中而不是植物的液泡中被沉积为无定形的二氧化硅。几项 报导强调这些Si物质可以提高植物对细菌和真菌攻击的抵抗。此外，二氧化硅物质缓解了 大范围的非生物应力，包括营养失衡、盐度、重金属毒性、水应力、紫外线、热和冷冻应力。
[0030] 所要求保护的本发明方法不需要特定设备来控制冷却和/或加热速率，也不需要 昂贵的液氮。宿主结构（hoststructure)保持植物细胞活力且不妨碍它们在冻融循环后 的增殖。
[0031 ] 在二氧化硅基质内包封（植物）细胞的主要优点是捕获的细胞更抵抗生物（例如 细菌）或非生物应力（例如热、水应力和重金属）。
[0032] 由于二氧化硅凝胶与典型的冷冻添加剂相比是无毒的化合物，因而细胞可以成功 地低温保存短期或长期的时间（超过2年）。
[0033] 基于该技术，根据已识别并很好建立的准则，商业植物来源的药物开发可以成为 更便捷的途径。
[0034] 因此，本方法是基于二氧化硅基质在低温（在约_30°C或更低，至_196°C，优选在 约-70°C，低至-196°C)的意料不到的保护效果，其可以在标准实验室冷冻器中，以及在指 定用于保存，尤其是低温保存细胞或其他生物材料的中心（如ATCC)中，用作用于长期低温 保存（植物，包括藻类）细胞、遗传修饰的（植物）细胞、（植物，包括藻类）细胞系、细胞 器（例如，类囊体）或组织的独创、简单而有效的技术。
[0035](植物）细胞培养物（如，例如拟南芥）可以成功地通过根据本发明的方法低温保 存，其包括三个基本步骤。
[0036] 本发明的方法包括三个基本的连续步骤：
[0037] 第一步骤包括在多孔二氧化硅基质内经由溶胶-凝胶方法包封（植物，包括藻类） 细胞、遗传修饰的（植物）细胞、（植物，包括藻类）细胞器（例如，类囊体）或（植物，包 括藻类）组织。所获得的基质，基于二氧化硅的溶胶由一种或多种二氧化硅前体和一种或 多种冷冻保护剂制成。一种或多种二氧化硅前体选自自由聚硅酸（H2Si03)n(优选偏硅酸 H2Si03)、氢氧化娃、二氧化硅烷氧化物（例如原硅酸四甲酯（TM0S)、原硅酸四乙酯（TE0S)、 原硅酸四丙酯（TP0S)、四（2-羟乙基）原硅酸酯（EGMS)、四（2-羟丙基）原硅酸酯（PGMS) 和四（2, 3-二羟丙基）原硅酸酯（GLMS))、硅酸盐（如硅酸钠或硅酸钾）、二氧化硅纳米颗 粒、山梨醇硅烷、有机改性硅酸盐（有机改性的二氧化硅）、三甲氧基甲基硅烷、二甲氧基二 甲基硅烷、TM0S(四甲氧基硅烷）、DGS(二甘油基硅烷），或其混合物所组成的组。更优选地， 二氧化硅前体为聚硅酸（H2Si03)n、三甲氧基甲基硅烷、二甲氧基二甲基硅烷或其混合物。此 外，可以将其它添加剂，如二氧化硅胶体（例如，LUDOXK)、二氧化硅共前体，或二氧化 硅纳米颗粒加入到二氧化硅前体溶液。这些添加剂作为附加的二氧化硅来源发挥作用。
[0038] -种或多种冷冻保护剂，优选选自由DMS0 (二甲基亚砜）、氨基酸（例如脯氨酸或 甘氨酸）、两性离子化合物（甜菜碱）和糖（海藻糖、蔗糖）、二醇（如（聚）乙二醇或乙二 醇）或多元醇（或聚醇（多元醇、聚合醇，polyalcohol)，例如山梨糖醇、麦芽糖醇、甘油、赤 藻糖醇、木糖醇、阿拉伯糖醇（arabitol)(树胶糖醇，lyxitol)、甘露醇、乳糖醇、异麦芽糖 醇等）或其混合物所组成的组。
[0039] 使用的二氧化硅前体的浓度可以在约5%和约10% (W/V)之间变化。二氧化硅前 体的类型可影响低温保存方法的功效。
[0040] 优选地，一种或多种冷冻保护剂以分别约1 %至10% (DMS0)之间和约0. 2M至约 1. 0M(蔗糖）之间的浓度与前体二氧化硅混合。
[0041] 第二步骤（后续步骤）包括所得到的混合物在室温下的培养期，优选在控制室 (controlledroom)内（在约4°C至约20°C之间的温度），时间为超过1小时，优选约6小 时到约48小时或更长时间。制备的杂化凝胶（hybridgels)优选保持在封闭的瓶中。
[0042] 最后的步骤包括将所得的杂化二氧化硅凝胶转移到实验室冷冻器中（在约-30°C或更低，低到-196Γ，优选在约-70°C，低到-196Γ)，不需要任何特定的预防措施。
[0043] 可以通过在室温下短时间快速加温样品瓶约5分钟至约10分钟来恢复（复原、回 收，recovery)(植物）细胞悬液。然后将解冻的二氧化硅凝胶在含有固体营养培养基的板 上铺展。宿主结构保持（植物）细胞活力并且不妨碍它们在冻融循环后的增殖。在约7天 到约14天的时期后，将回收的杂合二氧化硅-细胞材料转移至含新鲜液体培养基的瓶中。 可替换地，将培育物（cultivar)保持在固体营养培养基上。该方法是有效的、快速且价廉 的并因此，比使用的现有方法如慢冻技术或脱水固定化细胞更加有效。
[0044] 本发明的另一方面涉及低温保存试剂盒，特别是用于低温保存（植物，包括藻类） 细胞、遗传修饰的（植物）细胞、（植物，包括藻类）细胞器（如类囊体）或（植物，包括藻 类）组织的低温保存试剂盒，其可以用在根据本发明的方法中并包括由一种或多种二氧化 硅前体，如聚硅酸，以及一种或多种冷冻保护剂制成的二氧化硅基质。根据本发明的试剂 盒可以在单独的小瓶中包括这些用于根据本发明的基质的成分（element)。一种或多种二 氧化硅前体优选选自由聚硅酸（H2Si03)n (优选偏硅酸H2Si03)、氢氧化硅、二氧化硅烷氧化 物（例如原硅酸四甲酯（TM0S)、原硅酸四乙酯（TE0S)、原硅酸四丙酯（TP0S)、四（2-羟乙 基）原硅酸酯（EGMS)、四（2-羟丙基）原硅酸酯（PGMS)和四（2, 3-二羟丙基）原硅酸酯 (GLMS))、硅酸盐（如硅酸钠或硅酸钾）、二氧化硅纳米颗粒、山梨醇硅烷、有机改性硅酸盐 (有机改性的二氧化硅）、三甲氧基甲基硅烷、二甲氧基二甲基硅烷、TM0S(四甲氧基硅烷）、 DGS(二甘油基硅烷），或其混合物所组成的组。一种或多种冷冻保护剂是前面所描述的，如 DMS0(二甲基亚砜）、糖（海藻糖、蔗糖）、氨基酸（脯氨酸或甘氨酸）、两性离子化合物（甜 菜碱）、二醇、多元醇（或聚醇，例如山梨糖醇、麦芽糖醇、甘油、赤藻糖醇、木糖醇、阿拉伯糖 醇（树胶糖醇，lyxitol)、甘露醇等）或其混合物。
[0045] 优选地，在基质中二氧化硅前体的浓度可以在约5%到约10% (W/V)之间变化。在 优选的实施方式中，一种或多种冷冻保护剂（DMS0和蔗糖）以分别约1%至10% (DMS0)之 间和约0. 2M至约1. 0M(蔗糖）之间的浓度与二氧化硅前体混合。
[0046] 将参考附图在下列实施例中描述本发明，它们作为本发明的非限制性优选实施方 式。
【附图说明】
[0047] 图1表示经由在20°C监测02摄取（暗呼吸）确定低温保存拟南芥（A.Thaliana) 细胞的最佳条件。在低温保存方法的三个步骤的每一个之后，评估植物细胞的代谢活动。杂 化凝胶在不同温度下的温育时间对低温保存（A)后的细胞活性的影响。蔗糖（B)和DMSO(C) 浓度对细胞保存的影响。100%对应于未经历任何冻融循环的细胞的耗氧（氧气消耗、耗氧 量）。平均值（η= 3)以标准偏差来呈现。
[0048] 图2表示二氧化硅物质在低温保存拟南芥细胞中的作用。比较用聚硅酸（Α)或二 氧化硅纳米颗粒（Β)预温育的回收细胞的耗氧。平均值（η= 3)以标准偏差呈现。
[0049] 图3表示植物细胞的长期保存。杂化凝胶在_80°C的存储时间对在解冻后代谢活 性的影响。平均值（η= 3)以标准偏差呈现。
[0050] 实施例
[0051] 实施例1:用于低温保存拟南芥细胞的最佳条件。
[0052] 材料和方法
[0053]二氧化娃纳米颗粒（5_15nm)、三（1，2-苯二醇酸根-〇, 0'）娃酸钾（dipotassium tris(l，2-benzenediolato_0,0'）silicate)、Murashige和Skoog培养基（MSM0)、 鹿糖、二甲基亚砜（DMS0)、氢氧化钾、二水合草酸（oxalicaciddehydrate)99%、四 水合钼酸铵99%、4(甲氨基）硫酸苯酚（4-(甲氨基）苯酚硫酸盐，4(methylamin〇) phenolsulfate) 99 %、亚硫酸钠99 %、盐酸37 %、硫酸95 %、激动素和1-萘乙酸 (1-naphtalenaceticacid)购自Sigma-Aldrich。如由C.F.Meunier，J等人描述 的，聚硅酸（H2Si03)是由硅酸钠溶液（测定25. 5-28. 5 %，Merck) Chem.，2010, 20, 929-936)。Amplex红色过氧化氢测定试剂盒和孔径0. 2μπι的膜过滤器分 别获自Molecular Probes公司和Sartorius。
[0054] 培养条件
[0055] 在补