专利名称：海藻糖基水解酶及其制备和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种海藻糖基水解酶及其制备和用途，特别是涉及一种新型嗜酸耐热海藻糖基水解酶，它能够在酸性高温环境下特异性水解非还原性多糖中海藻糖部分和其余糖基部分之间的键，所述的非还原性多糖含有海藻糖结构为一个末端单位且葡萄糖聚合度为3或更高。本发明还涉及能产生所述酶的微生物及该酶的制备，用所述酶得到的海藻糖，及含所述海藻糖的组合物。
已知海藻糖或α，α一海藻糖是一种由葡萄糖单位组成的非还原性多糖。如在Advances in Carbohydrate Chemistry.Academic Press，1993，18201-225和Applied and Environmental Microbiology.1990，563213-3215中描述的那样，海藻糖广泛存在于生物界，包括动物、植物和微生物之中均存在此糖，但含量较低。海藻糖是一种非还原二糖，常态下为白色晶体，爽口甘甜且无后味，其甜度为砂糖的45％；因为该糖具有独特的生物学功能，对多种生物大分子和细胞膜有显著的保护作用，其用途和潜在作用十分广泛，可作为生物制品及活菌制剂的保护剂和稳定剂使用，也可在食品及化妆品中用做天然添加剂。因此迫切要求能够工业化大规模制备海藻糖。
传统的海藻糖制备方法包括如日本专利公开No.154,485/75中利用酵母提取物的方法及日本专利公开No.216,695/83中报道的用麦芽糖磷酸化酶和海藻糖磷酸化酶联合转化麦芽糖生成海藻糖的方法。然而，由于前者用作为起始材料的酵母体中，海藻糖的含量通常低于15W/W％(除非特别说明，本说明书中的术语“W/W％”缩写为“％”)，并且提取和纯化步骤复杂，因此不适于工业化生产。后者有下列缺点(I)由于海藻糖是经葡萄糖-1-磷酸形成的，不可能将作为底物的麦芽糖浓度调整到符合要求的高水平(II)磷酸酶的酶反应系统是传递反应，而实际生产中很难获得稳定的连续酶反应系统，因此海藻糖产率比较低，使该方法也不能作为工业化生产方法。
考虑这些因素，大家现在都努力寻找一种利用淀粉水解制备海藻糖的新途径。结果如日本专利申请No.362,13l,92中公开的，人们发现从土壤中分离的根瘤菌(Rhizobium sp.)M-11(CCTCC M94031)和节杆菌(Arthrobacter sp.)Q36(CCTCC M94030)能产生一种海藻糖基水解酶，在常温下与能形成具海藻糖末端单位且葡萄糖聚合度为3或更高的非还原多糖的海藻糖基合成酶一起使用，水解淀粉直接生产海藻糖。该海藻糖基水解酶能够在常温下水解有海藻糖末端单位且具有3或更高的葡萄糖聚合度的非还原性多糖中，海藻糖部分和其余糖基部分之间的键，释放海藻糖。因此用此海藻糖制备方法，从非还原性淀粉部分水解物生产海藻糖较以前的方法有很大的进步。但由于该方法中微生物培养周期长，产酶水平低，特别是该酶的热稳定性差，不耐酸，导致生产工艺复杂，糖转化率低下，生产成本偏高等众多不利因素，不能适应现代淀粉糖化生产中高温、高效、高质的需求。这是因为在实际生产中，淀粉水解温度低于55℃时，极容易染菌造成生产污染；此外反应过程中溶液pH会不断下降而导致不耐酸的酶类失活，但中性条件下，淀粉又容易老化，形成不溶沉淀，影响生产；这些都是该方法中明显的不足。为解决这个问题，迫切需要筛选一种新型海藻糖基水解酶，它既能有高的水解活力和理想的热稳定性，在55℃以上的环境中不失活，也要求具备理想的pH稳定性，特别在酸性条件下，也能具备稳定的酶活力。
为了达到上述目的，本发明人广泛筛选了能够生产这种新酶的微生物，所述酶可以在高温酸性环境中从具有海藻糖结构作为一个末端单位并且葡萄糖聚合度为3或更高的非还原性多糖中水解释放海藻糖。结果，我们发现了埃希氏菌属的微生物菌株(E.coli)MTH-11能够产生水解具有海藻糖末端结构且葡萄糖聚合度为3或更高的非还原多糖形成海藻糖的海藻糖基水解酶；我们发现，在高温酸性条件下在当与同样耐热耐酸的海藻糖基合成酶共同使用时，这种新型海藻糖基水解酶能够以令人满意的高产率催化水解反应形成海藻糖，而且通过让这种新型海藻糖基水解酶和海藻糖基合成酶对还原性淀粉部分水解物作用，并回收海藻糖含量相对高的反应混合物，很容易制备海藻糖。我们还发现，与来自埃希氏菌属的微生物一样，芽孢杆菌属、酵母菌的微生物也能够产生相似的水解具有海藻糖末端结构且葡萄糖聚合度为3或更高的非还原多糖形成海藻糖的海藻糖基水解酶，对此我们也进行了同样的研究并完成了本发明。我们同时也研制了含由上述制备方法制备的海藻糖的组合物，如食品、化妆品和药物，并完成了本发明。
本发明人已将这些微生物分别命名为“大肠杆菌(Escherichia coli)MTH-11”和“酵母菌(Saccharomyces)MTH-8”，并于2000年12月27日保藏于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心(China GeneralMicrobiological Culture Collection Center，即CGMCC)(中国，北京，中关村)。保藏号分别为CGMCC No 0526(大肠埃希氏菌，MTH-11)和CGMCC No 0525(酵母菌，MTH-8)。
除上述微生物外，埃希氏菌属、芽孢杆菌属、酵母属的其它菌株和其突变体；只要能产生本发明的新型嗜酸耐热海藻糖基水解酶，就适用于本发明，所述的海藻糖基水解酶能够在高温酸性条件下特异性水解具有海藻糖结构作为末端单位且葡萄糖聚合度为3或更高的非还原多糖中海藻糖部分和其余糖基部分之间的键。
任何营养培养基只要上述微生物能生长于其上，且能产生本发明的海藻糖基水解酶，就可用于本发明例如可随意使用合成的和天然营养培养基。任何含碳的物质只要它被所述微生物利用，就可作为碳源用于本发明所述碳源的实例是糖类，如葡萄糖，果糖，乳糖，蔗糖，甘露醇，山梨醇，糖蜜，淀粉和淀粉部分水解物；有机酸类如柠檬酸和琥珀酸。可以适当选择这些碳源在营养培养基中的浓度例如，在用葡萄糖时，从所述微生物生长和繁殖的角度看，优选的浓度通常是10％或更低，最好是1％或更低。可用于本发明的氮源有无机氮化合物，如铵盐和硝酸盐；含有机氮的物质，如脲，玉米浆，酪蛋白，蛋白胨，酵母提取物和牛肉膏。可用于本发明的无机盐有钙盐，镁盐，钾盐，钠盐，磷酸盐及锌，铁，铜，钼和钴的其它盐。如果需要，可以添加氨基酸和维生素。
将在本发明中可用的微生物于需氧条件下，通常在4-50℃的范围，优选的25-45℃的范围；及pH4-10；优选的pH5-9条件下培养。将在本发明中适用的培养时间调整至比所述微生物生长开始所需的时间更长，优选的是，8-100小时。没有特别限制营养培养基中溶解氧(DO)的浓度，通常使用0.5-20ppm范围的DO是令人满意的。通过控制通气率，搅拌营养培养基，通气补充氧，及增加发酵容器的内压，可将DO浓度保持在该范围内。该微生物的培养方式可以是分批培养，也可以是连续培养。
在微生物培养完成后，回收本发明的酶。在细胞和无细胞上清液中，都发现具有活性的本发明酶，可将其分别回收并用作粗酶；也可将所得的培养物原封不动地用作粗酶。在本发明中，可以使用传统的液—固分离方法，以便从培养物中分离细胞。例如，可以将所得的培养物直接离心的方法，以及预涂布滤器将其过滤或通过使用板框滤器或空心纤维的膜过滤分离细胞的方法，可将因此得到的无细胞滤液原封不动地用作酶溶液或在使用前将其浓缩，也可将获得的细胞直接破碎提取酶液。本发明中可用的浓缩方法如，加热法，使用硫酸铵的盐析，使用丙酮和醇的沉淀法，使用如板框滤器和空心纤维膜的浓缩法。
可将无细胞滤液和其浓缩物用于传统的固定方法。传统方法的实例是使用离子交换剂的结合法，使用树脂和膜的共价键合吸附法，以及使用高分子量物质的包埋法。可以将从所得培养液中分离的细胞用作粗酶而不需任何进一步的处理或在使用前将其固定。例如，将细胞与藻酸盐混合，在氯化钙液中滴所得的混合物，将珠滴胶凝成颗粒，从而固定细胞。可以用聚亚乙基亚胺或戊二醛固定所得的颗粒。可以将由细胞提取的酶制品，作为粗酶溶液使用。通过从细胞中提取本发明的酶，包括用超声波，使用玻璃珠和氧化铝的机械破碎，法兰西压(Frenchpress)破碎等，使得到的提取物经加热预处理、离心或膜过滤，从而得到含本发明酶的粗酶澄清溶液。
可以原封不动地使用由此得到的粗酶溶液或在使用前用传统方法将其纯化。例如可以通过粗酶液浓缩、透析，然后用“DEAE-Fast Flow”(一种阴离子交换剂)的阴离子交换柱上层析；用“Phenyl-Sepharose”(一种疏水树脂)的疏水柱层析；和使用“Sephaeryl S-200”(一种凝胶过滤树脂)的凝胶过滤层析，从而制备电泳上呈一条带的纯酶制品。
由此得到的本发明海藻糖基水解酶有下列物理化学特性；1.作用特异性水解具有海藻糖结构作为一个末端单位且葡萄糖聚合度为3或更高的非还原多糖中，海藻糖部分和其余糖基部分之间的键；2.分子量在十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)上约55,000到65,000道尔顿；3.等电点(PI)在用两性电解质的等电点电泳上约5.5到6.6；4.最佳温度在pH5.5保存30分钟时，60～85℃；5.最佳pH在65℃保存30分钟时，5.0～6.0；6.热稳定性在pH5.5保存60分钟时，可稳定的温度为约30～80℃；7.pH稳定性在25℃保存16小时，可稳定的pH为4.0～11.0。
按下列步骤检测本发明海藻基水解酶的活性将0.1ml酶溶液加到0.4ml 1.25w/w％麦芽三糖基海藻糖(别名α-麦芽四糖基α-葡萄糖苷)的50mm醋酸缓冲液(pH5.5)中，将混合物在75℃培养30分钟。将所得的反应混合物加到Somogyi铜溶液中进行Somogyi反应，以终止酶反应；然后用Somogyi-Nelson方法确定还原能力。作为对照，在100℃将酶溶液预热15分钟以使酶失活，按与上述相似的方法检测。本发明中将1单位的酶活性定义为在该条件下，每分钟增加1μmol葡萄糖还原能力所需的酶量。
任何物质只要它是一种含有海藻糖结构作为一个末端单位且葡萄糖聚合度为3或更高的非还原多糖，就可作为本发明酶的底物。所述底物的实例是葡萄糖基海藻糖，麦芽糖基海藻糖，麦芽三糖基海藻糖，麦芽四糖基海藻糖和麦芽五糖基海藻糖，这些糖是由海藻糖基合成酶作用于麦芽三糖，麦芽四糖，麦芽五糖，麦芽六糖和麦芽七糖而形成的。除这些底物外，通过用淀粉酶或酸部分水解淀粉类物质如淀粉、支链淀粉和直链淀粉而制备的，具有末端海藻糖结构且葡萄糖聚合度为3或更高的低还原性淀粉部分水解物也适用于本发明。
部分水解淀粉的所述淀粉酶的实例是在Handbook of Amyloses andRelated Enzymes(由Pergamon Press；Tokyo，Japan(1988)出版)中公开的α-淀粉酶、麦芽五糖形成淀粉酶和麦芽六糖形成淀粉酶。可以将这些淀粉酶与脱支酶如支链淀粉酶和异淀粉酶结合使用。
对在本发明中用作底物的还原性淀粉部分水解物的浓度没有特别的限制。根据本发明甚至可以在含0.1％或50％底物的溶液中进行酶反应，形成海藻糖。在本发明中也可使用含过量底物的不可溶悬浮物。在本发明酶反应中可用的反应温度可以是本发明酶不失活的温度，即最高达约80℃，优选的在55-80℃。在本发明酶反应中可用的反应pH是4.5-8.0，优选在pH5-7。应根据酶反应条件来选择本发明酶反应所用的时间，通常，当以0.1-100单位/g底物使用本发明的酶时，大约需0.1-100小时。
关于从材料底物制备海藻糖的产率，特别是在由具有相对低DE值又同时具有相对高的葡萄糖聚合度的非还原性淀粉部分水解物制备海藻糖的情况下，本发明的海藻糖制备方法具有提高海藻糖产率的优点，其产率大于用日本专利申请No.362,131/92中公开的制备方法(其中海藻糖基合成酶与葡糖淀粉酶结合使用)所得的产率。本发明的制备方法，其中，海藻糖基合成酶与本发明的海藻糖基水解酶结合使用，可以约70％或更高的产率形成海藻糖，而日本专利申请的制备方法，形成海藻糖的产率只有约30％。
本发明的酶机制如下首先用海藻糖基合成酶将具有相对高的葡萄糖聚合度的还原性淀粉部分水解物转变成1摩尔具有海藻糖结构作为末端单位的非还原多糖，然后，用本发明的海藻糖基水解酶将所得的非还原多糖水解成1摩尔海藻糖和1摩尔比原材料还原性淀粉部分水解物的葡萄糖聚合度低2的还原性淀粉部分水解物。对于新形成的葡萄糖聚合度为3或更高的还原性淀粉部分水解物，可以将其进一步转化为有一个海藻糖作为末端单位的非还原多糖，然后，用海藻糖基水解酶转变成1摩尔的海藻糖和淀粉部分水解物。因此，重复前述海藻糖基合成酶和海藻糖基水解酶的酶反应，可以从1摩尔还原性淀粉部分水解物形成多摩尔的海藻糖分子及非还原性淀粉部分水解物。(如
图1)在本发明制备方法中，可以同时使用海藻糖基合成酶和本发明的海藻糖基水解酶以作用于葡萄糖聚合度为3或更高的非还原性淀粉部分水解物，或以该顺序连续使用这两种酶作用于非还原性淀粉部分水解物。为了进一步提高海藻糖产率，也可使所得的反应混合物进一步经葡糖淀粉酶的作用。
用常规方法过滤并浓缩由此得到的反应混合物以除去不可溶物质，然后用活性炭将所得的溶液脱色，用H-和OH-形式的离子交换剂脱盐，进一步浓缩成浆状产品后，可以随意地将糖浆产品干燥成粉状产品。
如果需要，用一种或多种方法，如离子交换柱层析、活性炭或硅胶的柱层析分级分离进行纯化；用有机溶剂如乙醇和丙酮分离法；用降解剩余还原多糖的碱处理法等，很容易将粉状产品加工成高纯度的海藻糖产品。
如果需要，按照本发明，可以用淀粉酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶和/或海藻糖酶水解含海藻糖的多糖产品，或用环状糊精葡聚糖转移酶和/或葡糖基转移酶催化的多糖—转移反应以控制其甜度和还原力并降低其粘度。此外，可以随意氢化多糖产品将其转变成糖醇，从而降低其还原力。可以用上述的纯化方法，如离子交换柱层析从所得的产品中除去葡萄糖以制备海藻糖含量高的组份。可以很容易将由此得到的组份纯化并浓缩成糖浆产品，且根据需要可以进一步将糖浆产品浓缩成过饱和浓液并结晶以得到含水或无水的结晶海藻糖。
在本发明中可用的离子交换柱层析技术包括，在日本专利公开No.23,799/83和72,598/83中公开的使用强酸阳离子交换树酯的方法。使用这些技术，可以很容易地除去在粗海藻糖产品中所含的伴生糖以得到高海藻糖含量的产品。在这种情况下，可以随意使用固定床、移动床和半移动方法。
为了制备含水的结晶海藻糖，将约65-90％的海藻糖溶液放在—结晶器中，于95℃或更低，优选10-90℃的范围内，在存在0.1-20％晶种的情况下，边搅拌边逐渐冷却以得到含有含水结晶海藻糖的糖膏。可以在本发明中使用传统方法，如分离法、块粉碎作用、流化床或成粒作用及喷雾干燥法以便从糖膏或晶状多糖制备含水的结晶海藻糖。
在分离时，使糖膏经篮式离心以便从母液中分离含水的结晶海藻糖，如果需要，用少量冷水喷洗含水结晶海藻糖以促进高纯度含水结晶海藻糖的制备。喷雾干燥时，通过从一个高压泵嘴射具有60-85％浓度，约20-60％结晶度的糖膏，用含约60-100℃不融化所得晶体粉末的热空气干燥，边搅拌所得粉末边通热空气约1-20小时，很容易制备没有或基本没有吸湿性的结晶多糖。在块粉碎作用时，使水分含量为约10-25％且结晶度为约10-60％的糖浆放几小时或3天以便使全部内含物结晶并固化成块，粉碎或切割所得的块，并将所得物干燥，从而很容易地制备没有或基本没有吸湿性的结晶多糖。尽管可以通过干燥含水的结晶海藻糖以脱水来制备无水结晶海藻糖，但一般方法是通过将水分含量低于10％的高海藻糖含量溶液置于结晶器中，在搅拌条件下，于50-160℃，优选80-140℃的范围，添加晶种的情况下处理溶液以得到无水结晶海藻糖的糖膏，在干燥和高温下将其结晶，用传统方法如块粉碎法、流化床成粒法和喷雾干燥将所得的无水结晶海藻糖粉碎，从而制备无水结晶海藻糖。
由此得到的本发明海藻糖是稳定的且基本上没有还原能力，并可以与其它物质，特别是氨基酸、多肽和蛋白质混合，而不必顾虑引起焦化变质和产生令人讨厌的气味。海藻糖本身有令人满意的品质和甜度，且容易被体内的海藻糖酶水解，因此口服时能被机体同化，吸收和利用。此外，海藻糖基本上不会被诱发龋齿的微生物发酵，因此这可使其用作防龋齿的甜味剂。
可以将本发明的海藻糖制成药剂，如用于输血和管饲法的营养药剂，可以随意地将其施用于活体并很容易被活体代谢和利用而不必担心起毒性和副作用。因此，有利于将这些产品作为用于机体的能量补充剂。
海藻糖是稳定的甜味剂，特别是与粘合剂如支链淀粉，羟乙基淀粉或聚乙烯吡咯烷酮结合使用时，晶体海藻糖可随意被用作片剂的糖包衣剂。另外，海藻糖有许多特性，如控制渗透压的能力、赋予填料的能力、赋予光泽的能力、保持湿度的能力、赋予粘度的能力、基本不发酵性、防止胶凝化淀粉退化的能力、以及防止其它多糖结晶的能力。
因此，可随意地将本发明中海藻糖和含海藻糖的多糖组合物作为甜味剂、味道改善剂、质量改善剂、稳定剂和填充剂用于各种组合物如食品、香烟、烟草、饲料、化妆品和药物。
可将本发明中海藻糖和含海藻糖的多糖组合物原封不动地用作甜味调料。可根据需要与足量的一种或多种其它甜味剂，如粉化的糖浆、葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、异构糖、蜂蜜、槭糖、赤藓糖、山梨醇、甘露醇、乳糖醇、甜叶菊苷、阿里塔姆(Alitame)、甘草甜、天冬甜精(Asparmate)、糖精、甘氨酸和丙氨酸或填充剂如糊精、淀粉和乳糖一起使用。
可以原封不动地使用含本发明海藻糖和含海藻糖的多糖组合物的粉末或结晶与其它赋形剂、填充剂、稀释剂和粘合剂混合，并制成颗粒、球棒，扁片、锭剂和片剂。
含本发明海藻糖和含海藻糖的多糖组合物可以与有酸味、盐味、苦味、涩味及美味的其它物质很好地兼容，并有相对高的耐酸性和热抗性。因此可很好地将其用于食品、作为甜味剂、味道改善剂和质量改善剂。
可以将本发明海藻糖和含海藻糖的多糖组合物用于调味剂中，如氨基酸、肽、酱油、粉末化的酱油、酒、蛋黄酱、调味品、醋、酱菜、方便调料、核酸调味品、混合调料、食糖和咖啡糖。
可以将本发明海藻糖和含海藻糖的多糖组合物随意用于增加以下食品的甜味糕点、果胨、面酱、乳脂糖；甜食如甜点心，饼干，干酪，小甜饼，派，布丁，黄油，八宝粥，牛奶蛋糊，奶油酥，牛奶鸡蛋格子甜饼，海绵蛋糕，油炸饼圈，巧克力，口香糖，焦糖和糖果；冷冻甜点如冰激凌和甜味果汁粉、糖浆；加工过的水果和蔬菜如果酱、蜜饯、番茄酱；腌菜和腌制食品如腌萝卜、腌榨菜和腌黄瓜；肉产品如火腿和香肠；鱼肉产品如鱼火腿，鱼肠，鱼干；干菜如紫菜，脱水蔬菜；奶产品，如牛奶、豆奶；罐装和瓶装产品如肉，鱼肉，水果和蔬菜罐头；含醇饮料如米酒，黄酒，葡萄酒和白酒；软饮料如咖啡，茶，可可，果汁，碳酸饮料，酸牛奶饮料和含乳酸菌的饲料；方便食品如即食布丁混合物，即食热糕点混合物和即食汤混合物；和特殊食品，如婴儿食品、药疗食品、太空食品，全营养素；本发明海藻糖和含海藻糖的多糖组合物能改善上述食品的味道和质量。
也可将本发明海藻糖和含海藻糖的多糖组合物用于动物如家畜、家禽、蜜蜂、蚕和鱼的饲料和宠物食品，以改善其口味爱好。也可将海藻糖和含海藻糖的多糖组合物用作甜味剂、味道改善剂、质量改善剂和稳定剂添加进如烟草、香烟、牙膏和牙膏粉、口红、胭脂、唇膏、面霜、内服药、鱼肝油、口服降温剂、含漱剂、化妆品和药物。
可将本发明海藻糖和含海藻糖的多糖组合物作为质量改善剂和稳定剂用于对其有效成分和活性丧失敏感的生物活性物质，及含生物活性物质的健康食品和药物组合物。上述生物活性物质的实例是淋巴细胞活素如α-，β-，和γ-干扰素，α-肿瘤坏死因子(INF-α)，β-肿瘤坏死因子(TNF-β)，巨噬细胞迁移抑制因子，集落刺激因子，转移因子和白细胞介素2(IL-2)；激素如胰岛素，生长激素，泌乳素，红细胞生成素和卵泡刺激素；生物制品如BCG疫苗，日本脑炎疫苗，麻疹疫苗，活脊髓灰质炎疫苗，天花疫苗，破伤风类毒素，抗毒素和人免疫球蛋白，兽用注射疫苗；抗生素如青霉素，红霉素，氯霉素，四环素，链霉素和硫酸卡那霉素；维生素如硫胺，核黄素，L-抗坏血酸，鱼肝油，类胡萝卜素，麦角甾醇和生育酚；酶如脂酶，弹性蛋白酶，脲激酶，蛋白酶，α-乙酰乳酸脱羧酶，β-淀粉酶，异淀粉酶，聚葡糖酶和乳糖酶；提取物如人参提取物，龟鳖提取物，藻类提取物，芦荟提取物、蜂胶提取物；可存活的微生物菌种，如病毒，乳酸菌和酵母；其它生物活性物质如蜂王浆。通过使用本发明海藻糖和含海藻糖的多糖组合物，可以很容易将上述生物活性物质加工成具有令人满意的稳定性和质量的健康食品和药物组合物，而不必担心其有效成分和活性的丧失或丢失。
按上文所述，将本发明海藻糖和含海藻糖和多糖组合物掺入上述物质的方法包括传统方法，例如混合、捏合、溶解、融化、浸泡、渗透、喷淋、敷、涂上、喷、注射、结晶和固化。通常以0.1％或更高，优选的1％或更高的量，将本发明海藻糖和含海藻糖的多糖组合物掺入上述的物质和组合物中。
附图简要说明
图1表示由淀粉通过海藻糖基合成酶和海藻糖基水解酶生成海藻糖简图。其中，○葡萄糖残基●葡萄糖残基还原端 -α-1.4葡萄糖苷键～α.α-1.1-葡萄糖苷键d.p.n聚合度≥3。
图2为大肠杆菌MTH-11海藻糖基水解酶的“DEAE-Fast Flow”凝胶色谱柱洗脱图谱。
图3表示大肠杆菌MTH-11的海藻糖基水解酶的最适反应温度。
图4表示大肠杆菌MTH-11的海藻糖基水解酶的最适pH值。
图5表示大肠杆菌MTH-11的海藻糖基水解酶的温度稳定性。
图6表示大肠杆菌MTH-11的海藻糖基水解酶的pH值稳定性。
下列实施例说明从微生物大肠杆菌MTH-11和酵母菌MTH-8，以及迄今已知的微生物中生产并纯化本发明的嗜酸耐热海藻糖基水解酶。
实施例1海藻糖基水解酶的制备含0.1w/v％蛋白胨，0.05w/v％酵母提取物，0.1w/v％葡萄糖和0.1w/v％氯化钠的液体营养培养基，调pH到7.0，将约50ml等份的液体营养培养基放在250ml Erlenmeyer烧瓶中，在15 lbf/in2(1.034×105Pa)高压蒸汽灭菌30分钟，冷却，用大肠杆菌MTH-11种子培养物接种，在转速为220转/分的摇床上30℃培养12小时，收集所得的培养物并用作种子培养物。
将约3升上述新鲜制备的液体营养培养基放在5升的发酵罐中，灭菌，冷却到28℃，用5％的种子培养物接种，并在28-37℃，pH6.0-8.0，搅拌并通气的条件下培养约4-6小时，当培养液的OD600为0.3-1.0时，提高培养温度至38-42℃继续培养3-6小时。培养结束后，将培养物于4℃，6000转/分离心10分钟，分离成菌体细胞和上清液。
实施例2酶的纯化对由实施例1方法得到的菌体进行处理，用100ml醋酸缓冲液(pH5.5)重新悬浮菌体，在冰浴条件下超声波破碎，直到菌体悬浮液变清亮为止；所得悬浮液于70℃保温半小时后，11,000rpm下离心20分钟得到约100mL上清液为粗酶液。然后用20mL“DEAE-Fast Flow”(一种阴离子交换剂)装填的柱进行柱层析；目标蛋白海藻基水解酶被吸附于离子交换剂上，用新鲜制备的以不同盐浓度的醋酸缓冲液将它从柱上洗脱下来。图2表示了该柱层析的洗脱图谱。在盐浓度为0.3M时，海藻糖基水解酶被从柱上洗脱下来，合并含海藻基水解酶酶活的组份并精制。
把合并的含有海藻糖基水解酶的组份在新鲜制备的用2M硫酸铵补充的同一醋酸缓冲液中透析。透析液于10000rpm下离心30分钟除去不溶物，所得上清液用以10ml“Phenyl-Sepharose”(一种疏水树脂)装填的柱进行疏水柱层析。用从2M到0M范围的线性梯度缓冲液将吸附于凝胶的酶从柱上洗脱下来，回收具有酶活性的组份。将所得组份精制并用“Sephaeryl S-200”(一种凝胶过滤树脂)装填的柱进行凝胶过滤层析，回收具有酶活性的组份。
表1显示了每个纯化步骤中海藻糖糖基水解酶的总酶活性、比活性及收率。
总酶活力 比活 收率(U) (U/mg) (％)粗酶液 134800 27热处理 134800 73100DEAE-Fast Flow离子柱层析 109180 153 81Phenyl-Sepharose疏水柱层析 68748 220 51Sephaeryl S-200凝胶柱层析 32350 557 24纯化过的酶制品(由表1中凝胶过滤柱得到的洗脱液)，使用7.5％聚丙烯酰胺，在电泳上测定其纯度。结果，观察到酶制品呈单一蛋白谱带，这表明它是具有较高纯度的电泳单一制品。
实施例3海藻糖基水解酶的性质使用含10％十二烷基磺酸钠的聚丙烯酰胺凝胶，将由实施例2方法得到的纯酶制品进行电泳，并通过将它与蛋白分子量标记进行比较，测得其分子量为约55,000-66,000道尔顿。
使用含2w/v％两性电解质“AMPHOLINE”，对实施例2方法得到的纯酶制品进行等电点电泳(isoeletrohopresis)。将所得凝胶切成片，然后测定它们的pH值，得到该酶的pI为约5.5-6.6。
根据对酶活性的分析来研究温度和pH对该酶活性的影响。图3(温度的影响)和图4(pH的影响)分别显示了这些结果。
当于pH5.5保存30分钟时，该酶的适宜温度为约60-85℃，在65℃保存30分钟时，该酶的适宜pH为约5.0-6.0。
通过将在50mm醋酸缓冲液(pH5.5)中的酶在不同温度下保存60分钟，然后用冷水冷却测试试管中的缓冲液并测定每份缓冲液中残留的酶活性，从而来测定该酶的热稳定性。通过将在不同pH的广泛围缓冲溶液在25℃保存16小时，调整这些缓冲液至pH5.5，然后分析每份缓冲液中残留的酶活性来测定该酶的pH稳定性。图5和图6分别显示了该酶的热和pH稳定性结果。该酶在温度高达约80℃和pH约4-11下是稳定的。
实施例4从末端为海藻糖结构且葡萄糖聚合度为3或更高的非还原多糖制备海藻糖按日本专利申请No.362,131/92所述的方法来制备非还原多糖用作底物，它具有末端为海藻糖结构且葡萄糖聚合度为3或更高。分别向作为底物的含20％麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖或麦芽七糖的水溶液中加入2单位/g底物的海藻糖基合成酶，将所得混合物于75℃和pH5.5下进行酶反应48小时。将该反应混合物100℃加热，使残留的酶失活，过滤、脱色、脱盐并浓缩得到一种浓的糖溶液，然后用“XT-1016”(Na型，聚和度为4％的一种离子交换剂)对该溶液进行柱层析。在柱层析中，用内径为2.0cm，长为1m的3个套层的不锈钢柱装填离子交换剂，然后将这些柱顺序级联并加热至柱内温达55℃，将5v/v％浓糖溶液(对树脂量)上样，当湿度保持在55℃，且在SV(体积速度)为0.13下用55℃热水洗脱，得到高纯度的非还原多糖，该糖具有末端为海藻糖结构且葡萄糖聚合度为3或更高。在得到的制品中，葡糖基海藻糖制品含葡糖基海藻糖的纯度为97.6％，麦芽糖海藻糖、麦芽三糖基海藻糖、麦芽四糖基海藻糖和麦芽五糖基海藻和麦芽五糖基海藻糖在它们的高纯度制品中的纯度分别为98.6％、99.6％、98.3％和98.1％。
分别配制含20％上述5种非还原多糖制品的水溶液，然后将该溶液与实施例2中得到的纯化的海藻糖基水解酶以2单位/g底物的量混合，然后将所得溶液于75℃和pH5.5进行酶反应48小时。把得到的每种反应混合物脱盐并经高压液相色谱(HPLC)(使用REZEX RNMCARBOHYDRATE柱)分析其组成。作为对照，将新鲜制备的同样的海藻糖基水解酶作用于麦芽糖寡糖，例如麦芽糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖和麦芽七糖，并经HPLC分析得到的每种反应混合物的组成。表2显示该结果。
表2
表3中的结果表明1、根据本发明的海藻糖基水解酶特异地水解具有海藻糖结构作为一个末端和葡萄糖聚合度为3或大于3的非还原多糖中的海藻糖部分和糖基部分之间的键，形成海藻糖和一种葡萄糖聚合度为1或大于1的非还原糖；2、麦芽寡糖不被本发明的海藻糖基水解酶所水解。
这些结果证实本发明的海藻糖基水解酶是一种新酶，它具有在高温酸性条件下特异地水解带有海藻糖结构作为一个末端且葡萄糖聚合度为3或大于3的非还原多糖中的海藻糖部分和糖基部分间的键，从而将海藻糖从非还原多糖中释放出来。
为纯化各种反应混合物中的海藻糖，将该反应混合物用以“XT-1016(Na+型)”(一种碱金属型强酸阳离子交换树脂)装填的柱进行柱层析，之后回收含97％或更高的海藻糖的组份。将这些组份合并并浓缩至约65％浓度，将该浓缩物于25℃放置2天使其结晶出水合结晶海藻糖，然后分离出这些结晶并真空下干燥得到纯度为99％或更高的高纯度海藻糖制品。用葡萄糖基海藻糖、麦芽糖基海藻糖为底物制备海藻糖的收率分别为9.5％、14.9％、16.0％、18.5％和17.7％。研究了高纯度海藻糖制品和市场上购得的海藻糖样品(作标准品)的熔点、融化热、比旋光、红外吸收光谱、X-衍射图谱及对海藻糖酶(Sigma产品)的水解作用的敏感度。结果，各种海藻糖制品显示的熔点为97.6±0.5℃、融化热为57.9±1.2KJ/mol和比旋光为+182±1.1°，与标准海藻样品的数值十分吻合，此外这些海藻糖制品的红外吸收光谱和X-衍射图谱也与标准海藻样品的十分吻合。与标准的海藻糖样品相似，这些海藻糖制品很容易被海藻糖酶水解成为葡萄糖单体。
这些结果明确证实，由本发明的海藻糖基水解酶作用于具有海藻糖结构作为一个末断且葡萄糖聚合度为3或大于3的非还原多糖形成的非还原多糖是海藻糖。
实施例5从非还原性的淀粉部分水解物制备海藻糖经加热使含5％蜡状玉米淀粉的悬浮液明胶化，调至pH4.5，加热到50℃，与一种异淀粉酶(isoamylase)样品以4,000单位/g淀粉的量混合，并使该酶反应持续20小时。该反应混合物于120℃高压灭菌10分钟，冷至60℃，然后用以750ml“Toropearl 50s凝胶”装填的柱进行凝胶过滤层析，得到葡萄糖聚合度为35-10的还原性淀粉部分水解物。
将上述得到的还原性淀粉部分水解物或葡萄糖聚合度为3的麦芽三糖作为底物溶于10mM醋酸缓冲液(pH5.5)制成1％溶液，然后将该溶液与4单位/g底物的海藻糖基合成酶和纯化的海藻糖基水解酶(以实施例2中方法制备)以4单位/g底物的量混合，并于75℃进行酶反应24小时。待酶的反应完全后，将得到的每种反应混合物进行脱盐并经HPLC分析其组成。
将剩余的每种反应混合物加热到50℃，调pH至4.5，以50单位/g底物的量与葡萄淀粉酶样品混合，然后进行24小时酶反应。与上面相似，将得到的部分反应混合物进行脱盐并以HPLC分析其组成。表3显示了该结果。
表3
A海藻糖基合成酶+本海藻糖基水解酶B海藻糖基合成酶+本海藻糖基水解酶+葡萄淀粉酶如表3所示，在使用葡萄糖聚合度为3的麦芽三糖为底物的情况下，经海藻糖基合成酶与本海藻糖基水解酶发生酶反应后的海藻糖收率比较低，即4.3％，但在使用葡萄糖聚合度为10-35的淀粉部分水解物为底物的情况下，该海藻糖的收率比较高，即67.4-80.4％。并发现还原性淀粉部分水解物的葡萄糖聚合度越高，所得海藻糖的纯度也越高。还发现通过使葡萄淀粉酶作用于由两种酶水解还原性淀粉部分水解物制得的反应混合物，将伴生的具有海藻糖末端且葡萄糖聚合度为3或大于3的非还原多糖水解成海藻糖和葡萄糖分子，能提高所得海藻糖的浓度。
实施例6美拉德反应将1％甘氨酸、10％高纯度海藻糖(纯度为99.5％，通过实施例4的方法获得)溶于50mM磷酸缓冲液中(pH7.0)，于100℃保存90分钟，然后冷却该溶液并测定它在480nm波长处的光吸收。以同样处理的葡萄糖和麦芽糖作为对照，结果见表4。
表4
该结果表明本发明的海藻糖制品经美拉德反应诱导后仅表现为较浅的颜色，其颜色程度仅为葡萄糖和麦芽糖的约0.3-0.5％。说明该海藻糖基本上不参与美拉德反应，本发明的海藻糖是一种当它们与氨基酸混合时，对氨基酸的破坏威胁性较小的一种糖。
实施例7由已知微生物生产的海藻糖基水解酶及其性质迄今已知的微生物菌株中的酵母菌MTH-8和芽孢杆菌T-3，已被发明者证实它们能产生本发明的海藻糖基水解酶，与实施例1相似，将这两种菌株分别在发酵罐中30℃培养12小时。将所得的每种菌株的2L培养液收集菌体后使细胞破碎，并离心得到上清液，然后顺序用“DEAE-Fast Flow”(一种阴离子交换剂)的阴离子交换柱上层析；用“Phenyl-Sepharose”(一种疏水树脂)的疏水柱层析；和使用“SephaerylS-200”(一种凝胶过滤树脂)的凝胶过滤层析得到纯化的酶制品，然后研究它的性质。酵母菌MTH-8和芽孢杆菌T-3的海藻糖基水解酶基本与大肠杆菌MTH-11相似。
下述实施例A描述了本发明海藻糖基水解酶的制备，用该酶制备的海藻糖及含海藻糖的糖组合物，实施例B描述了含一种或多种这类海藻糖和糖的组合物实施例A-1按实施例1的方法，将大肠杆菌MTH-11的种子培养物接种到3L的营养培养基上，并在5L发酵罐中培养7小时。发酵完后，将所得发酵液离心，分离成菌体细胞和上清液。用100ml醋酸缓冲液(pH5.5)重新悬浮菌体，在冰浴条件下超声波破碎，直到菌体悬浮液变清亮为止；所得悬浮液于70℃保温半小时后，11,000rpm下离心20分钟得到约100mL上清液为粗酶液，该溶液含1380单位/ml的海藻糖基水解酶。
往15％的土豆淀粉悬浮液中加入碳酸钙使其终浓度达0.1％，将所得溶液调至pH6.0，与0.2％的高温α-淀粉酶样品混合，接下来于95℃进行酶反应15分钟，该反应混合物在2kg/cm2压力下高压灭菌消毒30分钟，冷却至75℃，调pH至5.5，以1,000单位/g淀粉的普鲁兰酶与4单位/g淀粉的海藻糖基合成酶及4单位/g上述海藻糖基水解酶溶液混合，接下来进行48小时的酶反应。如此得到的反应混合物于100℃保持10分钟，冷却并过滤，所得滤液以常规方法用活性炭脱色，用H-和OH-型离子交换剂脱盐并纯化，之后再将得到的溶液浓缩得为60％糖浆，收率约为92％。
该糖浆含有71.2％海藻糖、2.4％葡萄基海藻糖、3.3％麦芽糖基海藻糖、0.7％葡萄糖、9.1％麦芽糖、12.1％麦芽三糖和1.2％的麦芽四糖和高级寡糖，它具有爽口适中的甜味，较低的还原性及适宜的粘度和保湿性能。由于这些性质，它可任意地用于食品、化妆品和药品中，作为甜味剂、矫味剂、增质剂、稳定剂、稀释剂、填充剂和赋形剂。
实施例A-2通过实施例1的方法得到的糖溶液为原料溶液，用以“XT-1016”(Na+型，4％的聚合度，一种碱金属型强酸阳离子交换树脂)填装层析柱分离。该过程如下用内径5.4cm的4个套层的不锈钢柱装填树脂，将该柱顺序级联使得到的总凝交床深度为20m。将该柱加热到柱内温度55℃，并在该温度保持下，以5V/V％的糖溶液(对树脂)上柱，用55℃热水洗脱分离该糖溶液，以除去伴生的糖，例如麦芽糖和麦芽三糖，之后收集富集海藻糖的馏分。将得到的该组份合并、纯化、浓缩、真空干燥并粉碎得到高浓度海藻糖粉，收率为约58％。
该产物中海藻糖的浓度为约97％，且该产物具爽口适中的甜味，因此它可任意地用于食品、化妆品和药品中作为甜味剂、矫味剂、增质剂、稳定剂、赋形剂和填充剂。
实施例A-3通过实施例A-2方法得到的高浓度海藻糖溶液，用活性炭脱色，离子交换剂脱盐，并浓缩成70％溶液，然后将该溶液放入结晶皿中，混入约2％水合海藻糖结晶作为晶种，再缓慢冷却得到一糖膏，其结晶率约为45％。该糖浆经高压干燥喷雾，获得海藻糖结晶粉末，并将其注入老化塔中老化干燥10小时使之完全结晶，获得粉末状结晶海藻糖，收率为90％。
该产物基本上不吸湿，便于保存，可作为甜味剂、矫味剂、增质剂、稳定剂、赋形剂和填充剂任意地用于食品、化妆品和药品。
实施例A-4与实施例A-3相似，将实例A-2方法获得的高浓度海藻糖溶液，置于蒸发器中，真空蒸发得到湿度约为3.0％糖浆。将该糖浆放在结晶皿中，加入约1％的水合结晶海藻糖，于120℃下搅拌结晶5分钟，将产物置于老化塔中，于100℃老化6小时得到块状物。
将所得块状物用粉碎机粉碎，并经流化床干燥即得到粉状水合结晶海藻糖(其湿度约为0.4％)，收率约为88％。该产物可任意作为食品、化妆品、药品的干燥剂、甜味剂或填充剂使用。
实施例A-5按实施例A-1的方法，将大肠杆菌MTH-11的种子培养物接种到3L营养培养基上，用发酵器培养12小时，培养完后，用SF-膜滤去细胞得到约3L滤液，该滤液再用SF-膜浓缩至100mL酶溶液，该溶液含有约190单位/ml的海藻糖基水解酶。
通过加热6％的土豆淀粉悬浮液明胶化，调至pH4.5，加热至50℃，以500单位/g淀粉的量混入异淀粉酶样品，接下来进行20小时的酶反应。将该反应混合物调到pH6.5，于120℃高压灭菌10分钟，冷至95℃，以0.1％/g淀粉的量混入高温α-淀粉酶，接下来进行15分钟酶反应。该反应混合物于130℃高压灭菌30分钟，冷至75℃，调pH至5.5，加入10单位/g淀粉的海藻糖基合成酶及上述酶溶液，之后进行酶反应64小时。所得反应混合物于100℃保持20分钟，冷至50℃，调pH于5.0，以10单位/g淀粉的量混入葡萄淀粉酶，之后进行酶反应40小时，并加热使残留的酶失活。将如此得到的溶液以常规方法用活性炭脱色，用离子交换剂脱盐并浓缩为约60％溶液(含80.5％的海藻糖)。该溶液浓缩成82％溶液，之后置于结晶皿中并混入约占该溶液干重2％的水合结晶海藻糖作为晶种，在搅拌下结晶出海藻糖。将所得结晶放入平面塑料容器中，于室温放置3天使结块，用粉碎机将块状物粉碎得到粉状水合结晶海藻糖，收率90％。
该产物基本上不吸湿，易于保存，因此它作为甜味剂、矫味剂、增质剂、稳定剂、赋形剂和填充剂，可任意用于各种组合物中，例如食品、化妆品和药品和生物制品中。
实施例A-6按实施例1中的方法，将菌种酵母菌MTH-8的种子培养物接种于营养培养基中，在发酵罐中培养72小时。所得3L培养液于10,000rpm下离心20分钟除去细胞，用UF-膜浓缩得到的上清液，得200mL酶溶液，它含有25单位/ml的海藻糖基水解酶。
将1份重的土豆淀粉与6份重的水和0.01份重的高温α-淀粉酶混合搅拌，调至pH6.2并加热至85～90℃使淀粉明胶化和液化。所得液态淀粉于120℃高压灭菌10min使剩余的酶失活，冷至75℃，调pH至5.5，以500单位/g淀粉的异淀粉酶样品混合，另与10单位/g淀粉的海藻糖基合成酶及上述酶溶液混合，然后进行酶反应48小时。待反应完全后，于100℃将该反应混合物加热20min使剩余酶失活，调至50℃和pH5.0，以10单位/g淀粉量与葡萄糖淀粉酶混合，之后进行酶反应40小时，并加热使剩余的酶失活。如此得到的反应混合物以常规方法用活性炭脱色，用离子交换剂脱盐并浓缩成约60％溶液，该溶液含78.3％的海藻糖。与实施A-2的方法相同，只是使用CG6000(Na+型碱金属型强酸阳离子交换树脂)作为离子交换剂，将浓缩的溶液进行离子交换柱层析，得到高浓度海藻糖组份，它含有约95％的海藻糖。将所得组份浓缩到75％的浓度，置于一平面塑料容器中结晶，于室温放置并老化3天，使结块，然后将该块状物用粉碎机粉碎，得到粉状水合结晶海藻糖，收率为约70％。
该产品基本上没有吸湿性且易于保存，能任意地用作各种组合物，例如食品、化妆品和药品中的甜味剂、矫味剂、增质剂、赋形剂、填充剂和稀释剂。
实施例A-7按实施例1的方法，将芽孢杆菌T-3菌种的种子物接种到营养培养基上，在发酵器中培养36小时，得到的3L培养液用细胞破碎仪处理。所得混合物于10,000rpm下离心30min除去残留物，用UR-膜浓缩得到的上清液，得到100ml溶液，该溶液含12.5单位/ml的海藻糖基水解酶。
33％的木薯淀粉悬浮液与碳酸钙混合使其终浓度为0.1％，并调其pH至6.0，与0.3％α-淀粉酶混合，然后在95℃进行酶反应20min。所得反应混合物在2kg/cm2压力下高压灭菌30min，冷却至75℃。再以200单位/g淀粉量与异淀粉酶样品混合，以0.2ml/g淀粉量与10单位/g淀粉的海藻糖基合成酶及上述酶溶液混合，之后75℃进行酶反应48小时。如此得到的反应混合物于100℃保持20min，冷却并过滤，得到滤液，该滤液以常规方法用活性炭脱色，用H-和OH-型离子交换剂脱盐，再浓缩成60％糖浆，收率为约90％。
该产物含有60.1％海藻糖、1.4％葡糖基海藻糖、1.5％麦芽糖基海藻糖、1.0％葡萄糖、6.5％麦芽糖、8.3％麦芽三糖、21.2％麦芽四糖和高级寡糖，它具有爽口适中的甜味，还具有较低还原性和适当的保湿性能。由于这些因素，它可任意地用于各种组合物，例如食品、化妆品和药品中作为甜味剂、矫味剂、增质剂、稳定剂、赋形剂、填充剂和稀释剂。
实施例A-8将通过实施例A-6方法得到的含约95％海藻糖的高浓度溶液，以常规方法脱色和脱盐。将所得溶液浓缩成75％溶液，然后将该溶液转移到一结晶皿中，混入2％的水合结晶海藻糖作为晶种，加热至50℃，搅拌下逐渐冷至25℃，用篮式离心分离出结晶。喷入少量水洗涤所得到纯度为99％的高纯度水合结晶海藻糖，收率为约50％。
实施例B-1甜味剂往通过实施例A-5方法得到的1份重的粉状水合结晶海藻糖中加入0.01份重的天冬甜精和0.01份重的甜叶菊苷，将得到的混合物送入制粒机，得到粒状甜味剂。该产品有令人满意的甜味，且甜度为蔗糖的2.5倍，热量值为蔗糖的2/5。
由于该产品的低热量且具有令人满意的稳定性，不会分解混入的其它甜味剂，非常适宜作为向肥胖者和糖尿病患者提供的低热量食品的低热量甜味剂。
当诱导龋齿的细菌作用于该产物时，它基本上不形成酸和不溶性的葡聚糖，因此可用作甜味剂而防止龋齿的产生。
实施例B-2硬糖果将100份重的55％蔗糖溶液与30份重的海藻糖糖浆(通过实施例A-7方法得到)加热混合，真空浓缩至湿度低于2％。向该浓溶液中加1份重的柠檬酸和足量的柠檬酸芳香剂和着色剂混匀后，用常规方法制成所需产品。
该产品是一种高质量的硬糖果，它具有令人满意的味道和咀嚼特性，并且不用担心会产生蔗糖结晶。
实施例B-3口香糖将3份基姆胶加热至熔化变软，之后与4份重的蔗糖和3份重的水合结晶海藻糖粉(通过实施例A-3方法得到的)混合，再与足量芳香剂和着色剂混合。用常规方法将所得混合物用辊揉制成型并包装得所需产品。
该产品是一种具有令人满意的结构和味道的口香糖。
实施例B-4
甜浓缩牛奶将通过实施例A-1方法得到的三份重的海藻糖浆和1份重的蔗糖溶于100份新鲜牛奶中，所得溶液经平板加热器加热灭菌并浓缩成70％的浓度，随后将得到的浓缩物无菌装罐成所需产品。
该产品具有牛奶甜味和令人满意的味道，这使它可任意地用在婴儿食品、新生儿食品、水果、咖啡、可可和茶中作调料。
实施例B-5乳酸饮料将170份重的脱脂牛奶、130份重的海藻糖糖浆(通过实施例A-1的方法得到)和50份重的高含量乳蔗糖粉(如日本专利公开No.281,795/92中所公开)溶于1150份重的水中。所得溶液于65℃灭菌30min，冷却至40℃并接种30份重的乳酸菌作为起始物，于37℃培养8小时后得到所需产品。
该产品是一种味道令人满意的芳香的乳酸饮料。因为该产品中含有寡糖，可以保持乳酸菌的稳定并促进双歧菌的生长。
实施例B-6粉末果汁将33份重经喷雾干燥得到的粉状橘汁和50份重的高纯度海藻糖粉(通过实施例A-2方法制得)、10份重的蔗糖、0.65份重的无水柠檬酸、0.1份重的苹果酸、0.1份重的L-抗坏血酸、0.1份重的柠檬酸钠、0.5份重的支链淀粉和足量粉状芳香剂混合均匀。将所得混合物粉碎并送入制粒机制粒，同时以作为粘合剂的海藻糖糖浆(通过实施例A-1方法得到)喷雾并用40℃空气通风。将获得的粒状物进行称重并包装得所需产品。
该种含30％橘汁的产品能在较长时间内保持其高品质而不会产生异味。
实施例B-7牛奶蛋糊冻将100份重的玉米淀粉、100份重的海藻糖浆(通过实施例A-7方法得到)、80份重的乳糖、20份重的蔗糖和1份重的盐混合均匀后，再逐渐加入280份重的鸡蛋和100份重的沸牛奶，并继续加热搅拌，当混合物中淀粉完全明胶化时停止加热，得到半透明物，然后冷却该混合物并往其中加入足量香草香精。将所得混合物称重并注装得所需产品。
该产品表面光滑并具光泽，并有牛奶味和甜味。
实施例B-8豆沙酱用10份重的大豆为原料，以常规方法与水混合并煮沸，在去除豆的涩味和精糙感及水溶性杂质后，往所得物中加入14份重的蔗糖、5份重的海藻糖糖浆(通过实施例A-1方法得到)和4份重的水，并将所得混合物煮沸，与少量沙拉油混合并小心捏合到使豆不成糊状。这样，就制得了约35kg所需产品。
不因煮沸而褪色的该产品具有令人满意的味道和香味，这使它可用作豆沙酱面包、豆沙酱包子、汤圆、豆沙酱薄脆饼、米糕和冰激凌的原料。
实施例B-9面包将100份重的麦粉、2份重的酵母、5份重的糖、1份重的粉状水合结晶海藻糖(通过实施例A-3方法得到)、0.1份重的食用酵母粉混合后按一般方法加水捏合，于26℃发酵2小时，老化30分钟并烤制。
该产品是一种高品质的面包，具有令人满意的颜色、甜度和松软性。
实施例B-10火腿往1000份重的切成片的火腿肉中加入15份重的盐和3份重的硝酸钾并均匀磨碎，将该火腿肉片堆起并放在冷藏室过液。然后，将该火腿肉片先于冷藏在盐溶液中浸泡7天，该盐溶液含500份重的水、100份重的盐、3份重的硝酸钾、40份重的非还原多糖的粉末(通过实施例A-6方法制备)及足量胡椒，再以常规方法用冷水洗，挂起薰制，烹煮，冷却包装得所需产品。
该产品是一种高质量的火腿，具有令人满意的颜色、味道和芳香。
实施例B-11
豆奶粉将1份重的豆奶与两份重的结晶海藻糖粉末(通过实施例A-6的方法制备)混合，所得混合物放入塑料器皿中，于50℃真空干燥并粉碎得到粉末豆奶粉。
该产品具有令人满意的味道和芳香，可任意地用作糖果，例如预混物、冰糕和冰激凌的原料，也用作口服或饲料喂形工的婴儿食品和治疗用营养品的原料。
实施例B-12粉末蛋黄用新鲜鸡蛋制得的蛋黄，用平板加热器于60～64℃灭菌，将1份重的所得液体与4份重的粉状无水结晶海藻糖(通过实施例A-4得到)混合。并转入—容器中，放置过夜使结块，此时无水结晶海藻糖转化成水合结晶海藻糖。将这样得到的块状物用粉碎机粉碎得到粉末蛋黄。
该产品可任意地用作糖果，例如预混物、冰激凌和乳制品的原料，还有口服或饲喂形式的婴儿食品和治疗用营养的原料。该产品也可用作皮肤护理剂和生发剂。
实施例B-13化妆霜按常规方法加热溶解2份重的聚7二醇单硬脂酸酯、5份重的单硬脂酸甘油酯(自身乳化的)、2份重的高纯度海藻糖粉(通过实施例A-2方法得到)、1份重的α-糖基芦丁、1份重的液态凡士林、10份重的三-2-乙基环己酸甘油酯和足量抗菌剂。将所得溶液与2份重的L-乳酸、5份重的1，3-丁二醇和66份重的纯化水混合，并用均化器乳化所得混合物，再在搅拌下混入足量香精，得到化妆霜。
该产品有较高稳定性，可任意地用作高质量防晒霜、皮肤护理剂和皮肤增白剂。
实施例B-14粉末人参提取物将半份重的人参提取物与1.5份重的粉状无水结晶海藻糖(通过实施例A-4方法得到)混合，所得混合物转入平面容器中，使之放置2天将无水结晶海藻糖转化为水合结晶海藻糖，结块。用粉碎机粉碎所得块状物，分份得到粉末人参提取物。
该产物和足量维生素B1和B2装入制粒机制得含维生素的粉末人参提取物。
这样得到的该产品可任意地用作滋补剂、疲劳恢复剂和强身剂。
该产品也可用作生发剂。
实施例B-15固体药品将天然的人α-干扰素制品用常规方法上固定有抗人α-干扰素抗体的柱以吸附α-干扰素，并将作为稳定剂的一种含牛血清的缓冲液上柱，然后除去过量蛋白。此后，用含5％高含量海藻糖粉(通过实施例A-2方法得到)的生理盐水将α-干扰素从柱上洗脱下来，此时生理盐水的pH发生变化。将所得洗脱液进行膜过滤，滤液通过加入20倍体积的无水结晶麦芽糖粉，产物脱水后粉碎，并将所得粉末通过制片机制片，得到每片含约150单位天然人α-干扰素的药片，每片重约200mg。
该产品可作为舌下片给患者口服，剂量为每人1-10片/天，并任意地用于治疗病毒性疾病、变态反应、关节炎、糖尿病和肿瘤。更具体地，该产品适于用作治疗AIDS和肝炎的药剂，患有这类疾病的患者数显著增加。混在该中的海藻和麦芽糖作为天然人α-干扰素的稳定剂，其活性在室温下也能较长时间、较好地保持。
实施例B-16糖包衣片重150mg的未加工的片，用溶液进行包衣直至片的总重达230mg，该包衣用溶液组成为40份重的粉状水合结晶海藻糖(通过实施例A-3方法得到)、2份重的香草香精(平均分子量为200,000)、30份重的水、25份重的滑石粉和3份重的二氧化钛；将所得片剂再用一种溶液包衣，该溶液组成为65份新鲜制备的相同的水合结晶海藻糖、1份重的香草香精和34份重的水，并用液态石蜡上光，得到具有令人满意光泽和外观的糖包衣片。
该产品有较高的贮存耐受性并能在相当长的时间内保持其高质量。
实施例B-17牙膏通过将下列组份混合，用常规方法制备牙膏磷酸氢钙45.0％香草香精2.95％月桂基磺酸钠1.5％甘油20.0％聚氧乙烯脱水山梨醇 0.5％抗菌剂 0.05％粉状水合结晶海藻糖(通过实施例A-3方法制备)12.0％麦芽醇5.0％水 13.0％该产品由于有足够的甜味，可令人满意地作为新生儿用牙膏。
实施例B-18全营养素制备由下列组份组成的组合物500份重的的粉状水合海藻糖结晶(通过实施例A-6的方法制备)、270份重的粉末蛋黄、209份重的脱脂牛奶、4.4份重的氯化钠、1.8份重的氯化钾、4份重的硫酸镁、0.01份重的硫胺素、0.1份重的抗坏血酸钠、0.6份重的维生素E和0.04份重的尼克酰胺。将该组合物以25g每等份装入防潮的小袋并热封制得所需产品。
将1袋该产品溶于约150～300ml的水制成流食，通过饲喂经口或非胃肠道施用到鼻腔、胃或肠道，以补充机体能源。
实施例B-19超级营养液将通过实施例A-8方法制备的高纯度水合结晶海藻糖溶于水中制成10/w/v％海藻糖水溶液，然后以常规方法将该水溶液进行膜过滤除去热原，无菌条件下装入塑料瓶中，封口得所需产品。
该产品是一种令人满意的稳定超级营养液，存放时基本上不会产生变化，适于静脉和腹内施用。该产品的10w/v％溶液与血液是等渗透，并表明它可以高于葡萄糖2倍的浓度向机体提供能量。
实施例B-20超级营养液将通过实施例A-8方法制备的高纯度水合结晶海藻糖和由下组份组成的氨基酸组合物搅拌下溶于水中，得到浓度分别为5w/v％和30w/v％的溶液，以常规方法将该水溶液进行膜过滤除去热原，无菌条件下装入塑料瓶中，封口得所需产品。
氨基酸组合物的组成组份 mg/100mlL-异亮氨酸 180L-亮氨酸 410L-赖氨酸单盐酸盐 620L-甲硫氨酸 240L-苯丙氨酸 290L-苏氨酸 180L-色氨酸 60L-缬氨酸 200L-精氨酸盐酸盐 270L-组氨酸单盐酸盐 130甘氨酸 340虽然该产品是一种含有海藻糖和氨基酸的复合超级营养液，但它具有令人满意的稳定性，存放时基本不会发生变化，该产品可任意地用于向机体补充能源和氨基酸。
实施例B-21治疗损伤用软膏将200份重的高含量的海藻糖粉(通过实施例A-2方法制得)和300份重的麦芽糖与含有3份重的硫磺的50份重的甲醇溶液混合，该所得溶液再与200份重的的10w/v/％的香草香精水溶液混合，得到具有令人满意的伸展性和粘着性的所需产品。
该产品中含有的硫磺表现出杀细菌活性，该产品中的海藻糖作为活细胞的能量补充剂，由于这些性质，该产品缩短了创伤表面的愈合期，并使其恢复令人满意。
由上可见，当本发明的海藻糖基水解酶与海藻糖基合成酶一起，作用于还原性淀粉部分水解产物时，它能以较高收率从非还原多糖中释放生成海藻糖，所述非还原多糖具有海藻糖结构末且葡萄糖聚合度为3或高于3。这样得到的海藻糖可被简便地分离和纯化，所得的海藻糖和含有它的糖组合物具有令人满意的稳定性及较高的质量和中度甜味。当口服未加工的产品或经胃肠道施用输液剂时，该海藻糖可方便地被机体消化、吸收和利用。海藻糖本身和含有它的糖组合物可任意地用作各种组合物，例如食品、化妆品和药品中的甜味剂、增质剂、稳定性、赋形剂和填充剂。
因此，本发明提供限一种工业规模制备海藻糖和含有它的糖组合物的新技术，该技术以价廉和资源丰富的淀粉制备的淀粉部分水解产物为原料，具有较低成本。所以，本发明给许多领域带来不可预测的巨大影响，这些领域包括如淀粉、酶和生化科学等，其它工业领域有食品、化妆品、药品工业，及林业、渔业、农业、家畜和化学工业。因此，本发明对这些领域有着深远而巨大的影响。
考虑到在此的描述是本发明的优选实施方案，但很清楚其中可以进行各种修改和补充。因此本发明既包含了符合本发明实质精神和范围内的附属权利要求，也包括了与此相关的所有此类修改和补充产生的权力要求。
权利要求
1.一种新型嗜酸耐热海藻糖基水解酶，所述酶能在pH5.5，75℃条件下特异性高效水解具有海藻糖结构作为一个末端单位且葡萄糖聚合度为3或更高的非还原多糖中，海藻糖部分和其余糖基部分之间的键，并具有如下的物理化学特性(1)作用特异性水解具有海藻糖结构作为一个末端结构且葡萄糖聚合度为3或更高的非还原多糖中，海藻糖部分和其余糖基部分之间的糖苷键；(2)分子量在十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)上约55,000到65,000道尔顿；(3)等电点(PI)在用两性电解质的等电点电泳上约5.5到6.6；(4)最佳温度在pH5.5保存30分钟时，60～85℃；(5)最佳pH在65℃保存30分钟时，5.0～6.0；(6)热稳定性在pH5.5保存60分钟时，可稳定的温度为约30～80℃；(7)pH稳定性在25℃保存16小时，可稳定的pH为4.0～11.0。
2.根据权利要求1所述的酶，其中所述的酶是一种来自微生物的酶。
3.根据权利要求2所述的酶，其中所述微生物是选自埃希氏菌属、芽孢杆菌属、酵母属的微生物。
4.根据权利要求3所述的酶，其中所述埃希氏菌属的微生物是埃希氏菌属大肠杆菌(Escherichia Coli)MTH-11，保藏号为CGMCC No.0526。
5.根据权利要求3所述的酶，其中所述酵母菌的微生物是酵母属(Saccharomyces sp)MTH-8，保藏号为CGMCC No.0525。
6.根据权利要求3所述的酶，其中所述芽孢杆菌属的微生物是芽孢杆菌(Bacillus sp.)T-3。
7.一种制备权利要求1所述的酶的方法，所述方法包括在营养培养基中培养能生产所述酶的微生物以形成所述的酶，并回收所得的酶；所述微生物为选自埃希氏菌属、芽孢杆菌属、酵母菌的微生物。
8.一种制备海藻糖的方法，包括(a)使权利要求1的酶作用于含有海藻糖结构作为一个末端单位且葡萄糖聚合度为3或更高的非还原多糖溶液，所述酶能特异性水解所述非还原多糖中海藻糖部分和其余糖基部分之间的键；(b)纯化所得的海藻糖；
9.根据权利要求8所述的方法，其中将步骤(a)中的所述酶与海藻糖基合成酶一起使用，所述的海藻糖基合成酶能形成一个或多个具有海藻糖结构作为一个末端单位且葡萄糖聚合度为3或更高的非还原多糖。
10.根据权利要求8所述的方法，其中步骤(a)中还包括使葡萄糖淀粉酶作用于步骤(a)中所得溶液的步骤。
11.根据权利要求8所述的方法，其中步骤(b)包括使步骤(a)中所得的含海藻糖溶液经装有强酸阳离子交换树脂的柱的柱层析以纯化海藻糖的步骤。
12.根据权利要求8所述的方法，其中步骤(b)还包括将步骤(b)中所得溶液中的海藻糖制成含水或无水的结晶海藻糖的步骤。
13.根据权利要求8所述的方法，其中所述糖基部分由一个或多个葡萄糖残基组成。
14.一种制备含海藻糖的多糖组合物的方法，包括(a)使权利要求1所述的酶作用于具有海藻糖作为一个末端单位且葡萄糖聚合度为3或更高的非还原多糖以形成海藻糖，所述的酶能特异性水解所述非还原糖中海藻糖部分和其余糖基部分之间的键；(b)回收所得的含海藻糖和其它多糖的多糖组合物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中将步骤(a)中的所述酶与能形成一个或多个具有海藻糖结构作为末端单位且葡萄糖聚合度为3或更高的非还原多糖的海藻糖基合成酶一起使用。
16.根据权利要求14所述的方法，其中步骤(a)还含有使葡萄糖淀粉酶作用于步骤(a)中所得溶液的步骤。
17.根据权利要求14所述的方法，其中步骤(b)还包括将步骤(a)所得溶液中的海藻糖结晶成含水或无水晶体海藻糖。
18.根据权利要求14所述的方法，其中所述糖基部分由一个或多个葡萄糖残基组成。
19.一种制备含海藻糖的组合物的方法，包括(a)使权利要求1所述的酶与海藻糖基合成酶一起作用于含一种或多种葡萄糖聚合度为3或更高的还原性淀粉部分水解物以形成海藻糖，所述海藻糖基合成酶能形成具有海藻糖结构作一个末端单位且葡萄糖聚合度为3或更高的非还原多糖；(b)回收带有或不带有其它多糖的所得的海藻糖；(c)将带有或不带有其它多糖的海藻糖掺入物质构成组合物。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述的组合物是食品。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述的组合物是化妆品组合物。
22.根据权利要求19所述的方法，其中，所述的组合物是药物组合物。
23.一种降低还原性淀粉部分水解物的葡萄糖聚合度而不增加其还原能力的方法，包括步骤使权利要求1所述的酶和海藻糖基合成酶一起作用于含一种或多种葡萄糖聚合度为3或更高的还原性淀粉部分水解物的溶液，所述的海藻糖基合成酶能形成一种或多种具有海藻糖结构作为一个末端单位且葡萄糖聚合度为3或更高的非还原多糖。
全文摘要
本发明公开了一种新型嗜酸耐热海藻糖基水解酶及其制备和用途,该酶可以从埃希氏菌属、芽孢杆菌属、酵母属的微生物中获得,能够在高温酸性条件下高效水解具有海藻糖结构作为一个末端单位且葡萄糖聚合度为3或更高的非还原多糖中,海藻糖部分和其余糖基部分之间的键。该酶分子量约55000到65000道尔顿;等电点约为5.5到6.6。该酶很容易通过微生物发酵大量制备,并用于工业化制备海藻糖。该海藻糖可广泛地用于食品、化妆品和药品组合物中。
文档编号C12N1/20GK1364899SQ0110041
公开日2002年8月21日 申请日期2001年1月10日 优先权日2001年1月10日
发明者吴襟, 陈炜 申请人:中国科学院微生物研究所