方面，本发明番茄植物的果实从破色期进入红熟期需要更多的天数，例如， 本发明植物的果实从破色期进入红熟期需要的天数比野生型Acs2/A CS2对照多1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12、13 或 14 或更多天。
[0127] 在另一方面，本发明涉及本发明植物的果实，所述果实具有的贮藏期与野生型 Acs2等位基因纯和型的番茄果实的贮藏期相比长至少2天。在另一方面，本发明涉及具有 降低的乙烯产生的本发明植物的果实，所述降低的乙烯产生是与野生型Acs2等位基因纯 和型的番茄相比降低至少10%或降低至少15%或降低至少20%。在另一方面，本发明涉及 具有降低的乙烯产生的本发明植物的果实，当在粉红期或红熟期测量时，所述降低的乙烯 产生是与野生型Acs2等位基因纯和型的番茄相比降低至少10%或降低至少15%或降低至 少 20%。
[0128] 在一个具体的方面，本发明的番茄植株具有与野生型植物的贮藏期相比显著更长 的贮藏期，例如，当在相同的条件下种植植物且用相同方式处理果实并在相同条件下保存 果实时，从第一果实处于破色期（或转色期、粉红期、红熟期或从收获时起）直到其开始变 '坏'并不适合出售或食用的天数与对照植物（例如野生型Acs2/A CS2植物）的果实相比显 著更长，例如，长至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多天。
[0129] 延迟的成熟和/或延长的贮藏期可以具有这样的优势，即有更多的时间可以用于 将采摘的果实运输至例如零售商和超市，和/或消费者可以将果实保存更长的时间。可以 在绿熟期或破色期或其后收获番茄。在破色期之前收获时，需要乙烯暴露，而在破色期附近 或其后收获则不需要乙烯接触，这是由于果实自身产生乙烯。如图2中所示，本发明的成熟 延迟的突变体在粉红期和红熟期与野生型果实相比产生更少的乙烯，但是产生的乙烯足以 使其成熟到红熟期。在本发明的一个方面，提供了含有编码功能丧失的acs2蛋白或功能 降低的acs2蛋白的突变acs2等位基因的番茄植物，其中所述植物的果实与野生型（Acs2/ Acs2)植物相比产生明显更少的乙烯。"明显更少的乙烯"是指在粉红期或红熟期所述果实 产生的乙烯等于或少于纯合型Acs2/ACS2果实所产生的乙烯的75%、等于或少于70%、等 于或少于65%、等于或少于60%、等于或少于55%、等于或少于50%、等于或少于45%、等 于或少于40%、等于或少于35%、等于或少于30%、等于或少于25%、等于或少于20%、或 者等于或少于15%。因此，在一方面，在粉红期产生的乙烯低于约3.5ηV (h · g)，例如等 于或低于约3nl/(h · g)、或等于或低于约2. 5nl/(h · g)、或等于或低于约2. 0nl/(h · g)、 或等于或低于约I. 5nl/(h · g)、或等于或低于约I. 0nl/(h · g)、或等于或低于约0. 5nl/ (h · g)。在一方面，在红熟期产生的乙稀低于约6nl/(h · g)，例如等于或低于约5. 5nl/ (h · g)、或等于或低于约5. 0nl/(h · g)、或等于或低于约4. 5nl/(h · g)、或等于或低于约 3. 5nl/(h · g)、或等于或低于约3nl/(h · g)、或等于或低于约2. 5nl/(h · g)、或等于或低于 约2. Onl/ (h · g)、或等于或低于约I. 5nl/ (h · g)、或等于或低于约1.0 nl/ (h · g)、或等于或 低于约 0. 5nl/ (h · g)。
[0130] 在另一方面，本发明涉及具有由至少一个acs2等位基因中的非转基因突变引起 的更长的成熟期和/或增加的收获后贮藏期的本发明植物的番茄果实，其中所述更长的成 熟期和/或更长的收获后贮藏期为野生型Acs2等位基因纯合型的番茄果实的成熟期和/ 或收获后贮藏期的至少110%。优选地，所述成熟期和/或收获后贮藏期为野生型Acs2等 位基因纯合型的番茄果实的成熟期和/或收获后贮藏期的至少115%，更优选至少120%， 甚至更优选至少125%。在另一方面，所述成熟期和/或收获后贮藏期为野生型Acs2等位 基因纯合型的番茄果实的成熟期和/或收获后贮藏期的至少135%，更优选至少150%，甚 至更优选至少165%。在另一方面，所述成熟期和/或收获后贮藏期为野生型Acs2等位基 因纯合型的番茄果实的成熟期和/或收获后贮藏期的至少180 %，更优选至少200 %，甚至 更优选至少250%。
[0131] 另一方面，本发明涉及包含编码突变acs2蛋白的acs2等位基因的番前植物，所述 等位基因是来源自或可来源自，或者获得自或可获得自本发明的植物，所述植物的代表性 种子已经以登录号 NCMB 42032、NCMB 42033、NCMB 42035、NCMB 42036、NCMB 42040、 NCMB42042 或 NCMB42043 被保藏。
[0132] 在本发明的另一方面，提供了具有与本发明番茄植物相同或相似的延迟的成熟 和/或增加的IC藏期的番前植物，所述番前植物的代表性种子由Nunhems B. V.保藏并根 据布达佩斯条约按照Expert Solution(EPC2000, Rule 32(1))于2012年8月21日被接 受保藏在NCMB Ltd.(英国苏格兰，阿伯丁郡AB21 9YA，巴克斯本，克莱伯斯通区，弗格森 大厦(Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn Aberdeen, Scotland AB21 9 YA，UK))。种子被给予以下保藏号：NCMB 42032(突变体783)、NCMB 42033(突变体2145)、 NCMB 42035 (突变体 2714)、NCMB 42036 (突变体 3793)、NCMB 42040 (突变体 4946)、 NCMB 42042(突变体 7871)或 NCMB 42043(突变体 8185)。
[0133] 根据另一方面，本发明提供了本发明的番茄植物的细胞培养物或组织培养物。所 述细胞培养物或组织培养物包含可再生细胞。这类细胞可从叶、花粉、胚胎、子叶、下胚轴、 分生细胞、根、根尖部、花药、花、种子和茎中获得。
[0134] 还提供了可用于生长出本发明植物的种子，以及含有这类种子的包装物 (package)或容器。本发明的植物的无性繁殖物也是本文涵盖的一个方面。同样的，涵盖了 用于新鲜食用的或用于加工的或以经加工形式的收获的果实和果实的部分。可以将果实分 级、按大小分类和/或进行包装。可以将果实切成片状或切成块状或进一步加工。
[0135] 在另一方面，本发明涉及本发明植物的一个或多个细胞。
[0136] 本发明还涉及包含本发明番茄植物的果实或果实的部分或者由本发明番茄植物 的果实或果实的部分组成的食品和/或食品产品。本文使用的食品指被人或动物物种食用 的营养物质。实例是三明治、色拉、调味酱（sauce)、番茄酱等。
[0137] 产生本发明番茄植物的方法，其包括以下步骤：
[0138] a.从番茄植物中获得植物材料；
[0139] b.用诱变剂处理所述植物材料以产生诱变的植物材料；
[0140] c.分析所述诱变的植物材料以鉴定在至少一个和SEQ ID NO: 1或其功能性变体具 有基本序列同一性的acs2等位基因上具有至少一个突变的植物。
[0141] 所述方法还可以包括对所选择的植物或所述植物的后代的番茄果实的成熟期和/ 或贮藏期进行分析，并选择其果实具有延迟的成熟和/或延长的贮藏期的植物。
[0142] 在一方面，所述突变选自导致选自以下氨基酸置换的突变：SEQ ID NO: 1或其部分 的A101T、A101V、A103T、Gl 12R、Pl 18L、V147E和C265Y。在另一方面，所述突变选自导致以 下的 cDNA 改变的突变：SEQ ID N0:9 的 G307A、G334A、C353T、C302T、G301A、G794A*T440A。 在本方法中，步骤a)的植物材料优选地选自番茄植物株系或栽培种的种子、花粉、植物细 胞或植物组织。更优选植物种子。在另一方面，本方法使用的诱变剂是甲基磺酸乙酯。在 步骤b)和步骤c)中，所述诱变的植物材料优选地是突变群体，例如番茄TILLING群体。
[0143] 因此，在一方面，提供了用于产生具有延迟的果实成熟和/或更长的果实贮藏期 的番茄植物的方法，所述方法包括以下步骤：
[0144] a)提供番茄 TILLING 群，
[0145] b)筛选所述TILLING群的acs2基因上的突变体，和
[0146] c)从b)的突变植物中选择出其果实与野生型（Acs2/ACS2)果实相比具有降低的 乙烯产生和/或延迟的成熟和/或更长的贮藏期的那些植物（或那些植物的后代）。
[0147] 优选地将突变植物（Ml)自交一次或多次以产生用于表型分析的例如M2群或优选 M3或M4群。在M2群中，所述突变等位基因以1(突变等位基因纯合型）：2(突变等位基因 杂合型）：1(野生型等位基因纯合型）的比例存在。
[0148] 在另一方面，本发明涉及用于产生杂交番茄植物的方法，所述方法包括：
[0149] (a)获得本发明的第一番茄植物或可由其生长出本发明的植物的
[0150] 种子；以及
[0151] (b)用第二番茄植物与所述第一番茄植物杂交以获得杂交种子；
[0152] 其中所述杂交番茄植物包含具有一个或多个突变的acs2等位基因，其中所述突 变导致产生具有一个或多个氨基酸改变的突变acs2蛋白，所述氨基酸改变选自SEQ ID N0:1 或其变体的 A101T、A101V、A103T、G112R、P118L、V147E 和 C265Y。
[0153] 本发明的植物和植物部分（例如果实、细胞等）可以是所述突变acs2等位基因纯 合型或杂合型的。
[0154] 优选地，包含一个或多个突变acs2等位基因并且产生与野生型Acs2蛋白相比 acs2蛋白功能丧失或活性降低的突变acs2蛋白的本发明植物不会产生与野生型植物相比 更少的果实。因此，优选地，每个植株的果实数目不减少。
[0155] 可通过计算机（in silico)来鉴定其他推定的ACS2基因/蛋白质，例如通过在已 有的核酸或蛋白质数据库（例如GENBANK、SWISSPROT、TrEMBL)中使用标准的序列分析软 件（例如序列相似性搜索工具（BLASTN、BLASTP、BLASTX、TBLAST、FASTA等））来鉴定核酸 或蛋白质序列。
[0156] 在一个实施方案中，提供了 acs2蛋白功能丧失或功能降低的突变Acs2蛋白（包 括变体或直系同源物，例如野生番茄近缘种的acs2蛋白）以及在其基因组中含有一个或多 个acs2等位基因的植物或植物部分，所述acs2等位基因编码acs2蛋白功能丧失或功能降 低的突变体，由此所述降低的功能赋予了与野生型Acs2等位基因纯合型的番茄相比降低 的乙烯产生和/或更慢的果实成熟和/或更长的贮藏期。
[0157] 任何类型的突变都可能导致所编码Acs2蛋白的功能降低，例如在包含所述 cDNA(SEQ ID N0:9或其变体）的所述基因组DNA中一个或多个核苷酸的插入、缺失和/或 置换。在一个优选的实施方案中，提供了由于一个或多个突变而编码功能丧失的acs2蛋白 或功能降低的acs2蛋白的acs2核酸序列，与野生型Acs2等位基因纯合型的番茄相比，所 述acs2蛋白导致减少的乙烯产生和/或赋予更慢的果实成熟和/或更长的贮藏期。
[0158] 如本文所描述，可以通过确定该突变等位基因对乙烯产生和/或成熟期和/或贮 藏期的影响来检测这类蛋白在体内的acs2蛋白功能丧失或功能降低。如本领域已知的，可 以例如使用例如诱变来产生并通过TILLING来鉴定或使用EcoTILLING来鉴定这样的植物， 即其包含编码此类突变的功能丧失的acs2蛋白或功能降低的蛋白的核酸序列并且具有与 野生型Acs2等位基因纯合型的番茄相比降低的乙烯产生和/或更慢的果实成熟和/或更 长的贮藏期。还可以使用转基因方法来检测编码突变acs2蛋白的突变acs2等位基因的体 内功能性。可以将突变等位基因与植物启动子可操作地连接，并可以通过转化将所得嵌合 基因引入番茄植物中。可以检测再生植物（或后代，例如通过自交获得的后代）的乙烯产 生和/或果实成熟期和/或贮藏期。例如可以转化包含无功能的acs2等位基因的番茄植 物以检测所述转基因 acs2等位基因的功能性。
[0159] TILLING(定向诱导基因组局部损伤）是一种常用的反向遗传技术，该技术使用常 规的化学诱变方法产生诱变个体文库，然后对所述诱变个体文库进行高通量筛选以发现突 变。TILLING将化学诱变与对混合的PCR产物的突变筛选相结合，导致对靶基因的错义和无 义突变等位基因的分离。因此，TILLING使用常规的化学诱变（例如EMS或MNU诱变）或 其他诱变方法（例如辐射，如UV)，随后高通量筛选特定靶基因（例如本发明Acs2)中的突 变。使用Sl核酸酶（例如CELl或END01)切割突变体和野生型靶DNA的异源双链体并使 用例如电泳（如LI-COR凝胶分析仪系统）检测切割产物，参见例如Henikoff et al. Plant Physiology 2004,135:630-636。TILLING已经应用于很多植物物种，例如番茄（参见 http://tilling, ucdavis. edu/index. php/Tomato Tilling)、稻(Till et al. 2007, BMC Plant Biol 7:19)、拟南芥（Till et al. 2006, Methods Mol Biol 323:127-35)、芸苔、玉米 (Till et al. 2004, BMC Plant Biol 4:12)等。EcoTILLING也被广泛使用，由此检测天然群 中的突变体，参见 Till et al. 2006 (Nat Protoc 1:2465-77)和 Comai et al. 2004 (Plant J 37:778-86)。
[0160] 在本发明的一个实施方案中，编码所述突变acs2蛋白的（cDNA或基因组）核酸 序列包含一个或多个无义和/或错义突变，例如转换（将嘌呤置换为另一嘌呤（A o G) 或将嘧啶置换为另一嘧啶（CeT))或颠换（将嘌呤置换为嘧啶，或反之亦然 (C/T 〇 A/G ))。在一个实施方案中，所述一个或多个无义和/或错义突变位于编码 任意Acs2外显子的核苷酸序列中，或位于Acs2蛋白变体的基本相似的结构域中，即位于和 SEQ ID N0:1的氨基酸或其变体具有至少80%、90%、95%、98%、99%的氨基酸序列同一性 的结构域中。
[0161] 在一个实施方案中，提供了在一个外显子编码序列中含有一个或多个无义和/或 错义突变的acs2核苷酸序列，以及含有这种导致与野生型Acs2等位基因纯合型的番茄相 比降低的乙烯产生和/或延迟的果实成熟和/或更长的贮藏期的突变等位基因的植物。
[0162] 在本发明的一个具体的实施方案中，提供了含有功能丧失或功能降低的突变acs2 等位基因的番茄植物和植物部分（果实、种子等）。
[0163] 还提供了编码功能丧失的acs2蛋白或功能降低的acs2蛋白的核酸序列（基因组 DNA、cDNA、RNA)，例如所述 acs2 蛋白是 SEQ ID N0:2、3、4、5、6、7 或 8 中描述的 acs2;或上 文所定义的其变体（包括任何嵌合或杂合蛋白或突变蛋白或截短蛋白）。由于遗传密码的 简并性，不同的核酸序列可编码相同的氨基酸序列。所提供的核酸序列包括天然存在的、人 工或合成的核酸序列。在SEQ ID N0:9(野生型cDNA)中提供了编码Acs2的核酸序列，NCBI 参考序歹Li :NM_〇〇1247249. lhttp: //www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/NM 001247249〇
[0164] 应当理解，当序列以DNA序列描述并同时提及RNA时，所述RNA分子的实际碱基序 列是相同的，差异在于胸腺嘧啶（T)被尿嘧啶（U)替换。当本文中提到核苷酸序列（例如 DNA或RNA)时，使用斜体，例如acs2等位基因，而当提到蛋白时不使用斜体，例如acs2蛋 白。突变体用小写字母（例如acs2等位基因或acs2蛋白），而野生型/功能性的形式以大 写字母开头（Acs2等位基因或Acs2蛋白）。
[0165] 还提供了编码突变acs2蛋白（即如上文所述的功能丧失的acs2蛋白或功能降低 的acs2蛋白）的核酸序列（基因组DNA、cDNA、RNA)，以及含有所述突变序列的植物和植物 部分。例如，在野生型Acs2编码序列上含有一个或多个无义和/或错义突变的acs2核酸 序列，使得所编码的蛋白质在体内功能丧失或功能降低。还提供了具有其他突变的序列，例 如剪接位点突变（即导致前mRNA异常剪接的基因组acs2序列上的突变）、和/或移码突 变、和/或一个或多个核酸的插入（例如转座子插入）和/或缺失。
[0166] 显然，可以使用很多方法（例如核酸杂交、PCR技术、计算机分析和核酸合成等）来 鉴定、合成或分离acs2核酸序列的变体或片段。SEQ ID N0:9的变体既可以编码野生型、功 能性Acs2蛋白，也可以编码所述蛋白的任一种的acs2蛋白功能丧失或功能降低的突变等 位基因（例如通过例如诱变产生的和/或通过例如TILLING或EcoTILLING的方法或其他 方法鉴定的）。
[0167] 可将本发明的植物用于传统的植物育种方案中以产生更多的具有相同特征的植 物，或者用于将所述突变acs2等位基因引入到相同或相近植物物种的其他植物株系或品 种中。
[0168] 还可以通过本领域中已知的植物转化和再生技术使用本发明的突变acs2核苷酸 序列来产生转基因植物。可以选择"良种事件（elite event)"，其为将所述嵌合基因（包 含与编码功能丧失的acs2蛋白或功能降低的acs2蛋白的核苷酸序列可操作地连接的启动 子）插入到基因组中的特定位点并且所述插入导致所需表型的良好表达的转化事件。
[0169] 如上文所述的本发明植物是突变acs2等位基因纯合型或杂合型的。为产生含有 纯合形式的突变等位基因的植物，可以使用自交。可以通过传统的育种技术（例如杂交、自 交、回交等）将本发明的突变acs2等位基因转移到任何其他番茄植物中。因此，可以产生 任何类型的由于存在至少一个本发明的突变acs2等位基因而具有延迟的成熟和/或更长 的贮藏期的番茄。可以产生和/或鉴定在其基因组中含有至少一个突变acs2等位基因并 产生与野生型Acs2蛋白相比具有acs2蛋白功能丧失或活性降低的acs2蛋白的任何番前。 因此，所述番茄植物可以是任何栽培的番茄、任何商业品种、任何育种系或其它，其可以是 确定或不确定的、自由授粉或杂交的，可以产生具有任何颜色、形状和大小的果实。可以通 过育种（与含有突变等位基因