专利名称：酒精产品生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及从粒状淀粉制备酒精(alcohol)产品的工艺(process)，包括在低于胶质化温度的升高的温度预处理粒状淀粉，然后同时进行糖化和发酵。
背景技术：
粒状淀粉见于谷粒，谷物或植物块茎中。粒状淀粉是显微颗粒的形式，其在室温不溶于水。当加热含水淀粉浆时，所述颗粒膨胀并最终破裂，浆淀粉分子分散入溶液。在该“胶质化”过程中，粘度明显增加。由于固体水平在常规工业工艺中为30-40％，所述淀粉必须被稀释(thinned)或“液化”使得其可在随后的工艺步骤中得以处理。粘度的降低通常通过称为液化(liquefaction)的工艺中的酶降解实现。在液化中，长链淀粉被α-淀粉酶降解成较小的葡萄糖单位(糊精)的分支以及线性链。
常规酶促液化工业可作为三步热浆工艺实施。所述浆被加热到80-85℃并加入热稳定α-淀粉酶以启动液化。随后将所述浆在室温蒸气热压蒸煮(jet-cook)到105-125℃以完成所述浆的胶质化，冷却到60-95℃，并通常将另外的α-淀粉酶加入以终止水解。所述液化工艺通常在pH 5-6进行。磨细的并液化的完整谷粒已知为醪液(mash)。
在糖化过程中，来自液化的糊精进一步水解以生成低分子量糖DP1-3，其可被酵母代谢。所述水解通常利用葡糖淀粉酶完成，可选或除外葡糖淀粉酶，可以使用α-葡糖苷酶和/或酸性α-淀粉酶。完整的糖化步骤通常持续达72小时，然而，通常仅仅进行例如50℃以上、40-90分钟的预糖化，然后在发酵过程中，在已知为同时糖化与发酵(SSF)的工艺中进行完全糖化。
发酵可利用酵母例如来自糖酵母属进行，所述酵母被加入醪液。当酒精产物是回收的乙醇例如燃料乙醇、饮用乙醇或工业乙醇时，在通常约32℃发酵通常35-60小时。当所述酒精产物是啤酒时，在通常约14℃发酵通常达8天。
发酵后，醪液可用作例如啤酒，或经蒸馏以回收乙醇。乙醇可用作例如燃料乙醇，饮用乙醇，和/或工业乙醇。
从上述讨论明显可见，常规酒精产物中的淀粉水解由于不同步骤的不同温度需要而非常耗能。美国专利4,316,956提供了将粒状淀粉转化成乙醇的发酵工艺。欧洲专利EP0140410B2提供淀粉水解用酶组合物。本发明的目的是提供将粒状淀粉转化成酒精产物的改进的工艺。
发明概述本发明提供从粒状淀粉制备酒精产物而无需预先胶质化所述淀粉的方法。第一方面中，本发明提供用于制备酒精产物的方法，包括以下步骤(a)将含有水和粒状淀粉的浆液保持在低于所述淀粉初始胶质化温度0℃-20℃的温度5分钟-12小时，和(b)将步骤(a)的浆液与酵母在10℃-35℃发酵20-250小时以生成乙醇，其中步骤(a)和(b)在存在酸性α-淀粉酶活性，麦芽糖生成酶活性和α-葡糖苷酶活性的条件下进行。步骤(a)和(b)以所述顺序进行；然而，所述工艺包括本说明书中没有说明的其它步骤，其可在步骤(a)和(b)之前、之间和之后进行。
尽管不限于任何操作理论之一，本发明具体步骤(a)据信导致植物细胞中所含淀粉颗粒的膨胀导致细胞壁破坏并释放淀粉颗粒，从而导致所述淀粉颗粒更容易进一步发生水合并受到酶的作用。经步骤(a)的水合，酸性α-淀粉酶降解所述淀粉颗粒以产生糊精，其可被麦芽糖生成酶降解成麦芽糖，麦芽糖最终被α-葡糖苷酶降解成葡萄糖。该过程在步骤(b)中持续，其中所述葡萄糖被酵母持续发酵成乙醇，从而在整个发酵中将可发酵糖的浓度维持在相对低浓度。不限于任何一种操作理论，据信由于发酵过程中糖的低浓度，由于渗透调节对于甘油的需要有限，酵母的甘油生产减少。在此方面，本发明用于制备与常规工艺相比具有降低的甘油和/和甲醇含量的酒精产品。
本发明提供低耗能工艺以替代必须利用大量能量以胶质化所述淀粉浆的常规工艺。本发明的其它优势包括但不限于，在整个工艺中采用低pH的能力，减少不需要的微生物生长的几率，以及降低和消除对昂贵设备以胶质化所述淀粉的需要，所述设备诸如喷射装置和锅炉房(steam plant)设备。
本发明第二方面涉及酶组合物，其包含酸性α-淀粉酶活性，麦芽糖生成酶活性和α-葡糖苷酶活性，其中存在其它酶活性；所述酶活性选自支链淀粉酶，纤维素酶，木聚糖酶和肌醇六磷酸酶(phytase)组成的组。
本发明第三方面涉及第二方面的酶组合物在酒精产品工艺和淀粉水解工艺中的用途。
本发明第四方面涉及包含酸性α-淀粉酶活性，麦芽糖生成酶活性和α-葡糖苷酶活性的酶组合物在酒精产品工艺中的用途，包括粒状淀粉的水解。
发明内容
术语″酒精产品″指包含乙醇，例如燃料乙醇，可饮用以及工业乙醇的产品。然而所述酒精产品也可为啤酒，其可为任何类型的啤酒。优选的啤酒类型包括爱儿啤酒(ales)，上面发酵的浓烈黑啤酒(stouts)，英国黑啤(porters)，陈贮啤酒(lagers)，苦味酒(bitter)，麦芽酒(mait liquor)，happoushu，高酒精啤酒，低酒精啤酒，低热量啤酒和清淡啤酒。
术语″粒状淀粉″的意思是生的未蒸煮的淀粉，即谷物，块茎或谷粒中发现的天然形式的淀粉。淀粉在植物细胞中形成的不溶于水的微小颗粒。当加入冷水时，淀粉颗粒吸收少量液体并膨胀。在达50℃-75℃的温度，所述膨胀是可逆的。然而，在更高温度条件下，开始称为胶质化(gelatinization)的可逆膨胀。
术语″初始胶质化温度″指淀粉的胶质化开始的最低温度。在水中加热的淀粉在50℃-75℃开始胶质化；胶质化的确切温度有赖于具体的淀粉，并可由本领域技术人员轻易测定。因此，初始胶质化温度可根据植物品种，植物品种的具体变种，以及生长条件而变化。在本发明中，给定淀粉的初始胶质化温度是利用Gorinstein.S.and Lii.C.，Starch/Starke，Vol.44(12)pp.461-466(1992)所述的方法，淀粉颗粒的双折射损失5％的温度。
多肽“同源性”的意思是两条氨基酸序列之间的同一性程度。同源性可适宜通过本领域已知的计算机程序测定，诸如GCG程序包中的GAP(Program Manual for the Wisconsin Package，Version 8，August 1994，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)(Needleman，S.B.and Wunsch，C.D.，(1970)，Journal ofMolecular Biology，48，443-453)。多肽序列比较利用以下设定GAP生成罚分3.0，GAP延长罚分0.1。
酸性α-淀粉酶术语″酸性α-淀粉酶″的意思是以有效量加入的α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)，其在pH 3.0-7.0，优选3.5-6.0，或更优选4.0-5.0具有活性。
任何适宜的酸性α-淀粉酶可用于本发明。优选的酸性α-淀粉酶可源自真菌和细菌菌株。
优选的酸性真菌α-淀粉酶是Fungamyl-样α-淀粉酶。在本文的公开中，术语″Fungamyl样α-淀粉酶″表示这样的α-淀粉酶，其与WO96/23874中的SEQ ID No.10和/或本文的SEQ ID NO5的氨基酸序列具有高度同源性，即超过50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％或甚至90％同源性。当用作麦芽糖生成酶时，真菌α-淀粉酶可以0.001-1.0AFAU/gDS，优选0.002-0.5AFAU/g DS，优选0.02-0.1AFAU/g DS的量加入。
优选所述α-淀粉酶是酸性α-淀粉酶，其与具有SEQ ID NO1所述氨基酸序列的酸性真菌α-淀粉酶具有至少70％，优选至少75％，80％，85％或至少90％，例如至少95％，至少97％，至少98％，或至少99％同源性。最优选所述酸性α-淀粉酶是酸性真菌α-淀粉酶，其具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列或其变体，所述变体与SEQ ID NO1所示氨基酸序列相比其中一或多个氨基酸残基被缺失、取代和/或插入，其中所述变体具有α-淀粉酶活性。
优选用于本发明的酸性细菌α-淀粉酶可源自菌株地衣芽孢杆菌(B.lichenformis)，解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)，和嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)。还优选具有这样的氨基酸序列的酸性α-淀粉酶，所述氨基酸序列与SEQ ID NO2和SEQ ID NO3所示序列具有至少50％同源性，优选至少60％，70％，80％，85％或至少90％，例如至少95％，97％，98％，或至少99％，诸如100％同源性。优选用于本发明工艺的酸性α-淀粉酶是WO96/23874，WO97/41213和WO99/19467所述的酸性α-淀粉酶变体以及杂合体之一，诸如与SEQ ID NO2所示野生型氨基酸序列相比具有突变delta(181-182)+N193F(也表示为I181*+G182*+N193F)的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(BSGα-淀粉酶)变体。所述酸性细菌α-淀粉酶也可为杂合α-淀粉酶，其包含SEQ ID NO3所示地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的445C-末端氨基酸残基以及SEQ ID NO4所示的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的37N-末端氨基酸残基，其还可包含取代G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(利用WO 99/19467的SEQ ID NO5中的编号，在本文中显示为SEQ ID NO3)。还优选解淀粉芽孢杆菌来源的α-淀粉酶变体，其与SEQ ID NO4所示序列具有至少50％同源性，诸如至少60％，至少70％，至少80％，或甚至90％同源性。具体是优选这样的变体，其具有突变突变H154Y，A181T， N190F，A209V及Q264S中的一或多种突变和/或位置176与179之间的两个残基缺失，优选缺失E178和G179。
优选的商品化组合物包含酸性α-淀粉酶，包括来自DSM(Gist Brochades)的Mycolase，BANTM，TERMAMYLTMSC，FUNGAMYLTM，LIQUOZYMETMX和SAN SUPER，SANTMEXTRA L(Novozymes A/S)以及Clarase L-40,000，DEX-LOTM，Spezyme FRED，SPEZYMETMAA，和SPEZYMETMDELTA M(Genencor Int.)。
麦芽糖生成酶本发明的麦芽糖生成酶可为产麦芽糖α-淀粉酶，β-淀粉酶或真菌α-淀粉酶。
产麦芽糖α-淀粉酶(葡聚糖1，4-α-麦芽糖水解酶)能将直链淀粉和支链淀粉水解成α-构型的麦芽糖。此外，产麦芽糖α-淀粉酶能水解麦芽三糖以及环糊精。具体涉及的产麦芽糖α-淀粉酶可源自芽孢杆菌属，优选源自嗜热脂肪芽孢杆菌，最优选源自嗜热脂肪芽孢杆菌C599，诸如EP120.693中所述。该具体的产麦芽糖α-淀粉酶具有显示为US6162628中SEQ ID NO1的氨基酸1-686的氨基酸序列。优选的产麦芽糖α-淀粉酶具有与US6162628中SEQID NO1的氨基酸1-686有至少70％，优选至少80％，至少85％，至少90％，至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或具体至少99％同一性的氨基酸序列。产麦芽糖α-淀粉酶最优选的变体包含WO99/43794中公开的变体。
产麦芽糖α-淀粉酶可以以0.01-40.0MANU/g DS，优选0.02-10MANU/g DS，优选0.05-5.0MANU/g DS的量加入。
另一种用于本发明的麦芽糖生成酶可为β-淀粉酶(E.C 3.2.1.2)。β-淀粉酶是通常给予外-作用型(exo-acting)产麦芽糖淀粉酶的名称，其催化淀粉、支链淀粉以及相关葡萄糖聚合物中1，4-α-葡糖苷键的水解。
β-淀粉酶已经从各种植物和微生物中分离(W. M.Fogarty and C.T.Kelly，Progress in Industrial Microbiology，vol.15，pp.112-115，1979)。这些β-淀粉酶的特征在于具有40℃-65℃的最适温度范围以及4.5-7.0的最适pH范围。优选β-淀粉酶源自丝状真菌，诸如源自微小根毛霉(Rhizomucorpusilis)β-淀粉酶。涉及的β-淀粉酶包括来自大麦SpezymeBBA1500，SpezymeDBA和OptimaltTMME，Genencor Int.的OptimaltTMBBA以及Novozymes A/S的Novozym WBA的β-淀粉酶。
用于本发明工艺中的另一种麦芽糖生成酶可以是真菌α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)，诸如fungamyl-样α-淀粉酶。本发明的公开中，术语″fungamyl-样α-淀粉酶″表示这样的α-淀粉酶，其与WO96/23874中氨基酸序列SEQ ID No.10具有高同源性，即超过50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％或甚至90％同源性。当用作麦芽糖生成酶时，真菌α-淀粉酶可以以0.001-1.0AFAU/g DS，优选0.002-0.5AFAU/g DS，优选0.02-0.1AFAU/g DS的量加入。
α-葡糖苷酶用于本发明工艺中的α-葡糖苷酶或麦芽糖酶(EC 3.2.1.48)可源自微生物，诸如细菌或真菌，或源自植物。优选的真菌来源的α-葡糖苷酶诸如源自酵母和丝状真菌的α-葡糖苷酶。优选的α-葡糖苷酶源自念珠菌属(Candida)菌株诸如源自菌株C.edax，优选菌株CBS 6461。还优选源自毕赤酵母属(Pichia sp.)菌株的α-葡糖苷酶，所述毕赤酵母属的菌株诸如菌株P.amylophilia，P.missisippiensis，威克毕赤酵母(P.wicherhamii)和罗丹毕赤酵母(P.rhodanensis)。还涉及源自曲霉属诸如构巢曲霉(A.nidulans)的α-葡糖苷酶(Kato et al.2002，Appl EnvironMicrobiol.681250-1256)的α-葡糖苷酶，源自囊轴霉属(Rhizobium sp.)的α-葡糖苷酶(Berthelot etal.1999，ApplEnvironMicrobiol.652907-2911)或植物来源的的α-葡糖苷酶，诸如源自谷物，诸如小麦，裸麦(rye)，大麦玉米或稻。
优选的细菌α-葡糖苷酶包括源自芽孢杆菌属诸如嗜热脂肪芽孢杆菌菌株的α-葡糖苷酶。优选的α-葡糖苷酶具有与本文SEQ ID NO6所示序列的成熟部分有至少50％同源性，优选至少60％，70％，80％，85％或至少90％，例如，至少95％，97％，98％，或至少99％，诸如100％同源性的氨基酸序列。涉及的可购得的α-葡糖苷酶是嗜热脂肪芽孢杆菌α-葡糖苷酶，其购自SIGMA(Sigma cat.No.G3651)。植物来源的α-葡糖苷酶可来自谷物，诸如来自小麦，裸麦，大麦玉米或稻。
α-葡糖苷酶也可以以0.1-10000麦芽糖酶单位/kg DS，1-1000麦芽糖酶单位/kg DS，或更优选10-100麦芽糖酶单位/kg DS，诸如和更优选1-10麦芽糖酶单位/kg DS的量加入。
其它酶根据本发明使用的木聚糖酶可源自任何适宜的生物体，包括真菌和细菌生物体，诸如曲霉属，Disporotrichum，青霉属(Penicillium)，脉孢霉属(Neurospora)，镰孢属(Fusarium)和木霉属(Trichoderma)。
木聚糖酶也可以1-50000FXU/kg DS，优选5-5000FXU/kg DS，或更优选10-500FXU/kg DS的量加入。
优选可购得的制剂包括木聚糖酶，包括SHEARZYME PLUS，BIOFEED WHEAT，CELLUCLAST，ULTRAFLO，VISCOZYME(来自Novozymes A/S)和SPEZYMECP(来自Genencor Int.)。
纤维素酶活性(E.C.3.2.1.4)可以是微生物来源的纤维素酶，诸如可衍生自丝状真菌菌株(例如，曲霉属，木霉属，腐质霉属(Humicola)，镰孢属)。纤维素酶可以以0.01-500000EGU/kg DS，优选0.1-10000EGU/kg DS，优选1-5000EGU/kg DS，更优选10-500EGU/kg DS，最优选100-250EGU/kgDS的量使用。
可使用的包括纤维素酶的商品化制剂包括SHEARZYME PLUS，CELLUCLAST，CELLUZYME，CEREFLO和ULTRAFLO(来自Novozymes A/S)，LAMINEXTM和SPEZYMECP(来自Genencor Int.)和ROHAMENT7069W(来自Rohm GmbH)。
用于该工艺的另一种酶可为脱支酶，诸如支链淀粉酶(E.C.3.2.1.41).脱支酶可以以本领域技术人员已知的有效量加入。
第一方面的第一个优选实施方案中，本发明提供制备乙醇的工艺，包括以下步骤(a)将含有水和粒状淀粉的浆液保持在低于所述粒状淀粉的初始胶质化温度0℃-20℃的温度5分钟-12小时，(b)将步骤(a)的浆液与酵母一起在10℃-35℃发酵20-250小时以制备乙醇；其中步骤(a)和(b)在酸性α-淀粉酶活性，麦芽糖生成酶活性和α-葡糖苷酶活性存在的条件下进行。
步骤(a)和(b)按所述顺序进行；然而，所述工艺包括本发明中未说明的步骤，其在步骤(a)和(b)以前，中间和之后进行。
第一方面的第一个优选实施方案中，步骤(b)中的温度为28℃-36℃，优选29℃-35℃，更优选30℃-34℃，诸如约32℃，并保持所述浆液与α-淀粉酶，葡糖淀粉酶和酵母接触足够的时间，以允许步骤(b)中所述淀粉的水解以及释放的糖的发酵，优选25-190小时，优选30-180小时，更优选40-170小时，甚至更优选50-160小时，更优选60-150小时，甚至更优选70-140小时，最优选80-130小时，诸如85-110小时。
第一方面的第二个优选实施方案中，本发明提供制备啤酒的工艺，包括以下步骤(a)将含有水和粒状淀粉的浆液保持在低于所述粒状淀粉的初始胶质化温度0℃-20℃的温度5分钟-12小时，(b)将步骤(a)的浆液与酵母一起在10℃-18℃发酵20-200小时以制备乙醇；其中步骤(a)和(b)在酸性α-淀粉酶活性，麦芽糖生成酶活性和α-葡糖苷酶活性存在的条件下进行。步骤(a)和(b)按所述顺序进行；然而，所述工艺包括本发明中未说明的步骤，其在步骤(a)和(b)以前，中间和之后进行。
第一方面的第二个优选实施方案中，步骤(b)中的温度为10℃-18℃，优选11℃-17℃，更优选12℃-16℃，诸如13℃-15℃，例如约14℃，并保持所述浆液酸性α淀粉酶活性，麦芽糖生成酶活性，α-葡糖苷酶活性和酵母接触足够的时间，以允许步骤(c)中所述淀粉的水解以及释放的糖的发酵，优选100-230小时，优选150-210小时，更优选170-200小时。
酸性α-淀粉酶以有效量加入，所述有效量为足以实现将淀粉浆中的粒状淀粉转化成糊精的意图目的的酸性α-淀粉酶浓度。
麦芽糖生成酶以有效量加入，所述有效量为足以实现将淀粉浆中生成的糊精转化成麦芽糖的意图目的的麦芽糖生成酶浓度。
α-葡糖苷酶以有效量加入，所述有效量为足以实现将淀粉浆中生成的麦芽糖转化成葡萄糖的意图目的的α-葡糖苷酶浓度。
本发明第一方面的优选实施方案中，步骤(a)和/或步骤(b)在选自下组的其它酶活性存在下进行木聚糖酶，纤维素酶和肌醇六磷酸酶。所述其它酶优选与α-淀粉酶，麦芽糖生成酶和α-葡糖苷酶一同加入。
本发明第一方面的具体实施方案中，步骤(a)和/或步骤(b)在葡糖淀粉酶存在和缺乏的条件下进行。
所述酶活性的剂型优选为本发明第二方面的组合物。
优选实施方案中，所述淀粉浆包括水和5-60％DS(干固体)粒状淀粉，优选10-50％DS粒状淀粉，更优选15-40％DS，具体是约20-25％DS粒状淀粉.将在本发明工艺中加工的粒状淀粉可具体获自块茎，根，茎，玉米穗轴(cobs)，豆荚类(legume)，谷物或完整谷粒(grain)。更具体地，所述粒状淀粉可得自玉米，玉米穗轴，小麦，大麦，裸麦，买罗高梁(milo)，西米(sago)，木薯(cassava)，木薯(tapioca)，高梁，稻，豌豆(pea)，菜豆(bean)，香蕉或马铃薯。优选糯型和非糯型(waxy)玉米及大麦。待加工的粒状淀粉可优选包含粉碎的完整谷粒或可以含有更精制的淀粉质量，优选超过90％，95％，97％或99.5％纯淀粉。含有淀粉的原料物质优选被粉碎以开放其结构并允许进一步加工。可以采用干性碾磨(dry milling)以及湿性(wet)碾磨。当应用湿性碾磨时，可先进行浸泡和浸渍步骤。干性和湿性碾磨都是酒精生产领域已知的并为本发明的工艺所优选。在所述酒精产品时啤酒的本发明第一方面的第二个实施方案中，所述粒状淀粉可优选包含至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％或甚至至少90％粒状淀粉，所述粒状淀粉来自发芽谷物，例如大麦芽。
步骤(a)和/或(b)过程中的pH优选在3.0-7.0，更优选3.5-6.0，或最优选4.0-5.0，诸如4.3-4.6。
所述浆液在低于初始胶质化温度的升高的温度条件下与酶接触一段时间，以有效使得所述淀粉颗粒容易被酶降解(步骤b)，优选5分钟-12小时，优选10分钟-6小时，更优选15分钟-3小时，甚至更优选20分钟-1.5小时，诸如30分钟-1.25小时，40-70分钟，甚至50-60分钟。步骤(a)过程中的温度应一直被调节到低于待加工特定粒状淀粉的初始胶质化温度，并通常为45℃-75℃。根据本发明，步骤(a)在比待加工具体淀粉初始胶质化温度低0℃-20℃，优选0℃-15℃，更优选0℃-10℃，或甚至更优选0℃-5℃的温度进行。实际温度可为45℃-75℃，但优选55℃-65℃。优选步骤(a)进行的温度是至少45℃，46℃，47℃，48℃，49℃，50℃，51℃，52℃，53℃，54℃，55℃，56℃，57℃，58℃或优选至少55℃，优选所述温度不超过74℃，73℃，72℃，71℃，70℃，69℃，68℃，67℃，66℃，65℃，64℃，63℃或优选不超过62℃。
经过本发明第一方面的加工后，所述粒状淀粉的干固体的至少85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或优选99％被转化成乙醇。
所述乙醇可选被回收。所述乙醇可通过任何常规方式诸如蒸馏回收，并可用作燃料乙醇和/或饮用乙醇和/或工业乙醇。
在具体优选的实施方案中，待加工的粒状淀粉源自干或湿粉碎的谷物，诸如小麦，大麦，裸麦，和/或玉米，所述淀粉浆具有20-40％的DS，步骤(a)中的温度为50℃-60℃，诸如55℃，步骤(a)的持续时间是30分钟-75分钟，诸如60分钟，步骤(b)进行60-90小时。
本发明第二方面的组合物的优选实施方案中，存在其它酶活性；所述酶活性选自纤维素酶，木聚糖酶和肌醇六磷酸酶组成的组。
材料和方法α-淀粉酶活性(KNU)所述淀粉分解活性可利用马铃薯淀粉作为底物测定。所述方法基于酶对经修饰的马铃薯淀粉的分解，所述反应后将淀粉/酶溶液样品与碘溶液混合。开始，形成蓝黑色，但在淀粉分解过程中，蓝色变浅并逐渐变成红棕色，将其与有色玻璃(glass)标准品进行比较。
1公斤(kilo)Novoα淀粉酶单位(KNU)定义为在标准条件(即37℃+/-0.05；0.0003M Ca2+；pH 5.6)下，糊精化5260mg淀粉干物质MerckAmylum solubile的酶量。
更详细描述所述分析方法的文件EB-SM-0009.02/01可向NovozymesA/S，Denmark索取获得，所述文件包含在本文作为参考。
酸性α-淀粉酶活性当根据本发明使用时，任何酸性α-淀粉酶的活性可以AFAU(酸性真菌α-淀粉酶单位)测定。可选，酸性α-淀粉酶活性可以AAU(酸性α-淀粉酶单位)测定。
酸性α-淀粉酶单位(AAU)酸性α-淀粉酶活性可以AAU(酸性α-淀粉酶单位)测定，其是绝对方法。一个酸性淀粉酶单位(AAU)是标准条件下每小时将1g淀粉(100％干物质)转化成某种产物的酶的量，所述产物在与具有等于已知等同于颜色参比物之一的强度的碘溶液反应后具有620nm发射光谱(transmission)。
标准条件/反应条件底物 可溶淀粉，浓度大约20g DS/L。
缓冲液 柠檬酸，大约0.13M，pH＝4.2碘溶液 40.176g碘化钾+0.088g碘/L城市水(city water) 15°-20°dH(German degree hardness)pH 4.2保温温度 30℃反应时间 11分钟波长 620nm酶浓度 0.13-0.19AAU/mL酶工作范围 0.13-0.19AAU/mL所述淀粉应为Lintner淀粉，其为用于实验室作为比色指示剂的轻沸淀粉。Lintner淀粉通过用稀盐酸处理天然淀粉使其保持与碘呈蓝色的能力而获得。进一步详细说明见EP0140410B2，其公开包含在本文中作为参考。
酸性α-淀粉酶活性(AFAU)酸性α-淀粉酶活性可以以AFAU(酸性真菌A-淀粉酶单位)测定，其相对于酶标准品测定。1FAU定义为在上述标准条件下降解5.260mg淀粉干物质每小时的酶的量。
酸性α-淀粉酶，内-α-淀粉酶(1，4-α-D-葡聚糖-葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)水解淀粉分子内部区域中的α-1，4-葡糖苷键以形成链长各异的糊精和寡糖。同碘形成的颜色强度与淀粉浓度成正比。利用逆比色法测定淀粉酶活性，其为规定的分析条件下淀粉浓度的降低。
λ＝590nm蓝/紫罗兰t＝23sec.脱色标准条件/反应条件
底物可溶淀粉，大约0.17g/L缓冲液 柠檬酸，大约0.03M碘(12) 0.03g/LCaCl2 1.85mMpH 2.50±0.05保温温度40℃反应时间23秒波长590nm酶浓度 0.025AFAU/mL酶工作范围 0.01-0.04AFAU/mL更详细描述该分析方法的文件EB-SM-0259.02/01可向Novozymes A/S，Denmark索取获得，该文件包含在本文中作为参考。
产麦芽糖α-淀粉酶活性(MANU)一个产麦芽糖淀粉酶Novo单位(MANU)定义为在标准条件下每分钟切割1微摩尔麦芽三糖的酶的量。标准条件是10mg/ml麦芽三糖，37℃，pH5.0，和反应时间30分钟。在NADH形成的条件下，形成的葡萄糖通过葡萄糖脱氢酶(GlucDH，Merck)转化成葡糖酸内酯，其在340nm由光谱仪分析。更详细描述该分析方法的文件(EAL-SM-0203.01)可向Novozymes A/S，Denmark索取获得，该文件包含在本文中作为参考。
β-淀粉酶活性(DP°)SPEZYMEBBA 1500的活性以分解淀粉力(Degree of Diastatic PowerDP°)程度表示。当所述样品与100ml底物在20℃保温1小时的情况下，0.1ml 5％样品酶制备物溶液中所含的酶的量将产生足够的还原型糖，可还原5ml Fehling′s溶液。
支链淀粉酶活性(新支链淀粉酶单位Novo(NPUN))支链淀粉酶活性可相对于支链淀粉底物测定。支链淀粉是线性D-葡萄糖聚合物，基本由1，6-α-键连接的麦芽三糖单位组成。内-支链淀粉酶随机水解1，6-α-键，释放麦芽三糖，63-α-麦芽三糖基-麦芽三糖，63-α-(63-α-麦芽三糖基-麦芽三糖基)-麦芽三糖。
一个新支链淀粉酶单位Novo(NPUN)是内-支链淀粉酶活性单位并相对于Novozymes A/S Promozyme D标准品测定。标准条件是反应时间30分钟，40℃、pH 4.5；以0.7％支链淀粉作为底物。红色底物降解的量通过光谱仪在510nm测定，并与样品中的内-支链淀粉酶活性成比例。更详细描述所述分析方法的文件(EB-SM.0420.02/01)可向Novozymes A/S，Denmark索取获得，所述文件包含在本文作为参考。
在标准条件下，一个NPUN大约等于每分钟释放还原能力等于2.86微摩尔葡萄糖的还原型碳水化合物的酶的量。
α-葡糖苷酶活性α-葡糖苷酶活性可以以实施例1-5中所用的麦芽糖酶单位(形成的g葡萄糖/L麦芽糖酶制备物/小时)表示。麦芽糖酶制备物在60℃、20％w/v麦芽糖溶液中、于50mM柠檬酸pH＝4.5中保温60分钟(1小时)。释放的葡萄糖的量利用GOD-PERID实验，Boehringer Mannheim测定。
α-葡糖苷酶活性可选以实施例6-9所用α-葡糖苷酶单位表示。一个单位在37℃、pH 6.8，每分钟从p-硝基苯基-α-D-葡糖苷释放1.0微摩尔D-葡萄糖。
一个麦芽糖酶单位大约等于100α-葡糖苷酶单位。
木聚糖分解(xylanolytic)活性木聚糖分解活性可以以FXU-单位表达，所述FXU-单位在pH 6.0用remazol-木聚糖(用Remazol Brilliant Blue R，Fluka染色的4-O-甲基-D-葡糖醛酸-D-木聚糖)作为底物测定。
木聚糖酶样品与remazol-木聚糖底物一同保温。未降解的、染色的底物的背景通过乙醇沉淀。上清液中残留的蓝颜色(如光谱计在585nm测定的)与木聚糖酶活性成比例，并且随后相对于酶标准品在标准反应条件测定木聚糖酶单位，所述标准条件即50.0℃，pH 6.0，反应时间30分钟。
更详细描述所述分析方法的文件EB-SM.352.02/01可向Novozymes A/S，Denmark索取获得，所述文件包含在本文作为参考。
纤维素溶解活性纤维素溶解活性以内-葡聚糖酶单位(EGU)测定，所述测定在pH 6.0用羧甲基纤维素(CMC)作为底物进行。制备底物溶液，其含有34.0g/l CMC(Hercules 7LFD)(0.1M磷酸盐缓冲液中、pH 6.0)。待分析酶样品溶解于所述缓冲液中。混合5ml底物溶液和0.15ml酶溶液并转移到震动粘度计(vibration viscosimeter)(例如MIVI 3000，来自Sofraser，France)中，在40℃热稳定30分钟。一个EGU定义为在这些条件下将粘度减少到二分之一的酶的量。酶样品的量应调节到在反应混合物中为0.01-0.02EGU/ml。主要(arch)标准定义为880EGU/g。
更详细描述所述分析方法的文件EB-SM-0275.02/01可向NovozymesA/S，Denmark索取获得，所述文件包含在本文作为参考。
肌醇六磷酸酶活性肌醇六磷酸酶活性以FYT单位测定，一个FYT是在以下条件释放1微摩尔无机正磷酸盐每分钟的酶的量pH 5.5；温度37℃；底物肌醇六磷酸钠(C6H6O24P6Na12，浓度0.0050摩尔/l。
酶制备物使用以下酶制备物酸性细菌α-淀粉酶；酶制备物，其包含具有嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶活性(E.C.3.2.1.1)并具有WO99/19467中公开的氨基酸序列SEQ.NO4的多肽。活性120KNU/g(比重＝1.20-1.25g/mL)。
酸性真菌α-淀粉酶；酶制备物，其源自黑曲霉，包含酸性真菌α-淀粉酶以及一些葡糖淀粉酶。活性114AFAU/g，25AGU/g(比重＝1.2g/mL)。
酸性真菌α-淀粉酶，源自米曲霉，活性为800FAU/g(比重＝1.25g/mL)。
产麦芽糖α-淀粉酶，其具有WO9/943794中SEQ ID No1所示的氨基酸，活性为3200MANU/g(1，25g/mL)。
提取自小麦谷粒的植物β-淀粉酶，活性1250DP/g(1，2g/ml)。
真菌β-淀粉酶，其源自微小根毛霉(Rhizomucor pusilus)。
α-葡糖苷酶，其源自Candida edax。活性0.14麦芽糖酶单位/g。
酶制备物，其源自木霉和曲霉，包含木聚糖酶和纤维素酶活性。活性140FXU/g+350EGU/g(比重(density)＝1.2g/mL)。
支链淀粉酶，其源自Bacillus acidopullulyticus并在EP 63,909中描述。
α-葡糖苷酶BS嗜热脂肪芽孢杆菌α-葡糖苷酶，得自SIGMA(Sigmacat.No.G3651)。该酶具有SEQ ID NO6所示氨基酸序列。
实施例制备可饮用酒精的传统非加压批蒸煮工艺在题为″Use of Novozymesenzymes in alcohl production″的Novozymes公开出版物2001-10782-01中描述。
粉碎谷粒的20％D.S.浆液在室温(RT)自来水中制备。对于每个参数，将2×250g置于500mL蓝盖发酵瓶中。pH利用6N HCL调节到4.5。对于本发明的工艺，将酶按照下述内容配制，并在震摇水浴中、55℃预处理1小时。目前将摇瓶冷却到32℃，将0.25g干面包酵母加入每只烧瓶中(这对应约5-10百万有活力的细胞/g醪液)，并称重烧瓶。在预设定在32℃的震摇水浴中进行保温。然后给烧瓶配备气塞，并在震摇水浴中开始在32℃进行发酵。
进行同时糖化和发酵(SSF)工艺并持续72小时。在第48和72小时，称重所述烧瓶并测定CO2重量损失(g)以监测发酵进程。CO2损失量与乙醇重量之间的关系为CO2损失(g)×1.045＝EtOH(g)。
实施例1如上制备的粉碎的完整大麦谷粒浆液在细菌α-淀粉酶，真菌α-淀粉酶，和α-葡糖苷酶存在下在55℃，pH＝4.5保持60分钟。
可使用以下剂量
随后将温度调节到32℃，并将3×250g醪液分配到带有气塞的500mL蓝盖发酵瓶中。如上述进行并监测发酵。
实施例2如上制备的粉碎的完整大麦谷粒浆液在木聚糖酶和纤维素酶，细菌α-淀粉酶，产麦芽糖α-淀粉酶，以及α-葡糖苷酶存在下在55℃，pH＝4.5保持60分钟。
可使用以下剂量
随后将温度调节到32℃，并将3×250g醪液分配到带有气塞的500mL蓝盖发酵瓶中。如上述进行并监测发酵。
实施例3如上制备的粉碎的完整大麦谷粒浆液在酸性真菌α-淀粉酶，植物β-淀粉酶和α-葡糖苷酶存在下在55℃，pH＝4.5保持60分钟。
可使用以下剂量
随后将温度调节到32℃，并将3×250g醪液分配到带有气塞的500mL蓝盖发酵瓶中。如上述进行并监测发酵。
实施例4如上制备的粉碎的完整大麦谷粒浆液在酸性真菌α-淀粉酶，真菌β-淀粉酶，和α-葡糖苷酶存在下在55℃，pH＝4.5保持60分钟。
可使用以下剂量
随后将温度调节到32℃，并将3×250g醪液分配到带有气塞的500mL蓝盖发酵瓶中。如上述进行并监测发酵。
实施例5如上制备的粉碎的完整大麦谷粒浆液在酸性真菌α-淀粉酶，产麦芽糖α-淀粉酶，α-葡糖苷酶和支链淀粉酶存在下在55℃，pH＝4.5保持60分钟。
可使用以下剂量
随后将温度调节到32℃，并将3×250g醪液分配到带有气塞的500mL蓝盖发酵瓶中。如上述进行并监测发酵。
实施例6.
如上制备的粉碎的完整大麦谷粒浆液在来自芽孢杆菌的细菌α-淀粉酶，来自米曲霉的真菌α-淀粉酶以及来自Candida edax的α-葡糖苷酶存在的条件下在55℃，pH＝4.5保持60分钟。随后将温度调节到32℃，并将3×250g醪液分配到带有气塞的500mL蓝盖发酵瓶中。如上述进行并监测发酵。
该实施例表明，包含细菌α-淀粉酶和真菌α-淀粉酶的麦芽糖形成酶系统通过增加α-葡糖苷酶的剂量而得以改善。大麦淀粉含量为54-65％，乙醇产量是34-41升每100kg或37-44升每100kg干物质。因此，该实验显示，所得乙醇产量接近理论可得值。
实施例7.
如上制备的粉碎的完整大麦谷粒浆液在来自芽孢杆菌的细菌α-淀粉酶，产麦芽糖α-淀粉酶以及来自Candida edax的α-葡糖苷酶存在的条件下在55℃，pH＝4.5保持60分钟。随后将温度调节到32℃，并将3×250g醪液分配到带有气塞的500mL蓝盖发酵瓶中。如上述进行并监测发酵。
该实施例表明，包含细菌α-淀粉酶和产麦芽糖α-淀粉酶的麦芽糖形成酶系统通过增加α-葡糖苷酶的剂量而得以改善。所得乙醇产量接近理论可得值。
实施例8如上制备的粉碎的完整大麦谷粒浆液在来自芽孢杆菌的细菌α-淀粉酶，植物β-淀粉酶以及来自Candida edax的α-葡糖苷酶存在的条件下在55℃，pH＝4.5保持60分钟。随后将温度调节到32℃，并将3×250g醪液分配到带有气塞的500mL蓝盖发酵瓶中。如上述进行并监测发酵。
该实施例表明，包含细菌α-淀粉酶和植物β-淀粉酶的麦芽糖形成酶系统通过增加α-葡糖苷酶的剂量而得以改善。所得乙醇产量接近理论可得值。
实施例9在室温(RT)自来水中制备12-14％D.S.粉碎的小麦谷粒浆液。对于每个参数，将2×250g置于500mL蓝盖发酵瓶中。pH调节到6.0。本发明的工艺使用来自芽孢杆菌的α-淀粉酶、植物β-淀粉酶，来自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-葡糖苷酶(Sigma-产品号G3651)。将酶按照下述配制，并在震摇水浴中、55℃预处理60分钟。将摇瓶冷却到32℃，将0.25g干面包酵母加入每只烧瓶中(对应10百万有活力的细胞/g醪液)，并称重烧瓶。所述烧瓶在预设定在32℃的震摇水浴中进行保温，并进行同时糖化和发酵(SSF)工艺步骤大约67小时。称重烧瓶并测定CO2重量损失(g)以监测发酵进程。CO2损失量与乙醇重量之间的关系为CO2损失(g)×1.045＝EtOH(g)。乙醇产量如下计算
发酵醪液(mash)中的％乙醇通过HPLC利用离子缓冲的分配(Ionmoderated partitioning)测定。
增加α-葡糖苷酶的剂量可改善发酵后获得的乙醇产量以及基于重量平衡计算的经发酵的淀粉的百分含量。地生(ground)小麦的淀粉含量为58-62％，乙醇产量几乎为36-39升每100kg或39-42升每100kg干物质。因此，所述实验显示，所得乙醇产量与通常实际获得的接近，甚至经发酵的淀粉的百分比没有达到完全(completeness)。将支链淀粉酶包含在酶组合物中可获得更高的产量。
序列表<110>诺维信公司(Novozymes A/S)<120>酒精产品生产工艺<130>10483<160>6<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>484<212>PRT<213>黑曲霉(Aspergillus niger)<400>1Leu Ser Ala Ala Ser Trp Arg Thr Gln Ser Ile Tyr Phe Leu Leu Thr1 5 10 15Asp Arg Phe Gly Arg Thr Asp Asn Ser Thr Thr Ala Thr Cys Asn Thr20 25 30Gly Asn Glu Ile Tyr Cys Gly Gly Ser Trp Gln Gly Ile Ile Asp His35 40 45Leu Asp Tyr Ile Glu Gly Met Gly Phe Thr Ala Ile Trp Ile Ser Pro50 55 60Ile Thr Glu Gln Leu Pro Gln Asp Thr Ala Asp Gly Glu Ala Tyr His65 70 75 80Gly Tyr Trp Gln Gln Lys Ile Tyr Asp Val Asn Ser Asn Phe Gly Thr85 90 95Ala Asp Asn Leu Lys Ser Leu Ser Asp Ala Leu His Ala Arg Gly Met100 105 110Tyr Leu Met Val Asp Val Val Pro Asp His Met Gly Tyr Ala Gly Asn115 120 125Gly Asn Asp Val Asp Tyr Ser Val Phe Asp Pro Phe Asp Ser Ser Ser130 135 140Tyr Phe His Pro Tyr Cys Leu Ile Thr Asp Trp Asp Asn Leu Thr Met145 150 155 160Val Glu Asp Cys Trp Glu Gly Asp Thr Ile Val Ser Leu Pro Asp Leu165 170 175Asp Thr Thr Glu Thr Ala Val Arg Thr Ile Trp Tyr Asp Trp Val Ala180 185 190Asp Leu Val Ser Asn Tyr Ser Val Asp Gly Leu Arg Ile Asp Ser Val195 200 205
Leu Glu Val Gln Pro Asp Phe Phe Pro Gly Tyr Asn Lys Ala Ser Gly210 215 220Val Tyr Cys Val Gly Glu Ile Asp Asn Gly Asn Pro Ala Ser Asp Cys225 230 235 240Pro Tyr Gln Lys Val Leu Asp Gly Val Leu Asn Tyr Pro Ile Tyr Trp245 250 255Gln Leu Leu Tyr Ala Phe Glu Ser Ser Ser Gly Ser Ile Ser Asn Leu260 265 270Tyr Asn Met Ile Lys Ser Val Ala Ser Asp Cys Ser Asp Pro Thr Leu275 280 285Leu Gly Asn Phe Ile Glu Asn His Asp Asn Pro Arg Phe Ala Lys Tyr290 295 300Thr Ser Asp Tyr Ser Gln Ala Lys Asn Val Leu Ser Tyr Ile Phe Leu305 310 315 320Ser Asp Gly Ile Pro Ile Val Tyr Ala Gly Glu Glu Gln His Tyr Ala325 330 335Gly Gly Lys Val Pro Tyr Asn Arg Glu Ala Thr Trp Leu Ser Gly Tyr340 345 350Asp Thr Ser Ala Glu Leu Tyr Thr Trp Ile Ala Thr Thr Asn Ala Ile355 360 365Arg Lys Leu Ala Ile Ala Ala Asp Ser Ala Tyr Ile Thr Tyr Ala Asn370 375 380Asp Ala Phe Tyr Thr Asp Ser Asn Thr Ile Ala Met Ala Lys Gly Thr385 390 395 400Ser Gly Ser Gln Val Ile Thr Val Leu Ser Asn Lys Gly Ser Ser Gly405 410 415Ser Ser Tyr Thr Leu Thr Leu Ser Gly Ser Gly Tyr Thr Ser Gly Thr420 425 430Lys Leu Ile Glu Ala Tyr Thr Cys Thr Ser Val Thr Val Asp Ser Ser435 440 445Gly Asp Ile Pro Val Pro Met Ala Ser Gly Leu Pro Arg Val Leu Leu450 455 460Pro Ala Ser Val Val Asp Ser Ser Ser Leu Cys Gly Gly Ser Gly Arg465 470 475 480
Leu Tyr Val Glu<210>2<211>514<212>PRT<213>嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)<400>2Ala Ala Pro Phe Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu1 5 10 15Pro Asp Asp Gly Thr Leu Trp Thr Lys Val Ala ASn Glu Ala Asn Asn20 25 30Leu Ser Ser Leu Gly Ile Thr Ala Leu Trp Leu Pro Pro Ala Tyr Lys35 40 45Gly Thr Ser Arg Ser Asp Val Gly Tyr Gly Val Tyr Asp Leu Tyr Asp50 55 60Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Ala Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr65 70 75 80Lys Ala Gln Tyr Leu Gln Ala Ile Gln Ala Ala His Ala Ala Gly Met85 90 95Gln Val Tyr Ala Asp Val Val Phe Asp His Lys Gly Gly Ala Asp Gly100 105 110Thr Glu Trp Val Asp Ala Val Glu Val Asn Pro Ser Asp Arg Asn Gln115 120 125Glu Ile Ser Gly Thr Tyr Gln Ile Gln Ala Trp Thr Lys Phe Asp Phe130 135 140Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr His145 150 155 160Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Ser Arg Ile Tyr165 170 175Lys Phe Arg Gly Ile Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu180 185 190Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Leu Asp Met Asp His195 200 205Pro Glu Val Val Thr Glu Leu Lys Ser Trp Gly Lys Trp Tyr Val Asn210 215 220Thr Thr Asn Ile Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys
225 230 235 240Phe Ser Phe Phe Pro Asp Trp Leu Ser Asp Val Arg Ser Gln Thr Gly245 250 255Lys Pro Leu Phe Thr Val Gly Glu Tyr Trp Ser Tyr Asp Ile Asn Lys260 265 270Leu His Asn Tyr Ile Met Lys Thr Asn Gly Thr Met Ser Leu Phe Asp275 280 285Ala Pro Leu His Asn Lys Phe Tyr Thr Ala Ser Lys Ser Gly Gly Thr290 295 300Phe Asp Met Arg Thr Leu Met Thr Asn Thr Leu Met Lys Asp Gln Pro305 310 315 320Thr Leu Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Glu Pro Gly Gln325 330 335Ala Leu Gln Ser Trp Val Asp Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala340 345 350Phe Ile Leu Thr Arg Gln Glu Gly Tyr Pro Cys Val Phe Tyr Gly Asp355 360 365Tyr Tyr Gly Ile Pro Gln Tyr Asn Ile Pro Ser Leu Lys Ser Lys Ile370 375 380Asp Pro Leu Leu Ile Ala Arg Arg Asp Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His385 390 395 400Asp Tyr Leu Asp His Ser Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Val405 410 415Thr Glu Lys Pro Gly Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro420 425 430Gly Gly Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys Gln His Ala Gly Lys Val435 440 445Phe Tyr Asp Leu Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Thr Ile Asn Ser450 455 460Asp Gly Trp Gly Glu Phe Lys Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Trp465 470 475 480Val Pro Arg Lys Thr Thr Val Ser Thr Ile Ala Trp Ser Ile Thr Thr485 490 495Arg Pro Trp Thr Asp Glu Phe Val Arg Trp Thr Glu Pro Arg Leu Val500 505 510
Ala Trp<210>3<211>483<212>PRT<213>地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)<400>3Ala Asn Leu Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Met Pro1 5 10 15Asn Asp Gly Gln His Trp Arg Arg Leu Gln Asn Asp Ser Ala Tyr Leu20 25 30Ala Glu His Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly35 40 45Thr Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu50 55 60Gly Glu Phe His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys65 70 75 80Gly Glu Leu Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn85 90 95Val Tyr Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr100 105 110Glu Asp Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val115 120 125Ile Ser Gly Glu His Leu Ile Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro130 135 140Gly Arg Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe145 150 155 160Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys165 170 175Phe Gln Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Asn Gly Asn180 185 190Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp Val195 200 205Ala Ala Glu Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln210 215 220
Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe225 230 235 240Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met245 250 255Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn260 265 270Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu275 280 285His Tyr Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met290 295 300Arg Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ser305 310 315 320Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu325 330 335Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu340 345 350Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly355 360 365Thr Lys Gly Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys Ile370 375 380Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His385 390 395 400Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp405 410 415Ser Ser Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro420 425 430Gly Gly Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr435 440 445Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser450 455 460Glu Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr465 470 475 480Val Gln Arg
<210>4<211>480<212>PRT<213>解淀粉曲霉(Aspergillus amyloliquefaciens)<400>4Val Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Thr Pro Asn Asp1 5 10 15Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ala Glu His Leu Ser Asp20 25 30Ile Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly Leu Ser35 40 45Gln Ser Asp Asn Gly Tyr Gly Pro Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu Gly Glu50 55 60Phe Gln Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys Ser Glu65 70 75 80Leu Gln Asp Ala Ile Gly Ser Leu His Ser Arg Asn Val Gln Val Tyr85 90 95Gly Asp Val Val Leu Asn His Lys Ala Gly Ala Asp Ala Thr Glu Asp100 105 110Val Thr Ala Val Glu Val Asn Pro Ala Asn Arg Asn Gln Glu Thr Ser115 120 125Glu Glu Tyr Gln Ile Lys Ala Trp Thr Asp Phe Arg Phe Pro Gly Arg130 135 140Gly Asn Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe Asp Gly145 150 155 160Ala Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Ile Ser Arg Ile Phe Lys Phe Arg165 170 175Gly Glu Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Ser Glu Asn Gly Asn180 185 190Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Val Asp Tyr Asp His Pro Asp Val195 200 205Val Ala Glu Thr Lys Lys Trp Gly Ile Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Ser210 215 220Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Ala Lys His Ile Lys Phe Ser Phe225 230 235 240Leu Arg Asp Trp Val Gln Ala Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Glu Met
245 250 255Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asn Ala Gly Lys Leu Glu Asn260 265 270Tyr Leu Asn Lys Thr Ser Phe Asn Gln Ser Val Phe Asp Val Pro Leu275 280 285His Phe ASn Leu Gln Ala Ala Ser Ser Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met290 295 300Arg Arg Leu Leu Asp Gly Thr Val Val Ser Arg His Pro Glu Lys Ala305 310 315 320Val Thr Phe Val Glu Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu325 330 335Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu340 345 350Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly355 360 365Thr Lys Gly Thr Ser Pro Lys Glu Ile Pro Ser Leu Lys Asp Asn Ile370 375 380Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys Glu Tyr Ala Tyr Gly Pro Gln His385 390 395 400Asp Tyr Ile Asp His Pro Asp Val Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp405 410 415Ser Ser Ala Ala Lys Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro420 425 430Gly Gly Ser Lys Arg Met Tyr Ala Gly Leu Lys Asn Ala Gly Glu Thr435 440 445Trp Tyr Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Lys Ile Gly Ser450 455 460Asp Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Asp Gly Ser Val Ser Ile Tyr465 470 475 480<210>5<211>498<212>PRT<213>米曲霉(Aspergillus oryzae)<400>5Met Val Ala Trp Trp Ser Leu Phe Leu Tyr Gly Leu Gln Val Ala Ala1 5 10 15
Pro Ala Leu Ala Ala Thr Pro Ala Asp Trp Arg Ser Gln Ser Ile Tyr20 25 30Phe Leu Leu Thr Asp Arg Phe Ala Arg Thr Asp Gly Ser Thr Thr Ala35 40 45Thr Cys Asn Thr Ala Asp Gln Lys Tyr Cys Gly Gly Thr Trp Gln Gly50 55 60Ile Ile Asp Lys Leu Asp Tyr Ile Gln Gly Met Gly Phe Thr Ala Ile65 70 75 80Trp Ile Thr Pro Val Thr Ala Gln Leu Pro Gln Thr Thr Ala Tyr Gly85 90 95Asp Ala Tyr His Gly Tyr Trp Gln Gln Asp Ile Tyr Ser Leu Asn Glu100 105 110Asn Tyr Gly Thr Ala Asp Asp Leu Lys Ala Leu Ser Ser Ala Leu His115 120 125Glu Arg Gly Met Tyr Leu Met Val Asp Val Val Ala Asn His Met Gly130 135 140Tyr Asp Gly Ala Gly Ser Ser Val Asp Tyr Ser Val Phe Lys Pro Phe145 150 155 160Ser Ser Gln Asp Tyr Phe His Pro Phe Cys Phe Ile Gln Asn Tyr Glu165 170 175Asp Gln Thr Gln Val Glu Asp Cys Trp Leu Gly Asp Asn Thr Val Ser180 185 190Leu Pro Asp Leu Asp Thr Thr Lys Asp Val Val Lys Asn Glu Trp Tyr195 200 205Asp Trp Val Gly Ser Leu Val Ser ASn Tyr Ser Ile Asp Gly Leu Arg210 215 220Ile Asp Thr Val Lys His Val Gln Lys Asp Phe Trp Pro Gly Tyr Asn225 230 235 240Lys Ala Ala Gly Val Tyr Cys Ile Gly Glu Val Leu Asp Gly Asp Pro245 250 255Ala Tyr Thr Cys Pro Tyr Gln Asn Val Met Asp Gly Val Leu Asn Tyr260 265 270Pro Ile Tyr Tyr Pro Leu Leu Asn Ala Phe Lys Ser Thr Ser Gly Ser275 280 285
Met Asp Asp Leu Tyr Asn Met Ile Asn Thr Val Lys Ser Asp Cys Pro290 295 300Asp Ser Thr Leu Leu Gly Thr Phe Val Glu Asn His Asp Asn Pro Arg305 310 315 320Phe Ala Ser Tyr Thr Asn Asp Ile Ala Leu Ala Lys Asn Val Ala Ala325 330 335Phe Ile Ile Leu Asn Asp Gly Ile Pro Ile Ile Tyr Ala Gly Gln Glu340 345 350Gln His Tyr Ala Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Arg Glu Ala Thr Trp355 360 365Leu Ser Gly Tyr Pro Thr Asp Ser Glu Leu Tyr Lys Leu Ile Ala Ser370 375 380Ala Asn Ala Ile Arg Asn Tyr Ala Ile Ser Lys Asp Thr Gly Phe Val385 390 395 400Thr Tyr Lys Asn Trp Pro Ile Tyr Lys Asp Asp Thr Thr Ile Ala Met405 410 415Arg Lys Gly Thr Asp Gly Ser Gln Ile Val Thr Ile Leu Ser Asn Lys420 425 430Gly Ala Ser Gly Asp Ser Tyr Thr Leu Ser Leu Ser Gly Ala Gly Tyr435 440 445Thr Ala Gly Gln Gln Leu Thr Glu Val Ile Gly Cys Thr Thr Val Thr450 455 460Val Gly Ser Asp Gly Asn Val Pro Val Pro Met Ala Gly Gly Leu Pro465 470 475 480Arg Val Leu Tyr Pro Thr Glu Lys Leu Ala Gly Ser Lys Ile Cys Ser485 490 495Ser Ser<210>6<211>555<212>PRT<213>嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)<400>6Met Lys Lys Thr Trp Trp Lys Glu Gly Val Ala Tyr Gln Ile Tyr Pro1 5 10 15Arg Ser Phe Met Asp Ala Asn Gly Asp Gly Ile Gly Asp Leu Arg Gly20 25 30
Ile Ile Glu Lys Leu Asp Tyr Leu Val Glu Leu Gly Val Asp Ile Val35 40 45Trp Ile Cys Pro Ile Tyr Arg Ser Pro Asn Ala Asp Asn Gly Tyr Asp50 55 60Ile Ser Asp Tyr Tyr Ala Ile Met Asp Glu Phe Gly Thr Met Asp Asp65 70 75 80Phe Asp Glu Leu Leu Ala Gln Ala His Arg Arg Gly Leu Lys Ile Ile85 90 95Leu Asp Leu Val Ile Asn His Thr Ser Asp Glu His Pro Trp Phe Ile100 105 110Glu Ser Arg Ser Ser Arg Asp Asn Pro Lys Arg Asp Trp Tyr Ile Trp115 120 125Arg Asp Gly Lys Asp Gly Arg Glu Pro Asn Asn Trp Glu Ser Ile Phe130 135 140Gly Gly Ser Ala Trp Gln Tyr Asp Glu Arg Thr Gly Gln Tyr Tyr Leu145 150 155 160His Leu Phe Asp Val Lys Gln Pro Asp Leu Asn Trp Glu Asn Ser Glu165 170 175Val Arg Gln Ala Leu Tyr Asp Met Ile Asn Trp Trp Leu Asp Lys Gly180 185 190Ile Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Ile Ser His Ile Lys Lys Lys Pro195 200 205Gly Leu Pro Asp Leu Pro Asn Pro Lys Gly Leu Lys Tyr Val Pro Ser210 215 220Phe Ala Ala His Met Asn Gln Pro Gly Ile Met Glu Tyr Leu Arg Glu225 230 235 240Leu Lys Glu Gln Thr Phe Ala Arg Tyr Asp Ile Met Thr Val Gly Glu245 250 255Ala Asn Gly Val Thr Val Asp Glu Ala Glu Gln Trp Val Gly Glu Glu260 265 270Asn Gly Val Phe His Met Ile Phe Gln Phe Glu His Leu Gly Leu Trp275 280 285Lys Arg Lys Ala Asp Gly Ser Ile Asp Val Arg Arg Leu Lys Arg Thr290 295 300
Leu Thr Lys Trp Gln Lys Gly Leu Glu Asn Arg Gly Trp Asn Ala Leu305 310 315 320Phe Leu Glu Asn His Asp Leu Pro Arg Ser Val Ser Thr Trp Gly Asn325 330 335Asp Arg Glu Tyr Trp Ala Glu Ser Ala Lys Ala Leu Gly Ala Leu Tyr340 345 350Phe Phe Met Gln Gly Thr Pro Phe Ile Tyr Gln Gly Gln Glu Ile Gly355 360 365Met Thr Asn Val Gln Phe Ser Asp Ile Arg Asp Tyr Arg Asp Val Ala370 375 380Ala Leu Arg Leu Tyr Glu Leu Glu Arg Ala Asn Gly Arg Thr His Glu385 390 395 400Glu Val Met Lys Ile Ile Trp Lys Thr Gly Arg Asp Asn Ser Arg Thr405 410 415Pro Met Gln Trp Ser Asp Ala Pro Asn Ala Gly Phe Thr Thr Gly Thr420 425 430Pro Trp Ile Lys Val Asn Glu Asn Tyr Arg Thr Ile Asn Val Glu Ala435 440 445Glu Arg Arg Asp Pro Asn Ser Val Trp Ser Phe Tyr Arg Gln Met Ile450 455 460Gln Leu Arg Lys Ala Asn Glu Leu Phe Val Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu465 470 475 480Leu Leu Glu Asn His Pro Ser Ile Tyr Ala Tyr Thr Arg Thr Leu Gly485 490 495Arg Asp Arg Ala Leu Ile Ile Val Asn Val Ser Asp Arg Pro Ser Leu500 505 510Tyr Arg Tyr Asp Gly Phe Arg Leu Gln Ser Ser Asp Leu Ala Leu Ser515 520 525Asn Tyr Pro Val Arg Pro His Lys Asn Ala Thr Arg Phe Lys Leu Lys530 535 540Pro Tyr Glu Ala Arg Val Tyr Ile Trp Lys Glu545 550 55权利要求
1.制备酒精产品的工艺，包括以下步骤(a)在低于所述粒状淀粉的初始胶质化温度0℃-20℃的温度，将含有水和粒状淀粉的浆液保持5分钟到12小时，(b)将步骤(a)的浆液与酵母一起在10℃-35℃之间的温度发酵20-250小时以制备乙醇，其中步骤(a)和(b)在酸性α-淀粉酶活性、麦芽糖生成酶活性以及α-葡糖苷酶活性存在的条件下进行。
2.权利要求1的工艺，包括回收所述乙醇。
3.前述权利要求任一的工艺，其中所述产品是燃料乙醇，饮用乙醇和/或工业乙醇。
4.前述权利要求任一的工艺，其中步骤(b)中的温度为28℃-36℃，诸如29℃-35℃，诸如30℃-34℃，诸如约32℃。
5.权利要求1或2的工艺，其中所述产品是啤酒。
6.权利要求1或5的工艺，其中步骤(b)中的温度为11℃-17℃，诸如12℃-16℃，诸如13℃-15℃，诸如约14℃。
7.前述权利要求任一的工艺，其中所述酸性α-淀粉酶是酸性真菌α-淀粉酶。
8.前述权利要求任一的工艺，其中所述酸性真菌α-淀粉酶得自曲霉属的菌株，优选得自黑曲霉菌株。
9.前述权利要求任一的工艺，其中所述酸性α-淀粉酶是酸性α-淀粉酶，其具有与SEQ ID NO1有至少70％，优选至少75％，80％，85％或至少90％，例如至少95％，至少97％，至少98％，或至少99％同源性的氨基酸序列。
10.前述权利要求任一的工艺，其中所述酸性α-淀粉酶是酸性α-淀粉酶，其具有与SEQ ID NO5有至少50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％或甚至90％同源性的氨基酸序列。
11.前述权利要求任一的工艺，其中所述酸性α-淀粉酶是酸性细菌α-淀粉酶。
12.前述权利要求任一的工艺，其中所述酸性α-淀粉酶是源自地衣芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，以及嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株的α-淀粉酶。
13.前述权利要求任一的工艺，其中所述酸性细菌α-淀粉酶是源自地衣芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，以及嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株的α-淀粉酶。
14.前述权利要求任一的工艺，其中所述酸性细菌α-淀粉酶是酸性α-淀粉酶，其具有与SEQ ID NO2或SEQ ID NO3中所示序列有至少50％同源性，优选至少60％，70％，80％，85％或至少90％，例如至少95％，97％，98％或至少99％同源性的氨基酸序列。
15.前述权利要求任一的工艺，其中所述酸性细菌α-淀粉酶源自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株，所述酸性细菌α-淀粉酶与SEQ ID NO2中所示野生型氨基酸序列相比具有突变I181*+G182*+N193F。
16.前述权利要求任一的工艺，其中所述酸性细菌α-淀粉酶是杂合α-淀粉酶，其包含SEQ ID NO3所示地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的445C-末端氨基酸残基，以及SEQ ID NO4所示解淀粉芽孢杆菌来源的α-淀粉酶的37N-末端氨基酸残基，并具有取代G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S。
17.前述权利要求任一的工艺，其中所述酸性细菌α-淀粉酶是α-淀粉酶，其具有氨基酸序列SEQ ID NO4，并具有突变H154Y、A181T、N190F、A209V、Q264S和/或在位置176和179之间的两个残基缺失，优选E178和G179缺失。
18.前述权利要求任一的工艺，其中麦芽糖生成酶活性是产麦芽糖α-淀粉酶。
19.前述权利要求任一的工艺，其中麦芽糖生成酶活性是产麦芽糖α-淀粉酶，其具有与US6162628中SEQ ID NO1的氨基酸1-686有至少70％同一性的氨基酸序列。
20.前述权利要求任一的工艺，其中麦芽糖生成酶活性是β-淀粉酶。
21.前述权利要求任一的工艺，其中所述α-葡糖苷酶活性源自念珠菌属菌株，诸如来自C.edax菌株。
22.前述权利要求任一的工艺，其中所述α-葡糖苷酶活性源自芽孢杆菌属菌株，诸如来自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株，尤其是SEQ ID NO.6所示的嗜热脂肪芽孢杆菌α-葡糖苷酶。
23.前述权利要求任一的工艺，其中步骤(a)和(b)在支链淀粉酶存在的条件下进行。
24.前述权利要求任一的工艺，其中步骤(a)和/或步骤(b)在存在选自木聚糖酶，纤维素酶或肌醇六磷酸酶的酶活性的条件下进行。
25.前述任一权利要求的工艺，其中所述淀粉浆含有5-60％DS粒状淀粉，优选10-50％DS粒状淀粉，更优选20-40％DS，尤其是约30％DS粒状淀粉。
26.前述任一权利要求的工艺，其中步骤(a)和/或(b)中的pH范围是3.0-7.0，优选3.5-6.0，或更优选4.0-5.0，诸如4.3-4.6。
27.前述任一权利要求的工艺，其中所述粒状淀粉得自块茎，根，茎，果实，种子或完整谷粒。
28.前述任一权利要求的工艺，其中所述粒状淀粉得自玉米，玉米穗轴，小麦，大麦，裸麦，买罗高梁，西米，木薯，树薯，木薯(tapioca)，高梁，稻或马铃薯。
29.前述任一权利要求的工艺，其中所述粒状淀粉得自谷物。
30.前述任一权利要求的工艺，其中所述粒状淀粉得自对完整谷粒的干性碾磨或湿性碾磨。
31.前述权利要求任一的工艺，其中步骤(a)中的保持时间为5分钟-12小时，优选10分钟-6小时，更优选15分钟-3小时，甚至更优选20分钟-11/2小时，诸如30分钟-11/4小时，40-70分钟，甚至50-60分钟。
32.前述权利要求任一的工艺，其中步骤(b)中的保持时间是25-190小时，优选30-180小时，更优选40-170小时，甚至更优选50-160小时，更优选60-150小时，甚至更优选70-140小时，最优选80-130小时。
33.前述权利要求任一的工艺，其中步骤(a)中的温度是45℃-75℃。
34.一种酶组合物，其包含酸性α-淀粉酶活性，麦芽糖生成酶活性和α-葡糖苷酶活性，其中存在另一种酶活性；所述酶活性选自支链淀粉酶，纤维素酶，木聚糖酶或肌醇六磷酸酶。
35.前述任意权利要求的酶组合物在酒精产品工艺和淀粉水解工艺中的用途。
36.包含酸性α-淀粉酶活性，麦芽糖生成酶活性以及α-葡糖苷酶活性的酶组合物在酒精产品工艺中的用途，包括粒状淀粉的酶促水解。
全文摘要
本发明涉及从粒状淀粉制备酒精产品的工艺，包括在低于所述粒状淀粉的初始胶质化温度的升高的温度进行预处理，然后同时进行糖化和发酵。
文档编号C12N9/28GK1798847SQ200480015139
公开日2006年7月5日 申请日期2004年5月28日 优先权日2003年5月30日
发明者汉斯·S·奥尔森, 巴里·E·诺曼, 莫根斯·沃姆普尔曼, 杰普·W·塔姆斯 申请人:诺维信公司