专利名称：基于pcr检测谷丝核菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及种特异性引物在聚合酶链式反应方法检测谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)，一种小麦真菌病原体的用途。这些引物可用于监控植物种群中病害的发展。
每年，植物病害引起相当可观的作物减产，这既导致农民的经济损失，又在世界许多地方导致当地人口营养供应不足。杀真菌剂的广泛使用为防止植物病原体侵袭提供了有力的安全保障。尽管用于杀真菌剂的费用达到10亿美元，但在1981年全世界范围内作物损失约占作物价值的10％(James，1981；Seed Sci.& Technol.9679-685)。
病害破坏的严重程度由病原体的进攻性和宿主的反应决定的。大多数植物育种计划的一个目的是增加宿主植物对病害的抵抗能力。一般地，不同品种的病原体与同一作物的不同变种的相互作用不同，并且许多宿主抵抗源仅能抵御特定的病原体品种。而且，一些病原体品种导致病害早期症状，但对作物的伤害很小。Jones和Clifford(1983；谷类病害(Cereal Diseases)，John Wiley)报导，在将抗性引入宿主栽培品种时，预期会在病原体种群中出现强致病性的病原体类型。因此，有必要监控病原体种群。另外，已有几篇关于对特定杀真菌剂产生抗性的真菌菌株的进化的文献案例。早至1981年，Fletcher和Wolfe(1981；Proc.1981 Brit.Crop Prot.Conf.)主张，因杀真菌剂氯苯氧基二甲乙基三唑乙醇的使用，来自春大麦的24％白粉菌种群和来自冬大麦的53％白粉菌种群表现出相当可观的变异性，并且在不同品种之间这些种群的比例不同，其中最敏感品种具有最高发生率的较不敏感变种。真菌对杀真菌剂的敏感性有相似的变异。已有文献记载了小麦霉属(同样对氯苯氧基二甲乙基三唑乙醇)、葡萄孢属(Botrytis)(对苯菌灵)、核腔菌属(Pyrenophora)(对有机汞)、假尾孢霉属(Pseudocercosporella)(对MBC型杀真菌剂)，以Mycosphaerella fijiensis对三唑类等等(Jones和Clifford；谷类病害，John Wiley，1983)。
在国际市场上，小麦是目前最重要的农产品，约占全世界耕种土地的20％(1977；小麦病害概略(Compendium of Wheat Diseases)，美国植物病理学协会，第1页)。全世界小麦供应量的80％来自北美、欧洲、中国和苏联。每年，因病害而损失大约全球小麦产量的20％。
尖锐眼状斑纹病(sharp eyespot)是由谷丝核菌van der Hoeven(有性型Ceratobasidium cereale Murray & Burpee)引起，可发生在小麦、大麦、燕麦和黑麦(1977；小麦病害概略，美国植物病理学协会，第50页)。一些病原体分离物仍能感染草坪草，引起黄斑病。严重的小麦感染会引起早熟和倒伏，因而影响产量。现在，还没发现对尖锐眼状斑纹病有抗性的栽培品种。
因此，的确需要发展能在感染早期鉴定出特定真菌病原体的技术。通过在作物出现明显的病害症状之前鉴定出具体的病原体，农学家能评估在作物品种中已鉴定出的病原体的进一步发展的可能影响，并且如果有必要运用杀真菌剂，将能选择合适的杀真菌剂。
因此，本发明提供了一种分离的DNA分子，其包括选自下组的内部转录间隔区(Internal Transcribed Spacer，ITS)序列(a)谷丝核菌的ITS1，其中谷丝核菌的ITS1包括SEQ ID NO17的核苷酸31-243，SEQ ID NO18的核苷酸31-242，SEQ ID NO19的核苷酸31-243，SEQ ID NO20的核苷酸31-241，SEQ ID NO21的核苷酸31-243，SEQ ID NO22的核苷酸31-243，SEQ ID NO243的核苷酸31-180，SEQ ID NO24的核苷酸31-240，SEQ ID NO25的核苷酸31-242，或SEQ ID NO26的核苷酸31-242；(b)谷丝核菌的ITS2，其中谷丝核菌的ITS2包括SEQ ID NO17的核苷酸397-630，SEQ ID NO18的核苷酸396-629，SEQ ID NO19的核苷酸397-630，SEQ ID NO20的核苷酸395-628，SEQ ID NO21的核苷酸397-630，SEQ ID NO22的核苷酸397-630，SEQ ID NO23的核苷酸397-630，SEQ ID NO24的核苷酸394-627，SEQ ID NO25的核苷酸396-629，或SEQ ID NO26的核苷酸396-629。
本发明还提供●一种在基于扩增的真菌内部转录间隔区DNA序列的检测中使用的寡核苷酸引物，其中所述引物的序列与在上文提到的内部转录间隔区序列的至少10个连续核苷酸相同。
●一对在基于扩增的真菌内部转录间隔区DNA序列的检测中使用的寡核苷酸引物，其中至少所述引物之一是上文提到的寡核苷酸引物。
●一种选自SEQ ID NO7-16的寡核苷酸引物。
●一对寡核苷酸引物，其中至少所述引物之一选自SEQ IDNO7-16。
●在上文提到的一对寡核苷酸引物，其中所述引物对选自下列引物对SEQ ID NO12和SEQ ID NO9，SEQ ID NO1和SEQ ID NO10，SEQ ID NO1和SEQ ID NO9，SEQ ID NO1和SEQ ID NO14，SEQ ID NO12和SEQ ID NO4，SEQ ID NO7和SEQ ID NO9，SEQ ID NO15和SEQ ID NO9，SEQ ID NO16和SEQ ID NO9，SEQ ID NO15和SEQ ID NO4，SEQ ID NO16和SEQ ID NO4，SEQ ID NO15和SEQ ID NO10，和SEQ ID NO16和SEQ ID NO10●在上文提到的一对寡核苷酸引物，其中所述引物对是SEQ IDNO12和SEQ ID NO9。
本发明还提供●一种检测真菌病原体的方法，包括步骤(a)从感染病原体的植物叶片中分离DNA；(b)用所述DNA进行聚合酶链式反应扩增，其中使用至少一种根据本发明的引物；和(c)通过显示所述聚合酶链式反应扩增的产物来检测所述真菌病原体，特别是，其中所述真菌病原体是谷丝核菌。
●一种检测真菌病原体的方法，包括步骤(a)从感染病原体的植物叶片中分离DNA；(b)以所述DNA为模板，使用根据本发明的一对引物，进行聚合酶链式反应，扩增所述病原体的内部转录间隔区序列的一部分；和(c)通过显示该内部转录间隔区序列的已扩增部分来检测所述真菌病原体，特别是，其中所述真菌病原体是谷丝核菌。
●一种检测谷丝核菌的方法，包括步骤(a)从感染谷丝核菌的植物叶片中分离DNA；(b)以所述DNA为模板，使用根据本发明的一对引物，进行聚合酶链式反应，扩增谷丝核菌的内部转录间隔区序列的一部分；和(c)通过显示该内部转录间隔区序列的已扩增部分来检测谷丝核菌。
●在上文提到的方法，其中所述引物对是SEQ ID NO12和SEQ IDNO9。
本发明还提供●用于检测真菌病原体的诊断试剂盒，其中包括根据本发明的引物。
本发明描述了鉴定植物致病真菌的不同致病型的方法。本发明提供了在不同真菌致病型之间表现出多样性的内部转录间隔区(ITS)DNA序列。这些DNA序列在本发明的方法中是有用的，因为可用它们衍生在基于聚合酶链式反应(PCR)的诊断检测中所用的引物。这些引物在所用的DNA模板来自特定的真菌致病型的PCR反应中产生独有的片段。因此在病害症状发生之前，可用于鉴定在宿主植物材料中特定的致病型的存在与否。
在一个优选实施方案中，本发明为病原体谷丝核菌提供ITS1和ITS2 DNA序列(例如，SEQ ID NO17-26)。在另一个优选实施方案中，本发明为检测谷丝核菌提供ITS衍生的诊断引物(例如，SEQ IDNO7-16)。
本发明使评估作物变种与病原体菌株之间特定关系的潜在破坏成为可能，也使合理使用各种已有的杀真菌剂成为可能。而且，本发明能提供在扩展的地理区域里关于特定病原体品种发展和蔓延的详细信息。本发明提供一种特别适用于检测有长潜伏期的病害的方法。
也提供了在本发明的实践中有用的试剂盒。这些试剂盒在鉴别真菌病原体谷丝核菌中有特殊用途。
对序列表中的序列的简要描述SEQ ID NO1寡核苷酸引物ITS1。
SEQ ID NO2寡核苷酸引物ITS2。
SEQ ID NO3寡核苷酸引物ITS3。
SEQ ID NO4寡核苷酸引物ITS4。
SEQ ID NO5M13通用-20引物。
SEQ ID NO6用于实施例2中的反向引物。
SEQ ID NO7寡核苷酸引物JB643。
SEQ ID NO8寡核苷酸引物JB644。
SEQ ID NO9寡核苷酸引物JB645。
SEQ ID NO10 寡核苷酸引物JB646。
SEQ ID NO11 寡核苷酸引物JB647。
SEQ ID NO12 寡核苷酸引物JB648。
SEQ ID NO13 寡核苷酸引物JB649。
SEQ ID NO14 寡核苷酸引物JB650。
SEQ ID NO15 寡核苷酸引物JB687。
SEQ ID NO16 寡核苷酸引物JB688。
SEQ ID NO17 从谷丝核菌分离物44235 PCR扩增出的ITS区域的DNA序列，按5’到3’方向包括小亚基rRNA基因的3’末端(核苷酸1-30)，内部转录间隔区1(核苷酸31-243)，5.8S rRNA基因(核苷酸244-396)，内部转录间隔区2(核苷酸397-630)和大亚基rRNA基因的5’末端(核苷酸631-687)。
SEQ ID NO18从谷丝核菌分离物AGDC57 PCR扩增出的ITS区域的DNA序列，按5’到3’方向包括小亚基rRNA基因的3’末端(核苷酸1-30)，内部转录间隔区1(核苷酸31-242)，5.8S rRNA基因(核苷酸243-395)，内部转录间隔区2(核苷酸396-629)和大亚基rRNA基因的5’末端(核苷酸630-686)。
SEQ ID NO19从谷丝核菌分离物CAG1BN1 PCR扩增出的ITS区域的DNA序列，按5’到3’方向包括小亚基rRNA基因的3’末端(核苷酸1-30)，内部转录间隔区1(核苷酸31-243)，5.8S rRNA基因(核苷酸244-396)，内部转录间隔区2(核苷酸397-630)和大亚基rRNA基因的5’末端(核苷酸631-687)。
SEQ ID NO20从谷丝核菌分离物AGDC73 PCR扩增出的ITS区域的DNA序列，按5’到3’方向包括小亚基rRNA基因的3’末端(核苷酸1-30)，内部转录间隔区1(核苷酸31-241)，5.8S rRNA基因(核苷酸242-394)，内部转录间隔区2(核苷酸395-628)和大亚基rRNA基因的5’末端(核苷酸629-685)。
SEQ ID NO21从谷丝核菌分离物52182 PCR扩增出的ITS区域的DNA序列，按5’到3’方向包括小亚基rRNA基因的3’末端(核苷酸1-30)，内部转录间隔区1(核苷酸31-243)，5.8S rRNA基因(核苷酸244-396)，内部转录间隔区2(核苷酸397-630)和大亚基rRNA基因的5’末端(核苷酸631-687)。
SEQ ID NO22从谷丝核菌分离物Bn505 PCR扩增出的ITS区域的DNA序列，按5’到3’方向包括小亚基rRNA基因的3’末端(核苷酸1-30)，内部转录间隔区1(核苷酸31-243)，5.8S rRNA基因(核苷酸244-396)，内部转录间隔区2(核苷酸397-630)和大亚基rRNA基因的5’末端(核苷酸631-686)。
SEQ ID NO23从谷丝核菌分离物R88-303 PCR扩增出的ITS区域的DNA序列，按5’到3’方向包括小亚基rRNA基因的3’末端(核苷酸1-30)，内部转录间隔区1(核苷酸31-243)，5.8S rRNA基因(核苷酸244-396)，内部转录间隔区2(核苷酸397-630)和大亚基rRNA基因的5’末端(核苷酸631-687)。
SEQ ID NO24从谷丝核菌分离物52184 PCR扩增出的ITS区域的DNA序列，按5’到3’方向包括小亚基rRNA基因的3’末端(核苷酸1-30)，内部转录间隔区1(核苷酸31-240)，5.8S rRNA基因(核苷酸241-393)，内部转录间隔区2(核苷酸394-627)和大亚基rRNA基因的5’末端(核苷酸628-684)。
SEQ ID NO25从谷丝核菌分离物62063 PCR扩增出的ITS区域的DNA序列，按5’到3’方向包括小亚基rRNA基因的3’末端(核苷酸1-30)，内部转录间隔区1(核苷酸31-242)，5.8S rRNA基因(核苷酸243-395)，内部转录间隔区2(核苷酸396-629)和大亚基rRNA基因的5’末端(核苷酸630-686)。
SEQ ID NO26从谷丝核菌分离物52183 PCR扩增出的ITS区域的DNA序列，按5’到3’方向包括小亚基rRNA基因的3’末端(核苷酸1-30)，内部转录间隔区1(核苷酸31-242)，5.8S rRNA基因(核苷酸243-395)，内部转录间隔区2(核苷酸396-629)和大亚基rRNA基因的5’末端(核苷酸630-686)。
SEQ ID NO27谷丝核菌的ITS区域的DNA序列的GenBank序列(编号#AF063019)列表，按5’到3’方向包括小亚基rRNA基因的3’末端(核苷酸1-29)，内部转录间隔区1(核苷酸30-241)，5.8S rRNA基因(核苷酸242-394)，内部转录间隔区2(核苷酸395-628)和大亚基rRNA基因的5’末端(核苷酸629-685)。
SEQ ID NO28从曲毛假尾孢霉(P.herpotrichoides)分离物R1 PCR扩增出的ITS区域的DNA序列，按5’到3’方向包括小亚基rRNA基因的3’末端，内部转录间隔区1，5.8S rRNA基因，内部转录间隔区2和大亚基rRNA基因的5’末端。
SEQ ID NO29从颖枯壳针孢(5.nodorum)分离物24425 PCR扩增出的ITS区域的DNA序列，按5’到3’方向包括小亚基rRNA基因的3’末端，内部转录间隔区1，5.8S rRNA基因，内部转录间隔区2和大亚基rRNA基因的5’末端。
SEQ ID NO30从小麦壳针孢(S.tritici)分离物26517 PCR扩增出的ITS区域的DNA序列，按5’到3’方向包括小亚基rRNA基因的3’末端，内部转录间隔区1，5.8S rRNA基因，内部转录间隔区2和大亚基rRNA基因的5’末端。
SEQ ID NO31从偃麦草核腔菌(P.tritici-repentis)分离物6715 PCR扩增出的ITS区域的DNA序列，按5’到3’方向包括小亚基rRNA基因的3’末端，内部转录间隔区1，5.8S rRNA基因，内部转录间隔区2和大亚基rRNA基因的5’末端。
SEQ ID NO32从大刀镰孢(F.culmorum)分离物62215 PCR扩增出的ITS区域的DNA序列，按5’到3’方向包括小亚基rRNA基因的3’末端，内部转录间隔区1，5.8S rRNA基因，内部转录间隔区2和大亚基rRNA基因的5’末端。
SEQ ID NO33从M.nivale分离物520 PCR扩增出的ITS区域的DNA序列，按5’到3’方向包括小亚基rRNA基因的3’末端，内部转录间隔区1，5.8S rRNA基因，内部转录间隔区2和大亚基rRNA基因的5’末端。
本发明提供了在鉴定植物致病真菌的不同致病型中有用的独特DNA序列。尤其是，在基于PCR分析以鉴别真菌致病型时，该DNA序列可用作引物。本发明的DNA序列包括特定真菌病原体的核糖体RNA基因区域的内部转录间隔区(ITS)序列，以及从这些区域衍生的能用于鉴定该特定病原体的引物。在同一病原体物种或属的不同成员之间，ITS DNA序列不同，可用于鉴别这些特定的成员。
生物医药研究者使用基于PCR的技术检测受感染动物组织中的病原体已有一段时间，并取得了一定成功。然而，仅仅在最近，该技术才应用于检测植物病原体。已应用对病原体线粒体基因组特异的序列经PCR检测受感染小麦中禾顶囊壳(Gaumannomyces graminis)的存在(Schlesser等，1991；应用与环境微生物学(Applied andEnviron.Microbiol.)，57553-556)。随机扩增的多态DNA(即RAPD)标记能区分针叶树硬皮性溃疡(scleroderris canker)致病因子的Gremmeniella abietina的众多品种。美国专利No.5,585,238(在此完整引入作为参考)描述了来自壳针孢属、假尾孢属和球腔菌属菌株的核糖体RNA基因区域的ITS序列的引物，以及这些引物在用基于PCR的技术鉴定这些真菌分离物中的使用。另外，WO95/29260(在此完整引入作为参考)描述了来自镰孢属菌株的核糖体RNA基因区域的ITS序列的引物，以及这些引物在用基于PCR的技术鉴定这些真菌分离物中的使用。并且，美国专利No.5,800,997(在此完整引入作为参考)描述了来自尾孢霉属(Cercospora)、长蠕孢属(Helminthosporium)、球梗孢属(Kabatiella)、柄锈菌属(Puccinia)菌株的核糖体RNA基因区域的ITS序列的引物，以及这些引物在用基于PCR的技术鉴定这些真菌分离物中的使用。
因为核糖体基因拷贝数量高，所以适合用作分子探针的靶基因。尽管成熟rRNA序列的保守性高，但非转录间隔区序列和转录间隔区序列通常保守性较差，因此适合作为检测最近的进化分歧的靶序列。
真菌rRNA基因以单位形式组织起来，每个单位编码18S(小亚基)、5.8S和28S(大亚基)三个成熟亚基。这些亚基被两个约300bp的内部转录间隔区ITS1和ITS2分开(White等，1990；PCR方案；Innes等编著；315-322页)。另外，这些转录单位被非转录间隔区序列(NTS)分开。ITS和NTS序列特别适合用于检测不同真菌病原体的特定致病型。
本发明的DNA序列来自不同植物病原体的核糖体RNA基因区域的内部转录间隔区序列。来源于同一病原体种或属的不同致病型的ITSDNA序列在这同一种或属的不同成员之间不同。一旦确定了一种病原体的ITS序列，即可将这些序列与其他ITS序列进行比对。这样，可从ITS序列推导出引物。即可以根据ITS内含有真菌致病型之间在序列上有最大差异的区域设计出引物。这些序列和基于这些序列设计出的引物可用于鉴定特定的病原体。
感兴趣的特定DNA序列包括来自谷丝核菌的ITS DNA序列。该ITSDNA序列公开于SEQ ID NO17-26。来自这些ITS序列具有代表性的寡核苷酸引物序列公开于SEQ ID NO7-16。这些序列可用于基于PCR鉴别感兴趣的病原体。
在PCR分析中使用本发明的引物的方法在本领域是众所周知的。例如，见美国专利Nos.4,683,195和4,683,202，以及Schlesser等(1991)，应用与环境微生物学(Appfied and Environ.Microbiol.)，57553-556。还参见Nazar等(1991；生理与分子植物病理学(Physiol.and Molec.Plant Pathol.)391-11)，其中用PCR扩增方法检测黄萎轮枝孢(Verticillium albo-atrum)和大丽花轮枝孢(Verticillium dahliae)在ITS区域的差异，并因此区分开这两个物种；Johanson和Jeger(1993；真菌学研究(Mycol.Res.)97670-674)用相似的技术区分开香蕉病原体Mycosphaerella fijiensis和Mycosphaerella musicale。
本发明的ITS DNA序列可用本领域已知的方法从真菌病原体克隆。通常，从真菌分离物中分离DNA的方法是已知的。见Raeder和Broda(1985)，应用微生物通讯(Letters in Applied Microbiology)217-20；Lee等(1990)，真菌遗传学通讯(Fungal GeneticsNewsletter)3523-24；Lee和Taylor(1990)，PCR方案方法和应用指南(InPCR ProtocolsA Guide to Methods andApplications，Innes等编著)，282-287页。
或者，可通过PCR扩增确定感兴趣的ITS序列。在一个作为例子的实施例中，用于扩增整个ITS区域的引物是根据White等(1990；PCR方案；；Innes等编著，315-322页)的方法设计的，并将扩增的ITS序列亚克隆到pCR2.1克隆载体。被亚克隆的序列包括左侧ITS(ITS1)、右侧ITS(ITS2)和位于中间的5.8S rRNA基因。该方法用于谷丝核菌的几种分离物。
在每个病原体组中比较确定的ITS序列以定位序列差异，而这种差异可用于在PCR中区分不同菌种和/或菌株。典型的已确定的ITSDNA序列表示在SEQ ID NOs17-26中。用这些序列做了一个比较性的序列比对。在鉴定序列差异中，合成了大量引物并用于PCR扩增。作为PCR扩增检测的模板首先用纯化的病原体DNA，然后用从受感染的宿主植物组织中分离的DNA。这样，有可能鉴定出诊断性的引物，即可鉴定特定的病原体菌种或菌株而不是同一病原体的另一菌种或菌株。
优选的引物组合能用于区分受感染宿主组织中的不同菌种或菌株，即已感染了特定病原体菌种或菌株的宿主组织。本发明提供了大量达到检测谷丝核菌标准的引物对。本发明的引物是依据真菌ITS区域的序列差异设计出的。序列之间一个碱基对的最小差异即能保证设计出区别性的引物。对特异真菌DNA的ITS区域设计的引物可与对核糖体DNA编码区域的保守序列区域设计的引物联合使用，以扩增出菌种特异性的PCR片段。通常，引物的理论熔解温度应该在约60到70℃，以得到好的敏感性，并且在引物联合中应避免形成显著的二级结构和3’端重叠。通常，引物至少与ITS1或ITS2的约5-10个相邻核苷酸有100％序列相同。在优选的实施例中，任何来源的引物的长度大约是5-30个核苷酸。
根据本发明易于制备包含进行该过程所必须的成分的试剂盒。该试剂盒包括一个被区室化的载体，从而在这封闭的区域里放下一个或更多的容器，例如试管或小瓶。其中的一个容器可包含未标记或可检测标记的DNA引物。标记的DNA引物可处于冻干状态或必要时处于合适的缓冲溶液中。一个或更多的容器可包含一种或更多的用于PCR反应的酶或试剂。这些酶或是纯品或是混合品，可处于冻干状态或合适的缓冲液中。
最后，试剂盒可含有进行本发明技术所必须的全部其他成分，例如缓冲液、提取试剂、酶、吸液管、平板、核酸、三磷酸核苷、滤纸、凝胶材料、转移材料、放射自显影设备等等。
下面的实施例展现了典型的实验方案，该实验方案可用于分离ITS序列、筛选合适的引物序列、检测引物的筛选和诊断功效，以及这些引物在病害和真菌分离物检测中的使用。通过例文性而非限制性的方式提供了这些实施例。
实施例这里使用的标准重组DNA和分子克隆技术在本领域是众所周知的，这些技术在以下的书中有描述J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，分子克隆实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，NY(1989)；T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，基因融合实验，冷泉港实验室，冷泉港，NY(1984)；Ausubel，F.M.等，分子生物学最新方案，Greene Publishing Assoc和Wiley-Interscience出版(1987)。
实施例1真菌分离物和真菌基因组DNA提取见表1，列出了使用的真菌分离物和它们的来源。通过用来自PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)培养基的菌丝体片段接种150ml的马铃薯葡萄糖培养液，从而培养真菌。在有轨振荡器上28℃培养7-11天。或者，可直接将菌丝体从PDA平板分离出。菌丝体经离心而沉淀，再在液氮中研磨，用Lee和Taylor的方案(1990；PCR方案方法和应用指南；Innes等编著；282-287页)提取总基因组DNA。
表1被测分离物的来源
1美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，Rockville，马里兰，美国2Marc Cubeta博士，北卡罗莱纳州立大学，Raleigh，北卡罗莱纳，美国3Lee Burpee博士，乔治亚大学，Athens，乔治亚，美国4Simon Edwards博士，Harper Adams农业学院，Newport，Shropshire，英国5Novartis Crop Protection AG，CH-4002 Basel，瑞士6Paul Nelson博士，宾夕法尼亚州立大学，宾夕法尼亚，美国7Novartis，Vero Beach，佛罗里达，美国8Cynthia Ocambi博士，俄勒冈州立大学，Corvallis，俄勒冈，美国9Paul Nicholson博士，John Innes Centre，Norwich，英国实施例2内部转录间隔区(ITS)区域的分离挑选表1所列的的真菌分离物，利用从中分离出的10ng基因组DNA，使用50pmol的ITS1引物(5’-tccgtaggtgaacctgcgg-3’；SEQ ID NO1)和ITS4引物(5’-tcctccgcttattgatatgc-3’；SEQ ID NO4)，进行PCR扩增，得到大约700bp长的内部转录间隔区区域片段。按实施例4的描述进行PCR。用Invitrogen Corporation(San Diego，CA)的TA克隆试剂盒(分类编号K2000-01)和PCR2.1克隆载体对PCR产物进行克隆。用Applied Biosystems(Foster City，CA)的自动测序仪，通过双脱氧法测定ITS区域的DNA序列，所用引物是ITS1引物(SEQ ID NO1)、ITS4引物(SEQ ID NO4)、M13通用-20引物(5’-gtaaaacgacggccagt-3’；SEQ ID NO5)和反向引物(5’-aacagctatgaccatg-3’；SEQ ID NO6)。White等(1990；PCR方案；Innes等编著，315-322页)对ITS引物ITS1和ITS4有详细描述。
实施例3从小麦中提取DNA用大块浸解方法从小麦中提取DNA。用大块浸解方法从大田里几个自然感染的小麦茎秆分离DNA，以优化用于高产率分析的大田取样方法。
大块浸解方法(1)从茎秆基部之上的主分蘖直接切下4cm长的小麦茎秆，将适当数量这样的小麦茎秆放进Bioreba(Reinach，瑞士)高容量塑料袋(目录号490100)中。秤量植物组织重量，用装有茎秆部分塑料袋的重量减去无关部分重量(塑料袋重量)。
(2)每克小麦组织加等量体积(ml)的Muller提取缓冲液(0.1％w/v Tween-80；0.04M Tris-Cl，pH7.7；0.15M NaCl；0.1％w/vBSA-Pentex fraction V；0.01％w/v叠氮钠；200mM EDTA)。用BiorebaHomex 6匀浆器以转速70浸析组织。研磨叶片直到组织成纤维状。
(3)使用时，集中多个塑料袋的提取物，并混匀。将提取液等量分装到放在冰上的微量离心管中。
(a)将100μl浓缩提取物煮沸5分钟。
(b)将煮沸的提取物放在冰上。
(c)通过将10μl煮沸的浓缩提取物加入90μl无菌dH2O中，使之按1∶10稀释。
(d)将稀释的提取物保存在冰上备用。
实施例4聚合酶链式反应扩增用购自Perkin-Elmer/Cetus的GeneAmp试剂盒(Norwalk，CT；分类编号N808-0009)进行聚合酶链式反应，其中在最终体积为50μl的反应中使用50mM KCl，2.5mM MgCl2，10mM Tris-HCl，pH8.3，包含dTTP、dATP、dCTP和dGTP各200μM，每种引物各50pmol，2.5个单位的Taq聚合酶，10ng基因组DNA或1μl的按1∶10稀释的植物提取液。反应在Perkin-Elmer/Cetus9600型或9700型热循环仪中进行30-40循环，每个循环为94℃时，15秒，50℃-70℃时，15秒，72℃时，45秒。每个PCR样品在1.0％琼脂糖凝胶上上样10μl，电泳，由此分析产物。
实施例5寡核苷酸的合成与提纯例如，寡核苷酸(引物)由Intergrated DNA Technologies(Coralville，IA)或Midland Certified Reagent(Midland，德克萨斯)合成。
实施例6物种特异性引物的选择将来自谷丝核菌分离物44234的ITS区域与来自颖枯壳针孢、曲毛假尾孢霉-R型、偃麦草核腔菌、大刀镰孢、M.nivale和小麦壳针孢的ITS区域进行序列比对。以对比序列的分析为基础，根据实施例5，合成寡核苷酸引物，如下表2中所列引物。对在真菌菌种之间序列上含有最大差异的区域设计引物。在以下谷丝核菌分离物的ITS区域之间进行另一个序列比对44235、AGDC57、CAGBN1、AGDC73、52182、Bn505、R88/303和52184。对谷丝核菌分离物的高保守区域也设计引物。另外，合成已发表的核糖体基因特异引物ITS1、ITS2、ITS3和ITS4(White等，1990；PCR方案；Innes等编著，315-322页)，用于与ITS区域特异性引物联合进行检测。
表2为检测真菌设计的引物引物模板引物引物序列18S rDNA ITS1 5’-tccgtaggtgaacctgcgg-3’(SEQ ID NO1)5.8S rDNA ITS2 5’-gctgcgttcttcatcgatgc-3’(SEQ ID NO2)5.8S rDNA ITS3 5’-gcatcgatgaagaacgcagc-3’(SEQ ID NO3)25S rDNA ITS4 5’-tcctccgcttattgatatgc-3’(SEQ ID NO4)谷丝核菌 JB6435’-gcgagagagaggctggct-3’(SEQ ID NO7)谷丝核菌 JB6445’-ctcgcgagagagaggctggct-3’(SEQ ID NO8)谷丝核菌 JB6455’-gagatcagatcataaagtgtg-3’(SEQ ID NO9)谷丝核菌 JB6465’-gagatcagatcataaagtgtgtttg-3’(SEQ ID NO10)谷丝核菌 JB6475’-ctgtgcaactgtttagacggtcg-3’(SEQ ID NO11)谷丝核菌 JB6485’-tgcaactgtttagacggtcg-3’(SEQ ID NO12)谷丝核菌 JB6495’-accgttagaagcggttcgtccat-3’(SEQ ID NO13)谷丝核菌 JB6505’-gttagaagcggttcgtccat-3’(SEQ ID NO14)谷丝核菌 JB6875’-tgcacctgtttagacggttg-3’(SEQ ID NO15)谷丝核菌 JB6885’-tgtgcacctgtttagacggt-3’(SEQ ID NO16)实施例7引物对纯化的真菌基因组DNA的特异性的测定根据实施例4，使用不同的引物组合(表3)进行PCR，以扩增出单一的特异性片段。在每种感兴趣的真菌菌株中，从由大、小核糖体DNA亚基之间的ITS区域设计的引物得到特异的PCR扩增产物。表3衍生自ITS的诊断性PCR引物引物特异性 5’端引物3’端引物扩增片段的大概长度谷丝核菌JB648(SEQ ID NO12)JB645(SEQ ID NO9) 523bp谷丝核菌ITS1(SEQ ID NO1) JB646(SEQ ID NO10) 637bp谷丝核菌ITS1(SEQ ID NO1) JB645(SEQ ID NO9) 637bp谷丝核菌ITS1(SEQ ID NO1) JB650(SEQ ID NO14) 596bp谷丝核菌JB648(SEQ ID NO12)ITS4(SEQ ID NO4)573bp谷丝核菌JB643(SEQ ID NO7) JB645(SEQ ID NO9) 485bp谷丝核菌JB687(SEQ ID NO15)JB645(SEQ ID NO9) 523bp谷丝核菌JB688(SEQ ID NO16)JB645(SEQ ID NO9) 525bp谷丝核菌ITS1(SEQ ID NO1) JB650(SEQ ID NO14) 596bp谷丝核菌JB648(SEQ ID NO12)ITS4(SEQ ID NO4)573bp谷丝核菌JB643(SEQ ID NO7) JB645(SEQ ID NO9) 485bp谷丝核菌JB687(SEQ ID NO15)JB645(SEQ ID NO9) 523bp谷丝核菌JB688(SEQ ID NO16)JB645(SEQ ID NO9) 525bp谷丝核菌JB687(SEQ ID NO15)ITS4(SEQ ID NO4)573bp谷丝核菌JB688(SEQ ID NO16)ITS4(SEQ ID NO4)575bp谷丝核菌JB687(SEQ ID NO15)JB646(SEQ ID NO10) 523bp谷丝核菌JB688(SEQ ID NO16)JB646(SEQ ID NO10) 525bp实施例8引物对已感染真菌的植物组织的特异性和引物与其他谷类真菌病原体的交叉反应性的测定按实施例3的描述，从健康小麦茎秆和已感染谷丝核菌的小麦茎秆分离总基因组DNA。按实施例4的描述，对小麦组织DNA进行PCR，以检测引物组合，如表3中所列的那些。按实施例1的描述，获得纯化的真菌基因组DNA，并且按实施例4的描述，用诊断性引物进行PCR分析。对其他真菌DNA菌种和分离物进行测试，以分析各诊断性引物之间的交叉反应能力。
用谷丝核菌特异引物组合JB648(SEQ ID NO12)和JB645(SEQ IDNO9)，从表1所列的所有谷丝核菌分离物的DNA以及谷丝核菌感染的小麦组织的DNA中扩增出一个523bp片段。该引物组合不能从健康小麦组织扩增出诊断性片段。该引物组合也不能从下列常见谷类病原体的纯化的基因组DNA中扩增出诊断性片段曲毛假尾孢霉-R-和W-致病型、D.sorokiniana、扁豆枝孢、小麦壳针孢、落花生尾孢、颖枯壳针孢、茄丝核菌、大刀镰孢、禾本科镰孢、M.nivale、偃麦草核腔菌和圆核腔菌。用表3所列的其他谷丝核菌特异引物组合得到相似的诊断结果。
虽然只参考具体实施方案描述了本发明，但应当理解，大量的变更、修改和进一步的实施方案是有可能的，因此，所有这些变更、修改和实施方案被认为属于本发明的范围。
序列表序列表<110>Syngenta Participations AG<120>基于PCR检测谷丝核菌<130>PB/5-31135A<140><141><150>US 09/481293<151>2000-01-11<160>33<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列ITS1的描述<400>1tccgtaggtg aacctgcgg 19<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列ITS2的描述<400>2gctgcgttct tcatcgatgc 20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列ITS3的描述<400>3gcatcgatga agaacgcagc20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列ITS4的描述<400>4tcctccgctt attgatatgc 20<210>5<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列M13通用20引物的描述<400>5gtaaaacgac ggccagt 17<210>6<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列反向引物的描述<400>6aacagctatg accatg16<210>7<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列JB643的描述<400>7gcgagagaga ggctggct18<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列JB644的描述<400>8ctcgcgagag agaggctggc t 21<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列JB645的描述<400>9gagatcagat cataaagtgt g21<210>10<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列JB646的描述<400>10gagatcagat cataaagtgt 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660aacttaagca tatcaataag cggagga 687<210>20<211>685<212>DNA<213>谷丝核菌<400>20tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta atgaatgaat gtagagtcgg ttgtagctgg 60gtcttttaat cgaggccatg tgcacacctt ctctttcatc cactcacacc tgtgcacctg 120tttagacggt tgaaggaaaa agtctttctc gcgagagaga ggccggctcc ttttcccgtc 180caatacataa aatcttatat atttaatcag aatgtaatcg atgtaaacgc atctataaac 240taagtttcaa caacggatct cttggctctc gcatcgatga agaacgcagc gaaatgcgat 300aagtaatgtg aattgcagaa ttcagtgaat catcgaatct ttgaacgcac cttgcgctcc 360ttggtattcc tcggagcacg cctgtttgag tatcatgaaa ttctcaaagc aagtcttttg 420ttaattcaac tggcttttgt tttggatttg gaggttttgc agattcacgt ctgctcctct 480taaatgcatt agctggatct ctataaaacc ggttccactc ggcgtgataa gtatcactcg 540ctgaggacac tcttgaaaaa gggtggccgg attcatggat gaaccgcttc taacggtcta 600ttagattaga caaacacact ttatgatctg atctcaaatc aggtgggact acccgctgaa 660cttaagcata tcaataagcg gagga 685<210>21<211>687<212>DNA<213>谷丝核菌<400>21tcctccgctt attgatatgc ttaagttcag cgggtagtcc cacctgattt gagatcagat 60cataaagtgt gtttgtctaa 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cctcggagca cacctgtttg agtatcatga aattctcaaa gcaagtcttt 420tgttaattca actggctttt gttttggatt tggaggtctt gcagattcac gtctgctcct 480cttaaatgca ttagctggat ctctataaaa ccggttccac tcggcgtgat aagtatcact 540cgccgaggac actcttgcaa aagggtggcc ggattcatgg acgaaccgct tctaacggtc 600tattagatta gacaaacaca ctttatgatc tgatctcaaa tcaggtggga ctacccgctg 660aacttaagca tatcaataag cggagga687<210>24<211>684<212>DNA<213>谷丝核菌<400>24tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta atgaatgaat gtagagtcgg ttgtagctgg 60gtcttttaat cgaggccatg tgcacgcctt ctctttcatc cacacacacc tgtgcacctg 120tttagacggt cgaaggaaaa agtctttctc gcgagagaga ggctggctcc ttttccgtcc 180aatacataaa atcttatata tttaatcaga atgtaatcga tgtaaacgca tctataaact 240aagtttcaac aacggatctc ttggctctcg catcgatgaa gaacgcagcg aaatgcgata 300agtaatgtga attgcagaat tcagtgaatc atcgaatctt tgaacgcacc ttgcgctcct 360tggtattcct cggagcacgc ctgtttgagt atcatgaaat tctcaaagca agtcttttgt 420taattcaact ggcttttgtt ttggatttgg aggtcttgca gattcacgtc tgctcctctt 480aaatgcatta gctggatctc tataaaatcg gttccactcg 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1.一种分离的DNA分子，其包括选自下组的内部转录间隔区(ITS)序列(a)谷丝核菌的ITS1，其中谷丝核菌的ITS1包括SEQ ID NO17的核苷酸31-243，SEQ ID NO18的核苷酸31-242，SEQ ID NO19的核苷酸31-243，SEQ ID NO20的核苷酸31-241，SEQ ID NO21的核苷酸31-243，SEQ ID NO22的核苷酸31-243，SEQ ID NO243的核苷酸31-180，SEQ ID NO24的核苷酸31-240，SEQ ID NO25的核苷酸31-242，或SEQ ID NO26的核苷酸31-242；(b)谷丝核菌的ITS2，其中谷丝核菌的ITS2包括SEQ ID NO17的核苷酸397-630，SEQ ID NO18的核苷酸396-629，SEQ ID NO19的核苷酸397-630，SEQ ID NO20的核苷酸395-628，SEQ ID NO21的核苷酸397-630，SEQ ID NO22的核苷酸397-630，SEQ ID NO23的核苷酸397-630，SEQ ID NO24的核苷酸394-627，SEQ ID NO25的核苷酸396-629，或SEQ ID NO26的核苷酸396-629。
2.一种在基于扩增的真菌内部转录间隔区DNA序列的检测中可使用的寡核苷酸引物，其中所述引物与权利要求1的内部转录间隔区序列的至少10个连续核苷酸序列相同。
3.一对在基于扩增的真菌内部转录间隔区DNA序列的检测中可使用的寡核苷酸引物，其中至少所述引物之一是权利要求2的寡核苷酸引物。
4.一种选自SEQ ID NO7-16的寡核苷酸引物。
5.一对寡核苷酸引物，其中至少所述引物之一是权利要求4的寡核苷酸引物。
6.根据权利要求5所述的一对寡核苷酸引物，其中所述引物对选自下列引物对SEQ ID NO12和SEQ ID NO9，SEQ ID NO1和SEQ ID NO10，SEQ ID NO1和SEQ ID NO9，SEQ ID NO1和SEQ ID NO14，SEQ ID NO12和SEQ ID NO4，SEQ ID NO7和SEQ ID NO9，SEQ ID NO15和SEQ ID NO9，SEQ ID NO16和SEQ ID NO9，SEQ ID NO15和SEQ ID NO4，SEQ ID NO16和SEQ ID NO4，SEQ ID NO15和SEQ ID NO10，和SEQ ID NO16和SEQ ID NO10
7.根据权利要求6所述的一对寡核苷酸引物，其中所述引物对是SEQ ID NO12和SEQ ID NO9。
8.一种检测真菌病原体的方法，包括步骤(a)从感染病原体的植物叶片中分离DNA；(b)用所述DNA进行聚合酶链式反应扩增，其中使用根据权利要求2所述的至少一种引物；和(c)通过显示所述聚合酶链式反应扩增的产物来检测所述真菌病原体。
9.权利要求8的方法，其中所述真菌病原体是谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)。
10.一种检测真菌病原体的方法，包括步骤(a)从感染病原体的植物叶片中分离DNA；(b)以所述DNA为模板，使用根据权利要求3所述的一对引物，进行聚合酶链式反应，扩增所述病原体的内部转录间隔区序列的一部分；(c)通过显示该内部转录间隔区序列的已扩增部分来检测所述真菌病原体。
11.权利要求10的方法，其中所述真菌病原体是谷丝核菌。
12.一种检测谷丝核菌的方法，包括步骤(a)从感染谷丝核菌的植物叶片中分离DNA；(b)以所述DNA为模板，使用根据权利要求6所述的一对引物，进行聚合酶链式反应，扩增谷丝核菌的内部转录间隔区序列的一部分；和(c)通过显示该内部转录间隔区序列的已扩增部分来检测谷丝核菌。
13.权利要求12的方法，其中所述引物对是SEQ ID NO12与SEQID NO9。
14.一种用于检测真菌病原体的诊断试剂盒，其包括权利要求2的引物。
15.一种用于检测真菌病原体的诊断试剂盒，其包括权利要求3的引物对。
全文摘要
描述了小麦真菌病原体谷丝核菌的不同菌株的核糖体RNA基因区域内部转录间隔区(ITS)DNA序列。证实来自这些序列的特异引物在基于PCR的技术鉴定谷丝核菌中是有用的。
文档编号C12N15/31GK1395621SQ01803602
公开日2003年2月5日 申请日期2001年1月9日 优先权日2000年1月11日
发明者J·J·贝克, C·J·巴奈特 申请人:辛根塔参与股份公司