示例性的可显现标记包括绿色荧 光蛋白（GFP)，β -葡糖醛酸糖苷酶（GUS)，荧光素酶（LUX)。可以通过用适当的光源照射推 定的转化体并且选择表现出荧光的转化体而可视性地进行选择。
[0073] 在一些实施方案中，所述选择标记可以是可去除的和/或可切除的选择标记（例 如，"清理基因"技术（"clean gene" technology))，例如，其可以侧翼连接LoxP位点，以 使在存在Cre重组酶的条件下，将其从宿主核酸序列中切除。本领域中还已知其他的重组 酶系统，例如，Flp-Frt。制备和使用可去除的和/或可切除的选择标记的方法在本领域中 是已知的，例如，参见 Day 和 Goldschmidt-Clermont. Plant Biotechnology (植物生物技 术）2011 9 :540-533 ;其通过引用完全结合在本文中。
[0074] 线性ptDNA分子的体内形式可以包括端粒（末端）结构。这种端粒结构可以由平 端、5'突出端或3'突出端构成。此外，末端可以具有结构修饰，包括可以形成或可以不形 成连接两条DNA链的共价键的单链环，或与5'端或3'端共价连接的分子，如蛋白、肽、或 氨基酸。修饰线性DNA载体以使其具有与体内ptDNA相似的端粒结构可以提高质体转化效 率。
[0075] 所述线性DNA载体还可以在Y端、3'端或Y端和:V端两端具有单链突出端。 备选地，所述线性DNA载体在Y端或:V端不包含任何单链突出端。
[0076] 在一些实施方案中，所述线性DNA载体可以具有单链环，所述单链环可以或可以 不共价连接所述线性DNA载体的两条DNA链。
[0077] 在一些其他的实施方案中，所述线性DNA可以具有与Y端或:V端共价连接的不 是核苷酸的分子（例如，蛋白、肽或氨基酸）。
[0078] 可以向其中引入包含目的转基因的线性DNA载体的质体包括包含基本上不降解 的质体DNA的任意质体。示例性的质体包括黄化质体，前质体，色质体，白色体，造粉体，油 质体，和叶绿体，它们包含基本上不降解的质体DNA。质体的类型和鉴定它们的方法在本领 域中是已知的；例如，参见 Wise. Advances in Photosynthesis and Respiration(光合作 用和呼吸作用进展）2006 23 :3-26 ;其通过引用完全结合在本文中。在一些实施方案中，所 述质体是非绿色质体，例如，其不是叶绿体。
[0079] 分开质体中存在的基因组DNA序列的完整的一套序列称为"单位基因组"。在任意 给定的质体中可能存在多个拷贝的单位基因组。在一些实施方案中，在同一核酸分子内可 能存在单位基因组的任意给定部分的多个拷贝，多至包含完整的单位基因组。因此，质体中 给定的不降解的核酸分子的长度可以是X bp，2x bp，3x bp等。长度为X bp的核酸分子可 以称为"单位基因组尺寸的"，而"多基因组尺寸的"分子长度可以是2x bp，3x bp，4x bp， 5x bp等。质体的发育和/或暴露于光可以诱导所述质体DNA的降解，以使给定的核酸分子 长度为yx bp，其中y不是整数。在一些实施方案中，如果多于25%的质体DNA是单位基因 组和多基因组尺寸的，则所述质体包含基本上不降解的质体DNA。在某些实施方案中，多于 30% -90%，如多于 30%，35%，40%，45%，50%，55%，60%，70%，80 %或 90 % 的质体 DNA 是单位基因组和多基因组尺寸的。在一些实施方案中，包含基本上不降解的质体DNA的质 体可以是非绿色组织包含的质体。用在本文中时，"非绿色"细胞或组织是包含少于20% (例如，20%以下，10%以下，5%以下，2%以下或1%以下）的在绿色的光合作用细胞或组 织（例如，绿叶）中存在的叶绿体和/或叶绿素的细胞或组织。
[0080] 包含基本上不降解的质体DNA的任意组织可以用于质体转化。所述组织包括非绿 色组织，如暗处生长的幼苗的茎杆和叶，不成熟的和成熟的胚，种子，暗处生长的胚形成的 愈伤组织，原生质体，根，块茎，以及它们的部分。成熟的胚是由一个或两个子叶、胚根和下 胚轴组成的充分发育的种子的部分。不成熟的胚是发育中的种子（典型地在传粉后11-14 天收获的种子）的部分。
[0081] 使用非绿色组织，特别是来自谷物的那些，用于质体转化比使用绿色组织有利。不 希望受到理论限制，本发明人假设之前尝试转化谷物中的质体的失败至少部分是由于某些 绿色质体（例如，玉蜀黍绿色质体）中的DNA是高度降解的。本发明人进一步假设，之前 的失败还可能由包含绿色质体的细胞已经由其分生细胞中的前体分化并且不能将质体DNA 传到其后代细胞中的事实导致。因此，在某些实施方案中，进行质体转化的组织是非分化状 态的非绿色组织。在一些实施方案中，组织中的大部分质体是前质体，例如，至少50%的质 体是前质体，至少60%的质体是前质体，至少70%的质体是前质体，至少80%的质体是前 质体，或至少90%的质体是前质体。
[0082] 适合用本文公开的方法进行质体转化的植物包括双子叶植物和单子叶植物。在 一些实施方案中，所述植物是农作物植物（例如，培育的植物，包括种植主要用于人类消耗 的农作物，如谷物农作物）、蔬菜、水果、种子农作物和产油植物。谷物农作物是由于其谷 粒的可食用成分而培育的禾本科植物（单子叶禾本科（Poaceae)成员），其谷粒由胚乳、 胚原基和麸组成。适于质体转化的谷物农作物包括玉蜀黍（maize)，小麦（wheat)，水稻 (rice)，大麦（barley)，高粱（sorghum)，粟（millet)，燕麦（oats)，黑小麦（triticale)， 裸麦（rye)，乔麦（buckwheat)，fonio,和（谷粒样）奎奴亚藜（quinoa)。适于质体 转化的另外的示例性植物包括烟草（tobacco)，萬苣（lettuce)，棉花（cotton)，大豆 (soybean)，番前（tomato)，和拟南芥（Arabidopsis)。考虑另外的植物和/或农作物适 合按照本文所述的方法和组合物进行质体转化。这些另外的植物和/或农作物可以包 括，但不限于：被子植物和裸子植物，如金合欢属（acacia)，紫花苜蓿（alfalfa)，苹果属 (apple)，杏树（apricot)，洋蓟（artichoke)，灰树（ash tree)，天门冬属（asparagus)， 鳄梨（avocado)，色蕉属（banana)，豆类（beans)，甜菜（beet)，桦树（birch)，山毛榉 (beech)，黑霉（blackberry)，蓝霉（blueberry)，花挪菜（broccoli)，球芽甘蓝（brussels sprouts)，卷心菜（cabbage)，芸苔（canola)，香瓜（cantaloupe)，胡萝卜（carrot)，木 薯（cassava)，花挪菜（cauliflower)，序菜（celery)，栗树（chestnut)，楼桃（cherry)， 大白菜（Chinese cabbage)，柑桔属（citrus)，克莱门氏小柑橘（Clementine)，苜蓿 (clover)，咖啡树（coffee)，玉米（corn)，棉花（cotton)，5工豆（cowpea)，黄瓜（cucumber)， 前子（eggplant)，榆树（elm)，菊苣（endive)，桉树（eucalyptus)，茴香（fennel)，无花 果（figs)，冷杉（fir)，老鹤草属（geranium)，葡萄（grape)，葡萄柚（grapefruit)，野 (groundnuts)，酸衆属植物（ground cherry)，山核桃（hickory)，羽衣甘蓝（kale)，奇异 果（kiwifruit)，35i (kohlrabi)，落叶松属植物（larch)，韭葱（Ieek)，梓檬（lemon)， 酸橙（lime)，洋槐（locust)，铁线蕨（maidenhair)，芒果（mango)，楓树（maple)，甜瓜 (melon)，蘑葫（mushroom)，芥菜（mustard)，油桃（nectarine)，坚果类（nuts)，橡树（oak)， 秋葵（okra)，洋葱（onion)，柑桔（orange)，观赏植物或花或树，木瓜树（papaya)，棕榈 (palm)，欧序（parsley)，欧洲防风草（parsnip)，豌豆（pea)，桃树（peach)，花生（peanut)， 梨树（pear)，peat，胡椒属植物（pepper)，柿树（persimmon)，木豆（pigeon pea)，菠萝 (pineapple)，车前草（plantain)，李属植物（plum)，石植（pomegranate)，白杨（poplar)， 马铃薯（potato)，南瓜（pumpkin)，榲梓（quince)，菊苣（radicchio)，萝卜（radish)，油菜 籽（rapeseed)，悬钩子（raspberry)，柳树（sal low)，菠菜（spinach)，南瓜小果（squash)， 草莓（strawberry)，糖萝卜（sugarbeet)，甘鹿（sugarcane)，向日葵（sunflower)，甘薯 (sweet potato)，甜玉米（sweet corn)，红橘（tangerine)，茶树（tea)，树木（trees)， 冷季型草坪草（turf grasses)，宪菁（turnips)，藤本植物（vine)，胡桃（walnut)，水田 芥（watercress)，西瓜（watermelon)，山药（yams)，紫杉（yew)，西萌芦（zucchini)，雪 松（cedar)，柏树（cypress)，松树（pine)，美洲杉（sequoia)，云杉（spruce)，培养的苔 类植物和相关的苔藓类植物的细胞，以及培养的藻类。所述植物可以来自选自由下述组 成的组的属：葱属（AlIium)，金鱼草属（Antirrhinum)，天门冬属（Asparagus)，颠前属 (Atropa)，燕麦属（Avena)，甜菜属（Beta)，芸苔属（Brassica)，雀麦属（Bromus)，布洛 华丽前属（Browailia)，辣椒属（Capsicum)，藜属（Chenopodium)，菊苣属（Cichorium)， 柑桔属（Citrus)，香瓜属（Cucumis)，南瓜属（Cucurbita)，曼陀罗属（Datura)，胡萝卜 属（Daucus)，菊属（Dendranthema)，毛地黄属（Digitalis)，草莓属（Fragaria)，老鹤 草属（Geranium)，大豆属（Glycine)，棉属（Gossypium)，向日葵属（Helianthus)，萱草 属（Hemerocallis)，大麦属（Hordeum)，天仙子属（Hyoscyamus)，核桃属（Juglans)，伽 蓝菜属（Kalanchoe)，萬苣属（Lactuca)，亚麻属（Linum)，黑麦草属（Lolium)，百脉根属 (Lotus)，苹果属（Malus)，木薯属（Manihot)，苜蓿属（Medicago)，烟草属（Nicotiana)，驴 食豆属（Onobrychis)，稻属（Oryza)，稷属（Panicum)，天竺葵属（Pelargonium)，狼尾草 属（Pennisetum)，碧冬前属（Petunia)，牵牛属（Pharbitis)，菜豆属（Phaseolus)，豌豆属 (Pisum)，杨属（Populus)，毛茛属（Ranunculus)，萝卜属（Raphanus)，蔷薇属（Rosa)，蛾蝶 花（Salpiglossis)，黑麦属（Secale)，千里光属（Senecio)，Sinapus，前属（Solanum)，车 轴草属（Trifolium)，胡卢巴属（Trigonella)，小麦属（Triticum)，5工豆属（Vigna)，葡萄属 (Vitis)，玉蜀黍属（Zea)，云杉属（Picea)，松属（Pinus)，和黄杉属（Pseudotsuga)。
[0083] 向植物组织的质体中引入线性DNA载体可以通过本领域已知的任何技术进行。示 例性的技术包括电穿孔、粒子枪转化、聚乙二醇转化和晶须（whiskers)技术（参见美国申 请公布号2010/0218277 ;其通过引用完全结合在本文中）。在优选的实施方案中，通过用包 被有线性DNA载体的微粒生物弹道轰击植物组织而将所述线性DNA载体引入到植物组织的 质体中。
[0084] 质体转化后，具有引入到其质体中的转基因（例如，具有整合到其质体DNA中的转 基因）的细胞可以通过本领域已知的多种技术进行检测，所述技术诸如杂交，电泳，测序和 /或PCR。在某些实施方案中，具有引入到其质体中的转基因的细胞可以通过选择标记进行 选择，所述选择标记的基因与所述转基因一起也被引入。例如，如果aadA与转基因一起引 入，可以用链霉素或壮观霉素筛选含有aadA与转基因的细胞。在实施例中提供了某些用于 检测含有结合到其质体DNA中的转基因的细胞的示例性的方法。
[0085] 在某些实施方案中，质体转化处理后（例如，用线性DNA载体包被的生物弹道轰 击），将处理的植物组织进一步避光和/或不经受任何选择剂（例如，链霉素或壮观霉素） 培养3-21天。延迟将组织暴露于选择压力防止选择剂杀死多个或大部分潜在可转化的细 胞，并且增加转化率。使用非绿色组织并且延迟将其暴露于光（某些选择剂，如链霉素或壮 观霉素的选择需要光）还防止某些质体DNA (例如，玉蜀黍质体DNA)在暴露于光时快速降 解。
[0086] 在相关的方面中，本公开内容通过通过本文提供的方法得到的转质体植物或植物 组织。"转质体"植物或植物组织是指具有引入到至少其部分质体中的异源基因（例如，转 基因）的植物或植物组织。在优选的实施方案中，所述转质体植物或植物组织是同质的。 "同质的"转质体植物或植物组织仅包含携带掺入的转基因作为其DNA的一部分的质体，并 且不含有其DNA不携带转基因的质体（即，其DNA仅包含野生型质体DNA的质体）。
[0087] 由于植物细胞包含大量拷贝数的制剂基因组，因此，有效的选择标记和选择方案 对于选择同质的转化体是重要的。可以使用本领域已知的选择策略。所述策略的实例包括 使用选择标记，诸如使用用于壮观霉素/链霉素抗生素抗性的aadA(Svab等.，Proc Natl Acad Sci USA(美国国家科学院学报）87 :8526-30,1990 ;Verma Maliga 和 Bock，Plant Physiol (植物生理学）155 :1501-10, 2011)，用于除草剂抗性的 bar (White 等，Nucleic Acids Res(核酸研宄）18:1062，1989;Nakamura 等，Biosci Biotechnol Biochem(生物 科学生物技术生物化学）74 :1315-9, 2010)，和/或用于代谢选择的pmi (Wright等，Plant Cell R印（植物细胞报告）20 :429-36,2001)。在这一阶段，如果选择标记（例如，基于aadA 或bar基因的那些）需要，可以将转化体从暗处转移到有光处。
[0088] 在其质体中包含目的转基因的转化体可以用于再生转质体植物。可以使用本领域 已知的用于再生转基因或转质体植物的任意方法。示例性的方法包括用体细胞胚胎发生 (somatic embrogenesis)和幼