6] 一种具有如下的氨基酸序列的分离的多肽，该氨基酸序列基于ClustalW比对 方法，当与SEQIDNO:3、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26 或 27 比较时，具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、 62 %,63 %,64 %,65 %,66 %,67 %,68 %,69 %,70 %,71 %,72 %,73 %,74 %,75 %,76 %, 77 %,78 %,79 %,80 %,81 %,82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %, 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。该多肽优选为〇^1多 肽。
[0167] 一种分离的多核苷酸或cDNA，其包含：（i)基于ClustalW比对方法，当与SEQID NO:2 比较时，具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、 61 %,62 %,63 %,64 %,65 %,66 %,67 %,68 %,69 %,70 %,71 %,72 %,73 %,74 %,75 %, 76 %,77 %,78 %,79 %,80 %,81 %,82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %, 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的核酸序列；或者 (ii) (i)的核酸序列的完全互补序列。任何前述的分离的多核苷酸或cDNA可在本公开的任 何重组DNA构建体（包括抑制构建体在内）中应用。
[0168] 一种分离的多核苷酸或cDNA，其包含核苷酸序列，其中该核苷酸序列可在严格条 件下与包含SEQIDNO:2的完全互补序列的DNA分子杂交。
[0169] 一种分离的多核苷酸或cDNA，其包含核苷酸序列，其中该核苷酸序列通过至少一 种选自缺失、置换、添加和插入的方法变更SEQIDNO:2的一个或更多个核苷酸而源自SEQ IDNO:2〇
[0170] 一种分离的多核苷酸或cDNA，其包含核苷酸序列，其中该核苷酸序列对应于SEQ IDNO:2的等位基因。
[0171] CRW2
[0172] 从EMS群体分离了一株显示出提高的对WCR成虫的易感性的玉蜀黍突变株，并命 名为crw2-EMS。独立地，在源自Mu活性株系的F2群体中鉴定了另一株WCR易感突变株， 命名为crw2-Mutag。该Crw2突变株当在大田试验中评估时显示出提高的对WCR成虫以及 对日本金龟子和欧洲玉米螟（ECB)的易感性。crw2-EMS和crw2-Mutag都作为单基因隐性 性状分离，定位于5号染色体的相同区域，并且在正反交中互为等位基因。克隆了Crw2基 因（SEQIDNO:28)并确定其编码推定的同型半乳糖醛酸聚糖（HGAl)(也称为"糖基转移酶 AER61"）或者"推定的未表征的蛋白"(SEQIDN0:29)。糖基转移酶是植物中一个可将单个 或多个活化的糖转移到多种小分子接纳体的大的超家族的成员。最近的研宄已显示，植物 中的糖基转移酶可在植物生长、发育和对环境的响应的许多过程中具有作用（Wang，J.和 Hou，B.，（2009)，《中国生物学前沿》（Front.Biol.China)，4 :39-46) 〇
[0173] Crw2的至少两个突变等位基因已显示赋予提高的对玉米根虫甲虫植食性的易感 性：称为crw2-Mutag的等位基因，其在外显子2中具有Mu元件插入，crw2-EMS等位基因， 其在HGAl的保守区域中具有单个氨基酸改变R292C，以及独立的TUSC等位基因，其也在外 显子2中具有插入。图13显示玉蜀黍Crw2基因结构和每个鉴定的Crw2突变的位置的示 图。
[0174] 术语"野生型Crw2基因"、"crw2wt基因"、"Crw2基因"和"CRW2基因"在本文中可 互换使用。
[0175] 本公开包括下述的分离的多核苷酸、cDNA和多肽：
[0176] 一种分离的多核苷酸或cDNA，其包含：（i)编码具有如下的氨基酸序列的多肽的 核酸序列，该氨基酸序列基于ClustalW比对方法，当与SEQIDN0:29、34、35、36、37、38、 39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50比较时，具有至少50%、51%、52%、53%、54%、 55 %,56 %,57 %,58 %,59 %,60 %,61 %,62 %,63 %,64 %,65 %,66 %,67 %,68 %,69 %, 70 %,71 %,72 %,73 %,74 %,75 %,76 %,77 %,78 %,79 %,80 %,81 %,82 %,83 %,84 %, 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%序列同一性；或者（ii)(i)的核酸序列的完全互补序列，其中该完全互补序列和（i) 的核酸序列由相同数目的核苷酸组成并且100%互补。任何前述的分离的多核苷酸或cDNA 可在本公开的任何重组DNA构建体（包括抑制DNA构建体在内）中应用。该多肽优选为 CRW2多肽。
[0177] 一种具有如下的氨基酸序列的分离的多肽，该氨基酸序列基于ClustalW比对方 法，当与SEQIDNO:29、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49 或 50 比较 时，具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、 63 %,64 %,65 %,66 %,67 %,68 %,69 %,70 %,71 %,72 %,73 %,74 %,75 %,76 %,77 %, 78 %,79 %,80 %,81 %,82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %, 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。该多肽优选为〇^2多肽。
[0178] -种分离的多核苷酸或cDNA，其包含：（i)基于ClustalW比对方法，当与SEQID NO:28 比较时，具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、 61 %,62 %,63 %,64 %,65 %,66 %,67 %,68 %,69 %,70 %,71 %,72 %,73 %,74 %,75 %, 76 %,77 %,78 %,79 %,80 %,81 %,82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %, 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的核酸序列；或者 (ii) (i)的核酸序列的完全互补序列。任何前述的分离的多核苷酸或cDNA可在本公开的任 何重组DNA构建体（包括抑制构建体在内）中应用。该多肽优选为CRW2多肽。
[0179] 一种分离的多核苷酸或cDNA，其包含核苷酸序列，其中该核苷酸序列可在严格条 件下与包含SEQIDNO:28的完全互补序列的DNA分子杂交。该多肽优选为CRW2多肽。
[0180] 一种分离的多核苷酸或cDNA，其包含核苷酸序列，其中该核苷酸序列通过至少一 种选自缺失、置换、添加和插入的方法变更SEQIDNO:28的一个或更多个核苷酸而源自SEQ IDNO：28〇
[0181] 一种分离的多核苷酸或cDNA，其包含核苷酸序列，其中该核苷酸序列对应于SEQ IDNO:28的等位基因。
[0182] 具有提高的对昆虫害虫棺畲件的易感件的棺物及其制各方法。
[0183] 由于Crwl的内源表达降低而具有提高的对昆虫害虫植食性的易感性的植物可包 括Crwl基因的任何变体，如：（i)Crwl核酸序列（SEQIDNO:2)的一部分；（ii)能够与Crwl 核酸序列（SEQIDNO:2)杂交的核酸序列；（iii)Crwl核酸序列（SEQIDNO:2)的剪接变 体；（iv)Crwl核酸序列（SEQIDN0:2)的天然存在的等位基因变体；(V)通过基因改组获 得的Crwl核酸序列；(vi)通过定点诱变获得的Crwl核酸序列；(vii)通过TILLING方法获 得和鉴定的Crwl变体。
[0184] 类似地，由于Crw2的内源表达降低而具有提高的对昆虫害虫植食性的易感性的 植物可包括Crw2基因的任何变体，如：（i)Crw2核酸序列（SEQIDN0:28)的一部分；（ii) 能够与Crw2核酸序列（SEQIDN0:28)杂交的核酸序列；（iii)Crw2核酸序列（SEQIDNO: 28)的剪接变体；（iv)Crw2核酸序列（SEQIDN0:28)的天然存在的等位基因变体；（V)通 过基因改组获得的Crw2核酸序列；(vi)通过定点诱变获得的Crw2核酸序列；(vii)通过 TILLING方法获得和鉴定的Crw2变体。
[0185] 可通过如下方式在植物细胞中降低内源Crwl和/或Crw2表达的水平：反义构建 体、有义构建体、RNA沉默构建体、RNA干扰、人工微RNA以及基因组破坏如但不限于通过转 座子、TILLING和同源重组引起的破坏。
[0186] 在一个方面，可使用经修饰的植物miRNA前体，其中该前体已被修饰成用被设计 来产生导向靶基因（Crwl或者Crw2)的miRNA的序列替换miRNA编码区。该前体还在星号 链序列中被修饰以对应于该miRNA编码区中的变化。
[0187] 在另一个方面，通过基因改组获得可用于本公开的方法的Crwl和/或Crw2的核 酸变体。
[0188] 在另一个方面，还可使用TILLING(定向诱导基因组局部损害）技术，在玉蜀黍 Crwl或者Crw2基因的基因座中引入遗传修饰。
[0189] 在另一个方面，可使用定点诱变来产生Crwl和/或Crw2核酸的变体。有几种方 法可用来实现定点诱变；最常用的方法是基于PCR的方法（美国专利第7956240号）。
[0190] 在另一个方面，还可使用同源重组来使植物中的内源Crwl和/或Crw2的表达失 活或者降低。
[0191] 同源重组可用来通过特异性地革El向体内Crwl和/或Crw2基因来诱导定向基因修 饰。使用标准的技术，在体外作出基因的选定部分（包括5'上游区域、3'下游区域和基因 内区域）的突变（如本文中提供的那些）并引入到所需的植物中。弓丨入的突变基因和靶内 源基因之间的同源重组将导致转基因植物中的野生型基因的定向替换，从而导致基因表达 的抑制。
[0192] 在另一个方面，还可使用催化性RNA分子或核糖酶来抑制所关注的基因的表达 (Crwl或者Crw2)。可以设计实际上与任何靶RNA特异性配对并且在特定位置切割磷酸二 酯骨架，从而使靶RNA功能性失活的核糖酶。在进行这个切割时，核糖酶本身不发生变更， 因而能够循环使用并切割其他分子。在反义RNA内插入核糖酶序列赋予其RNA切割活性， 从而增加构建体的活性。已鉴定了许多类别的核糖酶。例如，有一类核糖酶源自多种能够 在植物中自我切割并复制的小环形RNA。所述RNA可单独复制（类病毒RNA)或者与辅助 病毒一起复制（卫星RNA)。RNA的例子包括来自鳄梨日斑类病毒的RNA以及来自烟草环斑 病毒、紫花苜蓿短暂条纹病毒、绒样烟草斑点病毒、茄属植物斑点病毒和地中海三叶草斑点 病毒的卫星RNA。靶RNA特异性核糖酶的设计和用途已被描述。参见例如Haseloff等人， (I988)，《自然》（Nature)，334 :585_591〇
[0193] 在另一个方面，可通过有义抑制来抑制表达，使所关注的基因（Crwl或者Crw2) 灭活。其中核酸被构造成相对于启动子处于有义方向的表达盒的引入，已被显示是阻断期 望的靶基因的转录的有效手段。（Napoli等人，（1990)，《植物细胞》（ThePlantCell)，2: 279-289 ;以及美国专利第5, 034, 323号、第5, 231，020号和第5, 283, 184号）。
[0194] 在另一个方面，Crwl和/或Crw2基因也可通过例如基于转座子的基因失活来进 行失活。
[0195] 在另一个方面，该失活步骤包括在所关注的基因（Crwl或者Crw2)中产生一个或 更多个突变，其中该基因序列中的该一个或更多个突变包含一个或更多个转座子插入，从 而与相应的对照植物相比灭活该基因。例如，该突变可包含该基因中的纯合破坏，或者该一 个或更多个突变包含该基因中的杂合破坏。
[0196] 这些可移动的遗传元件例如通过有性杂交传递到细胞，选择转座，并且对所得的 插入突变株进行例如所关注表型的筛选。可将包含破坏的Crwl和/或Crw2基因的植物与 野生型植物杂交。取决于要杂交的物种，可使用多种标准的育种技术中的任何一种。TN(转 座子）在分离的或者重组的植物的基因组内的位置可通过已知的方法确定，例如侧翼区的 测序，如本文所描述。例如，可使用来自植物的PCR反应来扩增该序列，然后可进行诊断性 测序以确认其来源。可选地，对插入突变株筛选所需的表型，如Crwl和/或Crw2的表达的 抑制或者提高的对昆虫害虫植食性的易感性。
[0197] 任何在本文中被鉴定为具有降低的Crwl和/或Crw2表达从而具有提高的对昆虫 害虫植食性的易感性的植物，都可在以下描述的方法中使用。
[0198] Crwl的表达的降低可赋予提高的对昆虫害虫植食性的易感性，其中该昆虫害 虫可为鞘翅目害虫。鞘翅目害虫的例子包括但不限于西部玉米根虫（WCR，Diabrotica virgiferavirgiferaLeConte)、北部玉米f艮虫(NCR,DiabroticabarberiSmith和 Lawrence)、墨西哥玉米根虫（MCR，DiabroticavirgtferazeaeKrysan和Smith)、南 部玉米根虫（SCR，Diabroticaundecimpunctatahowardi)、科罗拉多马铃薯甲虫（CPB， Leptinotarsadecemlineata)和日本金龟子（Popiffiajaponica)。玉米根虫特别值得关 注。
[0199] Crw2的表达的降低可赋予提高的对昆虫害虫植食性的易感性，其中该昆虫害虫可 为鞘翅目或者鳞翅目害虫。
[0200] 鞘翅目害虫的例子包括但不限于西部玉米根虫（WCR，Diabroticavirgifera virgiferaLeConte)、北部玉米根虫（NCR，DiabroticabarberiSmith和Lawrence)、 墨西哥玉米根虫（MCR，DiabroticavirgiferazeaeKrysan和Smith)、南部玉米根虫 (SCR，Diabroticaundecimpunctatahowardi)、科罗拉多马铃薯甲虫（CPB，Leptinotarsa decemlineata)和日本金龟子（Popiffiajaponica)。玉米根虫和日本金龟子特别值得关 注。
[0201] 鳞翅目害虫的例子包括但不限于欧洲玉米螟（ECB)(鳞翅目：草螟科）、西南部玉 米螟（SWCB)(鳞翅目：草螟科）、玉米穗虫（CEW)(鳞翅目：夜蛾科）、秋粘虫（FAW)(鳞翅目： 夜蛾科）、藜豆毛虫（VBC)(鳞翅目：夜蛾科）、大豆尺蠖（SBL)(鳞翅目：夜蛾科）、西部豆切 根虫（WBCW)(鳞翅目：夜蛾科）、黑地蚕（BCW)(鳞翅目：夜蛾科）、甘蔗螟虫（SCB)(鳞翅目： 草螟科）、秋结网毛虫（Hyphantriacunea)和香蒲毛虫（Simyrainsularis)。欧洲玉米螟 特别值得关注。
[0202] 诱虫作物及其用涂
[0203] Crwl和Crw2突变株对植食性的不寻常的易感性使得这种植物能够被用作"诱虫" 作物。诱虫作物可被定义为"吸引、转移、拦截和/或保留目标昆虫或者它们所携带的病原 体以便减少对主要作物的损害"的一片植物（plantstand) (Shelton和Badenes-Perez， 2006,《昆虫学年评》（Annu.Rev.Entomol.)，51 :285-308)。
[0204] 诱虫作物包括一种或更多种由于Crwl和/或Crw2的内源表达降低而具有提高的 对昆虫害虫植食性的易感性的植物。昆虫害虫可为鞘翅目或者鳞翅目害虫。昆虫害虫可为 玉米根虫、欧洲玉米螟