在这些产核黄素微生物中，理想的是利用那些能够摄取植物油或动物油作为碳源的微生物。优选的例子是棉桃阿舒氏囊霉(Ashbyagossypii)ATCC10895。
本发明的发酵方法在培养基中使用植物油或动物油作为碳源。当然也允许结合使用除了植物油或动物油之外的其它碳源。作为可被组合使用的碳源，可以例举出糖类例如葡萄糖，半乳糖，麦芽糖，纤维二糖，阿拉伯糖和蔗糖，糖醇例如甘油，有机酸例如乙酸，葡萄糖酸，琥珀酸，蚁酸，柠檬酸，富马酸，谷氨酸，乳酸以及它们的盐，以及醇例如甲醇和乙醇。
作为培养基中的氮源，可利用有机的或无机的铵化合物例如氨，氯化铵，硫酸铵，碳酸铵，磷酸铵和醋酸铵，脲或其衍生物以及任意的其它天然的氮源。
作为有机物质可以利用金属盐例如钠，钾，镁，钙，锌，钴，镍，铜和锰，以及盐酸，硫酸，磷酸或硝酸的盐，以一种或多种的组合。
当所使用的微生物需要营养时，所需要的物质被加到培养基中。当需要时，进一步地，天然的营养物，各种微生物的水解产物，酵母提取物，日本米酒酒糟提取物，肉羹，蛋白胨以及降解的大豆饼可被加到培养基中。
根据情况，可进一步添加不同的物质例如嘌呤如鸟嘌呤，腺嘌呤以及次黄嘌呤，嘧啶如胸腺嘧啶，尿嘧啶和胞嘧啶，以及其糖类或磷酸化糖类的衍生物来增加核黄素形成的量。
在本发明中，核黄素可在已知的条件下培养。培养的条件例如温度等处在已知的范围中，通常从20到35℃且特别是从25到30℃。
培养基中的的水相和油相中也存在最佳的范围。水相和油相以重量比，通常，从200∶1到3∶1的范围，特别是，从50∶1到10∶1存在。
当油相的量大于上述的范围或小于上述的范围时，形成核黄素的速率趋于降低。
在本发明中，培养基中的载体的量也存在一个最佳的范围。理想的载体的量是从培养基重量的0.1到10％，尤其是从0.5到5％。
当载体的量太小时，核黄素的生产率降低且当载体的量太大时，核黄素的生长受到阻碍引起核黄素产量的下降。
当含有油组分的废粘土被用作起始物质和作为本发明的优选实施方案的载体时，理想的废粘土含有水相和油组分的重量比率为从100∶1到5∶1和，尤其是，从20∶1到5∶1。
当废粘土相的量大于或小于上述的范围时核黄素的产生速率趋于降低。
本发明的乳化方法不需要生硬地保持上面三种组分的加入的上述的次序，且可以选择一种方法加载体到水中，搅拌混合物，加入油并搅拌以及乳化该混合物，然而其可依据混合油相和水相的速率，或油的使用，使用的条件或种类而变化。然而，更优选，载体被加到油中并被搅拌以及，然后，水被加入，且混合物被搅拌和乳化来获得更稳定的乳化组合物。理想的搅拌以400到700rpm的速度进行。
本发明的乳化操作可以是一个常规采用的物理方法例如搅拌。在实验室规模上，乳化操作可基于几乎等同于普通家用混合器的具有剪切力的机械力来完成，其持续数十秒到几分钟。为了进行工业规模的大量的加工，可使用例如匀浆器，胶体压榨机，射流搅拌器或螺旋式热交换器。然而，本发明决不限于上述的物理方法，而且如需要可采用化学的方法例如一种逆乳化方法，一种凝胶乳化方法或HLB-温度乳化方法。
为了培养微生物，本发明含有粘土矿物的乳化剂加入到含有用微生物和油以及脂肪的培养基中。然后，通过使用常规通气搅拌容器或者诸如填充床型反应器或者气升式气泡塔，上述形成的乳化组分通过任一分批系统，半分批系统，重复分批系统或者连续系统根据发酵产物的特性进行培养。
本发明将通过实施例进行描述，但是本发明决不限于此。
(测定方法)(1)测定油的消耗量5毫升己烷被加入到5ml的培养液中，一起混合两分钟。混合物在3000rpm离心分离15分钟。己烷层移出，在105℃干燥3小时，获得油的剩余量，然后将所述剩余油从最初所使用量减去来获得消耗量。
(2)测定核黄素浓度。
培养液进行稀释使得核黄素的浓度不高于30mg/L，然后将0.2ml的1N NaOH与0.8ml的稀释培养液混合。取出混合了NaOH的培养液0.4ml，然后加入1mL的0.1M的磷酸缓冲液(pH6.0)。混合物在11,000rpm离心分离10分钟，取出悬浮液，在444nm处测定其吸光度。根据在444纳米波长处的吸光度×稀释倍数×127.2971计算以mg/L单位表示核黄素的浓度。
(3)吸光度通过使用由Hitachi，Ltd生产的U-2001型进行测定。
(4)荧光显微照相通过使用由Olympus Kogaku Co.生产的IX-70型进行观察。
(实施例1)(在烧瓶中培养)(预培养)30g的CSL(玉米浆)，9g的酵母提取物以及15g的大豆油溶解在一起，向其中加入蒸馏水使体积为1升。然后加入5N的KOH调整pH值到6.8，从而制备培养基。
100毫升这样制备的培养基加入到500mL的使瓶中并进行灭菌。然后，植入棉桃阿舒氏囊霉(Ashbya gossypii)ATCC 10895并在28℃，220rpm培养24小时获得预培养液。
(主培养)50g的大豆油和11.1g的海泡石(商品名Aidplus ML-50D，由Mizusawa Kagaku Co生产)彼此混合。此混合物以及30g的明胶，60g的CSL，1.5g的KH2PO4，1.5g的甘氨酸，2mg的Co2+，5mg的Mn2+，10mg的Zn2+以及1mg的Mg2+溶解在1升的蒸馏水中，用5N的KOH将pH调整到6.8以制备培养基。培养基中海泡石的浓度为1.1％重量(后面出现的实施例中，海泡石由上述Mizusawa Kagaku Co生产)。
50毫升的上述培养基加入到500mL的烧瓶中并进行灭菌。然后，植入1ml的预培养液并在28℃，220rpm培养7天。获得的核黄素的浓度，产率(％)以及增长率(％)显示在表4中。
增长率根据下列公式进行计算，增长率(％)＝(A-B)×100/B其中A为当加入海泡石时的核黄素浓度，B为不加海泡石时的核黄素浓度。
产率根据由1g的起始油(在本实施例中是大豆油)产生的核黄素的量(％)表示。
(实施例2到4)主培养的培养基以实施例1的相同方式将pH调整到6.8进行制备，除了将海泡石的量改变到22.3g，33.4g以及55.7g。在获得的培养基中海泡石的浓度分别为2％重量，3％重量，以及5％重量。
将50毫升的上述培养基加入到500mL的烧瓶中并进行灭菌。然后，植入1ml实施例1制备的预培养液并在28℃，220rpm培养7天。获得的核黄素的浓度，产率(％)以及增长率(％)显示在表4中。
(比较实施例1)pH调整到6.8的主培养的培养基以实施例1的相同方式进行制备，除了不使用海泡石。
50毫升的上述培养基加入到500mL的烧瓶中并进行灭菌。然后，植入1ml实施例1制备的预培养液并在28℃，220rpm培养7天。获得的核黄素的浓度，产率(％)以及增长率(％)显示在表4中。
表4实施例1 实施例2 实施例3实施例4 比较实施例1海泡石的量1wt％2wt％3wt％ 5wt％ 0wt％核黄素浓度1,100mg/L1,001mg/L966mg/L863mg/L690mg/L产率(％) 2.2 2.0 1.91.71.4增长率59％ 45％ 4 0％ 25％ 0％
实施例5到7(小型发酵罐培养)(预培养)2g的酵母提取物，20g的蛋白胨，0.6g的肌醇和10g的葡萄糖溶解在1升蒸馏水中，用5N KOH将pH调整到6.8获得培养基A。
此外，30g的CSL(玉米浆)，9g的酵母提取物以及15g的大豆油溶解在一起，并向其加入蒸馏水使体积为1升。然后加入5N的KOH调整pH值到6.8，从而制备培养基B。
50毫克培养基A加入到500mL的锥形瓶中并进行灭菌。然后，植入棉桃阿舒氏囊霉(Ashbya gossypii)ATCC 10895并在28℃，220rpm预培养24小时获得培养液A。
随后，100ml培养基B加入到500mL的锥形瓶中并进行灭菌。然后，植入1ml上面获得的培养液并开始第二次培养24小时获得二次培养液。
(主培养)用于主培养(海泡石的浓度为1％重量)的培养基以和实施例1大体相同的方式进行制备。2升的这种培养基加入一个5升的小发酵罐并灭菌。然后，植入上述获得的二次培养液，并培养5天。提供氧气(1vvm)同时将搅拌速度改变到400到700rpm。
表5显示了获得的核黄素的浓度以及增长率(％)。表5的结果为通过在不同搅拌速度进行两次实验获得的结果。
(比较实施例2到4)不含海泡石的用于主培养的培养基以和比较实施例1大体相同的方式进行制备。2升的这种培养基加入一个5升的小发酵罐并灭菌。然后，植入实施例5制备的二次培养液的，并培养5天。提供氧气同时将搅拌速度改变到400到700rpm。
表5显示了获得的核黄素的浓度和增长率(％)。
表5搅拌速度核黄素浓度增长率实施例5-1400rpm 1,230mg/L 583％比较实施例2-1400rpm 1 80mg/L -实施例5-2400rpm 1,094mg/L 501％比较实施例2-2400rpm 1 82mg/L -实施例6-1600rpm 2,380mg/L 54％比较实施例3-1600rpm 1,550mg/L -实施例6-2600rpm 2,500mg/L 44％比较实施例3-2600rpm 1,731mg/L -实施例7-1700rpm 1,922mg/L 27％比较实施例4-1700rpm 1,515mg/L -实施例7-2700rpm 1,580mg/L 35％比较实施例4-2700rpm 1,169mg/L -(实施例8)菌株棉桃阿舒氏囊霉(Ashbya gossypii)ATCC 10895在含有10g酵母提取物，10g葡萄糖，3g甘氨酸以及20g/L琼脂的固体培养基(pH6)上于30℃培养2天(固体培养)。
随后，含有30g/L CSL，15g/L的酵母提取物以及6g/L的大豆油的蒸馏水培养基进行灭菌，然后向其中植入铂环量的上述固体培养物，在28℃，220rpm预培养24小时获得预培养液。
随后，30g的明胶，60g的CSL，1.5g的KH2PO4，1.5g的甘氨酸，2mg的Co2+，5mg的Mn2+，10mg的Zn2+以及1mg的Mg2+，以及碳源溶解在1升的蒸馏水中，用5N的KOH将pH调整到6.8以制备用于主培养的培养基。利用含有40％重量的菜油的废粘土作为碳源。
2毫升的预培养液植入到这样制备的培养基中进行主培养，并在摇床上于28℃，220rpm培养7天。
培养结束后，分离出废粘土，取出其湿重为1.5g(在105℃干燥2小时重量为0.636g)提取核黄素。提取方法包括向废粘土中加入0.4NNaOH，然后进行剧烈搅拌以测定上清液核黄素的浓度。
结果，核黄素通过两次提取可以回收高于80％，通过3次提取可回收高于90％。表6显示了获得的核黄素的浓度以及产率(％)。
(实施例9)通过使用菌株棉桃阿舒氏囊霉(Ashbya gossypii)ATCC 10895，通过与实施例8相同的方式进行固体培养和预培养获得预培养液。
另外，与实施例8大体上相似的方式进行主培养，但是使用125g含40％重量棕榈油作为碳源的废粘土进行，与实施例8相同的方式提取核黄素。表6显示了获得的核黄素浓度以及产率(％)。
(实施例10和11)通过使用菌株棉桃阿舒氏囊霉(Ashbya gossypii)ATCC 10895，通过与实施例8相同的方式进行固体培养和预培养获得预培养液。
与实施例8大体上相同的方式进行主培养，但是使用50g提取自废粘土的菜油或者棕榈油作为碳源进行。
培养结束后，测定油的浓度和核黄素的浓度，并从测定结果计算产率(％)。
为了计算油的浓度，培养结束后提取2ml的培养液，并加入相同量的己烷，充分混合2分钟。然后将混合物在3000rpm进行离心分离，去除上清液，蒸发掉己烷，然后进行干燥。随后，测定油的重量以计算油的浓度。核黄素的浓度根据上述方法进行计算。
表6显示了核黄素浓度和产率(％)。
表6实施例8实施例9 实施例10 实施例11油的种类菜油 棕榈油提取油1提取油2核黄素浓度 1,123.2880.0 833.4 863.9产率(％)2.22.2 1.71.7提取油1从废粘土提取的菜油。
提取油2从废粘土提取的棕榈油。
核黄素浓度mg/L单位表示。
(比较实施例5和6)通过使用菌株棉桃阿舒氏囊霉(Ashbya gossypii)ATCC 10895，通过与实施例8相同的方式进行固体培养和预培养获得预培养液。
另外，与实施例8大体上相同的方式进行主培养，但是使用50g纯的大豆油(由Wako Junyaku Co生产的试剂)或者菜油(由Nakaraitesk生产的试剂)作为碳源进行。
培养结束后，通过与实施例10和11相同的方式测定油的浓度和核黄素的浓度，并从测得的结果计算产率(％)。表7显示了获得的核黄素浓度以及产率(％)。
表7比较实施例5 比较实施例6油的种类(新油)大豆油 菜油核黄素浓度(mg/L) 76 8.2 778.6产率(％) 1.5 1.6实施例12通过使用菌株棉桃阿舒氏囊霉(Ashbya gossypii)ATCC 10895，通过与实施例8相同的方式进行固体培养和预培养获得预培养液。
另外，与实施例8大体上相同的方式进行主培养，但是使用188g含40％重量棕榈油作为碳源的废粘土进行主培养10天，并以与实施例8相同的方式提取核黄素。表8显示了获得的核黄素浓度以及产率(％)。
(比较实施例7)通过使用菌株棉桃阿舒氏囊霉(Ashbya gossypii)ATCC 10895，通过与实施例8相同的方式进行固体培养和预培养获得预培养液。
另外，通过与实施例12大体上相同的方式进行主培养，但是使用75g纯棕榈油(Spectrum Chemical Mfg.Corp)作为碳源进行。
培养结束后，通过与实施例10和11相同的方式测定油的浓度和核黄素的浓度，并从测得的结果计算产率(％)。表8显示了获得的核黄素浓度以及产率(％)。
表8实施例12 比较实施例7油的种类棕榈油 棕榈油(新)核黄素浓度(mg/L)2500 1600产率(％)3.8 2.5实施例13制备吸收50g菜油(PC由Shiroshi Calcium Kogyo Co.生产)的碳酸钙125g。这种碳酸钙以及30g的明胶，60g的CSL，1.5g的KH2PO4，1.5g的甘氨酸，2mg的Co2+，5mg的Mn2+，10mg的Zn2+以及1mg的Mg2+溶解在1升的蒸馏水中，用5N的KOH将pH调整到6.8以制备用于主培养的培养基。50毫升的上述培养基加入500ml的培烧并进行灭菌。然后，在实施例1中制备的1ml预培养液植入并在28℃，220rpm培养7天。表9显示了获得的核黄素浓度以及产率(％)。
(比较实施例8)通过与实施例13相同的方式进行主培养，但是使用125g吸收了50g菜油的氢氧化镁替代上述碳酸钙。获得的核黄素浓度以及产率(％)。
(比较实施例9)与实施例13相同的方式进行主培养，但是使用125g吸收了50g菜油的硅(MTZUCASIL P707由Mizu-Sawa Kogyo Co.制造)代替上述碳酸钙。表9显示了获得的核黄素浓度以及产率(％)。
表9实施例13 比较实施例8 比较实施例9载体的种类 碳酸钙 氢氧化镁 硅石核黄素浓度(mg/L)1200 0 390产率(％)2.4 0 0.7实施例14通过使用菌株棉桃阿舒氏囊霉(Ashbya gossypii)ATCC 10895，通过与实施例8相同的方式进行固体培养和预培养获得预培养液。
另外，与实施例8大体上相同的方式进行主培养，但是使用125g含40％重量牛油和猪油(牛油∶猪油＝1∶1的混合物)作为碳源的废粘土进行主培养，并用与实施例8相同的方式提取核黄素。表10显示了获得的核黄素浓度以及产率(％)。
(比较实施例10)通过使用菌株棉桃阿舒氏囊霉(Ashbya gossypii)ATCC 10895，通过与实施例8相同的方式进行固体培养和预培养获得预培养液。
另外，与实施例14大体上相同的方式进行主培养，但是使用50g纯牛油作为碳源。表10显示了获得的核黄素浓度以及产率(％)。
(比较实施例11)通过使用菌株棉桃阿舒氏囊霉(Ashbya gossypii)ATCC 10895，通过与实施例8相同的方式进行固体培养和预培养获得预培养液。
另外，与比较实施例10大体上相同的方式进行主培养，但是使用50g纯牛油作为碳源。表10显示了获得的核黄素浓度以及产率(％)。
表10实施例14比较实施例10 比较实施例11动物油和脂的种类牛油，猪油 牛油 猪油核黄素浓度(mg/L) 997.16335.64260.53产率(％) 1.99 0.67 0.52根据该生产核黄素的方法，即通过在培养基中培养产核黄素微生物，通过利用植物油或者动物油作为碳源在其中形成和聚集核黄素并收集核黄素，具有油吸收特性的粘土矿物载体，其化学处理产物或者钙化合物在培养基中存在使得可以稳定地将植物油分散在培养基中，而且不影响搅拌操作到过度的程度从而损伤微生物，因此能够高产量和高生产率地生产核黄素。
本发明进一步提供了通过利用植物油或者动物油作为碳源在培养基中培养产核黄素微生物的方法，其中植物油或者动物油以改良的方式分散在培养基中，使得能够高产量和高生产率地生产核黄素。
本发明进一步提供了以低成本生产核黄素的方法，不需要诸如浓缩或者回收核黄素的烦琐操作。
本发明还使得从待处理的废植物油或者废动物油中高效回收核黄素成为可能。回收的核黄素可以用作药物，动物食品添加剂，食品染色剂以及营养助剂。当通过粘土矿物携带时，核黄素优选用作动物食品补充营养并增强肠道功能。尤其是，废粘土可被高效利用并且同时可以减轻环境负担。也可以添加本发明使用的载体到由家庭，快餐店，面包店等所排放的已成为处理的难题的废食用油中，来从中产生核黄素。
权利要求
1.一种通过在利用植物油或动物油作为碳源的培养基中培养产核黄素微生物，在其中形成和积累核黄素并从中回收核黄素来生产核黄素的方法，其中使具有油吸附特性粘土矿物载体，其化学处理的产物或钙化合物存在于培养基中。
2.根据权利要求1的生产方法，其中的载体存在的量为培养基重量的0.1-10％。
3.根据权利要求1的生产方法，其中的载体是链状粘土矿物。
4.根据权利要求1的生产方法，其中的粘土矿物具有70-400埃的纤维直径和0.2-400μm的纤维长度。
5.根据权利要求1的生产方法，其中至少部分的载体是蒙脱土粘土矿物和其酸处理的产物。
6.根据权利要求1的生产方法，其中的载体以吸留植物油或动物油的状态存在于培养基中。
7.根据权利要求6的生产方法，其中的吸留植物油或动物油的载体是废粘土。
8.根据权利要求1的生产方法，其中的钙化合物是碳酸钙。
9.一种通过在利用植物油或动物油作为碳源的培养基中培养产核黄素微生物，在其中形成和积累核黄素并从中回收核黄素来生产核黄素的方法，其中的碳源是吸留植物油或动物油的废粘土。
10.一种通过在利用植物油或动物油作为碳源的培养基中培养产核黄素微生物，在其中形成和积累核黄素并从中回收核黄素来生产核黄素的方法，其中的碳源是从吸留植物油或动物油的废粘土提取的油成分。
全文摘要
一种生产核黄素的方法，包括在植物油或动物油作为碳源的培养基中培养产核黄素真菌来实现核黄素的形成和积累以及核黄素的回收，其特征在于由能够吸收油成分的粘土矿物或其化学处理的产物或钙化合物组成的载体被掺入到培养基中。此方法使得能够以低成本浓缩和回收核黄素，不需要费时的操作，从而，核黄素可被高生产率生产，且进一步能够有效的利用待处理的废植物油或动物油来回收核黄素。
文档编号C12P25/00GK1518601SQ0380049
公开日2004年8月4日 申请日期2003年2月18日 优先权日2002年2月19日
发明者阿部洁, 新田裕, 朴龙洙, 郑银熙, 明华 申请人:水泽化学工业株式会社