一种紫色甘薯脱毒及穴盘快繁的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种植物的组织培养脱毒与快繁领域，具体涉及一种紫色甘薯脱毒及穴盘快繁的方法。
【背景技术】
[0002]紫色甘薯是指薯块肉色呈紫色的一类甘薯，其营养价值丰富，除了具有普通甘薯的营养价值外，还含有丰富的花青素。研宄表明，紫薯块根中的花青素有很强的抗氧化作用，能去除活性氧，预防高血压和动脉硬化，改善肝功能，减少基因突变，抑制致癌物质的产生，改善视力等保健作用，而且紫薯花青素还具有很好的耐热耐光性，在食品、化妆品、医药方面也有广阔的应用前景。因此近年来种植紫色甘薯也越来越受到人们的欢迎。但随着紫薯种植面积的扩大，紫薯受病毒的危害也越发严重，紫薯感染病毒后，导致品种退化，死苗率增加，产量下降甚至绝收；感染病毒的紫薯薯块变小，品质变差。紫薯病毒病已成为导致甘薯种性退化、产量下降的重要原因，只有对染病紫薯种苗进行茎尖分生组织的脱毒培养和快繁，才能保证原紫薯品种的产量和品质。
[0003]近年来，随着植物组织培养技术的不断进步，利用组织培养对植物进行脱毒的技术也广泛应用在蔬菜、花丼和一些农作物上。但不同的植物有其不同的生长特性，脱毒和快繁的具体方法也因植物而异，因品种而异。因此，紫色甘薯因其自身的特点，脱毒培养和快繁的技术也不同于其他植物，需要研宄人员通过试验来不断探索和完善。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种紫色甘薯的脱毒与穴盘快繁方法，既可保证原紫薯品种产量和品质水平，又可打破季节限制，实现多次、高效的扩繁。
[0005]本发明的目的通过以下技术方案得以实现:
[0006]一种紫色甘薯的脱毒与穴盘快繁方法，包括如下步骤:
[0007]I)茎尖消毒:从紫色甘薯种苗上切取2cm左右的茎尖，去除所有叶片后放入干净的三角瓶中，在自来水下反复冲洗5?lOmin，加入两滴洗洁精浸泡lOmin，倒去洗涤液，用蒸馏水清洗4?5次。将茎尖转移到超净工作台上，用75%乙醇浸泡30s，用无菌水清洗
2?3次，再将茎尖置于2%的NaClO溶液中浸泡lOmin，或0.1 %的HgCl2 (升汞)溶液中浸泡5min，之后用无菌水冲洗3次，消毒后的茎尖用无菌滤纸吸去茎尖表面的水分，置于无菌培养皿中备用；
[0008]2)茎尖分生组织的剥离与接种:将消过毒的茎尖置于20-80倍体视显微镜(双筒解剖镜)下，用解剖针逐次去掉幼叶，直至露出光滑的茎尖分生组织，用解剖刀切取带I?2个叶原基(0.1?0.3mm)的生长点，用接种针将生长点移至装有再生培养基的培养皿内培养，每个培养皿内可接种约20个生长点；
[0009]3)茎尖分生组织的培养:把接种后的培养皿放在光照培养箱或组培室内的光照培养架上进行培养。培养条件为温度25°C，光照强度2000?30001x、光照时间16h/d，一般培养20?30d看到茎尖明显伸长且呈绿色，有小叶发生时将小茎芽转入继代培养基的试管内进行培养，继续生长并形成根系，再经I个月左右即可发育成4?5个叶片的小植株；用血清法检测再生小植株，去除携带甘薯病毒的植株。
[0010]4)准备穴盘和基质:选择聚乙烯塑料穴盘，尺寸为54cmX28cm，规格50穴(口径50_X50mm，穴深50mm)或72穴(口径40_X40mm，穴深45mm)为宜；用500倍多菌灵液浸泡12小时或用高锰酸钾1000倍液浸泡30分钟，然后用清水将穴盘清洗干净后晾干；将穴盘内装满基质，基质选择营养土，或自配(每10kg黄土 +高温膨化鸡粪5kg+45 %三元复合肥lkg+50%多菌灵50g)，浇透水备用，穴盘底部用托盘垫底。
[0011]5)脱毒试管苗的移栽:在超净工作台中用解剖刀小心截取通过病毒检测的试管苗约4cm左右的茎段，将每个茎段去掉下部的叶片，只留上端I片展开叶，插入穴盘的一个孔穴中，插入深度2cm左右，试管苗根部剩余的部分依然留在试管中继续生长；待试管苗长到6cm左右时可再次截取上部茎段移栽至穴盘中，一直反复进行。
[0012]6)将插好苗的穴盘放入温室或大棚的多层培养架子上，围好防虫网；控制温室或大棚的温度在25?28°C，最低不能低于20°C，注意定时给薯苗饶水。
[0013]7)待薯苗长至1cm左右时即可再次剪苗，上半截只留最上面I片展开叶，去掉下部多余叶片，插出新的穴盘中，下半截留在原来的穴盘中继续生长，如此连续进行剪苗即可实现甘薯脱毒苗的快速扩繁，随时备大田移栽。
[0014]前述紫色甘薯的脱毒与穴盘快繁方法中，所述的再生培养基的配比是:MS基本培养基粉末 4.4g/L，6-苄基腺嘌呤(6-BA) 1.0 ?2.0mg/L，a-奈乙酸(NAA)0.1 ?1.0mg/L，蔗糖30g/L、植物凝胶Gelzan 3g/L ;继代培养基的配比是:MS基本培养基粉末4.4g/L，蔗糖 30g/L、植物凝胶 Gelzan 3g/L。
[0015]本发明的积极效果是:
[0016]1.传统接种方式都是用试管，每管仅能接种I个茎尖分生组织，而利用培养皿接种，操作更方便(培养皿深度更浅)，单皿接种量大(约20个/皿)，培养皿可在光照培养箱或组培室中分层叠放，极大的节省了培养空间；
[0017]2.利用穴盘法进行脱毒苗的快速扩繁，操作简便，繁殖系数高，不受季节限制。
[0018]3.对染毒紫薯品种进行脱毒和扩繁，有效防止品种退化，保持种性和保证稳产和品质O
【具体实施方式】
[0019]通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的内容并不局限于此。
[0020]下面实施例中的实验方法所使用的实验方法，如无特殊说明均为常规方法；下面实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0021]实施例1
[0022]选用国审紫色甘薯品种“宁紫薯I号”进行脱毒和快繁，具体步骤如下:
[0023]I)茎尖消毒:四月中旬在“宁紫薯I号”甘薯苗床上选取具有本品种典型特征、生长健壮、无病虫的健康薯苗，剪取薯苗顶部2cm左右的茎尖，去除所有可见叶，放入干净的三角瓶中，在自来水下反复冲洗5min后，加入两滴洗洁精浸泡lOmin，倒去洗涤液，再用蒸馏水清洗5次，洗净残留的洗涤液。随后将茎尖转移到超净工作台上，用75%乙醇浸泡30s进行表面消毒，用无菌水清洗2次，再将茎尖置于2%的NaClO溶液中浸泡1min之后用无菌水冲洗3次，洗净残留的NaClO溶液，进行深度消毒，消毒后的茎尖用无菌滤纸吸去茎尖表面的水分，置于无菌培养皿中备用；
[0024]2)茎尖分生组织的剥离与接种:将消过毒的茎尖置于80倍体式显微镜(双筒解剖镜)下，用解剖针逐次去掉幼叶，直至露出光滑的茎尖分生组织，用解剖刀小心切取带有I?2个叶原基(0.1?0.3mm)的生长点，用接种针将生长点移至装有再生培养基(MS基本培养基粉末4.4g/L、6-苄基腺嘌呤1.0mg/L, a-奈乙酸0.lmg/L、蔗糖30g/L、植物凝胶Gelzan 3g/L)的培养皿内培养，每个培养皿内可接种20个生长点；
[0025]3)茎尖分生组织的培养:把接种后的培养皿放在组培室内的光照培养架上进行培养。培养条件为温度25?28°C，光照强度2000?30001x、光照时间16h/d，培养20d后，当看到茎尖明显伸长且呈绿色，有小叶发生时将小茎芽转入继代培养基(MS基本培养基粉末4.4g/L、鹿糖30g/L、植物凝胶Gelzan 3g/L)的试管内进行培养，使其继续生长并形成根系，每个试管种植一棵小苗，经过30d左右即可发育成4?5个叶片的“宁紫薯I号”甘薯小植株；
[0026]4)试管苗的病苗检测:再生出的宁紫薯I号试管苗要及时进行病毒检测，一般长到4?5个叶片大小的试管苗即可进行病毒检测。先用目测法去除叶片上有花叶明脉或褪绿斑的带毒试管苗；目测法无法鉴定的试管苗用血清法检测，去除携带有甘薯羽状斑驳病毒、甘薯潜隐病毒、甘薯类花叶病毒的试管苗。
[0027]5)准备穴盘和基质:选择尺寸为54cmX28cm，规格50穴的聚乙烯塑料穴盘，使用前先用500倍多菌灵液浸泡12小时，然后用清水将穴盘清洗干净并晾干；将穴盘内装满基质，基质选择营养土(每10kg黄土 +高温膨化鸡粪5kg+45%三元复合肥lkg+50%多菌灵50g)，饶透水备用，穴盘底部用托盘垫底，防止水分溢出。
[0028]6)脱毒试管苗的移栽:在超净工作台中用解剖刀小心截取通过病毒检测的宁紫薯I号试管苗约4cm左右的茎段，将每个茎段去掉下部的叶片，只留上端I片展开叶，插入穴盘的一个孔穴中，插入深度2cm左右，试管苗根部剩余的部分依然留在试管中继续生长；待试管苗再次长到6cm左右时可再次截取上部茎段移栽至穴盘中，一直反复进行。
[0029]7)将插好宁紫薯I号脱毒苗的穴盘放入大棚的多层培养架子上，围好防虫网；控制温室或大棚的温度在25?28°C，定时给薯苗浇水。
[0030]8)待薯苗长至1cm左右时即可再次剪苗，上半截只留最上面I?2片展开叶，去掉下部多余叶片，插入新的穴盘中，下半截留在原来的穴盘中继续生长，如此连续进行剪苗，一般每个月可实现8?16倍的快速繁殖，随时备大田移栽。
[0031]该品种为春、夏薯型，适应种植范围广，产量30000?45000kg/hm2;脱毒后比对照(脱毒前的宁紫薯I号)增产28.7%。
[0032]实施例2
[0033]选用“宁紫薯2号”紫色甘薯品种进行脱毒和穴盘快繁，具体步骤如下:
[0034]I)茎尖消毒:四月中旬在“宁紫薯2号”紫色甘薯苗床上选取具有本品种典型特征、生长健壮、无病虫的健康薯苗，剪取薯苗顶部2cm左右的茎尖，去除所有可见叶，放入干净的三角瓶中，在自来水下反复冲洗1min后，加入两滴洗洁精浸泡lOmin，倒去洗涤液，再用蒸馏水清洗5次，洗净残留的洗涤液。随后将茎尖转移到超净工作台上，用75%乙醇浸泡30s进行表面消毒，用无菌水清洗2次，再将茎尖置于2%的NaClO溶液中浸泡lOmin，之