专利名称：对鳞翅目与鞘翅目昆虫高毒力的Bt基因、表达载体和工程菌的制作方法
技术领域：
本发明属于生物防治技术领域。进一步，本发明涉及对鳞翅目、鞘翅目害虫均有高毒力的Bt基因、表达载体和工程菌。更进一步，本发明涉及对鳞翅目、鞘翅目害虫均有抗性的Bt cry1Ba3基因序列、cry1Ba/cry3Aa基因组合方式，以实现两种基因的高效表达；还涉及广宿主表达载体pGM1105。
本发明的研究背景苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)在芽孢形成期能产生一种杀虫活性的晶体蛋白，已被广泛地应用于农业、林业、卫生害虫的防治。
1983年，Krieg等(Krieg，A.等，J.Appli.Entomology，1983，96500-508)分离到第一株对鞘翅目害虫高毒力的Bt菌株(Bt.tenebrionis)。1987年，Herrnstadt(Herrnstadt，C.等，Gene，1987，57(1)37-46)克隆了第一个对鞘翅目害虫有活性的Bt杀虫蛋白基因cry3Aa，用于防治马铃薯甲虫(Leptinotarsa decernlineata(Say))。美国Ecogen公司(Sick，A.等，Nucl.Acids Res.，1990.18，1305；Entwistle，P.F.等，An Environmental BiopesticideTheory andPractice[M]，Wiley Chichester Press，UK，1993，125-146)利用质粒结合转移等细胞工程手段构建了对鳞翅目和鞘翅目有活性的Bt工程菌。
由于单一基因编码一种蛋白，害虫很快对Cry3A蛋白产生抗性(Whalon，M.E.等，J.ofEconomic Entomology，1993，86(2)226-233；Nicholas，D.等，Transgenic Plant and Insect PestsBiocontrol[M]，John Wiley & Sons Press，USA，1997，1-18)。这样由于害虫抗药性的迅速产生，将极大缩短转基因产品的使用寿命，造成巨大的浪费。1993年Chang，C.Y.M.等人(Chang，C.Y.M.等，Appl.Environ.Micro.1993，59815-821.)报导了Bt以色列亚种中不同晶体蛋白对蚊子幼虫存在协同增效作用。
因此，筛选高毒力的蛋白组合，进而进行基因组合，将能提高Bt产品的杀虫活力，扩大它的杀虫谱。更重要的是，不同性能的杀虫蛋白能有效克服或延缓害虫的抗药性产生，具有很强的实用性。
本发明的内容本发明的目的针对目前世界上防治鞘翅目害虫所使用的Bt制剂以及转基因产品基因品种单一、害虫易于产生抗性、杀虫谱较窄等不足，本发明采用两种对鞘翅目高毒力的基因cry3Aa7和cry1Ba3进行组合，提高毒力，并利用cry1Ba3基因对鳞翅目害虫也有活性的特点，扩大产品的杀虫谱，以应用于转化微生物和植物，使之表现对相关害虫的毒性，并克服、延缓害虫对工程菌和转基因植物抗药性的产生。
进一步，为便于研究Bt杀虫蛋白基因在不同微生物受体菌中的表达，本发明构建一种能在三种亲本微生物中自由穿梭的载体，克服了现有载体宿主范围窄的不足，并通过将Btcry3Aa7基因插入其中，完成一系列的检测工作。
本发明的技术方案1.Bt22菌株中cry3Aa基因的克隆按照Narva(Narva，K.E.等，EP0462721 A2，1991，8)等方法从Bt22菌株中提取质粒DNA，用HindIII酶完全消化质粒DNA，进行Southern杂交，探针由cry3Aa基因特异引物扩增质粒DNA而获得，为1.38kb。引物为5’CGAACAATCGAAGTGAACATGATAC3’CATCTGTTGTTTCTGGAGGCAAT用32p进行标记；杂交方法按“分子克隆实验指南”进行，得到杂交结果(见图1)。发现在3kb有杂交信号，从凝胶中回收3.0kb的质粒DNA HindIII酶切片段，纯化后与pBluescript SK(+)相连接，转化大肠杆菌JM107，以cry3A基因特异性引物进行PCR检测，筛选到阳性重组质粒pBY33(图2、图3)。重组质粒含有3.0kb的cry3A基因大片段。对其进行亚克隆得到pBY33-5、pBY33-6、pBY-16三种重组质粒，分别含有0.72、1.6、0.675kb的外源基因片段。DNA序列测定由北京六合通生物工程公司完成。该基因由Btδ内毒素基因国际命名委员会命名为cry3Aa7。
2.从Bt17菌株中克隆cry1Ba基因提取Bt17菌株质粒DNA，用Sau3A I酶进行部分酶切，从凝胶中回收2-7kb DNA片段，纯化后与经BamHI消化、碱性磷酸酶处理的pBluescript SK(+)载体进行连接，转化大肠杆菌JM107后，用cry1Ba基因特异性引物Sun1Ba5/3对进行PCR扩增，筛选阳性转化子。5’和3’端引物分别为正向引物(Forward primer)TCCTGCAGTTGACTTCAAATAGG；反向引物(Reverse primer)CAGTCGACTCATCCGATAAACACGCCAC’.
筛选得到重组质粒pHT3-66，该质粒含有cry1Ba基因全长DNA片段。进行DNA序列分析，结果表明该基因含有3687bp，由1229个氨基酸组成，分子量为139.5kDa。在第1055位碱基因与已知cry1Ba1基因不同，其编码的氨基酸也变成了精氨酸，即Bt17菌株中氨基酸序列与已知基因存在差异。该基因由Btδ内毒素基因国际命名委员会命名为cry1Ba3。
3.穿梭载体的构建将含Bt复制子的质粒pHT315(6.5kb)用AatII切开，用Klenow酶补成平端；以StuI和StiI双酶切质粒pUCP19，获得1.2kb的含有假单胞菌复制子质粒DNA片段，用Klenow大片段补平，将这两种DNA连接，转化大肠杆菌JM107，筛选7.7kb的重组质粒，经酶切鉴定得到pGM1105(7.7kb)，将它分别转化荧光假单胞菌P303菌株(RifR、Nad)和Bt野生菌株Bt17、Bt22、Btk无晶体突变株BE20(Lereclus等转化方法，Lereclus，D.等，FEMSMicrobiology Letters，1989，60211-217)，均能生长出阳性转化子，并提取各类转化子质粒进行酶切分析，证明pGM1105这种载体能在三种细菌中穿梭并稳定遗传，稳定性大于90％。
4.表达载体的构建将cry3Aa7基因(3.0kb)克隆到pGM1105的HindIII位点上，转化大肠杆菌JM107，筛选出含cry3Aa基因的重组质粒pLF31105(10.7kb)，将它转化大肠杆菌SCS110菌株后，提取质粒，将这些质粒分别转化荧光假单胞菌P303菌株和Bt野生菌株Bt17(含有crylBa3基因)，分别进行蛋白检测，SDS-PAGE分析表明cry3A基因在P303和Bt17中均能正常表达67kDa蛋白，它的导入不影响Bt17中crylBa3基因表达140kDa的蛋白。cry3A基因导入Bt17得到转化子，经过各种分子检测，证明转化成功，将该转化子命名为工程菌BiotIII-I。
5.工程菌的培养和观察采用GT培养基、1/2 LB培养基和Z氏培养基(本实验室自制)，分别培养BiotIII-I工程菌，电子扫描显微镜和光学显微镜观察结果，在BiotIII-I中存在方形和双锥体形两种晶体(见图18)，证明两种基因的共表达。
6.杀虫生物活性测定测试昆虫为鳞翅目害虫—小菜蛾(Plutella xylostella)；鞘翅目害虫—榆蓝叶甲(Pyrrhalta aenescens)，马铃薯甲虫(Leplinotarsa decernlineata)。
本发明的有益效果本发明使用对鳞翅目、鞘翅目害虫均有抗性的Bt cry1Ba基因和对鞘翅目害虫有活性的cry3Aa基因进行组合；利用本发明构建的广宿主穿梭表达载体pGM1105，可将cry3Aa基因转化导入含有cry1Ba基因的Bt17菌株中，实现两种基因的高效表达。这两种基因表达产物的组合所产生的对鞘翅目害虫的毒力强于目前国际上发现的同类自然菌株和工程菌株，说明两种基因表达产物存在显著的协同增效作用。
进一步，本发明所涉及的cry1Ba3基因序列、cry1Ba/cry3Aa基因组合方式、广宿主表达载体pGM1105亦为本发明所特有。
图1为Bt22质粒Southern Blotting结果。
其中，道1、2、3、4、5分别代表cry3Aa1.38kb、λDNA/HindIII、Bt22质粒/PstI、Bt22质粒/HindIII、Bt22质粒。
图2为Bt22、Bt17cry基因鉴定图谱。
其中，道1、2、3、4、5、6分别代表cry3Aa 1.38kb PCR产物、1.38kb/EcoRI、pUC DNA混合(1116，883，692，501，489，404，331，242，190，147，111，110bps)、λDNA/EcoO130I、cry1Ba1.6kb PCR产物、1.6kb/Bgl II。
图3为重组质粒pBY33(6.0kb)的限制性酶切分析。
其中，道1、2、3、4、5、6和M分别代表pBY33/BamHI、pBY33/EcoRI、pBY33/HindIII、pBY33/PstI、pBY33/SalI、pBY33/XbaI、λ/EcoO130I。
图4为cry3Aa基因的亚克隆流程图。
图5为cry3Aa7基因三种亚克隆重组质粒酶切分析结果。
其中，道1、2、3、4和M分别代表pBY33-16/EcoRI、pBY33-6/EcoRI、pBY33-5/EcoRI+HindIII、pBY33/EcoRI、1kb梯度(Ladder)(1.0～9.5kb)。
图6为Bt17质粒DNA Southern杂交结果。
其中，道1、2、3、4、5、6分别代表UV17 plasmid DNA/BamHI、UV17 plasmid DNA/SstI、UV17 plasmid DNA/SalI、UV17 plasmid DNA、λDNA/EcoO130I、cry1Ba1.6kb。
图7为Bt17质粒DNA文库构建流程图。
图8为Bt17质粒DNA部分酶切结果。
其中，道1-7分别代表不同酶量的酶切结果，道M代表λDNA/Eco130 I。
图9为cry1Ba基因重组质粒酶切分析。
其中，道1、2、3、4和M分别代表pHT3-67/SalI、pHT3-66/SalI、pHT3-66/HindIII、pHT3-66/EcoRI、λ/Eco130I。
图10为cry1Ba基因重组质粒PCR检测。
其中，道1、2和M分别代表pUC Mix、1.6kb PCR产物、产物/PstI。
图11为pGM1105载体构建流程图。
图12为pUCP19与pHT315酶切结果。
其中，道1、2、3、M1和M2分别代表pUCP19/HindIII、pUCP19/SfiI+StuI、pHT315/AatII、λ/EcoO130I、1kb梯度。
图13为pGM1105(7.7kb)酶切检测结果。
其中，道1、2、3、4、5和M分别代表pGM1105/BamHI、pGM1105/EcoRI、pGM1105/HindIII、pGM1105/SalI、pHT315/AatII、λ/EcoO130I。
图14为重组质粒pLF31105酶切分析。
其中，道1、2、3、4、5和M分别代表pLF31105/SalI、pLF31105/HindIII、pLF31105/EcoRI、pBY33/HindIII、pGM1105/HindIII、1kb梯度。
图15为pLF31105转化Pf、Bt、E.coil质粒及其酶切分析。
其中，道1、2、3、4、5、6和M分别代表pLF31105(BE20)、pLF31105(Pf)、pLF31105(E.coli)、pLF31105/EcoRI、pLF31105/SalI、pLF31105/HindIII、1kb梯度。
图16为各转化子中cry3Aa基因PCR分析结果。
其中，道1、2、3为PCR产物，分别为pLF31105(BE20)、pLF31105(Pf)、pLF31105(E.coli)；道4、5、6为PCR产物/EcoRI，分别为pLF31105(BE20)、pLF31105(Pf)、pLF31105(E.coli)；道M1和M2分别代表pUC Mix和λ/EcoO130I。
图17为Bt工程菌cry3Aa基因表达结果(1/2LB培养基)。
其中，道M、1、2、3、4、5和6分别代表蛋白质标记物(marker)、Btt、Bt22、BiotIII205、BiotIII-I、Bt17、HD-1。
图18为双价基因工程菌蛋白晶体扫描电镜结果。
其中，18a、18b、18c分别代表BiotIII205、BiotIII-I、Bt22。
本发明的具体实施方案以下叙述本发明的实施例。应该说明的是，本发明的实施例对于本发明只有说明作用，而没有限制作用。
需特别指出的是，尽管在实施例中详尽描述了两种基因在Bt中的组合与表达，然而这并不意味本发明的基因组合只限于用Bt菌株进行转化和生产具有对上述害虫有抗性的Bt工程菌。
因此，使用本发明所描述的cry1B和cry3基因进行组合，以提高对害虫的毒力和抗性，并扩大杀虫范围，使用本发明所描述广宿主表达载体，以本领域普通技术人员所具有的任何一种方法导入任何微生物、植物或其组织或细胞中，以及由此而获得的具有任何抗虫活性的微生物、植物，以及该类植物后代的种子、杂交和转育后代，均包括在本发明所要求的权利范围之内。
实施例1、Bt22菌株中cry3Aa基因的克隆按照Narva(Narva，K.E.等，EP0462721 A2，1991，8)等方法从Bt22菌株中提取质粒DNA，用HindIII酶完全消化质粒DNA，进行Southern杂交，探针由cry3Aa基因特异引物扩增质粒DNA而获得，为1.38kb(鉴定结果见图2)。引物为5’CGAACAATCGAAGTGAACATGATAC3’CATCTGTTGTTTCTGGAGGCAAT用32P进行标记；杂交方法按“分子克隆实验指南”进行，得到杂交结果(见图1)。发现在3kb有杂交信号，从凝胶中回收3.0kb的质粒DNA HindIII酶切片段，纯化后与pBluescript SK(+)相连接，转化大肠杆菌JM107，以cry3A基因特异性引物进行PCR检测，筛选到阳性重组质粒pBY33(图3、图5)。重组质粒含有3.0kb的cry3A基因大片段。对其进行亚克隆得到pBY33-5、pBY33-6、pBY-16三种重组质粒，分别含有0.72、1.6、0.675kb的外源基因片段(亚克隆流程图见图4)。DNA序列测定由北京六合通生物工程公司完成。该基因由Btδ内毒素基因国际命名委员会命名为cry3Aa7。
实施例2、Bt17菌株中克隆cry1Ba基因对Bt17菌株中的cry1Ba基因进行鉴定核和定位，结果表明该基因位于大质粒上，鉴定结果见图2，Southern杂交结果见图6。提取Bt17菌株质粒DNA，用Sau3A I酶进行部分酶切，从凝胶中回收2-7kb DNA片段，纯化后与经BamHI消化、碱性磷酸酶处理的pBluescript SK(+)载体进行连接，转化大肠杆菌JM107后，用cry1Ba基因特异性引物Sun1Ba5/3对进行PCR扩增，筛选阳性转化子(Bt17质粒DNA文库构建见图7、8)。5’和3’端引物分别为正向引物(Forward primer)TCCTGCAGTTGACTTCAAATAGG；反向引物(Reverse primer)CAGTCGACTCATCCGATAAACACGCCAC’。
筛选得到重组质粒pHT3-66，该质粒含有cry1Ba基因全长DNA片段(结果见图9、10)。进行DNA序列分析，结果表明该基因含有3687bp，由1229个氨基酸组成，分子量为139.5kDa。在第1055位碱基因与已知cry1Ba1基因不同，其编码的氨基酸也变成了精氨酸，即Bt17菌株中氨基酸序列与已知基因存在差异。该基因由Btδ内毒素基因国际命名委员会命名为cry1Ba3。该基因序列参见SEQ ID NO 2。
实施例3、穿梭载体的构建将含Bt复制子的质粒pHT315(6.5kb)用AatII切开，用Klenow酶补成平端；以StuI和StiI双酶切质粒pUCP19，获得1.2kb的含有假单胞菌复制子质粒DNA片段，用Klenow大片段补平，将这两种DNA连接，转化大肠杆菌JM107，筛选7.7kb的重组质粒，经酶切鉴定得到pGM1105(7.7kb)(分析结果见图11、12、13)。将它分别转化荧光假单胞菌P303菌株(具有利福平Rif和萘啶酮酸Nad抗性)和Bt野生菌株Bt17、Bt22、Btk无晶体突变株BE20(Lereclus等转化方法，Lereclus，D.等，FEMS Microbiology Letters，1989，60211-217)。
假单胞菌转化方法为28℃、220r/pm，LB培养基培养菌株过夜，次日进行1％接种，培养条件不变。待O.D600为0.5时，取培养好的假单胞菌菌液进行冰浴，4℃下离心收集菌体，加入1/2体积的0.1M MgCl2冰浴5min，离心收集菌体，加入1/2体积的0.05MCaCl2冰浴30min，离心收集菌体，加入1/10体积的上述CaCl2备用。余下部分同大肠杆菌一样。
上述两种菌均能生长出阳性转化子，提取各类转化子质粒进行酶切分析，证明pGM1105这种载体能在三种细菌中穿梭并稳定遗传，稳定性大于90％。
实施例4、表达载体的构建将cry3Aa7基因(3.0kb)克隆到pGM1105的HindIII位点上，转化大肠杆菌JM107，筛选出含cry3Aa基因的重组质粒pLF31105(10.7kb)(见图14)；将它转化大肠杆菌SCS110菌株后，提取质粒，将这些质粒分别转化荧光假单胞菌P303菌株和Bt野生菌株Bt17(含有cry1Ba3基因)(分析鉴定结果见图15、16)；分别进行蛋白检测，SDS-PAGE分析表明cry3A基因在P303和Bt17中均能正常表达67kDa蛋白，它的导入不影响Bt17中cry1Ba3基因表达140kDa的蛋白。cry3A基因导入Bt17得到转化子，经过各种分子检测，证明转化成功，将该转化子命名为工程菌BiotIII-I(蛋白分析结果见图17)。
实施例5、工程菌的培养、观察和检测采用GT培养基、1/2LB培养基和Z氏培养基(本实验室自行研制)，分别培养BiotIII-I工程菌，电子扫描显微镜和光学显微镜观察结果，在BiotIII-I中存在方形和双锥体形两种晶体(见图18)，证明两种基因的共表达。
实施例6、工程菌对几种害虫毒力测定测试昆虫鳞翅目害虫—小菜蛾(Plutella xylostella)二龄幼虫；鞘翅目害虫—榆蓝叶甲(Pyrrhalta aenescens)二～四龄幼虫；鞘翅目害虫—马铃薯甲虫(Leplinotarsa decernlineata)二～四龄幼虫。
杀虫生物测定方法小菜蛾采用甘蓝叶片秤重后浸叶法，96小时调查结果；榆蓝叶甲采用新鲜榆树叶片浸叶法，96小时调查结果；马铃薯甲虫采用叶面喷施法，96小时调查结果。
(1)工程菌对不同种群的小菜蛾杀虫结果(参见表1)双价基因组合的工程菌BiotIII-I不同的稀释倍数对小菜蛾的毒杀效果与出发菌株Bt17相当，例如，180倍稀释样品，BiotIII-I校正死亡率(CM)为92.56％，540倍CM为84.62％；而且对来自海南的Bt小菜蛾种群仍有较强的毒杀效果，180倍CM为57.82％，而生产使用的菌株BtC005对这个抗性种群180倍CM只有36％。
(2)工程菌对榆蓝叶甲杀虫结果(参见表2、表3)从表2中发现这些供试样品中，工程菌BiotIII-I、Bt22、Bt17杀虫效果CM分别为63.33％、43.33％、36.67％。双价基因组合的工程菌BiotIII-I毒力最强，强于两种出发菌株Bt22和Bt17。
根据表3结果，cry1Ba和cry3A两种基因表达产物(蛋白浓度分别为0.5mg/mL)按照50∶50和40∶60的比例混合配比时，杀虫毒力最大，CM分别为68.75％和72.73％；证明这两种蛋白的协同增效作用显著。
表1、工程菌对不同种群小菜蛾杀虫测定结果北京试虫(敏感) 海南试虫(抗性)样品48小时96小时 48小时 96小时校正死 校正死 校正死 校正死总虫数 死虫数 死虫数 总虫数 死虫数死虫数亡率％ 亡率％亡率％ 亡率％20X 3130 96.7731 100 363494.43 36 10060K 3128 9032 31 1028176071 26 9172180X 2822 7850 26 9204 289 3214 21 7100540X 3016 5333 22 7025 277 2593 18 61341620X 308 2667 18 536320X 3029 30 103029 30 1060X 2927 9310 29 1031196129 29 9252180X 3022 7333 28 9262 33175152 21 5782540X 2920 6897 25 8462 296 2067 13 36001620X 344 1176 9147CK 29 31034 29 4137表2、工程菌对榆蓝叶甲杀虫作用结果(96小时)样品处理重复总数列数死率 ％ 校正死亡率％1/2B 培养基 2 35 0 0 0B22 10X 2 30 13 4333 433B17 10X 2 30 11 3667 366BiotIII-I 10X 2 27 19 6333 633
表3 工程菌对榆蓝叶甲杀虫增效作用结果(96小时)
样品配比起始浓度cry3Aa7蛋白(Bt22)含量与cry1Ba3蛋白(Bt17)含量均为0.5mg/mL(3)工程菌对马铃薯甲虫杀虫结果(参见表4)结果表明Bt17(cry1Ba)菌株对马铃薯甲虫具有中等毒力；Bt22(cry3Aa)与国外工程菌Bt2321具有高毒力，分别达93.97％和91.38％；双价基因组合的工程菌BiotIII-I毒力最强，防治效果达99.15％，与化学农药相当。充分说明双价基因具有显著的协同增效作用。
表4工程菌对马铃薯甲虫杀虫测定结果(96小时调查结果)样品 处理重复 总虫数 存活虫数 防治效率％方差分析Bt23211X 3 636 5191.38 BCbBt22 1X 3 730 4293.97 BbBt17 1X 3 692 260 59.26 DdBiotIII-I 1X 3 631 5 99.15 Aa10X 3 548 129 74.77 Cc化药 1500X3 760 0 100AaH2O 3 671 626 - -注化药为德国Bayer公司生产的“保得”附本发明所涉及的DNA序列和蛋白质序列(1)SEQ ID NO 1 (cry3Aa7基因的核苷酸序列，其中下划线部分为编码区1932bp)AAGCTTAATT AAAGATAATA TCTTTGAATT GTAACGCCCC TCAAAAGTAA GAACTACAAA60AAAAGAATAC GTTATATAGA AATATGTTTG AACCTTCTTC AGATTACAAA TATATTCGGA120CGGACTCTAC CTCAAATGCT TATCTAACTA TAGAATGACA TACAAGCACA ACCTTGAAAA180TTTGAAAATA TAACTACCAA TGAACTTGTT CATGTGAATT ATCGCTGTAT TTAATTTTCT240CAATTCAATA TATAATATGC CAATACATTG TTACAAGTAG AAATTAAGAC ACCCTTGATA300GCCTTACTAT ACCTAACATG ATGTAGTATT AAATGAATAT GTAAATATAT TTATGATAAG360AAGCGACTTA TTTATAATCA TTACATATTT TTCTATTGGA ATGATTAAGA TTCCAATAGA420ATAGTGTATA AATTATTTAT CTTGAAAGGA GGGATGCCTA AAAACGAAGA ACATTAAAAA480CATATATTTG CACCGTCTAA TGGATTTATG AAAAATCATT TTATCAGTTT GAAAATTATG540TATTATGATA AGAAAGGGAG GAAGAAAAAT GAATCCGAAC AATCGAAGTG AACATGATAC600AATAAAAACT ACTGAAAATA ATGAGGTGCC AACTAACCAT GTTCAATATC CTTTAGCGGA660AACTCCAAAT CCAACACTAG AAGATTTAAA TTATAAAGAG TTTTTAAGAA TGACTGCAGA720TAATAATACG GAAGCACTAG ATAGCTCTAC AACAAAAGAT GTCATTCAAA AAGGCATTTC780CGTAGTAGGT GATCTCCTAG GCGTAGTAGG TTTCCCGTTT GGTGGAGCGC TTGTTTCGTT840TTATACAAAC TTTTTAAATA CTATTTGGCC AAGTGAAGAC CCGTGGAAGG CTTTTATGGA900ACAAGTAGAA GCATTGATGG ATCAGAAAAT AGCTGATTAT GCAAAAAATA AAGCTCTTGC960AGAGTTACAG GGCCTTCAAA ATAATGTCGA AGATTATGTG AGTGCATTGA GTTCATGGCA1020AAAAAATCCT GTGAGTTCAC GAAATCCACA TAGCCAGGGG CGGATAAGAG AGCTGTTTTC1080TCAAGCAGAA AGTCATTTTC GTAATTCAAT GCCTTCGTTT GCAATTTCTG GATACGAGGT1140TCTATTTCTA ACAACATATG CACAAGCTGC CAACACACAT TTATTTTTAC TAAAAGACGC1200TCAAATTTAT GGAGAAGAAT GGGGATACGA AAAAGAAGAT ATTGCTGAAT TTTATAAAAG1260ACAACTAAAA CTTACGCAAG AATATACTGA CCATTGTGTC AAATGGTATA ATGTTGGATT1320AGATAAATTA AGAGGTTCAT CTTATGAATC TTGGGTAAAC TTTAACCGTT ATCGCAGAGA1380GATGACATTA ACAGTATTAG ATTTAATTGC ACTATTTCCA TTGTATGATG TTCGGCTATA1440CCCAAAAGAA GTTAAAACCG AATTAACAAG AGACGTTTTA 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H G A T N T S I N P V T L 3801141 CGGTTCGCATCTCGAGACGTTTATAGGACTGAATCATATGCAGGAGTGCTTCTATGGGGA 1200381 R F A S R D V Y R T E S Y A G V L L W G 4001201 ATTTACCTTGAACCTATTCATGGTGTCCCTACTGTTAGGTTTAATTTTACGAACCCTCAG 1260401 I Y L E P I H G V P T V R F N F T N P Q 4201261 AATATTTCTGATAGAGGTACCGCTAACTATAGTCAACCTTATGAGTCACCTGGGCTTCAA 1320421 N I S D R G T A N Y S Q P Y E S P G L Q 4401321 TTAAAAGATTCAGAAACTGAATTACCACCAGAAACAACAGAACGACCAAATTATGAATCT 1380441 L K D S E T E L P P E T T E R P N Y E S 4601381 TACAGTCACAGGTTATCTCATATAGGTATAATTTTACAATCCAGGGTGAATGTACCGGTA 1440461 Y S H R L S H I G I I L Q S R V N V P V 4801441 TATTCTTGGACGCATCGTAGTGCAGATCGTACGAATACGATTGGACCAAATAGAATCACC 1500481 Y S W T H R S A D R T N T I G P N R I T 5001501 CAAATCCCAATGGTAAAAGCATCCGAACTTCCTCAAGGTACCACTGTTGTTAGAGGACCA 1560501 Q I P M V K A S E L P Q G T T V V R G P 5201561 GGATTTACTGGTGGGGATATTCTTCGAAGAACGAATACTGGTGGATTTGGACCGATAAGA 1620521 G F T G G D I L R R T N T G G F G P I R 5401621 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2160701 Y A K R L S D E R N L L Q D P N F T S I 7202161 AATAAGCAACCAGACTTCATATCTACTAATGAGCAATCGAATTTCACATCTATCCATGAA 2220721 N K Q P D F I S T N E Q S N F T S I H E 7402221 CAATCTGAACATGGATGGTGGGGAAGTGAGAACATTACCATCCAGGAAGGAAATGACGTA 2280741 Q S E H G W W G S E N I T I Q E G N D V 7602281 TTTAAAGAGAATTACGTCACACTACCGGGTACTTTTAATGAGTGTTATCCGACGTATTTA 2340761 F K E N Y V T L P G T F N E C Y P T Y L7802341 TATCAAAAAATAGGGGAGTCGGAATTAAAAGCTTATACTCGCTACCAATTAAGAGGTTAT 2400781 Y Q K I G E S E L K A Y T R Y Q L R G Y8002401 ATTGAAGATAGTCAAGATTTAGAGATATATTTGATTCGTTATAATGCGAAACATGAAACA 2460801 I E D S Q D L E I Y L I R Y N A K H E T8202461 TTGGATGTTCCAGGTACCGAGTCCCTATGGCCGCTTTCAGTTGAAAGCCCAATCGGAAGG 2520821 L D V P G T E S L W P L S V E S P I G R8402521 TGCGGAGAACCGAATCGATGCGCACCACATTTTGAATGGAATCCTGATCTAGATTGTTCC 2580841 C G E P N R C A P H F E W N P D L D C S8602581 TGCAGAGATGGAGAAAAATGTGCGCATCATTCCCATCATTTCTCTTTGGATATTGATGTT 2640861 C R D G E K C A H H S H H F S L D I D V8802641 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12203661 GTGGAATTACTCCTCATGGAAGAATAG 36871221 V E L L L M E E *1240
权利要求
1.一种Bt基因cry1Ba3的基因序列，其特征是该序列具有如SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列，编码具有如SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列的蛋白质，且对昆虫具有毒性；
2.权利要求1的基因序列，其中所说的基因序列包括该基因序列的部分序列；
3.权利要求1的基因序列，其中所说的基因序列包括该基因序列的同源序列；
4.权利要求1的基因序列，其中所说的昆虫是鳞翅目和鞘翅目昆虫；
5.一种对昆虫具有活性的蛋白质的氨基酸序列，其特征是该蛋白质的氨基酸序列是由权利要求1的基因序列所编码，具有如SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列，且对昆虫具有毒性；
6.权利要求5的氨基酸序列，其中所说的氨基酸序列包括该氨基酸序列的部分序列；
7.权利要求5的氨基酸序列，其中所说的氨基酸序列包括该氨基酸序列的同源序列；
8.权利要求5的氨基酸序列，其中所说的昆虫是鳞翅目和鞘翅目昆虫；
9.一种能够在苏云金芽孢杆菌-大肠杆菌-假单胞菌之间穿梭的遗传载体，其特征是该穿梭表达载体是由一个来自苏云金芽孢杆菌-大肠杆菌的穿梭载体和一个来自假单胞菌的质粒DNA复制子所构建；
10.一种基因表达载体，其特征该表达载体是由权利要求9的遗传穿梭载体和如SEQID NO 1所示的基因序列所构建；
11.一种转化Bt细胞获得工程菌的方法，其特征是该方法应用权利要求10的基因表达载体；
12.一种基因cry1Ba与cry3Aa7的组合，其特征是该组合可应用于转化微生物和植物，使之表现出对相关害虫的毒性，并克服或延缓昆虫对工程菌和转基因植物抗药性的产生；
13.一种蛋白质Cry1Ba与Cry3Aa7的组合，其特征是该组合可应用于转化微生物和植物，使之表现出对相关害虫的毒性，并克服或延缓昆虫对工程菌和转基因植物抗药性的产生；
14.一种广义表达载体pGM1105，其特征是该载体是依据权利要求1、5、9、10、11而构建，且能够用于多种宿主生物(细胞)；
15.一种表达载体pLF31105，其特征是该载体携带有如SEQ ID NO 1所示的基因序列。
全文摘要
本发明为“对鳞翅目与鞘翅目昆虫高毒力的Bt基因、表达载体和工程菌”，属生物防治技术领域。进一步，本发明涉及对鳞翅目、鞘翅目害虫均有抗性的Bt crylBa3基因序列，涉及crylBalcry3Aa基因组合方式，还涉及广宿主表达载体pGM1105。更进一步，本发明使用对鳞翅目、鞘翅目害虫均有抗性的Bt crylBa基因和对鞘翅目害虫有活性的cry3Aa基因进行组合，以提高基因对有关害虫的毒性；利用本发明构建的广宿主穿梭表达载体pGM1105，将cry3Aa基因转化导入含有crylBa基因的Bt17菌株中，以实现两种基因的高效表达。本发明所涉及的两种基因或其表达产物的组合所产生的对鞘翅目害虫的毒力强于目前国际上发现的同类自然菌株和工程菌株，说明在两种基因或其表达产物之间存在显著的协同增效作用。
文档编号C12N15/70GK1401773SQ0112416
公开日2003年3月12日 申请日期2001年8月20日 优先权日2001年8月20日
发明者张 杰, 黄大昉, 宋福平, 陈中义, 李国勋 申请人:中国农业科学院植物保护研究所