来自珊瑚组织的色素蛋白的制作方法

专利名称：来自珊瑚组织的色素蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及来自珊瑚的色素蛋白，特别是编码所述色素蛋白的多核苷酸分子及其用途。
背景技术：
业已从天然来源中分离并鉴定了多种有色分子和/或荧光分子。其例子包括apoaequorin，一种从发光水母——多管水母中分离的单链多肽，从Renilla(又被称为海肾)中分离的绿色荧光蛋白(GFP)和renilla荧光素酶，Renilla属于被称为珊瑚虫的一类腔肠动物。
本申请从各种珊瑚组织中纯化了色素蛋白(PPCT)，并克隆了编码具有特殊的、和有用特征的PPCT的基因。

发明内容
在第一方面，本发明提供了一种分离的多核苷酸分子，它包括编码从在受到入射光线辐射时能发射荧光的珊瑚组织中分离的色素蛋白(PPCT)的核苷酸序列，其中，所述入射光线的最大吸收在320-600纳米(优选550-580纳米)范围内，而最大荧光发射在350-700纳米(优选400-650纳米)范围内。
所述分离的多核苷酸分子优选包括编码具有以下N-末端氨基酸序列的蛋白的核苷酸序列SVIAK(SEQ ID NO1)。
更优选的是，所述分离的多核苷酸分子优选包括编码具有以下N-末端氨基酸序列的蛋白的核苷酸序列SVIAKQMTYKVYMSGTV(SEQ ID NO2)。
更优选的是，所述分离的多核苷酸分子优选包括编码具有相当于下文所示SEQ ID NO3或4的序列的氨基酸序列的蛋白的核苷酸序列。
更优选的是，所述分离的多核苷酸分子包括一种核苷酸序列，它与下文所示SEQ ID NO5或SEQ ID NO6的序列的相同性为至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％。
最优选的是，所述分离的多核苷酸分子包括一个基本上相当于下文所示SEQ ID NO5或SEQ ID NO6的序列的核苷酸序列。
在本发明的一种优选实施方案中，所述分离的多核苷酸分子包括能在高严格条件下与SEQ ID NO5或6所示序列杂交的核苷酸序列，并且其长度小于5000个核苷酸，尽管它的长度可以小于1000甚至500个核苷酸。不过，优选的是，本发明的杂交多核苷酸分子的长度至少为18个核苷酸。
能在高严格条件下与SEQ ID NO5或6所示序列杂交的本发明的多核苷酸分子包括编码为本申请人所了解的PPCT异构型的多核苷酸分子，其长度为221个氨基酸。所述多核苷酸分子包括一个终止密码子，它位于SEQ ID NO5或6所示编码Cys221的密码子的位置上。
在第二方面，本发明提供了一种包括以下N-末端氨基酸序列的蛋白SVIAK(SEQ ID NO1)，所述蛋白基本为纯化形式。
优选的是，所述基本上纯化的蛋白包括以下N-末端氨基酸序列SVIAKQMTYKVYMSGTV(SEQ ID NO2)。
更优选的是，所述蛋白包括基本上相当于下文所示SEQ ID NO3或4的序列的氨基酸序列。
本发明的蛋白(PPCT)具有以下特征i)水溶性蛋白(长度为231-235个氨基酸)；ii)λmax的吸收光谱在340-600纳米范围内；iii)光诱导的；iv)大多为二聚体形式，尽管有时也可以是三聚体；v)与绿色荧光蛋白(GFP)有大约22％的氨基酸相同性和大约56％的氨基酸相似性；vi)PPCT上的氨基酸序列“QYG”取代了GFP载色团位置上的“SYG”；vii)估计PI＝9.5；和viii)在高温(例如35℃)下合成，并且在更高温度(例如40℃)下稳定。
在560-600纳米下具有最大吸收值的PPCTs在所有条件下都具有弱荧光(在560-600纳米下激发，在600-650纳米下发射)。其他PPCTs在不同波长下吸收/激发和发射。基本上有四种类型根据荧光行为可将PPCTs分成以下类型在300-360纳米、420-465纳米、480-490纳米和550-600纳米波长下激发时能发出荧光。所述分子在400-550纳米、480-490纳米、500-505纳米和610-630纳米波长下分别具有最大的发射(参见表4)。
PPCT可以从以下珊瑚科的组织中纯化Pocilloporidae、Acroporidae、Poritidae、Faviidae、Merulinidae、Fungiidae。
优选的是，PPCT是从以下珊瑚组织中纯化的Acropora aspera、Acropora digitifera、Acropora horrida、Acropora formosa、Montiporamonasteriata、Montipora caliculata、Pocillopora damicornis、Poritesmurrayensis、Porites lobata、Plesiastrea versipora或Seriatoporahystrix。
更优选的是，PPCT可以从以下珊瑚组织中纯化Acroporaaspera、Acropora horrida、Montipora monasteriata、Montiporacaliculata、Porites murrayensis、Porites lobata或Plesiastreaversipora。
另外，PPCT可以从能通过导入的PPCT-编码多核苷酸分子表达PPCT的重组宿主细胞培养物中纯化。
在第三方面，本发明提供了一种适用于本发明第一方面的多核苷酸分子复制和/或表达的载体。
例如，所述载体可以是质粒、病毒或噬菌体载体，它具有一个复制起点，并优选具有用于表达所述多核苷酸的启动子，选择性地具有一个所述启动子的调控子。所述载体可以包括一种或多种选择标记，例如，对于细菌质粒来说为氨苄青霉素抗性基因，或者对于哺乳动物表达载体来说为青霉素抗性基因。例如，所述载体可用于体外生产RNA，或者用于转染或转化宿主细胞。
本发明的第四方面提供了用本发明第三方面的载体转染或转化过的宿主细胞。
适用于克隆或表达PPCT的宿主细胞有原核细胞、酵母、或高等真核细胞。
合适的原核细胞包括真杆菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如，大肠杆菌、芽孢杆菌属，如枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌，假单胞菌，如铜绿假单胞菌，鼠伤寒沙门氏菌或粘质沙雷氏菌。
真核微生物，如丝状真菌或酵母也是表达PPCT的合适宿主。低等真核宿主微生物中，最常用的是酿酒酵母或普通面包酵母。不过，有多种其他的属、种、和株是常见的，并可用于本发明，如球形裂殖酵母、克鲁维氏酵母属宿主，如乳酸克鲁维氏酵母；丝状真菌，如链孢霉属或青霉属；以及曲霉属宿主，如构巢曲霉和黑曲霉。
合适的高等真核宿主细胞可以是培养的脊椎动物、无脊椎动物或植物细胞。可以使用来自以下物种的昆虫宿主细胞，如草地夜蛾、埃及伊蚊、白纹伊蚊、果蝇和家蚕。可以将棉花、玉米、马铃薯、大豆、番茄和烟草的植物细胞培养物用作宿主。通常植物细胞是通过与根癌农杆菌的某些菌株一起培养转染的。
近年来，脊椎动物细胞在培养物中的繁殖(组织培养)业已成为常规方法。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子有SV40转化过的猿肾CV1系(COS-7，ATCC CRL1651)；人类胚胎肾系(亚克隆的293或293细胞，用于在悬浮培养中生长)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCCCCL10)；中国仓鼠卵细胞/-DHFR(CHO)；小鼠足细胞，猿肾细胞(CV1，ATCC CCL70)；人子宫癌细胞(HELA，ATCC CCL2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL34)，和人肝癌细胞细胞系(Hep G2)。优选的宿主细胞是人类胚胎肾293和中国仓鼠卵细胞。
用本发明的表达或克隆载体转染，更优选转化宿主细胞，并在改进过的、以便适于诱导启动子的常规培养基中培养，选择转化体，或者扩增编码所需序列的基因。转化意味着将DNA导入一种生物，以便该DNA能够复制，它作为染色体外因子复制或者通过染色体整合复制。根据所使用的宿主细胞，转化用适合所述细胞的标准技术进行。
在第五方面，本发明提供了用于生产本发明第二方面的蛋白的方法，该方法包括以下步骤在适合表达编码所述蛋白的多核苷酸分子的条件下，培养用本发明第三方面的(表达)载体转染或转化过的宿主细胞，并选择性地回收表达的蛋白。
所述细胞可用于生产商业上有用量的所述编码蛋白。
由于PPCTs似乎在高温(例如35-40℃)下具有稳定性，本发明第五方面的方法可以在最佳培养温度或接近最佳培养温度(例如，30-70℃)的温度下进行。
在第六方面，本发明提供了一种寡核苷酸探针或引物，所述探针或引物具有能选择性地与本发明第一方面的多核苷酸分子杂交的序列。
在所述第六方面的一种优选实施方案中，所述寡核苷酸探针或引物包括至少8个核苷酸，更优选至少18个核苷酸，最优选至少25个核苷酸。在另一种优选实施方案中，所述寡核苷酸探针或引物被用作一种可检测的探针，其中，所述寡核苷酸与一种标记缀合，如放射性同位素、酶、生物素、荧光分子或化学发光分子。
在第七方面，本发明涉及将本发明第二方面的蛋白用作组织标记、荧光标记或普通染料。
预计本发明的蛋白能够用作在转化组织中进行的、下列基因表达的、无害的蛋白基标记。本发明的蛋白还具有作为便于生产的无害染料的潜在用途。
在第八方面，本发明提供了一种包括有效量的本发明第二方面的蛋白的防晒制剂，它与合适的药理学上可接受的载体或赋形剂混合。
在第九方面，本发明提供了一种用于过滤入射光线中的紫外线或其他波长的过滤器，它包括有效量的本发明的第二方面的蛋白。
在本说明书中，除非本文需要另加说明，术语“包括”(“comprise”或诸如“comprises”或“comprising”的变体形式)被理解为包括一种状态的因子、整数或步骤，或因子组、整数或步骤。但不排除任何其他因子、整数或步骤，或因子组、整数或步骤。
在本说明书中，有关核苷酸序列相同性的百分比水平，是通过Altschul，S.F.等所披露的BLAST程序计算的(缺口BLAST和PSI-BLAST；新一代蛋白数据库检索程序，核酸研究，25卷，No.17，3389-3402页，1997)。
在本文中，术语“高严格条件”是指(1)采用低离子强度和高温进行洗涤，例如，15mM氯化钠/1.5mM柠檬酸钠/0.1％NaDodSO4，50℃；(2)在杂交期间使用一种变性剂，如甲酰胺，例如，50％(v/v)甲酰胺和0.1％牛血清白蛋白，0.1％Ficoll，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，50mM磷酸钠缓冲液，pH6.5和750mM氯化钠，75mM柠檬酸钠，42℃；或(3)采用50％甲酰胺，5×SSC(750mM氯化钠，75mM柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH6.8)，0.1％焦磷酸钠，5×Denhardt’s溶液，超声波处理过的鲑鱼精DNA(50微克/毫升)，0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，42℃，在0.2×SSC(30mM氯化钠，3mM柠檬酸钠)和0.1％SDS中。
在本文中，与核苷酸序列一起使用的“基本上相当于”用于表示包括由于不会导致编码蛋白发生改变的DNA密码的简并，而在该核苷酸序列上产生的微小变化。另外，该术语还用于表示包括该序列上的其他微小变化，该变化可能是增强在特定系统中的表达所需要的，但该变化不会导致编码蛋白的功能特征的改变。
在本文中，与氨基酸序列一起使用的术语“基本上相当于”用于表示氨基酸序列上所发生的、不会导致PPCT的功能特征发生改变的微小变化。所述变化可以包括保守性氨基酸取代。设想的取代有G，A，V，I，L，M；D，E；N，Q；S，T；K，R，H；F，Y，W，H；和P，Nα-烷基氨基酸。
为了能更清楚地理解本发明，将结合以下实施例和附图对优选形式进行说明。
附图的简要说明


图1表示可用于与编码PPCT的基因杂交的简并引物的核苷酸序列。
图2提供了为了测序而收集的凝胶过滤HPLC级分的SDS PAGE的电吸印。其泳道如下1.A.horrida，2.M.caliculata，3.M.monasteriata，4.P.lobata，5.P.murrayensis，6.A.formosa，7.S.hystrix，8.P.damicornis，9.S.pistillata。分子量标记在没有标记过的泳道中示出。
泳道3表示由图3中的克隆T7SP6BASPOC3编码的氨基酸序列。
泳道4表示图4中的克隆T7SP6BASPOC4编码的氨基酸序列。
图5表示源于A.aspera的编码PPCT的克隆T7SP6BASPOC3的cDNA核苷酸序列。
图6表示源于A.aspera的编码PPCT的克隆T7SP6BASPOC4的cDNA核苷酸序列。
图7表示适用于导入编码PPCT的cDNA并随后进行细菌表达的载体。
图8提供了暗礁形成珊瑚的主要色素多肽的分子模型示意图。A.MOLSCRIPT草图，从N-末端到C-末端。箭头表示β-链，而螺旋表示螺旋片段。荧光团的重原子(Q61、Y62和G63)以球和棒的形式表示。B.它附近的带电荷的、极性的和疏水性的侧链用球和棒形式表示。
图9表示来自A-C，Acropora aspera和D-F，Pocilloporadamicormis的GFP-样色素(pocilloporin)的吸收、激发和发射光谱。在27-28分钟(A和D)和25-26分钟(B和E)采集的样品在用于凝胶过滤处理时，表现出显著的荧光激发(1-3，5-6)和发射(1-3，5-6)光谱，在图C和F中示出了复合吸收(4，7峰值在580-560纳米中)和发射光谱(用虚线表示)。
图10表示PPCTs和共生双鞭甲藻的Peridinin-叶绿素-蛋白(PCP)复合体之间的相互作用。泳道1表示共生双鞭甲(Acroporaaspera)的PCP复合体的激发光谱，它会导致分离的PCP复合体在674纳米波长下发射荧光(泳道2，相当于Qy叶绿素a转运)。泳道3、4、5和6表示暗礁形成珊瑚(Acropora aspera)和Pocilloporadamicormis中的GFP-样pocilloporins的典型激发光谱。相应的箭头表示最大发射的位置。注意所述发射(箭头)与后续荧光色素的激发波长之间的联系。点划线表示PCP复合体的激发峰和叶绿素a的Qx带的大致位置。A＝叶绿素a(441纳米)，B＝Peridinin(472纳米)，而C＝Peridinin的额外的振动带(525纳米)。
例1一般分子生物学除非另有说明，用于本发明的重组DNA技术为本领域技术人员所公知的标准技术。所述技术披露并说明于以下文献中J.Perbal，分子克隆实践指南，John Wiley和Sons(1984)，J.Sambrook，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室出版社(1989)，T.A.Brown(著)，基础分子生物学实践方法，1和2卷，IRL出版社(1991)，D.M.Glover和B.D.Hames(著)，DNA克隆实践方法，1-2卷，IRL出版社(1995和1996)，和F.M.Ausubel等(著)，现代分子生物学方法，Greene出版社和Wiley-Interscience(1988，包括到目前为止的所有更新)，以上文献均被收作本文参考。
基因/DNA分离可以从用被认为能表达有关基因mRNA的组织制备的任何cDNA文库中获得编码一种蛋白的DNA，并以可检测的水平表达。DNA还可以从基因组文库中获得。
用为了鉴定感兴趣的基因或由该基因而编码的蛋白而设计的探针或分析工具筛选文库。对于cDNA表达文库来说，合适的探针包括能识别所述蛋白并与之专一性结合的单克隆或多克隆抗体；来自相同或不同物种的编码cDNA的已知的或推测的部分的、长度大约为20-80个碱基的寡核苷酸；和/或编码相同的或杂合基因的核苷酸的互补或同源cDNA或片段。适于筛选基因组DNA文库的探针包括，但不限于寡核苷酸；它的能编码相同或杂合DNA的cDNA或片段，包括表达的序列标记等；和/或它的同源基因组DNA或片段。用选择的探针筛选cDNA或基因组文库，可以用标准方法进行，如披露于Sambrook的等的著作中的第10-12章中的方法。
分离基因编码的另一种方法是，使用披露于Sambrook等的著作中的第14节中的聚合酶链式反应(PCR)的方法。该方法需要使用能与所述基因杂交的寡核苷酸探针。
被选择用作探针的寡核苷酸序列应当足够长，并且具有足够的明确性，以便降低假阳性。实际核苷酸序列通常基于该基因的保守的或高度同源的核苷酸序列或片段。所述寡核苷酸可以在一个或多个位置上简并。简并寡核苷酸的使用在筛选来自其优势密码子利用是已知的物种的文库时特别主要。所述寡核苷酸必须进行标记，以便在与被筛选的文库中的DNA杂交时可以检测。优选的标记方法是使用本领域众所周知的方法，用32p-标记的ATP和多核苷酸激酶对该寡核苷酸进行放射性标记。不过，可用于标记所述寡核苷酸的其他方法包括，但不限于生物素化或酶标记。
通过筛选特定的cDNA或基因组文库获得具有全部蛋白编码序列的核酸，如果必要，采用披露于Sambrook等的著述的7.79节中的常规引物延伸方法，检测不能逆转录成cDNA的mRNA的前体和加工中间体。
获得感兴趣的基因的另一种方法是化学合成，它使用披露于Fingels等的著作(Agneu Chem.Int.Ed.Engl.28716-734，1989)中的方法之一。所述方法包括三酯、亚磷酸酯、亚磷酰胺和H-膦酸酯方法，PCR和其他自动引物方法，以及在固体支撑物上进行的寡核苷酸合成。在以下情况下可以使用上述方法所述基因的完整的核酸序列是已知的，或者可以获得互补于所述编码链的核酸序列，或者，目标氨基酸序列是已知的，人们可以利用每一种氨基酸残基的已知的和优选的编码残基推测潜在的核酸序列。纯化方法(i)通过在4℃下将珊瑚在0.6M磷酸钾缓冲液pH6.65中浸泡过夜，从珊瑚组织中提取有色色素(ii)在280纳米下监测凝胶过滤(Pharmacia，SuperoseHR10/30)并用磷酸缓冲液洗脱λmax(峰值收集)(iii)脱盐并冻干(iv)在15％SDS-PAGE上分离(v)用CAPS缓冲液电吸印到PVDF上(vi)N-末端序列分析(澳大利亚国立大学测序设备)cDNA文库物种兰色头Acropora aspera(i)mRNA分离采用Qiagen mRNA试剂盒(polyA+)或者更优选采用Chomczynski和Sacchi所披露的方法(分析生物化学，162，156-159，1987)。
(ii)用购自CLONTECH的SMART PRC cDNA合成试剂盒制备cDNA(iii)将cDNA连接到StratageneλZapII EcoRI裂解的/CIAP上，并用Stratagene GigapackII包装。文库的PCR(i)用凝胶纯化的寡聚体作5’引物，并用SMART PCR接头作3’引物-PCR扩增基因(ii)将凝胶纯化的产物连接到pGemT易化载体(Promega)上，由T7和SP6引物进行LICOR测序，并翻译序列以便得到氨基酸序列。突变体产生预料通过诱变可以改善具有弱荧光的PPCT的荧光特性。所述突变体(及其编码它的多核苷酸分子)也被视为本发明的组成部分。
突变的位点可以单独改变或进行系列改变，例如，通过以下方法(i)首先用选择的保守性氨基酸取代目标残基，然后根据所获得的结果用选择的更激进的残基进行取代。
(ii)缺失目标残基，和/或(iii)将残基或其他配体插入靶残基附近。
一种用于鉴定诱变残基或片段的有用方法被称为“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells所述(科学，1989，2441081-1085)。在这里，用中性或带负电荷的氨基酸(最优选Ala或poly-Ala)取代鉴定的目标残基或一组目标残基(例如，带电荷的残基，如Arg、Asp、His、Lys和Glu)，以便影响氨基酸与细胞内或细胞外的周围水环境的相互作用。然后通过导入另外的或其他的突变进一步确定对所述取代表现出功能敏感性的结构域。因此，尽管用于导入氨基酸序列突变的位点是预定的，但该突变本身的性质不一定是预定的。例如，为了优化特定位点上突变的性能，可以对目标密码子或片段进行丙氨酸扫描或随机诱变，并对表达的突变体进行筛选，以便寻找所需功能的最佳组合。例2方法色素蛋白的分离和纯化纯化色素蛋白，并按照Dove等(Biol Bull，189-288-297，1995)所披露的方法，在变性条件下进行电泳。在CAPS缓冲液中将所得到的SDS-PAGE亚单位转移到PADF纸上。然后用澳大利亚国立大学的生物分子资源设备对从五种两性型珊瑚中分离的28kD的亚基进行测序。RNA分离-cDNA文库构建-热循环仪条件在1997年11月24日中午，从Heron岛暗礁平台上采集Acroporaaspera的分支端(兰色)，并马上送到研究场所。马上从10个尖头(长度大约1厘米)中分离总RNA，并用购自Clontech实验室(PaloAlto，CA，USA)的SMART PCR cDNA合成试剂盒制备cDNA文库。由该文库扩增PPCT的完整长度的mRNA序列，使用凝胶纯化的简并引物，该引物是最常见序列的5’末端和N-末端的头10个氨基酸(表1)和SMARTPCRCDS3’引物。由此得到长度大约为760bp的单一产物。将凝胶纯化的产物连接到pGemT易化载体上(Promega，Madison，WI，USA)，并用T7和SP6引物测序(两个克隆，正向和反向，LICOR，USA)。所得到的衍生蛋白具有231个氨基酸(POC3)和235个氨基酸(POC4)，仅有少数的功能相似的氨基酸取代。模型构建用MALIGN(Johnson等，1993)进行序列排比，所使用的预设评分矩阵源于多重结构排比，并进行目测编辑，以便优化保守的和化学相似残基的排比。用MODELLER程序，根据绿色荧光蛋白(PDB1GFL)的模板结构产生POC4模型。通过模拟退火方法，用建设中的分子动力学对所述初级模型进行反复修正，以便改进由PROCHECK计算的结构品质。用GRASP建立所述蛋白模型的分子表面。发射和激发光谱测定分析以下凝胶过滤级分的激发和发射光谱(i)在25分钟到29分钟之间每隔1分钟所收集的凝胶过滤级分，它基本上相当于由25-29kD的单聚体蛋白亚基组成的三聚体，(ii)在蛋白纯化的最大吸收波长附近收集的窄凝胶过滤级分，根据珊瑚的种类它出现在大约26-大约28分钟之间(表1)。
从zooxanthellae中分离peridinin-叶绿素-蛋白(PCP)复合体。通过对用空气刷从珊瑚中取出的组织进行匀浆从zooxanthellae中分离水溶性PCP复合体，并从若干种珊瑚(Montipora digitata，Acroporaaspera)中分离。通过以3000rpm的速度将匀浆物离心2分钟得到富含共生双鞭甲藻的级分。沉淀物并冰镇的磷酸缓冲液一起培养。对PCP复合体作进一步纯化，并用Dove等所披露的方法(1995，同上)在变性条件下进行电泳，所不同的是，收集30-31分钟的级分。
结果和讨论从10种暗礁形成珊瑚中分离PPCT。所分离的蛋白的天然分子量(大约)为42-69kD(表1)，并包括大约为28kD的亚基(图2)。对来自6种Acropord和Poritid珊瑚的亚基的N-末端进行测序。尽管在28kD的带上具有多种背景序列，但所有科都具有以氨基酸SVIAK开始的序列(表1)。用Mono-Q组(Pharmacia，瑞典)和多种pH梯度和盐浓度进行的离子交换程序未能进一步分离所述凝胶分离级分。这表明所述多肽上的表面电荷是非常相似的。为了得到具有所述共同N-末端序列的多肽的完整序列，用兰色珊瑚Acropora aspera构建cDNA文库。由此导致了编码该蛋白的完整长度mRNA的成功扩增。扩增得到了具有很少核酸差别的两种克隆，它们能产生长度为231的蛋白(POC3)(参见图5)和长度为235的蛋白(POC4)(参见图6)，这两种蛋白都具有终止密码子位于221号氨基酸上的异构型。数据库检索发现，所述序列与源于水母Aequorea victoria(Cl.Scyphozoa)的绿色荧光蛋白(GFP)吻合。很显然，GFP也是具有228kD亚基的二聚体(Tsien，生物化学年度综述，67，509-544，1998)。POC4与GFP和从Discosoma sp.(Order Corallomorpharia，Cl.Anthozoa，Matz等，自然生物技术，17，969-973，1999)中分离的GFP-样蛋白的排比表现出与GFP有19.6％的相同性，与drFP583具有65.3％的相同性(表2)。在浓缩以后，所述窄的凝胶过滤级分具有与得到它的珊瑚基本上相同的颜色(即兰色、紫色或粉色)。因此，在可见光下看到的珊瑚中的色素是由于这类GFP蛋白。具有28kD亚基的二聚体与GFP的特征吻合。
三维结构模型的构建揭示出PPCT序列适用于绿色荧光蛋白(PDB1GFL)的‘β-can’结构(Yang等，自然生物技术，14，1246-1251，1996)，在该蛋白中具有11个β-链和一个生色团(包括热改性的残基Gln-61，Tyr-62和Gly-63)(图8B)。该模型表明，所述生色团是由“QYG”氨基酸基序形成的。PPCT上N-末端帽子部分的缺乏(参见表2中的排比，图8 A、B)表明，该分子可能具有减弱了的荧光能力，因为在N-末端截短实验中发现它对GFP是很关键的。推测该序列是下面将要讨论的色素的高吸收-低发射形式(最大激发出现在570纳米处(图9)。PPCT模型的GRASP分子表面上(未示出)没有出现通道，这表明所述荧光团在溶剂中受到了很好的保护。靠近所述荧光团的部分似乎与堆积溶剂完全隔离了，在5埃范围内有25个残基(在表4中给出，并示于图8A、B中)，而在GFP中有19个残基。这种增加部分归因于由Gln-61的侧链所形成的氢键。业已提出了该荧光团的两种共振形式，一种具有存在于Tyr-62的苄基氧(OH)上的部分负电荷上，另一种具有存在于Tyr-62的羰基氧上的部分负电荷(咪唑酮环的一部分)。这两种共振形式似乎都是分别由Arg-192和Arg-90稳定的(表4)，因此无法推测哪种形式是该模型的显性。Yang等(1996，同上)业已提出，从空间和静电角度考虑，GFP的Thr-203、Glu-222或Ile-167的突变会直接影响该荧光团。PPCT上相应的残基Arg-192、Glu-210和Met-158都位于该荧光团附近，这表明它们是该蛋白功能的关键残基。特别重要的是，色氨酸残基在“β-can”结构中的存在Trp-88(相当于GFP的Asn-94)，在该荧光团的范德华接触之内具有来自该荧光团的Trp-53和Trp-138(分别为10.8埃和6.7埃)。后者与GFP的Trp-57(在WT中为13埃；Yang等，1996，同上)和Tyr-145对应，可能是由于电荷离域。这表明，所述色氨酸在稳定并保护PPCT不受紫外线辐射影响方面是重要的，这增加了其在高水平阳光照射下的潜在功能(参见下文)。该模型结构还解释了PPCT的异常稳定性，该稳定性是在可能超过35℃的浅水环境中表现的，而在GFP的最高温度为25℃。
检查来自10种暗礁形成珊瑚的天然PPCT的荧光发现，有多种荧光特性类似于在天然和突变型GFP中所观察到的特性(Tsien等，生物化学，67，509-544，1998)。荧光特性基本上可将分子分成以下类型在300-360纳米、420-465纳米、480-490纳米和550-600纳米波长下激发的荧光(表4)。这些分子分别具有400-450纳米、480-490纳米、500-505纳米和610-630纳米的最大发射波长。吸收范围为550-600纳米、发射范围为610-630纳米的一类分子具有极低强度的荧光，表现在该范围内窄的凝胶过滤级分具有高的吸收度数(和高的蛋白含量)，及其比较低的荧光(图9)。就存在于每一种珊瑚中的PPCT的类型而言，在不同的种之间存在相当显著的差异。例如，源于Acroporid珊瑚Acropara aspera的兰色分支尖端的PPCT在UVA和可见光下具有荧光，并表现出3个不同的最大发射波长344纳米、420纳米和576纳米(图9A、B)。在上述波长下激发会导致分别发射445纳米(兰色)、490纳米(蓝绿色)和630纳米(橙红色，弱)的荧光。如果用25-26分钟的HPLC样品进行分析，PPCT以340纳米的最大激发为主，以420纳米和576纳米的最大激发为主的PPCT的样品来自26-27分钟。在Acropara aspera的组织中发现了若干种类型的PPCT，某些形式具有形成同源二聚体、有可能是异源二聚体或三聚体的较大潜力。在来自所有其他物种的PPCT上发现了不同的洗脱时间。具有单一的(主要的，排除肩)激发和发射最大值的GFP和突变体进一步强化了所发现的每一对激发和发射光谱表示一种PPCT的情形。
因此，暗礁形成珊瑚的明亮颜色是由于一种或多种GFP-样pocilloporins的组合的吸收和荧光特性。例如，Acropara aspera的分支尖端的兰色是由于在可见光谱的绿色至橙色部分的强的吸收(吸收峰＝580纳米，而在大于650纳米的波长下没有吸收)和基本上为兰色的荧光发射(图9C)。在紫色种类中，最大吸收略微偏离光谱的红色末端(表3)，但保留了在大约340纳米和/或420-465纳米处的激发的强的兰色荧光。另一方面，粉红色珊瑚，如Pocillopora damicornis(图9F)，它的PPCT吸收峰值在560纳米处，在600纳米以上没有吸收。在这种情况下，大部分黄色和红色光线被传递并被底部的白色珊瑚反射，而由358纳米或484纳米的激发所产生的兰色荧光比较弱或者不存在。许多珊瑚在340纳米波长下具有强的荧光，但在可见光线下没有任何可见的宿主颜色，或者是发冷光的绿色。所述珊瑚可能具有340纳米和420-465纳米激发种类的GFP-样蛋白(绿色发射蛋白)，并且不具有本文所披露的高吸收-低发射兰色或粉红色种类的PPCT。
绿色荧光蛋白是在生物发光水母(Cl.Scyphozoa)Aequoreacictoria中发现的，其中，它在400纳米处具有最大激发(其肩在475纳米处)，发射高峰在509纳米处。在该物种中，GFP在吸收由钙离子激活的光蛋白aequorin发射的兰-绿色光线之后起着发射绿色光线的作用(Morin等，细胞生理学杂志77，313-318)。能形成暗礁的珊瑚不是生物发光的。这样的话，为什么能形成暗礁的珊瑚具有像PPCTs那样的荧光GFP-样蛋白呢？PPCT的分子特性表明，这些蛋白起着光保护和集光的作用，正如由若干作者所提出的。不同的PPCT似乎具有不同的作用，所述高吸收/低发射种类能专一性地吸收波长为550-600纳米的光线，该波长对于PCP复合体的吸收来说太长了(410-550纳米，
图13)，而发射波长对于叶绿素a和c的Qy波段来说太短了。所述低发射PPCT的吸收范围与叶绿素a和c的Qx波段吻合。Qx波段起着吸收由所述叶绿素的不同的偶极方向所产生的散射光线的作用。由于散射光线与总照射的比例随着光线强度而增加，这种特殊的PPCT可能起着光线依赖型过滤色素的作用并能减弱共生双鞭甲藻在高光线环境中的光合抑制作用。高吸收低发射PPCTs的浓度与PAR相关而不是与UV相关这一事实进一步证实了这种作用。
其他PPCT能将UV辐射(低到至少300纳米，图9a)和兰色光线转化成较长的波长。这表明PPCT在高光和低光条件下分别具有两种额外的作用。业已证实阳光照射中的UV成分对珊瑚及其双鞭甲藻共生物具有大的负面影响。通过将UV辐射转化成兰色光线(440-445纳米)，然后再转化成(在很多情况下)兰-绿色(480-490纳米和500-505纳米)，UV辐射能被转化成有害作用较低的可见光辐射，该辐射能够被共生的双鞭甲藻的PCP复合体所吸收(图50)。PCP复合体是高度调控的集光复合体，它能指导捕获供给两种光合系统的能量，或者以加热形式储存多余的光能，通过将光能转移到相关的类胡萝卜素。奇怪的是，某些所述蛋白是如何引导能量偏离大约430纳米的Soret波段而进入PCP复合体的吸收波长的(
图10)。通过这种方式，它们很显然在通过将某些光线转化成能被PCP复合体的其他成分所吸收的某些光线的方式起到限制光线直接进入叶绿素a的作用。某些PPCT在将UV光线转化成较长波长的行为中还表现出在低光习性中起作用。通过将非光合UV光线转化成兰色和绿色光线，PPCT扩展了共生光合作用可以发生的波长范围。因此，在低光习性中，PPCT的300-360纳米和420-465纳米的形式可以起着基于宿主的附加色素的作用，它能增加生长在那里的暗礁形成珊瑚的光线可利用性。荧光色素颗粒能增强深水珊瑚的光合速度的发现进一步支持了PPCT的这种附加作用。表1.来自HPLC凝胶过滤级分的亚基的大小和N-末端氨基酸序列珊瑚种类 洗脱 近似天然 所得亚基(28kD)的时间 分子量 N-末端氨基酸序列〔min〕 (Kd)Slylophora pistillata 27.942NdPocillopora27.6 46NddamiconnisSorjalopora hystrix26.957NdAcropora digilifera27.646NdAcropora horrlda 26.564SVIAKQMTYKVYMSGTV〔SEQ IDNO2〕Acropora formosa 26.564NdAcropora aspera26.465SVIAKQMTYKVYMSGTVN*〔SEQ IDNO7〕Monlipora 26.465SVIAK〔SEQ ID NO1〕monaslerialaMonlipora caliculala 26.269SVIAKQMTYKVYMSGTVN〔SEQ IDNO7〕Poriles murrayansis26.367SVIAKQMTYKVYMSGTVN〔SEQ IDNO7〕Poriles lobala 26.367SVIAKQMTYKVYMSGTVNNHYEFVT〔SEQ ID NO8〕星号表示源于cDNA序列表2. 编码源于暗礁形成珊瑚Acropora aspera的GFP-样蛋白的mRNA的核苷酸序列和氨基酸序列 表3.暗礁形成珊瑚中GFP-样蛋白的最大吸收、激发和相应的发射峰值珊瑚种类 颜色吸收〔nm〕 激发 发射〔nm〕〔nm〕Pocillopora粉红色 560 358 440*damicormis 484 499*570 625Serialopora hystrix粉红色 560 462 482Acropora digilifera+ 紫蓝色 578(550 425 490肩) 570 590Acropora horrida+ 蓝色579 345 400420 485575 625Acropora aspora蓝色580(550340 445*肩)420-450 490*480 500576 630*Montipora 紫色574-578420-450 490manasteriata+570 610Monlipora oaliculata+ 紫色579(545 420-450-465 485肩)Porites lobata 576(545肩)Poriles murrayensis+ 紫色576(545 420485肩) 530550570625Plesilras versipora绿色492 492505*表示图9所示的色素特征+表示与用于制备测序相同的凝胶过滤级分表4.荧光团5内的残基，以及原子接触的细节。
原子数与PDB命名一致荧光团的相互作用稳定化的共振形式用黑体表示蛋白 荧光团 距离残基 原子 残基 原子〔〕Glu-210 OE2 Gln-61OE1 2.5Ser-64NGly-63O2.6Arg-90NH2 Tyr-62O2.7Arg-192 NH1 Tyr-62OH 2.7Glu-210 OE1 Gln-61NE2 2.7Ser-57OGln-61N2.9Gln-37OE1 Gln-61CG 3.0Pro-58OGly-63N3.0Val-39CG1 Gln-61OE1 3.3Glu-143 OE1 Tyr-62CD2 3.4Tyr-115 CD2 Gly-63O3.5Ser-106 OG Gly-63O3.6Asn-141 CB Tyr-62OH 3.7Leu-194 CD2 Tyr-62GE1 3.7Tyr-86OH Gly-63O4.2Met-158 CE Tyr-62OH 4.2Gln-208 CB Gln-61NE2 4.3Glu-139 OTyr-62OH 4.5Asn-156 OD1 Tyr-62CE2 4.6Glu-171 OTyr-62CD2 4.7Leu-56OGln-61N4.8Trp-88NE1 Tyr-62O4.8Cys-209 OGln-61NE2 5.0例3用以下正向和反向引物从pGEM-EASY克隆载体中PCR扩增POC3和POC4POG〔正向〕5′-TCC GTT ATC GCT AAA CAG AT-3′〔SEQ ID NO11〕POC3〔231〕〔反向〕5′-TTT GTG CCT TGA TTT GAC TC-3′〔SEQ ID NO12〕POC4〔235〕〔反向〕5′-CGC CAC TGC GTA TTT GTG CC-3′〔SEQ ID NO13〕POC4〔220〕〔反向〕5′-GGC GACCAC AGG TTT GCG TG-3′〔SEQ ID NO14〕对扩增的序列进行凝胶纯化，并用pBAD TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)插入细菌pBAD TOPO表达载体中，然后再转化到One Shot感受态细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)。通过在pBAD TOPO表达载体上的pBAD正向和反向引导位点之间进行ABI核苷酸测序检查较长序列(231个氨基酸和235个氨基酸)中读框和AA221位置上终止密码子的存在。
通过优化阿拉伯糖的浓度调控pBAD TOPO的蛋白表达。表达的蛋白用以下方式纯化(i)结合在工程蛋白的C-末端合成的六×His尾，以便利用pBAD TOPO转录密码子，和(ii)凝胶过滤层析缺乏六×His标记表达蛋白。例4PPCT能吸收320-700纳米范围内的光线的能力，即转化UVA和UVB辐射，使其成为防晒制剂的有用的防晒成分。例如，所述制剂包括有效防晒量的PPCT，并选择性地与药理学上可以接受的载体或赋形剂混合。包括PPCT的防晒制剂可以通过将PPCT与一种试剂或能使得PPCT不溶于水的组合物混合制成一种乳液而生产。另外，合成的PPCT可以具有“taq”肽或诸如长链脂肪酸的化合物(例如，通过将所述“taq”连接于PPCT的C-末端或靠近该末端。使得PPCT不溶于水，因此能够在含水载体或赋形剂中制成乳液。酰化蛋白的方法，例如酰化蛋白的羧基或氨基(例如，ε-氨基)为本领域所熟知。存在于防晒制剂中PPCT的量通常至少占该制剂重量的1％。优选的含有PPCT的防晒制剂(用具有10个碳原子的脂肪酸酰化)包括(i)大约3％的鲸蜡硬脂基醇，PEG-40蓖麻油和/或cetearyl硫酸钠，(ii)大约10％油酸癸酯，(iii)大约1.5％氢氧化钠(45％的溶液)，(iv)大约0.1-0.5％乙二胺四乙酸二钠，(v)大约0.5％的carbomer，(vi)大约1-10％酰化PPCT，和(vii)用水平衡。
所述防晒制剂还可以含有本领域所公知的防晒剂，例如羟基苯甲酸丙酯，二甲基氨基苯甲酸(PABA)，苯基水杨酸，和/或辛基甲氧基肉桂酸盐。例5PPCT吸收320-700纳米范围内的光线的能力还使其能够用于掺入各种材料中，如玻璃和聚合材料，如perspex中，以便用作过滤器，用于太阳镜镜片、相机、水族箱和温室中。
PPCT的320-700纳米的吸收范围覆盖了叶绿素a的soret波段(430纳米)，更具体地讲，覆盖了叶绿素a和c的Qx波段(550-600纳米)。Qx波段能专一性地吸收与高光强度相关的散射光。因此掺入过滤器中的PPCT起着减弱植物在强光环境中的光合抑制作用的功能。另外，PPCT发射的光线波长大于其激发或最大吸收波长的能力，提供了通过诸如玻璃传递的可能性，与光波长相关的能量不会被传递。所述能量在光合活性辐射(PAR)的范围内的波长下被转移，即400-550纳米，将PPCT用于过滤器中提供了产生用于植物、藻类、珊瑚等生长的改善了的生长条件的可能性。例如，使用能被320-360纳米光线激发的源于A.horrida的PPCT，能够使得UVA光线吸收(大部分不能由玻璃传递)能在430-450纳米的PAR波长下被再次传递。
PPCT的耐高温性(＞40℃)使得PPCT能够方便地掺入或涂敷在玻璃及其他聚合材料(特别是具有较低熔点温度的聚合材料)上。掺入和其他聚合材料，或掺入包衣材料中的PPCT的量一般大于重量的1％。
本领域技术人员可以理解的是，在不脱离本发明的广义的构思或范围的前提下，可以对具体实施方案所表示的本发明进行多种改变和/或改进。因此，从各方面讲，本发明的实施方案被视为说明性的，而不是限定性的。
权利要求
1.一种分离的多核苷酸分子，包括编码来自珊瑚组织的色素蛋白(PPCT)的核苷酸序列，所述蛋白在受到入射光线照射时能发射荧光，其中，所述入射光线的最大吸收在320-600纳米范围内，而最大荧光发射在300-700纳米范围内。
2.如权利要求1的分离的多核苷酸分子，其中，所述编码的色素蛋白对所述入射光线的最大吸收在550-580纳米范围内，而最大荧光发射在400-630纳米范围内。
3.一种分离的多核苷酸分子，包括编码来自珊瑚组织的色素蛋白(PPCT)的核苷酸序列，其中，所述分子包括编码具有以下N-末端氨基酸序列的蛋白的核苷酸序列SVIAK(SEQ ID NO1)。
4.一种分离的多核苷酸分子，包括编码来自珊瑚组织的色素蛋白(PPCT)的核苷酸序列，其中，所述分子包括编码具有以下N-末端氨基酸序列的蛋白的核苷酸序列SVIAKQMTYKVYMSGTV(SEQ ID NO2)。
5.如上述权利要求中任一项的分离的多核苷酸分子，其中，所述编码蛋白包括含有以下氨基酸序列的生色团片段QYG。
6.如上述权利要求中任一项的分离的多核苷酸分子，其中，所述分子包括编码具有相当于SEQ ID NO3或4所示序列的氨基酸序列的蛋白的核苷酸序列。
7.如上述权利要求中任一项的分离的多核苷酸分子，其中，所述分子包括与SEQ ID NO5或6所示序列至少具有80％相同性的核苷酸序列。
8.如权利要求7的分离的多核苷酸分子，其中，所述分子包括与SEQ ID NO5或6所示序列至少具有90％相同性的核苷酸序列。
9.如权利要求7的分离的多核苷酸分子，其中，所述分子包括与SEQ ID NO5或6所示序列至少具有95％相同性的核苷酸序列。
10.如上述权利要求中任一项的分离的多核苷酸分子，其中，所述分子包括基本上相当于SEQ ID NO5或6所示序列的核苷酸序列。
11.一种蛋白，包括以下N-末端氨基酸序列SVIAK(SEQ ID NO1)，所述蛋白为基本上纯化的形式。
12.一种蛋白，包括以下N-末端氨基酸序列SVIAKQMTYKVYMSGTVN(SEQ ID NO2，所述蛋白为基本上纯化的形式。
13.如权利要求11或12的蛋白，其中，所述蛋白包括相当于SEQID NO3或4所示序列的氨基酸序列。
14.如权利要求11-13中任一项的蛋白，其中，所述蛋白可以从选自下列一组的珊瑚科的珊瑚组织中纯化Pocilloporidae、Acroporidae、Poritidae、Faviidae、Merulinidae、Fungiidae。
15.如权利要求14的蛋白，其中，所述蛋白可以从选自下列一组的珊瑚的组织中纯化Acropora aspera、Acropora digitifera、Acroporahorrida、Acropora formosa、Montipora monasteriata、Montiporacaliculata、Pocillopora damicornis、Porites murrayensis、Poriteslobata、Plesiastrea versipora和Seriatopora hystrix。
16.如权利要求14的蛋白，其中，所述蛋白可以从选自下列一组的珊瑚的组织中纯化Acropora aspera、Acropora horrida、Montiporamonasteriata、Montipora caliculata、Porites murrayensis、Poriteslobata和Plesiastrea versipora。
17.一种含有权利要求1-10中任一项多核苷酸分子的载体。
18.一种用权利要求17的载体转染或转化过的宿主细胞。
19.一种用于生产权利要求11-16中任一项的蛋白的方法，其中，该方法包括以下步骤在适于表达编码所述蛋白的多核苷酸分子的条件下，培养用权利要求17的载体转染或转化过的宿主细胞，并选择性地回收所表达的蛋白。
20.如权利要求19的方法，其中，所述培养宿主细胞的步骤是在30-37℃的温度下进行的。
21.如权利要求19的方法，其中，所述培养宿主细胞的步骤是在35℃左右的温度下进行的。
22.一种寡核苷酸探针或引物，包括能与权利要求1-10中任一项的多核苷酸分子选择性地杂交的核苷酸序列。
23.如权利要求22的寡核苷酸探针或引物，其中，所述探针或引物包括至少8个核苷酸。
24.如权利要求22的寡核苷酸探针或引物，其中，所述探针或引物包括至少18个核苷酸。
25.如权利要求22的寡核苷酸探针或引物，其中，所述探针或引物包括至少25个核苷酸。
26.如权利要求22-25中任一项的寡核苷酸探针或引物，其中，所述寡核苷酸与一种可检测的标记缀合。
27.将权利要求11-16中任一项的蛋白用作组织标记、荧光标记或普通染料的用途。
28.一种防晒制剂，含有有效量的权利要求11-16中任一项所述的蛋白，该蛋白与一种合适的药理学上可以接受的载体或赋形剂混合。
29.一种用于过滤紫外线或其他波长的入射光线的过滤器，包括有效量的权利要求11-16中任一项的蛋白。
30.如权利要求29的过滤器，其中，所述紫外线或其他波长的入射光线是通过由所述蛋白吸收与所述光线相关的能量然后再以比所述入射光线长的波长发射而被过滤的。
31.如权利要求30的过滤器，其中，被吸收的所述入射光线的能量以400-550纳米的波长从所述蛋白上发射。
全文摘要
披露了来自珊瑚的色素蛋白(PPCT)和编码所述色素蛋白的多核苷酸分子。所述色素蛋白在受到入射光线辐射时会发出荧光,其中,所述入射光线的最大吸收在320－600纳米范围内,而最大荧光发射在300－700纳米。还披露了所述色素蛋白的用途,特别是用作组织标记、荧光标记或一般染料。
文档编号C12Q1/68GK1345330SQ00805766
公开日2002年4月17日 申请日期2000年2月2日 优先权日1999年2月2日
发明者O·赫格－古尔德博格, S·多维 申请人:悉尼大学