专利名称：抗肿瘤药和杀虫剂总番荔素及其制造方法
技术领域：
本发明涉及从番荔枝科(Annonaceae)植物番荔枝(Annona squamosa)种子中提取的总活性成分总番荔素(Annonaceous acetogenins或polyketids)，用于制造抗肿瘤药物和农用或家用杀虫剂。
番荔枝是我国南方热带和亚热带地区产的一种药用植物，其果实是食用水果。番荔枝科中若干属植物含有一类抗肿瘤和杀虫活性很强的长碳链脂肪酸内酯类的天然化合物，即番荔素。从1982年报道第一个番荔素至今，已发现的类似物超过260个。但至今仍停留在化学结构、类似物合成和生物活性等方面的研究。由于每种植物所含的番荔素同系列化合物品种繁多，如从番荔枝已发现40多个同系物，各同系物的理化性质十分近似，分离较困难，并且单个化合物的含量相对较低，要积累纯的单体化合物供活性研究，药效评价和开发抗肿瘤新药或杀虫剂，其难度都较大。尽管经各国科学家多年研究，发现结构各异的番荔素业已超过260个，并测定了它们在体外的生理活性以及其中少数化合物在体内活性。番荔素的分子结构中有多个手性碳原子，用化学合成方法去开扩药源亦非易事。因此，无论从植物中分离或用化学方法合成单体番荔素，距离实际应用阶段尚有一段较长的距离。
本发明的目的是从番荔枝种子提取总活性成分总番荔素，以总有效成分代替单一有效成分制造抗肿瘤药物以及农用或家用杀虫剂。由于本专利以资源丰富易得的植物为原料，又采用较简单的制造工艺，降低了生产成本，有利于实用的目的。
本发明主要内容和要点一．化学与药学部分总番荔素提取与富集将番荔枝种子破碎成粗粉，温室下，以己烷或石油醚浸泡脱脂，挥去溶剂后，继以95％的乙醇(甲醇、丙醇、异丙醇或丙酮)渗漉，减压回收溶剂得醇提取物，在水溶液中以氯仿(二氯甲烷、二氯乙烷、乙醚或乙酸乙酯)分配处理，番荔素为氯仿萃取提出，再以90％乙醇(甲醇、丙醇或异丙醇)己烷(或石油醚)分配处理氯仿提取物，最后将90％乙醇提取物以硅胶吸附层析，氯仿(二氯甲烷、二氯乙烷、乙醚或乙酸乙酯)-甲醇(98∶2～90∶10)洗脱，收集最先洗出部分(～70％)，可使总番荔素含量富集至90％，其工艺流程见(图1)。番荔素的质量控制方法1．比色法测定总番荔素含量本法基于番荔素的分子中含有一个α,β-不饱和-γ-内酯环，在乙醇溶液中能与3,5-二硝基苯甲酸(2％)和氢氧化钠(5％)乙醇试剂显示桃红色反应，置可见光分光光度计中，530nm下测定吸收度，计算含量。回归方程y=0.4048x-1.097×10-3线性范围0.07-0.30mg r=0.9999(相关系数)表-1比色法测定各提取物中的总番荔素含量
*数据为测量多次平的均值2．高效液相色谱法测定主要番荔素的含量采用C-18烷基键合硅胶柱(4.5mm×25cm)，甲醇∶水(8∶2)为流动相，流速1ml/分，在高效液相色谱仪，检测波长220 nm，测量各成分的吸收度，结果如下表-2高效液相色谱法测定总番荔素中主要番荔素的含量
高效液相色谱分离图见附图2二．药理学部分1．总蕃荔素的急性毒性实验小鼠半数致死量LD50值测定结果如下腹腔注射ip×1 LD50=6.11±0.10mg/kg静脉注射iv×1 LD50=3.89±0.10mg/kg口服po×1 LD50=82.98±5.40mg/kg总蕃荔素的LD50值与目前临床应用的一些抗肿瘤药物如长春新碱(VCR)相近。在敏感剂量区量-效(死亡)关系非常明显。三种给药途径中以口服毒性反应最小。腹腔注射给药后吸收很快，高剂量死亡时间集中在2小时内，低剂量集中于8小时内，若24～48小时内动物能够存活，就基本不会死亡，说明药物在体内的吸收，转化或排出较快。
2．总番荔素体外抗肿瘤作用体外对人肝癌细胞Bel、人结肠癌细胞HCT-8、人卵巢癌细胞A2780、人口腔上皮癌细胞KB及其耐药细胞株KBv-200、人宫颈癌细胞HeLa S3、中国仓鼠肺纤维瘤细胞V79和小鼠母纤维瘤细胞L729，进行了抑制肿瘤生长实验，结果表明对人肝癌，人结肠癌，人卵巢癌抑癌活性最强；对人口腔上皮癌及其耐药株KBv-200具有同等的药效，说明总番荔素没有一般抗癌药物存在的易产生多药耐药性(MDR)的缺点。见表3,4,5和6。
表-3．总番荔素对五种人癌细胞株的杀伤活性(ED50半数有效剂量
*5-Fu阳性对照药5-氟尿嘧啶药表-4．总番荔素对四种人癌细胞培养生长的抑制作用(表中数据为抑制率％
表-5．总番荔素对人肝癌Bel细胞培养生长的抑制作用(表中数据为抑制率％)<
表-6．总番荔素对三种癌细胞培养生长的抑制作用*(表中数据为抑制率％)<
ADM阳性对照药-阿霉素3．总番荔素体内对动物移植性肿瘤生长的抑制作用以小鼠肝癌H22、小鼠黑色素瘤B16、小鼠肉瘤S180、小鼠子宫颈癌U14、小鼠艾氏癌实体瘤ESC和小鼠路易斯(Lewis)肺癌等6种动物移植性肿瘤细胞株进行体内抑瘤生长试验。总番荔素设三个剂量组，另设对照组(给溶解样品的相同溶剂)和环磷酸胺(CTX)阳性对照组，各组连续口服给药10～11天，结果表明总番荔素对小鼠肝癌H22的活性最强，其次为黑色素瘤B16和子宫颈癌U14。表明总蕃荔素有一定的毒性靶组织和器官。
表-7．总番荔素口服给药对小鼠移植性肝癌H22的抑瘤作用
*对照组给相同量溶解样品的溶剂，下同表-8．总番荔素口服给药对小鼠黑色素瘤B16的抑瘤作用
表-9．总番荔素口服给药对小鼠肉瘤S180的抑瘤作用
表-10．总番荔素口服给药对小鼠移植性子宫颈癌U14的抑瘤作用
表-11．总番荔素口服给药对小鼠艾氏癌实体瘤ESC的抑瘤活性
表-12．总蕃荔素口服给药对小鼠Lewis肺癌的抑瘤作用
表13．总番荔素杀虫，杀螨生物活性试验
4．特殊毒理学实验 总番荔素只在剂量较高时方出现致突变作用(Ames实验)和微核计数呈轻度阳性反应，表明本药的致诱变作用较轻，与多数抗癌药有所不同。
5．一般药理学实验本药在0.03-0.1mg/kg,iv剂量下对犬的呼吸频率、幅度、心律、心率和心电图均无影响；对小鼠的一般活动无计数差异，只在0.34mg/kg iv时，对小鼠有较轻的兴奋作用。
本发明的优点和效果是从番荔枝种子提取总活性成分番荔素，以总有效成分代替单一有效成分制造抗肿瘤药物以及农用或家用杀虫剂，不仅能够集中显示各单一有效成分的特点，而且还可提高总活性成分的含量。与此同时，由于以资源丰富易得的植物为原料，又采用较简单的制造工艺，降低了生产成本，有利于实际应用。
图1总番荔素工艺流程2高效液相色谱分离图其中(1)-番荔辛(2)-中心番荔辛(3)-番荔亭E (4)-番荔亭B1仪器Waters高效液相色谱仪486紫外检测器检测波长220nm
权利要求
1．抗肿瘤药和杀虫剂总番荔素及其制造方法，其特征包括以下步骤(1)．用有机溶剂从番荔枝种子提取总的有效成分总番荔素；(2)．用光电比色法测定制品中的总番荔素含量，用高效液相色谱法测定总番荔素中四个主要有效成分的含量；(3)．通过体外肿瘤细胞培养和体内抑瘤动物实验，测定制品的抗肿瘤活性；通过喷雾法、药膜法和浸叶法测定制品的杀虫作用。
2．按照权利要求1所述的抗肿瘤药和杀虫剂总番荔素及其制造方法，其特征是番荔枝种子先用己烷脱脂，然后用醇渗漉、氯仿萃取以及己烷-90％乙醇分配处理，取90％乙醇部分，最后再经硅胶吸附层析，氯仿-甲醇洗脱，可得到有效物质总番荔素含量达到90％。
3．按照权利要求1所述的抗肿瘤药和杀虫剂总番荔素及其制造方法，其特征是用光电比色法，在乙醇溶液中加入3,5-二硝基苯甲酸和氢氧化钠试剂显示桃红色反应，在530nm测定吸收度，计算总番荔素含量；用高效液相色谱法，采用C-18键合硅胶柱，甲醇-水(80∶20)为流动相，220nm下测定番荔辛、牛心番荔辛、番荔亭-E和番荔亭-B1的含量。
4．按照权利要求1所述的抗肿瘤药和杀虫剂总番荔素及其制造方法，其特征是用6种人癌和2种动物肿瘤细胞株进行体外培养，测定制品的半数有效剂量(ED50)及抑制率(％)用6种动物移植性肿瘤进行体内抑瘤活性试验；采用药膜法、喷雾法或浸叶法测定对8种害虫的杀灭率(％)。
全文摘要
本发明涉及一种用番荔枝种子为原料提取其总有效成分总番荔素,用于制造肮肿瘤药和杀虫剂,其工艺是用已烷脱脂,用醇渗漉,氯仿萃取以及已烷90%－乙醇分配处理,再经硅胶吸附层析,氯仿－甲醇洗脱得到成品,经药效学实验证明,对肝癌、结肠癌、卵巢癌等有很强的抑制作用,对多种害虫亦有杀灭作用,本制品原料丰富,工艺简单,总有效成分含量很高,成本较低,适于推广应用。
文档编号A01N43/02GK1224016SQ9810136
公开日1999年7月28日 申请日期1998年4月10日 优先权日1998年4月10日
发明者余竞光, 王德昌, 罗秀珍, 王永泉, 孙兰 申请人:中国医学科学院药用植物研究所