活细胞的冷冻保存的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及冷冻保存（低温保存（冷冻保存，cryopreservation))细胞，特别是 包括藻类的植物细胞、（植物）细胞器以及（植物）组织的领域。
【背景技术】
[0002] 植物细胞和组织培养是在基础和应用研究中广泛使用的重要工具。它们允许高通 量研究，如基因功能和调节、代谢分析或生物农药（生物杀虫剂）开发。它们还是引人注目 且功能强大的在生物反应器中产生精细化学品的生物机制。尤其是，植物细胞培养在产生 适当糖基化和折叠的药物活性蛋白（如免疫球蛋白、白细胞介素）方面令人感兴趣。它们 本质上安全，这与哺乳动物或微生物生产平台相反，因为它们不是宿主人病原体，也不产生 内毒素。然而，在涉及植物生物学的各实验室中维持多种野生型和转基因细胞系不仅费力 费钱，而且还会产生微生物污染、不期望的遗传改变（例如，染色体变化，包括倍性变化、表 观遗传不稳定性（epigeneticinstability))以及最终培养物损失的风险。
[0003] 实际上，大多数的动物和陆生植物使用不同的机制以增强它们在极端环境条件下 的存活。例如，为了适应其生长和发育，植物可以感觉小温度变化（1°C)。此外，生长在温带 (temperate)和冷气候区中的大多数植物在其生命周期期间倾向于严寒（冰冻，freezing) 温度。在这些环境条件下，导致细胞死亡的主要原因与细胞脱水和由胞外冰形成引发的机 械应力连同包围细胞器或细胞本身的生物膜严重损伤有关。因此，植物已经发展出复杂的 策略来预防在温和冷冻条件下的细胞损伤。为了存活，植物通常需要预暴露于非致命温度， 即，冷适应步骤。该过程涉及多种机制，包括累积冷冻保护代谢物和抗冻蛋白。由于极端温 度代表着对于植物的重大压力，耐冻性仍然为限制全球植物分布的关键因素。
[0004] 50多年来，在材料内整合活细胞已被识别为生物技术中强有力的工具。通过粘附 在基质（substrate)上的固定、在材料中的捕获或包封是可以在新设备如生物反应器、生 物传感器、生物燃料细胞和人工器官的结构中操控全细胞利益的方法。实际上，从其天然环 境分离的细胞通常是脆弱的。基于细胞的生物技术装置因此需要将细胞整合入非生物材料 (abioticmaterials)〇
[0005] 保存植物材料的常用策略涉及建立在生长条件下的植物组织或在田间的植物群 体的体外收集。对于长期储存，因为保存植物组织的成本和质量问题，这些方法是不合适 的。现在，大多数植物在没有高浓度冷冻保护剂（防冻剂）（其可以是细胞毒性的）或脱水 工序下不能存活于冻融循环。而且，这些方法的成功与复杂的冷却程序是紧密关联的。例 如，以最佳速率将细胞冷却到中间温度（略低于凝固点），然后在液氮中玻璃化。事实上， 这些措施允许在细胞内空间使细胞脱水和冰结晶最小化，其负责不可逆的细胞损伤。最后， 由此获得的生物材料存储在昂贵的填充液氮的罐中，以使温度维持在-196Γ。在这些条件 下，几乎所有的代谢活动都停止，而活组织可以保存延长的时间。
[0006]目前，已经提出了三种不同的方法用于低温保存在液氮中的植物细胞培养物：
[0007] ⑷慢冷却技术
[0008] (B)玻璃化（vitrification)方法，以及
[0009] (C)在藻酸盐珠粒内脱水固定化的细胞
[0010] 描述了各种固定或包封基质。比生物分子远远更加灵敏的，活性细胞的固定涉及 使用生物相容性材料、温和（良性，benign)合成条件和外部流体支持系统或浸没于缓冲液 中，以避免脱水。最常使用的材料为多糖及衍生物、聚合物膜、活性碳以及光聚合树脂。然 而，在稳定性与生物相容性方面，这些有机基质显示出若干局限性。
[0011] 尽管已普遍冷冻保存哺乳动物和微生物培养物，但用于植物细胞的保存方法的受 限报告通常的特征在于低的细胞存活力。
[0012] 实际上，与其它细胞类型相比，由大型有液泡结构组成的植物细胞悬液更趋于严 重的低温损伤。植物细胞死亡的主要原因与细胞脱水和与包围细胞器或细胞本身的生物膜 的严重损伤相结合的胞外冰形成引发的机械应力有关。另外，当前方法通常需要昂贵的液 氮、专用装置来提供可编程的冷却速率以及可能是细胞毒性的高摩尔浓度的冷冻保护剂。 由于这些原因，仓I」建冷冻主细胞库（mastercellbanks)需要可替换的程序。
[0013] 发明目的
[0014] 本发明的目的在于提供用于冷冻保存或低温保存（植物）细胞、（植物）细胞器和 (植物）组织（包括例如，植物愈伤组织、分生组织、芽尖（apices)、芽外植体、胚珠和根） 的方法和试剂盒，其不存在现有技术的缺点。
[0015] 本发明的目的在于提供这样的方法和试剂盒，其是简单的、不太昂贵的并且不影 响处理的（植物）细胞、遗传修饰的（植物）细胞、（植物）细胞器以及（植物）组织（包 括例如植物愈伤组织、分生组织、芽尖、芽外植体、胚珠和根）的特性，其因而可以用于维持 (植物）细胞、（植物）细胞器以及（植物）组织的培养物并随时间保持它们的遗传特性， 特别是几个星期或几个月或甚至数年的长时期。
【发明内容】
[0016] 本发明涉及用于低温保存植物细胞（包括遗传修饰的植物细胞）、该植物的细胞 器或者该植物的组织的方法，其包括以下步骤（由以下步骤组成）：
[0017] -将该植物细胞、细胞器或该植物组织包封（encapsulate)在包含一种或多种二 氧化硅前体以及一种或多种冷冻保护剂的多孔二氧化硅基质中；
[0018] -在4°C至20°C温度下培养获得的混合物超过1小时并将所得到的杂化二氧化硅 凝胶（hybridsilicagels)转入到在-30°C至_196°C温度下的冷冻器（制冷器）中，优选 在约-80°C的温度下。
[0019] 在本发明的方法中，包封步骤优选通过使包含一种或多种二氧化硅前体和一种或 多种冷冻保护剂的溶液与植物细胞、植物细胞器或植物组织混合而获得。
[0020] 本发明的另一方面涉及用于（低温保存）基因修饰的（植物细胞）、植物细胞器或 植物组织的低温保存试剂盒，包括一种或多种二氧化硅前体和一种或多种冷冻保护剂。
[0021] 在根据本发明的方法和试剂盒中，冷冻保护剂优选选自由二甲基亚砜（DMS0)、糖、 氨基酸、两性离子化合物（甜菜碱）、二醇、多元醇或其混合物所组成的组。
[0022] 在根据本发明的方法和试剂盒中，几种不同的冷冻保护剂可以混合在一起用于执 行根据本发明的方法。
[0023] 优选地，糖为蔗糖或海藻糖，氨基酸优选脯氨酸或甘氨酸，二醇优选为（聚）乙二 醇而多元醇优选选自由山梨糖醇、麦芽糖醇、甘油、赤藻糖醇（赤藓糖醇，erythritol)、木 糖醇、阿拉伯糖醇（arabitol)、甘露醇、乳糖醇，异麦芽糖醇（isomaltitol)或其混合物所 组成的组。
[0024] 在根据本发明的方法中，在二氧化硅基质中二氧化硅前体的浓度可以在约5%和 约10 %之间变化。
[0025] 优选地，一种或多种二氧化硅前体选自由聚硅酸（H2Si03) n，优选偏硅酸 (metasilicicacid)H2Si03，氢氧化娃、二氧化硅烷氧化物（娃酸烷基酯，silicaalkoxide) (例如原硅酸四甲酯（TM0S)、原硅酸四乙酯（TE0S)、原硅酸四丙酯（TP0S)、四（2-羟乙 基）原硅酸酯（EGMS)、四（2-羟丙基）原硅酸酯（PGMS)和四（2, 3-二羟丙基）原硅酸酯 (GLMS))、硅酸盐（如硅酸钠或硅酸钾）、二氧化硅纳米颗粒、山梨醇硅烷、有机改性硅酸盐 (ormosils)(有机改性的二氧化硅）、三甲氧基甲基硅烷、二甲氧基二甲基硅烷、TM0S(四甲 氧基硅烷）、DGS(二甘油基硅烷），或其混合物所组成的组。
[0026] 作为在本发明的方法中的优选实施方式，冷冻保护剂为与二氧化硅前体混合的浓 度分别在〇· 2M和1. 0M之间（蔗糖）和1%和10%之间（DMS0)的蔗糖和DMS0。
[0027] 在根据本发明的方法中，在二氧化硅前体和冷冻保护剂中的溶液的pH优选在约4 至约8之间。
【具体实施方式】
[0028] 本发明提供了简单、快速而廉价的方法用于低温保存（植物，包括藻类）细胞、遗 传修饰的（植物）细胞、细胞器或组织培养物。该技术基于在低温（_30°C或更低至_196°C， 优选-70°C或更低至-196Γ)的二氧化硅基质的保护特性，其可以用作独创、简单而有效的 技术用于在普通实验室冷冻器中低温保存（植物，包括藻类）细胞、遗传修饰的（植物）细 胞、细胞器或组织系。
[0029] 硅以硅酸盐（Si02.nH20)形式天然存在于土壤中。这些矿物相在水中气候老化 (weather)以产生单体原娃酸（Si(0H)4)和一些焦娃酸（disilicic acid)，其被吸收、运输 以及遍及植物，特别是在细胞壁