一种樱桃苗超低温脱毒处理方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及果树病毒防治技术领域，具体属于一种樱桃苗超低温脱毒处理方法。
【背景技术】
[0002]樱桃是我国当前调整果树种植结构、实现农民增收的首选树种。病毒病严重影响甜樱桃的产量和质量，已成为限制我国樱桃产业发展的主要障碍之一。李属坏死环斑病毒是发生最普遍、危害较严重的核果类果树病毒，可导致树体衰退、叶片黄化或坏死、花期推迟、果实成熟期推后或减产，严重时绝产。据调查，我国甜樱桃栽培区域内，PNRSV普遍发生，山东、辽宁、北京等地均检测到PNRSV感染。宗晓娟等对山东甜樱桃生产园病毒病RT-PCR鉴定显示，PNRSV带毒率为46.8%。
[0003]现有采用超低温处理技术，超低温技术是指在_80°C以下的超低温条件下保存植物种质的一整套生物技术。由于液氮温度可达_196°C，且经济方便，目前普遍用于植物的超低温保存。目前，超低温保存作为一种新的脱毒技术而备受人们关注，并已经在多种植物中得到证实。1997年，Brison等用超低温保存结合茎尖离体培养，成功去除了李属根状茎上的李痘病毒，脱毒率达到50%，比单纯的莖尖培养的脱毒率多了 2倍多。
[0004]但传统的茎尖培养及热处理结合茎尖培养脱毒效率极低。代红艳等证明甜樱桃试管苗微茎尖培养不能有效脱除PNRSV。(2)操作复杂，效率低下。传统茎尖培养要求剥取茎尖小于0.5mm，操作难度大，成苗效率低。
【发明内容】
[0005]针对上述问题，本发明的目的是提供了一种樱桃苗超低温脱毒处理方法，克服了现有技术的不足，玻璃化法超低温保存可脱除樱桃苗病毒，脱毒率为90.6 %。而常规的茎尖培养，脱毒率仅为63.5%。不仅脱毒率高，而且茎尖取材大、操作简单方便。
[0006]本发明采用的技术方案如下:
[0007]一种樱桃苗超低温脱毒处理方法，包括步骤如下:1)取苗采取压枝的方法来取得樱桃苗；
[0008]2)切下取得樱桃苗单芽长约Imm的茎尖；
[0009]3)红芽芋茎尖在附加固体培养基上预培养3d，组培苗于温度26?42°C、光强1000-20001x条件下培养30?35天;
[0010]4)预培养、装载:将步骤3)热处理后的组培苗在超净工作台剥取I?2mm的茎尖组织，将茎尖组织预培养3?5天，然后经室温装载20?30min ;
[0011]5)玻璃化:装载后的茎尖组织转至冷冻保护溶液PVS2中冰浴处理60?90min，
[0012]6)冷冻:玻璃化处理后的茎尖组织分装至冻存管中，将冷冻管迅速投入液氮中冷冻20?24h ；
[0013]7)冷冻后进行解冻，然后进行恢复处理1-2次，然后进行诱导成苗；
[0014]8)诱导成苗:恢复处理后的茎尖组织转至MS增苗培养基中先暗培养3?7天，再转入光照培养，成苗后继代培养，
[0015]9)病毒检测:采用RT-PCR检测待测苗，筛选出脱毒苗，对含有该病毒的植株，拨取茎尖做初代培养，继代扩繁4次以后，拨取1_左右的茎尖，利用玻璃化超低温液氮处理技术对SMYEV进行脱除，在病毒脱除过程中，装载处理为20°C，Ih ;玻璃化处理为0°C，2h ;液氮处理Ih后，进行45°C水浴2min。
[0016]所述的步骤4)将茎尖组织于添加0.2?0.3mol/L蔗糖浓度的液体培养基中预培养2天，将预培养后的茎尖组织在装载液中于室温下处理28?30min，所述的装载液为添加I?3mol/L的甘油和0.3?0.5mol/L蔗糖浓度的液体培养基。
[0017]所述的所述的步骤6)，冷冻步骤从(TC降到-30°C，-35°C或_40°C，每分钟降温15°C，随即浸入液氮，或者以此种速度连续降到_196°C。
[0018]所述的所述的步骤6)，冷冻步骤从(TC降到-30°C，-35°C或_40°C，每分钟降温15°C，之后恒温预冻I小时，然后浸入液氮，或者以此种速度连续降到_196°C。
[0019]与已有技术相比，本发明的有益效果如下:
[0020]本发明通过玻璃化法超低温保存可脱除樱桃苗病毒，脱毒率为90.6%，而常规的茎尖培养，脱毒率仅为63.5%。因此，采用本发明的玻璃化法超低温保存脱毒法对樱桃苗进行脱毒，不仅脱毒率高，而且茎尖取材大、操作简单方便；超低温冷冻和复苏过程简化，省时省力、效率高、脱毒彻底、成本低、对仪器设备要求不高。
【具体实施方式】
[0021]实施例1，一种樱桃苗超低温脱毒处理方法，包括步骤如下:1)取苗采取压枝的方法来取得樱桃苗；
[0022]2)切下取得樱桃苗单芽长约Imm的茎尖；
[0023]3)红芽芋茎尖在附加固体培养基上预培养3d，组培苗于温度26?42°C、光强1000-20001x条件下培养30?35天;
[0024]4)预培养、装载:将步骤3)热处理后的组培苗在超净工作台剥取I?2mm的茎尖组织，将茎尖组织预培养3?5天，然后经室温装载20?30min ;
[0025]5)玻璃化:装载后的茎尖组织转至冷冻保护溶液PVS2中冰浴处理60?90min，
[0026]6)冷冻:玻璃化处理后的茎尖组织分装至冻存管中，将冷冻管迅速投入液氮中冷冻20?24h ；
[0027]7)冷冻后进行解冻，然后进行恢复处理1-2次，然后进行诱导成苗；
[0028]8)诱导成苗:恢复处理后的茎尖组织转至MS增苗培养基中先暗培养3?7天，再转入光照培养，成苗后继代培养，
[0029]9)病毒检测:采用RT-PCR检测待测苗，筛选出脱毒苗，对含有该病毒的植株，拨取茎尖做初代培养，继代扩繁4次以后，拨取1_左右的茎尖，利用玻璃化超低温液氮处理技术对SMYEV进行脱除，在病毒脱除过程中，装载处理为20°C，Ih ;玻璃化处理为0°C，2h ;液氮处理Ih后，进行45°C水浴2min。
[0030]所述的步骤4)将茎尖组织于添加0.2?0.3mol/L蔗糖浓度的液体培养基中预培养2天，将预培养后的茎尖组织在装载液中于室温下处理28?30min，所述的装载液为添加I?3mol/L的甘油和0.3?0.5mol/L蔗糖浓度的液体培养基。
[0031]所述的所述的步骤6)，冷冻步骤从(TC降到-30°C，-35°C或_40°C，每分钟降温15°C，随即浸入液氮，或者以此种速度连续降到_196°C。
[0032]实施例2，其其它步骤相同，其中所述的步骤6)，冷冻步骤从0°C降到_30°C，_35°C或-40°C，每分钟降温15°C，之后恒温预冻I小时，然后浸入液氮，或者以此种速度连续降到-196。。。
[0033]通过玻璃化法超低温保存可脱除樱桃苗病毒，脱毒率为90.6%，而常规的茎尖培养，脱毒率仅为63.5%。因此，采用本发明的玻璃化法超低温保存脱毒法对樱桃苗进行脱毒，不仅脱毒率高，而且茎尖取材大、操作简单方便；超低温冷冻和复苏过程简化，省时省力、效率高、脱毒彻底、成本低、对仪器设备要求不高。
[0034]以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
【主权项】
1.一种樱桃苗超低温脱毒处理方法，其特征在于:包括步骤如下:1)取苗采取压枝的方法来取得樱桃苗； 2)切下取得樱桃苗单芽长约Imm的茎尖； 3)红芽芋茎尖在附加固体培养基上预培养3d，组培苗于温度26?42°C、光强1000-20001x条件下培养30?35天; 4)预培养、装载:将步骤3)热处理后的组培苗在超净工作台剥取I?2_的茎尖组织，将茎尖组织预培养3?5天，然后经室温装载20?30min ； 5)玻璃化:装载后的茎尖组织转至冷冻保护溶液PVS2中冰浴处理60?90min， 6)冷冻:玻璃化处理后的茎尖组织分装至冻存管中，将冷冻管迅速投入液氮中冷冻20 ?24h ； 7)冷冻后进行解冻，然后进行恢复处理1-2次，然后进行诱导成苗； 8)诱导成苗:恢复处理后的茎尖组织转至MS增苗培养基中先暗培养3?7天，再转入光照培养，成苗后继代培养， 9)病毒检测:采用RT-PCR检测待测苗，筛选出脱毒苗，对含有该病毒的植株，拨取茎尖做初代培养，继代扩繁4次以后，拨取1_左右的茎尖，利用玻璃化超低温液氮处理技术对SMYEV进行脱除，在病毒脱除过程中，装载处理为20°C，Ih ;玻璃化处理为0°C，2h ;液氮处理Ih后，进行45°C水浴2min。
2.根据权利要求1所述的樱桃苗超低温脱毒处理方法，其特征在于:所述的步骤4)将茎尖组织于添加0.2?0.3mol/L蔗糖浓度的液体培养基中预培养2天，将预培养后的茎尖组织在装载液中于室温下处理28?30min，所述的装载液为添加I?3mol/L的甘油和0.3?0.5mol/L蔗糖浓度的液体培养基。
3.根据权利要求1所述的樱桃苗超低温脱毒处理方法，其特征在于:所述的所述的步骤6)，冷冻步骤从0°C降到_30°C，_35°C或_40°C，每分钟降温15°C，随即浸入液氮，或者以此种速度连续降到-196 °C。
4.根据权利要求1所述的樱桃苗超低温脱毒处理方法，其特征在于:所述的所述的步骤6)，冷冻步骤从0°C降到_30°C，_35°C或-40°C，每分钟降温15°C，之后恒温预冻I小时，然后浸入液氮，或者以此种速度连续降到_196°C。
【专利摘要】本发明公开了一种樱桃苗超低温脱毒处理方法，包括步骤如下1)取苗采取压枝的方法来取得樱桃苗，2)切下取得樱桃苗单芽长约1mm的茎尖，3)红芽芋茎尖在附加固体培养基上预培养3d，组培苗于温度26～42℃、光强1000-2000lx条件下培养30～35天；4)预培养、装载，5)玻璃化，6)冷冻，7)冷冻后进行解冻，然后进行恢复处理1-2次，然后进行诱导成苗，8)诱导成苗：9)病毒检测本发明克服了现有技术的不足，玻璃化法超低温保存可脱除樱桃苗病毒，脱毒率为90.6％。而常规的茎尖培养，脱毒率仅为63.5％。不仅脱毒率高，而且茎尖取材大、操作简单方便。
【IPC分类】A01H4-00
【公开号】CN104823851
【申请号】CN201510229959
【发明人】訾庆顺
【申请人】凤阳金小岗农林科技产业发展有限公司
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2015年5月7日