白曲霉酸稳定性α淀粉酶的异源表达和在颗粒淀粉水解中的应用的制作方法

专利名称：：白曲霉酸稳定性α淀粉酶的异源表达和在颗粒淀粉水解中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及来自白曲霉(Aspergilluskawachi)菌株的酸稳定性α淀粉酶(Acid-StableAlphaAmylase)(asAA)，其具有颗粒淀粉水解(granularstarchhydrolyzing(GSH))活性。本发明进一步涉及具有GSH活性的asAA在丝状真菌宿主细胞中、特别是木霉属(Trichoderma)和曲霉属(Aspergillus)细胞中的异源表达以及具有GSH活性的asAA在组合物中的应用，所述组合物任选地包括葡糖淀粉酶，以增强淀粉水解和醇产量。
背景技术：
：葡糖淀粉酶(glucoamylase)，特别是具有颗粒淀粉水解(granularstarchhydrolyzing(GSH))活性的葡糖淀粉酶是重要的工业酶，用于生产产品例如有机酸(即乳酸)、氨基酸(即谷氨酸)、醇(即乙醇)和来自谷物(grains)和谷类(cereals)的淀粉底物的其它化合物。在微生物发酵期间，尤其是在同步糖化发酵(SSF)期间，当颗粒淀粉底物被用作碳料时，降低发酵中的残留淀粉量将是有利的。本发明通过提供具有颗粒淀粉水解活性的酸稳定性α淀粉酶(asAA)响应这种需求，所述酸稳定性α淀粉酶可以与葡糖淀粉酶联合应用，以增强淀粉水解和醇产量。此外，本发明相对于现有技术组合物和方法的益处包括下列中的一个或更多个a)在淀粉水解和终产物生产期间热能使用的减少；b)对高酶量的需求的降低；c)采用连续的内部葡萄糖供料；d)在发酵罐中维持相对低的葡萄糖水平，其显著降低微生物污染的高风险和消除由于高浓度游离葡萄糖导致的酵母的分解代谢产物阻遏；e)降低棕色反应产物的形成；f)降低或免除在现有技术喷煮工艺(jetcookingprocess)期间所要求的钙添加；g)降低在发酵工艺期间水的使用；h)在发酵中使用较高的固体含量，其可以导致较高的终产物形成和降低的能耗；i)降低一些副产物的产量水平，例如甘油；和i)含可溶物干酒糟(distillersdrygrainsplussolubles)中降低的残留淀粉含量。发明概述在一方面，本发明涉及生产醇的方法，其包括将颗粒淀粉底物与具有颗粒淀粉水解(GSH)活性的酸稳定性α淀粉酶(asAA)和葡糖淀粉酶(GA)在发酵步骤中接触以及在发酵步骤中产生醇，所述发酵步骤还包括产乙醇微生物。在一些实施方式中，从玉米或小麦得到颗粒淀粉底物。在其它实施方式中，从真菌宿主细胞中异源多核苷酸的表达得到具有GSH活性的asAA，所述异源多核苷酸编码与SEQIDNO3的序列具有至少90％的序列同一性的asAA。在一个优选的实施方式中，发酵步骤包括表达asAA的真菌细胞，在其它实施方式中，发酵步骤包括无细胞asAA提取物。在进一步的实施方式中，真菌宿主细胞是木霉属细胞。在其它实施方式中，由所述方法产生的醇是乙醇，产乙醇微生物是酵母。在另外的实施方式中，从真菌宿主中异源多核苷酸的表达生产GA。在另外的其它实施方式中，从发酵中回收醇。在第二方面，本发明涉及真菌宿主细胞，其包括编码与SEQIDNO3的序列具有至少90％的序列同一性的具有颗粒淀粉水解(GSH)活性的酸稳定性α淀粉酶(asAA)的异源多核苷酸，在一些实施方式中，异源多核苷酸编码与序列SEQIDNO3具有至少95％的序列同一性的具有GSH活性的asAA。在一些实施方式中，从真菌宿主中表达的具有GSH活性的asAA比从天然宿主中获得的具有GSH活性的asAA的最适pH值低。在一个实施方式中，真菌宿主细胞是木霉属细胞。在进一步的实施方式中，木霉属宿主细胞是里氏木霉(T.reesei)细胞。在另一个实施方式中，真菌宿主细胞是曲霉属细胞。在第三方面，本发明涉及颗粒淀粉水解酶组合物，其包括具有颗粒淀粉水解(GSH)活性的酸稳定性α淀粉酶(asAA)，其中所述具有GSH活性的asAA与SEQIDNO3的序列具有至少90％的序列同一性。在一些实施方式中，从真菌宿主细胞中的异源多核苷酸的表达获得asAA。在进一步的实施方式中，真菌宿主细胞是木霉属或曲霉属宿主细胞。在其它实施方式中，组合物将进一步包括葡糖淀粉酶。在一些优选的实施方式中，葡糖淀粉酶将从曲霉属或根霉属(Rhizopus)菌株中获得。在其它实施方式中，葡糖淀粉酶将是具有GSH活性的葡糖淀粉酶以及从曲霉属、根霉属或腐质霉属(Humicola)的菌株获得。在其它实施方式中，asAA和葡糖淀粉酶都将在真菌宿主中被表达，所述真菌宿主含有表达具有GSH活性的asAA和葡糖淀粉酶的异源多核苷酸。在一些实施方式中，真菌宿主菌株将是相同的，在其它实施方式中，真菌宿主菌株将是不同的菌株。在其它实施方式中，本发明涉及使用本方面的酶组合物水解颗粒淀粉的方法。在第四方面，本发明涉及增强含有葡糖淀粉酶的组合物的颗粒淀粉水解活性的方法，其包括将具有颗粒淀粉水解(GSH)活性的酸稳定性α淀粉酶(asAA)加入到包含颗粒淀粉底物和葡糖淀粉酶的组合物中，产生可溶性淀粉水解产物，其中具有GSH活性的asAA具有与SEQIDNO3有至少90％的序列同一性的氨基酸序列，并且增溶的淀粉量大于缺乏具有GSH活性的asAA的相应组合物。在第五方面，本发明涉及从谷物底物产生醇、优选乙醇的一步法，包括在合适的发酵条件下、在发酵培养基中混合下列物质(i)来自谷物的颗粒淀粉底物，(ii)具有颗粒淀粉水解活性的酸稳定性α淀粉酶(asAA)，和(iii)产乙醇微生物，以获得包括醇的发酵组合物。在一个实施方式中，具有GSH活性的asAA与序列SEQIDNO3具有至少90％的序列同一性。在另一个实施方式中，具有GSH活性的asAA从木霉属宿主中的表达获得。在进一步的实施方式中，葡糖淀粉酶被加入该步骤。在又一个实施方式中，本发明涉及根据此方法获得的发酵组合物。在另一个实施方式中，根据本发明包含的方法所产生的乙醇被回收。在其它实施方式中，谷物从玉米、小麦、大麦、马铃薯、稻、高梁或木薯中得到。在第六方面，本发明涉及减少含固体干酒糟(distiller’sdriedgainsplussolids，DDGS)中的残留淀粉量的方法，包括通过本发明的方法产生醇、蒸馏该醇获得发酵残留物，和处理发酵残留物以获得含可溶物干酒糟。附图简述图1提供了编码天然白曲霉酸稳定性α淀粉酶的基因组DNA序列，其被称为asaA(SEQIDNO1)。在八个推知的内含子下划线。图2提供了白曲霉(A.kawachi)酸稳定性α淀粉酶(SEQIDNO4)的信号序列(SEQIDNO2)和成熟氨基酸序列(SEQIDNO3)(AsaA)。推知的信号序列(氨基酸l-21)加下划线并设为粗体。图3A-D提供了质粒pTrex3g_Akalpha(图4)的完整核酸序列(SEQIDNO5)，10990bp。图4提供了pTrex3g_Akalpha的图谱，pTrex3g_Akalpha被用于表达编码AsaA(白曲霉asAA)的核酸并且其含有位于真菌表达载体侧翼的EcoRI位点，其中a)cbhI启动子是里氏木霉纤维二糖水解酶启动子；b)asaA是编码SEQIDNO4的酸稳定性α淀粉酶的白曲霉多核苷酸；c)cbhI终止子是里氏木霉纤维二糖水解酶终止子；d)amdS是构巢曲霉(Aspergillusnidulans)乙酰胺酶营养标记基因；和e)attB是用于重组的Gateway克隆系统(Invitrogen)入噬菌体位点。图5提供了SDS-PAGE凝胶，其显示了在里氏木霉克隆的代表性发酵试验中来自里氏木霉的asaA表达，如实施例5所描述。泳道1代表标准品SeeBlue+2标记物；泳道2代表80小时后里氏木霉表达的AsaA；泳道3代表162小时后里氏木霉表达的AsaA和泳道4代表在162小时的里氏木霉宿主细胞对照，其中所述宿主细胞未被asaA转化。AsaA蛋白质条带在约90kDa被清楚地观察到，并且该条带在宿主菌株对照中不存在。图6以残留活性百分比说明了天然白曲霉(nAk-AsaA)和在里氏木霉宿主中表达的白曲霉(rAk-AsaA)(SEQIDNO3)的pH稳定性，如实施例6所述。图7说明了在pH5.0下，随着时间的过去，从具有葡糖淀粉酶(0.5GAU/gDISTILLASE)和α淀粉酶的玉米粉醪液发酵得到的乙醇(EtOH)产量百分比(v/v)，其中AKAA表示Tr-AsaA(在里氏木霉中表达的白曲霉酸稳定性α淀粉酶)；LT75表示SPEZYMELT75α淀粉酶；FRED表示SPEZYMEFRED；ETHYL表示SPEZYMEETHYL；FA表示CLARASE以及DISTILLASE是对照。参考实施例8。图8说明了在pH5.0下，与纯化的DISTILLASE(GA)、纯化的AKAA(在里氏木霉中表达的白曲霉酸稳定性α淀粉酶)以及AkAA和GA的组合温育4小时之后释放的、颗粒淀粉降解成的葡萄糖。参考实施例11。图9说明了颗粒玉米淀粉的SEMs，所述颗粒玉米淀粉与图8所描述的酶温育纯化的DISTILLASE(GA)、纯化的AkAA(在里氏木霉中表达的白曲霉酸稳定性α淀粉酶)以及AkAA和GA的组合。图10A概括了在发酵72小时测量的不同玉米粉固体(％ds)下以％(v/v)表示的最终乙醇水平。图10B说明了对于每一玉米醪液固体(cornmashsolids)(％ds)，使用AkAA的乙醇增加百分比，其相对于醪液固体(％ds)被作图。图11说明了在72小时后，与0.5GAU/g和AkAA(0.0SSU/g或1.5SSU/g)发酵的不同的玉米粉固体所产生的残留淀粉的百分数，如在实施例12中进一步解释。图12是示意图，其说明了本发明的一个实施方式。该实施方式包括，在包括在25-40℃的温度下发酵2-100小时的条件下，将颗粒淀粉底物与葡糖淀粉酶、asAA和微生物在反应器中混合，使得在单一的步骤中发酵。发酵中所产生的混合物被分离。可以从分离中回收醇，并且可以产生乙醇。此外，可以回收未发酵的固体和水。未发酵固体和水的混合物包括残留的淀粉、釜馏物、蛋白质和微生物，其可以被进一步处理，产生例如DDG和DDGS的产物或者所述混合物的成分(单独或合并)可以被再循环回反应器中进一步发酵。发明详述在一些方面，本发明借助遗传工程和分子生物学领域中使用的常规技术和方法。下面的资源包括根据本发明有用的一般方法的描述Sambrooketal.，MOLECULARCLONINGALABORATORYMANUAL(2ndEd.，1989)；Kreigler，GENETRANSFERANDEXPRESSION；ALABORATORYMANUAL(1990)以及Ausubeletal.，Eds.CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(1994)。这些普通参考资料提供了本领域技术人员已知的定义和方法。然而，本发明不意欲于被限制为所述的任何具体方法、方案和试剂，因为这些可以变化。除非本文中另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属
技术领域：
的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。Singleton，etal.，DICTIONARYOFMICROBIOLOGYANDMOLECULARBIOLOGY，2DED.，JohnWileyandSons，NewYork(1994)和Hale&Markham，THEHARPERCOLLINSDICTIONARYOFBIOLOGY，HarperPerennial，NY(1991)为技术人员提供了本发明中应用的许多术语的普通词典。尽管与本文中所述的那些方法和材料类似或等价的任何方法和材料可以在本发明的实践和测试中使用，还是描述了优选的方法和材料。现在，使用下面的定义和例子，仅通过参考的方式对本发明进行详细描述。本文中提及的所有专利和出版物，包括在这些专利和出版物中公开的所有序列，被明确地引入作为参考。数值范围包括限定该范围的数。除非另外指出，分别地，核酸以5′到3′方向从左到右书写；氨基酸序列以氨基端到羧基端的方向从左到右书写。本文所提供的标题不是对本发明的不同方面和实施方式的限制，而是整体上参考说明书对其进行理解。A.定义如本文中所使用，术语“淀粉(starch)”是指由植物复合多糖碳水化合物组成的任何物质，由具有式(C6H10O5)x的直链淀粉和支链淀粉组成，其中X可以是任何数。具体而言，该术语是指任何植物型物质，包括但不限于谷物、草、茎和根，更具体地，是小麦、大麦、玉米、黑麦、稻、高梁、麸、木薯(cassava)、黍、马铃薯、甘薯和木薯(tapioca)。术语“颗粒淀粉(granularstarch)”是指生(未煮过的)淀粉，例如未经过糊化的颗粒淀粉。术语“颗粒淀粉水解(granularstarchhydrolyzing(GSH))酶”或“具有颗粒淀粉水解(GSH)活性”是指具有水解颗粒形式的淀粉的能力的酶。术语“α淀粉酶(alphaamylase)(例如E.C.类别3.2.1.1)”是指催化α-1，4-糖苷键水解的酶。这些酶还被描述为那些在含1，4-α连接的D-葡萄糖单元的多糖中实施1，4-α-D-糖苷键的外切型或内切型水解作用的酶。用于描述这些酶的另一个术语是“糖原酶”。示例性酶包括α-1，4-葡聚糖4-葡聚糖水化酶葡聚糖水解酶。术语“酸稳定性α淀粉酶(acid-stablealphaamylase(asAA))”是指在pH3.0到7.0的pH范围内有活性的α淀粉酶，优选pH3.5到6.0。术语“葡糖淀粉酶(glucoamylase(asAA))”是指淀粉葡糖苷酶类的酶(例如，E.C.3.2.1.3，葡糖淀粉酶、1，4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶)。这些是外切作用酶，其从直链淀粉和支链淀粉分子的非还原端释放葡糖基。该酶还水解α-1，6键和α-1，3键，尽管速率比α-1，4键低得多。术语“糖基化(glycosylation)”是指通过加入糖部分的蛋白质转录后修饰，其中糖是N-连接或O-连接的，形成糖蛋白。糖蛋白的N-连接糖部分由糖苷键连接到天冬酰胺残基的β-酰胺氮上。O-连接糖是由糖苷键通过丝氨酸或苏氨酸残基的羟基连接到蛋白质。当在有关细胞、核酸、蛋白质或载体中使用时，术语“重组体(recombinant)”指所述细胞、核酸、蛋白质或载体已通过导入异源核酸或蛋白质或通过改变天然核酸或蛋白质而被修饰，或者是指细胞是来自被如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在细胞的天然(非重组)形式内未发现的基因或表达否则将异常表达、过低表达或完全不表达的天然基因。术语“蛋白质(protein)”和“多肽(polypeptide)”在本文中可以互换使用。常规的氨基酸残基单字母代码和三字母代码在本文中被使用。“信号序列(signalsequence)”指连接到蛋白质的N端部分的氨基酸序列，其促进成熟形式的蛋白质分泌到细胞外。信号肽的定义是功能性定义。胞外蛋白的成熟形式缺少信号序列，其在分泌过程中被切割。术语“天然酸稳定性α淀粉酶(nativeacid-stablealphaamylase(n-asAA))”是指从asAA内源性表达产生的asAA。例如，术语“n-asAA”是指来自白曲霉的酸稳定性α淀粉酶(即，SEQIDNO3)的内源性表达。术语“重组酸稳定性α淀粉酶(recominantacid-stablealphaamylase(r-asAA))”、“重组表达的asAA”和“重组产生的asAA”是指成熟asAA蛋白质序列，其在宿主细胞中从异源多核苷酸的表达中产生。例如，术语“r-asaA”是指白曲霉酸稳定性α淀粉酶(即SEQIDNO3)在已导入编码asaA的多核苷酸的宿主中被表达和产生。r-asAA的成熟蛋白质序列不包括信号序列。“基因(gene)”是指DNA片段，其与产生多肽有关并且包括编码区前和编码区后的区域以及单独的编码片段(外显子)之间的间插序列(内含子)。术语“核酸(nucleicacid)”包含单链或双链DNA、RNA，及其化学修饰。术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可以互换使用。因为遗传密码是简并的，一个以上的密码子可以用于编码一个特定的氨基酸，并且本发明包括编码特定氨基酸序列的多核苷酸。“载体(vector)”是指被设计用来将核酸引入到一种或更多种细胞类型内的多核苷酸序列。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌粒、序列盒及类似载体。本文中所使用的“表达载体(expressionvector)”是指DNA构建物，其包括可操纵地连接到合适的调控序列的DNA序列，所述调控序列能够引起所述DNA在合适宿主中的表达。这样的调控序列可以包括引起转录的启动子、调控转录的任选的操纵子序列、编码mRNA上合适的核糖体结合位点的序列、增强子和调控转录终止和翻译终止的序列。“启动子(promoter)”是调节序列，其参与结合RNA聚合酶以起始基因的转录。启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。本发明使用的优选的启动子是里氏木霉cbhl，其是诱导型启动子。“处于转录调控下(undertranscriptionalcontrol)”是本领域中被充分理解的术语，其是指多核苷酸—通常是DNA序列的转录，取决于其被可操纵地连接到有助于转录起始或促进转录的元件。“处于翻译调控下(undertranlationalcontrol)”是本领域中被充分理解的术语，其是指发生在mRNA形成之后的调节过程。如本文中在描述蛋白质和编码它们的基因时所使用，关于基因的术语是斜体字，(例如，编码asaA(白曲霉asAA)的基因可以被表示为asaA)。关于蛋白质的术语通常不是斜体并且第一个字母一般是大写的，(例如，由asaA基因编码的蛋白质可以被表示为AsaA或asaA)。术语“源自(derived)”包括术语“起源自(originatedfrom)”、“得到(obtained)”或“得自(obtainedfrom)”、和“分离自(isolatedfrom)”。术语“可操纵地连接(operablylinked)”是指并列关系，其中多种元件被排列，使得它们功能性相关。例如，如果启动子调控编码序列的转录，该启动子被可操纵地连接到该编码序列。术语“选择性标记(seletivemarker)”是指能够在宿主中表达的基因，其使得容易选择那些含有被导入的核酸或载体的宿主。选择性标记的例子包括但不限于抗微生物剂(例如潮霉素、博莱霉素或氯霉素)和/或赋予宿主细胞代谢优势例如营养优势的基因。多核苷酸或多肽具有与另一条序列某一百分比(例如80％、85％、90％、95％或99％)的序列同一性是指，当比对时，在比较两条序列中该百分比的碱基或氨基酸残基是相同的。该比对和同源性或同一性百分比可以使用本领域中已知的任何合适软件程序被确定，例如在CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(F.M.Ausubeletal.(eds)1987，附录30，7.7.18部分)中描述的那些程序。优选的程序包括GCGPileup程序、FASTA(Pearsonetal.(1988)Proc.Natl，Acad.SciUSA852444-2448)和BLAST(BLASTManual，Altschuletal.，Natl.Cent.Biotechnol.Inf.，NatlLib.Med.(NCIBNLMNIH)，Bethesda，MD，和Altschuletal.，1997)NAR253389-3402)。另一个优选的比对程序是ALIGNPlus(ScientificandEducationalSoftware，PA)，优选使用默认参数。发现有用的另一个序列软件程序是TFASTADataSearchingProgram，其在SequenceSoftwarePackageVersion6.0(GeneticsComputerGroup，UniversityofWisconsin，Madison，WI)中可得到。本领域的技术人员将认识到，本发明包含的序列还由在严格的杂交条件下与示例性的asaA序列(例如SEQIDNO1)杂交的能力所定义。当单链形式的核酸在适当的温度和溶液离子强度条件下能与另一条核酸退火，该核酸可以与另一核酸序列杂交。杂交和洗涤条件在本领域中是熟知的(参见，例如Sambrook(1989)supra，特别是第9和11章)。在一些实施方式中，严格条件相当于65℃的Tm和0.1×SSC，0.1％SDS。“宿主菌株(hoststrain)”或“宿主细胞(hostcell)”是指含有编码根据本发明的颗粒淀粉水解酶的多核苷酸的表达载体或DNA构建物的合适的宿主。特别地，宿主菌株优选地是丝状真菌细胞。在本发明的优选实施方式中，“宿主细胞”是指从丝状真菌菌株、特别是木霉属某种或曲霉属某利的细胞产生的细胞和原生质体。术语“丝状真菌(filamentousfungi)”是指所有丝状形式的真菌亚门(subdivisionEumycotina)(参见Alexopoulos，C.J.(1962)，INTRODUCTORYMYCOLOGY，Wiley，NewYork)。这些真菌的特征在于营养菌丝体具有由几丁质、纤维素和其它复合多糖组成的细胞壁。本发明的丝状真菌在形态学上、生理学上和遗传学上不同于酵母。丝状真菌的营养生长是通过菌丝伸长并且碳代谢是专性需氧的。在本发明中，丝状真菌亲本细胞可以是但不限于下列种的细胞木霉属(例如里氏木霉(以前分类为长梗木霉(Trichodermalongibrachiatum)，目前也被称为红褐肉座菌(Hypocreajecorina))、绿色木霉(Trichodermaviride)、康宁木霉(Trichodermakoningii)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum))；青霉属某种(Penicilliumsp.)、腐质霉属某种(Humicolasp.)(例如特异腐质霉(Humicolainsolens)和灰腐质霉(Humicolagrisea))；金孢菌属某种(Chryrysosporiumsp.)(例如，C.lucknowense)、胶霉属某种(Gliocladiumsp.)、曲霉属某种(Aspergillussp.)(例如米曲霉(A.oryzae)、黑曲霉(A.niger)和泡盛曲霉(A.awamori))、镰孢菌属某种(Fusariumsp.)、脉孢菌属某种(Neurosporasp.)、肉座菌属某种(Hypocreasp.)和裸孢菌属某种(Emericellasp.)(还参见Innisetal.，(1985)Sci.22821-26)。如本文中所使用，术语“木霉属(Trichoderma)”或“木霉属某种(Trichodermasp.)”是指以前或当前被归类为木霉属的任何真菌属。术语“培养(culturing)”是指在合适的条件下在液体或固体培养基中生长一群微生物细胞。在一个实施方式中，培养是指含颗粒淀粉的淀粉底物发酵性生物转化成终产物(通常在容器或反应器中)。发酵是通过微生物对有机物质的酶分解和无氧分解，产生较简单的有机化合物。尽管发酵在无氧条件下发生，并不意图使该术语仅受限于严格的无氧条件，正如发酵也可以在氧存在的情况下发生。短语“同步糖化发酵(simultaneoussaccharificationandfermentation，SSF)”是指产生生物化学物质中的过程，其中微生物例如乙醇生产微生物和至少一种酶例如asAA处于同一个处理步骤中。在本发明的一个实施方式中，SSF是指在同一个反应器中，同时将颗粒淀粉底物水解成包括葡萄糖的糖类和将糖类发酵成醇。术语“接触(contacting)”是指使各个酶(一种或多种)足够近地接近各自的底物，以使得该酶(一种或多种)能够将底物转化成终产物。本领域的技术人员将认识到，酶与各自底物的混合溶液可以实现接触。术语“酶促转化(enzymaticconversion)”通常是指底物通过酶作用的修饰。本文中所使用的术语还指颗粒淀粉底物通过酶作用的修饰。正如本文中所使用，术语“糖化(saccharification)”是指淀粉被酶促转化成葡萄糖。术语“糊化(gelatinization)”是指通过蒸煮溶解淀粉分子，形成粘性悬浮液。术语“液化(liquefaction)”是指在淀粉转化中的阶段，其中糊化的淀粉被水解，得到低分子量的可溶性糊精。术语“聚合度(degreeofpolymerization(DP))”是指在给定的糖中吡喃型葡萄糖酐单元(anhydroglucopyranoseunit)的数目。DPI的例子是单糖，例如葡萄糖和果糖。DP2的例子是二糖，例如麦芽糖和蔗糖。DP＞3表示聚合度大于3的聚合物。术语“终产物(end-product)”或“期望终产物(desiredend-product)”是指从颗粒淀粉底物酶促转化的任何碳源来源的分子产物。如本文中所使用，术语“干固体含量(drysolidscontent(ds))”是指基于干重以百分比(％)计的浆体中的总固体。术语“浆体(slurry)”是指含有不溶性固体的含水混合物。术语“残留淀粉(residualstarch)”是指在含淀粉底物发酵之后组合物中剩余的残余淀粉(可溶性的或不溶性的)。如本文中所使用，术语“一个再循环步骤(arecyclingstep)”是指醪液组分(mashcomponents)的再循环，所述醪液组分可以包括残留淀粉、酶和/或微生物，以发酵含颗粒淀粉的底物。术语“醪液(mash)”是指在水中的可发酵碳源(碳水化合物)的混合物，其被用于产生发酵产物，例如醇。在一些实施方式中，术语“发酵醪(beer)”和“醪液”可以被互换使用。术语“釜馏物(stillage)”是指未发酵的固体和水的混合物，其是将醇从发酵醪液除去后的残余物。术语“干酒糟(distillersdriedgrain(DDG))”和“含可溶物干酒糟(distillersdriedgrainwithsolubles(DDSG))”是指谷物发酵的有用的副产物。如本文中所使用，“产乙醇微生物(ethanologenicmicroorganisms)”是指具有将糖或寡糖转化成乙醇的能力的微生物。产乙醇微生物依靠它们表达一种或更多种酶的能力而产乙醇，所述酶单独或共同将糖转化成乙醇。如本文中所使用，术语“乙醇生产者(ethanolproducer)”或“乙醇生产微生物(ethanolproducingmicroorganism)”是指能够从己糖或戊糖中产生乙醇的任何生物体或细胞。通常，乙醇生产细胞含有醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶。乙醇生产微生物的例子包括真菌微生物例如酵母。优选的酵母包括酵母属(Saccharomyces)菌株，尤其是酿酒酵母(S.cerevisiae)。与多核苷酸或蛋白质有关的术语“异源的(heterologous)”是指在宿主细胞中并非天然发生的多核苷酸或蛋白质。在一些实施方式中，该蛋白质是商业上重要的工业蛋白质。意图是该术语包括由天然发生的基因、突变基因和/或合成基因编码的蛋白质。与多核苷酸或蛋白质有关的术语“内源的(endogenous)”是指在宿主细胞中天然发生的多核苷酸或蛋白质。本文中所使用的术语“回收”、“分离”和“分开”是指化合物、蛋白质、细胞、核酸或氨基酸从与其天然结合的至少一种组分中被移出。如本文中所使用，与细胞有关的术语“转化的”、“稳定转化的”和“转基因的”是指细胞具有非天然的(例如异源的)核酸序列，所述核酸序列整合进所述细胞的基因组或者作为可以被维持多代的附加体质粒。如本文中所使用，术语“表达”是指根据基因的核酸序列产生多肽的过程。该过程包括转录和翻译。在将核酸序列插入细胞的上下文中，术语“导入”是指“转染”或“转化”或“转导”并且包括将核酸序列引入真核或原核细胞中，其中所述核酸序列可以被整合入该细胞的基因组(例如，染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中，转化成自主复制子，或被瞬时表达(例如转染的mRNA)。如本文中所使用，术语“比活性(specificactivity)”是酶单位，其定义为，在特定的条件下，每单位时间被酶制剂转化成产物的底物摩尔数。比活性被表示为单位(U)/毫克蛋白。如本文所使用，术语“酶单位”是指在规定的试验条件下每分钟产生1微摩尔产物的酶量。例如，在一个实施方式中，术语“葡糖淀粉酶活性单位”(GAU)被定义为，在60℃和pH4.2的试验条件下每小时从可溶性淀粉底物(4％ds)中产生1g葡萄糖所需的酶量。在另一个实施方式中，颗粒淀粉水解酶单位(GSHEU)被定义为，在试验条件例如25℃、pH5.0下，每分钟从颗粒淀粉中产生1mg葡萄糖所需的GSHE的量。在一个优选的实施方式中，GSHE被定义为，在50℃、pH4.5下，每分钟从颗粒淀粉底物中产生1mg葡萄糖所需的GSHE的量。术语“产量”是指使用本发明的方法所产生的终产物或期望终产物的量。在一些优选的实施方式中，产量大于使用本领域已知的方法的产量。在一些实施方式中，该术语是指终产物的体积，在其它实施方式中，该术语是指终产物的浓度。“ATCC”是指位于Manassas，VA20108的美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)(ATCC；<www.atcc.com>)。“NRRL”是指AgriculturalResearchServiceCultureCollection，NationalCenterforAgriculturalUtilizationResearch(以前被称为USDANorthernRegionalResearchLaboratory)，Peoria，ILL.“一个(a)”、“一个(an)”或“这个(the)”包括复数形式，除非上下文中另外明确指出。如本文中所使用，术语“包括(comprising)”和其同源词以其包含性的意义使用；也就是说，等价于术语“包含(including)”及其相应的同源词。B.优选实施方式本发明涉及颗粒淀粉水解酶组合物，其包括具有颗粒淀粉水解(GSH)活性的酸稳定性α淀粉酶(asAA)和任选含有葡糖淀粉酶，其中asAA与序列SEQIDNO3具有至少90％的序列同一性。在一些优选的实施方式中，本发明提供了生产颗粒淀粉底物生物转化的期望终产物的方法，在优选的实施方式中，将asAA与颗粒淀粉底物浆体接触并且颗粒淀粉底物在颗粒淀粉底物没有糊化和液化的情况下被直接转化成终产物。颗粒淀粉底物本发明的方法中将被处理的颗粒淀粉底物可以得自任何植物部分，包括茎、谷粒、根和块茎。特别优选的植物来源包括玉米、小麦、黑麦、高梁、稻、黍、大麦、木薯(cassava)、豆科植物例如豆和豌豆、马铃薯、甘薯、香蕉和木薯(tapioca)。特别考虑的淀粉底物是玉米淀粉和小麦淀粉。来自谷物的淀粉可以是研磨过的或完整的并且包括玉米实体，例如玉米粒(kernels)、麸(brans)和/或玉米穗(cobs)。淀粉可以是高度精制的生淀粉(rawstarch)或经过精制工艺的原料。本领域的普通技术人员将充分意识到可用于制备在本发明包含的方法中所使用的颗粒淀粉底物的可得到的方法。这些方法中的一些包括使用锤磨机和轧制机对整谷粒进行干磨，和湿磨。多种淀粉是商业上可得的。例如，玉米淀粉可以从Cerestar、Sigma和KatayamaChemicalIndustryCo.(Japan)获得；小麦淀粉可以从Sigma获得；甘薯淀粉可以从WakoPureChemicalIndustryCo.(Japan)获得；马铃薯淀粉可以从NakaariChemicalPharmaceuticalCo.(Japan)获得。多篇参考文献已经报道了在谷粒中发现的淀粉量，参考TheAlcoholTextbook，3rdEd.K.Jacquesetal.，Eds.1999，NottinghamUniversityPress。例如，玉米含有约60-68％的淀粉；大麦含有约55-65％的淀粉；黍含有约75-80％的淀粉；小麦含有约60-65％的淀粉；精白米(polishedrice)含有70-72％的淀粉。在本发明包含的方法的一些实施方式中，颗粒淀粉底物被浆液化(通常使用水)并且浆体包括i)约10％到约55％的干固体含量(ds)；ii)约15％到约50％的干固体含量；iii)约20％到约45％的干固体含量；iv)约25％到约45％的干固体含量；v)约30％到约45％的干固体含量；vi)约30％到约40％的干固体含量；和vii)约30％到约35％的干固体含量。具有颗粒淀粉水解(GSH)活性的酸稳定性α淀粉酶(asAA)在一个实施方式中，具有GSH活性的asAA得自曲霉属菌株，例如米曲霉、白曲霉、黑曲霉和泡盛曲霉。在一个特别优选的实施方式中，具有GSH活性的asAA包括与SEQIDNO3列出的氨基酸序列有至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％的序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方式中，具有GSH活性的asAA包括与SEQIDNO3有至少90％的序列同一性的氨基酸序列。在进一步的实施方式中，具有GSH活性的asAA包括与SEQIDNO3有至少95％的序列同一性的氨基酸序列。asAA还可以包括与SEQIDNO3有至少98％的序列同一性的氨基酸序列。在进一步的实施方式中，具有GSH活性的asAA包括SEQIDNO3的氨基酸序列。在其它实施方式中，包含SEQIDNO3的氨基酸序列或与SEQIDNO3有至少95％的序列同一性的氨基酸序列的asAA由与序列SEQIDNO1有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％的序列同一性的多核苷酸编码。在一个特别优选的实施方式中，编码SEQIDNO3的asAA(AsaA)的核酸序列是SEQIDNO1的核酸序列。如本领域的技术人员所理解，用在本发明的组合物和方法中的具有GSH活性的asAA的量将取决于asAA的酶活性。通常，具有GSH活性的asAA以每克浆体干固体含量约0.01至15.0SSU的量与颗粒淀粉底物浆体混合。在一些实施方式中，具有GSH活性的asAA以每克淤浆干固体含量约0.01至10.0SSU、约0.01至5.0SSU、约0.05至10.0SSU、约0.05至5.0SSU、约0.1至10.0SSU、约0.1至5.0SSU、约0.1至2.0SSU、约0.25至2.5SSU、约0.5至5.0SSU、约0.5至2.5SSU；并且也以约0.5至1.5SSU的量被加入。葡糖淀粉酶葡糖淀粉酶(GA)可以源自细菌、植物和真菌来源。在本发明的组合物和方法中有用的优选葡糖淀粉酶由丝状真菌和酵母的几个株产生。具体而言，从曲霉属和木霉属菌株分泌的葡糖淀粉酶在商业上是重要的。这些葡糖淀粉酶的来源包括黑曲霉G1和G2葡糖淀粉酶及其变体(Boeletal.，(1984)EMBOJ.31097-1102；WO92/00381和WO00/04136)；泡盛曲霉葡糖淀粉酶(WO84/02921)；米曲霉葡糖淀粉酶及其变体(Hataetal.，(1991)Agric.Biol.Chem.55941-949)和Aspergillusshirousami(参见Chenetal.，(1996)Prot.Eng.9499-505；Chenetal.(1995)Prot.Eng.8575-582；和Chenetal.，(1994)BiochemJ.302275-281)。葡糖淀粉酶还得自踝节菌属(Talaromyces)菌株例如源自T.emersonii、T.leycettanus、T.duponti和嗜热踝节菌(T.thermophilus)的那些菌株(WO99/28488；USPNo.RE32,153；USPNo.4,587,215)；根霉属菌株例如雪白根霉(R.niveus)和米根霉(R.oryzae)；毛霉属(Mucor)菌株以及腐质霉属菌株，例如灰腐质霉(参见Boeletal.，(1984)EMBOJ.31097-1102；WO92/00381；WO00/04136；Chenetal.，(1996)Prot.Eng.9499-505；Tayloretal.，(1978)CarbohydrateRes.61301-308；美国专利4,514,496；美国专利4,092,434；以及Jensenetal.，(1988)Can.J.Microbiol.34218-223)。商业使用的具有葡糖淀粉酶活性的酶例如从黑曲霉(来自GenencorInternationalInc.，商品名为DISTILLASE、OPTIDEXL-400和GZYMEG9904Xfrom)或根霉属种(来自ShinNihonChemicals，Japan，商品名为CU.CONC)被生产出。也可以是商业消化酶，商品名为GLUCZYME，来自AmanoPharmaceuticals，Japan(Takahashietal.，(1985)J.Biochem.98663-671)。另外的酶包括根霉属菌种的3种形式的葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)，即“Glucl”(MW74,000)、“Gluc2”(MW58,600)和″“Gluc3”(MW61,400)”。Gluc1在本发明中特别有用。如本领域技术人员所理解，用在本发明的方法和组合物中的葡糖淀粉酶的数量取决于该葡糖淀粉酶的酶活性。通常，每克(ds)被调节到20-45％干固体的浆体中可以加入0.001和10.0GAU之间的葡糖淀粉酶量。在一些实施方式中，葡糖淀粉酶以每克(ds)浆体中0.01和10GAU之间、0.01和5.0GAU之间、0.05和5.0GAU之间、0.1和10.0GAU之间、0.1和5.0GAU之间、0.1和2.0GAU之间、0.25和1.5GAU之间的葡糖淀粉酶量被加入。在一个优选的实施方式中，葡糖淀粉酶的剂量范围为从0.1至2.0GAU/g(ds)淤浆。已知一个特定组的葡糖淀粉酶(GA)为颗粒淀粉水解酶GSHE(参见，例如Tosietal.，(1993)Can.J.Microbiol.39846-855)。GA-GSHEs不仅具有葡糖淀粉酶活性，而且能够水解颗粒(生)淀粉。GA-GSHEs已经从真菌细胞中回收，如腐质霉属某种、曲霉属某种和根酶属某种。米根霉GA-GSHE已经被描述在Ashikarietal.，(1986)Agric.Biol.Chem.50957-964和USP4,863,864。也可参考雪白根霉。灰腐质酶GA-GSHE被描述于Allisonetal.，(1992)Curr.Genet.21225-229和欧洲专利]71218。编码此酶的基因在本领域中也已知为“gla1”。泡盛曲霉白曲霉变种(Aspergillusawamorivar.kawachi)GA-GSHE被描述在Hayashidaetal，(1989)Agric.Biol.Chem53923-929。AspergillusshirousamiGA-GSHE由Shibuyaetal.，(1990)Agric.Biol.Chem.541905-1914描述。用于本发明的一种具体的GA-GSHE制剂包括可从BioconIndia，Ltd，India获得的以名称“M1”出售的酶制剂。GA-GSHE制剂的活性可以根据葡糖淀粉酶的活性被定义。在一个实施方式中，GA-GSHE酶可以源自灰腐质霉菌株，特别是灰腐质霉嗜热变种(Humicolagriseavar.thermoidea)的菌株(参见，美国专利号4,618,579)。在一些优选的实施方式中，灰腐质霉GA-GSHE酶从包括ATCC16453、NRRL(USDANorthernRegionalResearchLaboratory，Peoria，ILL)15219、NRRL15220、NRRL15221、NRRL15222、NRRL15223、NRRL15224和NRRL15225的真菌以及其遗传改变菌株中回收。这些种产生免疫学上相同的葡糖淀粉酶酶制剂(参见EP0171218)。重组表达酶在本发明的一些实施方式中，微生物被遗传改造以表达具有GSH活性的异源asAA，微生物也可以被改造以表达异源葡糖淀粉酶。优选的宿主细胞是丝状真菌细胞。在一个优选的实施方式中，丝状真菌宿主是曲霉属某种、木霉属某种、镰刀菌属某种(Fusariumsp)和青霉属某种的菌株。特别优选的真菌宿主细胞包括构巢曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、棘孢曲霉(A.aculeatus)、黑曲霉、日本曲霉(A.japonicus)、里氏木霉、绿色木霉、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)和茄腐皮镰孢菌(F.solani)。曲霉属菌株在Wardetal.(1993)Appl.Microbiol.Biotechnol.39738-743和Goedegebuuretal.，(2002)CurrGene4189-98中被公开。在一个最优选的实施方式中，宿主是木霉属的菌株，特别是里氏木霉菌株。里氏木霉菌株是已知的，非限制性例子包括ATCCNo.13631、ATCCNo.26921、ATCCNo.56764、ATCCNo.56765、ATCCNo.56767和NRRL15709。在一些优选实施方式中，宿主菌是RL-P37的衍生物。RL-P37在Sheir-Neissetal.(1984)Appl.Microbiol.Biotechnology2046-53中被公开。在一些优选的实施方式中，木霉属宿主细胞或曲霉属宿主细胞被遗传改造，以表达具有GSH活性的asAA，该asAA特征在于与SEQIDNO3具有至少90％、95％、96％、97％、98％和99％的同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，编码asAA的多核苷酸将具有核酸序列SEQIDNO1或与SEQIDNO1有至少70％的序列同一性的核酸序列。在一些实施方式中，相比于由在天然宿主中具有GSH活性的asAA的内源表达所产生的asAA，在被改造以包括编码具有GSH活性的asAA的异源多核苷酸的宿主细胞中所产生的asAA将具有不同的性质，例如改进的性质。这些性质可以包括，例如，增加的酶活性、在较低pH水平下增加的酶稳定性或增加的比活性。在其它实施方式中，被遗传改造以表达具有GSH活性的asAA的宿主菌株也可以被遗传改造以表达异源GA。宿主菌已经可以通过遗传工程被预先操纵。在一些实施方式中，真菌宿主细胞的多种天然基因将已被失活。这些基因包括，例如，编码纤维素分解酶如内切葡聚糖酶(EG)和外切纤维二糖水解酶(CBH)的基因(例如cbh1、cbh2、egl1、egl2和egl3)。美国专利5,650,322公开了在cbh1基因和cbh2基因中具有缺失的RL-P37衍生菌株。载体尽管下面的描述具体指asAA，本领域的普通技术人员将容易理解，对将编码GA的多核苷酸导入宿主细胞中有用的DNA构建物和载体，可以应用相同或相似的方法。根据本发明，包括编码本发明涉及的编码asAA的核酸的DNA构建物被构建，以便将asAA转移进宿主细胞。在一个实施方式中，DNA构建物通过表达载体被转移进宿主细胞，该表达载体包括可操纵地连接到asAA编码序列的调节序列。载体可以是当其被导入真菌宿主细胞时被整合进宿主细胞基因组并被复制的任何载体。对于载体列表，参考FungalGeneticsStockCenterCatalogueofStrains(FGSC，<www.fgsc.net>)。合适的表达载体和/或整合载体的其它例子提供在Sambrooketal.，supra(1989)、Ausubel(1987)supra、vandenHondeletal.1991)inBennettandLasure(Eds.)MOREGENEMANIPULATIONSINFUNGI，AcademicPresspp.396-428以及美国专利号5,874,276。特别有用的载体包括pFB6、pBR322、PUC18、pUC100和pENTR/D。在优选的实施方式中，编码本发明包含的asAA的核酸被可操纵地连接到在真菌宿主细胞中显示转录活性的合适的启动子。启动子可以源自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。优选地，启动子在木霉属宿主中是有用的。启动子的合适非限制性例子包括cbh1、cbh2、egl1、egl2。在一个实施方式中，启动子是对于宿主细胞为天然的启动子。例如，当里氏木霉是宿主时，启动子是天然的里氏木霉启动子。在一个优选的实施方式中，启动子是里氏木霉cbh1，其是诱导型启动子并且以登记号(AccessionNo.)D86235被存放于Genbank中。“诱导型启动子”是在环境调控或发育调控下具有活性的启动子。在另一个实施方式中，启动子是对于真菌宿主细胞为异源的启动子。有用的启动子的其它例子包括来自泡盛曲霉和黑曲霉葡糖淀粉酶基因的启动子(Nunbergetal.，(1984)Mol.CellBiol.42306-2315和Boeletal.，(1984)EMBOJ.31581-1585)。此外，里氏木霉xln1基因和纤维二糖水解酶1基因的启动子可以是有用的(EPA137280A1)。在一些优选的实施方式中，asAA编码序列被可操纵地连接到信号序列。编码信号序列的DNA优选地是与将被表达的asAA基因天然连接的序列。优选地，信号序列由编码Ak-asaA的白曲霉asaA基因编码。更优选地，信号序列与SEQIDNO2的信号序列具有至少90％、至少95％、至少97％和至少99％的序列同一性。在另外的实施方式中，包括在将被导入真菌宿主的DNA构建物或载体中的信号序列和启动子序列来自相同的来源。例如，在一些实施方式中，信号序列是可操纵性连接到cdh1启动子的cdh1信号序列。在一些实施方式中，表达载体还包括终止序列。在一个实施方式中，终止序列和启动子序列来自相同的来源，在另一个实施方式中，终止序列与宿主细胞同源。特别合适的终止序列是来自木霉属菌株、特别是里氏木霉的cbh1。其它有用的真菌终止子包括来自黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的终止子(Nubergetal.，(1984)supra，和Boeletal.，supra(1984))。在一些实施方式中，表达载体包括选择性标记。优选的选择性标记的例子包括使具有抗微生物抗性(例如潮霉素和腐草霉素)的标记。营养性选择标记也在本发明中有用，包括本领域已知为amdS、argB和pyr4的那些标记。在用于木霉属转化的载体系统中有用的标记是本领域中已知的。(参见，例如Finkelstein，BIOTECHNOLOGYOFFILAMENTOUSFUNGI中第6章，Finkelsteinetal.Eds.Butterworth-Heinemann，Boston，MA(1992)，第6章；以及Kinghornetal.(1992)APPLIEDMOLECULARGENETICSOFFILAMENTOUSFUNGI，BlackieAcademicandProfessional，ChapmanandHall，London)。在一个优选的实施方式中，选择性标记是amdS基因，其编码乙酰胺酶，允许转化细胞以乙酰胺作为氮源而生长。构巢曲霉amdS基因作为选择标记的使用描述于Kelleyetal.，(1985)EMBOJ.4475-479和Penttilaetal.，(1987)Gene61155-164中。包括具有编码asAA的多核苷酸的DNA构建物的表达载体可以是能够在给定的真菌宿主生物中自我复制或能够整合进宿主的DNA中的任何载体。在一些实施方式中，表达载体是质粒。在优选的实施方式中，考虑了两种类型的表达载体，用以获得基因表达。第一表达载体包括DNA序列，其中启动子、asAA编码区和终止子都源自将被表达的基因。在一些实施方式中，通过剔除不期望的DNA序列(例如编码不需要的结构域的DNA)获得基因截短，留下在其自身转录和翻译调节序列的控制下被表达的结构域。第二类表达载体被预装配，并包含高水平转录所需的序列和选择标记。在一些实施方式中，asAA基因的编码区或其部分被插入通用表达载体，使得其处于表达构建物启动子和终止子序列的转录控制下。在一些实施方式中，基因或其部分被插入强cbh1启动子的下游。用于连接包括编码asAA的多核苷酸、启动子、终止子和其它序列的DNA构建物的方法以及用于将它们插入合适载体的方法是本领域中已知的。连接通常通过在适宜的限制位点进行连接而完成。如果这类位点不存在，根据常规实践，使用合成的寡核苷酸连接体(linker)。(参见，Sambrooksupra(1989)，以及BennettandLasure，MOREGENEMANIPULATIONSINFUNGI，AcademicPress，SanDiego(1991)pp70-76。)另外，可以使用已知的重组技术构建载体(例如InvitrogenLifeTechnologies，GatewayTechnology)。在期望获得具有一个或更多个失活基因的真菌宿主细胞的情况下，可以使用已知的方法(例如，美国专利5,246,853、美国专利5,475,101和WO92/06209中公开的方法)。基因失活可以通过完全或部分缺失、插入失活或使得基因对于预期目标无功能化的任何其它方法(因而，阻止基因表达功能蛋白)而进行。已被克隆的来自木霉属某种或其它丝状真菌宿主的任何基因可以被缺失，例如cbh1、cbh2、egl1和egl2基因。在一些实施方式中，通过用本领域已知的方法使将某一形式的要被失活的期望基因插入质粒中，可以进行基因缺失。然后，缺失质粒在期望基因编码区内部的适宜限制性酶切位点被切割，并且基因编码序列或其部分替换为选择标记。待缺失基因的座位(优选约0.5至2.0kb之间)的侧翼DNA序列保持在标记基因的每一边。适宜的缺失质粒通常具有存在于其中的独特限制性酶切位点，使得含有缺失基因的片段，包括侧翼DNA序列和选择标记基因能够被作为单一线性片段而被除去。宿主细胞的转化、表达和培养DNA构建物或载体向宿主细胞的导入包括技术例如转化；电穿孔；核显微注射；转导；转染(例如，脂转染介导和DEAE-Dextrin介导的转染)；与磷酸钙DNA沉淀物温育；DNA包被微粒的高速轰击；以及原生质体融合。普通转化技术在本领域中是已知的(参见，例如Ausubeletal.，supra(1987)，第9章；以及Sambrook(1989)supra，和Campbelletal.，(1989)Curr.Genet.1653-56)。木霉属中异源蛋白的表达描述于USP6,022,725；美国专利6,268,328；Harkkietal.(1991)；EnzymeMicrob.Technol.13227-233；Harkkietal.，(1989)BioTechnol.7596-603；EP244,234；EP215,594；以及Nevalainenetal.，″TheMolecularBiologyofTrichodermaanditsApplicationtotheExpressionofBothHomologousandHeterologousGenes″，MOLECULARINDUSTRIALMYCOLOGY，Eds.LeongandBerka，MarcelDekkerInc.，NY(1992)pp.129-148。对于曲霉属菌株的转化，也参考Caoetal.，(2000)Sci.9991-1001。优选地，用载体系统构建遗传上稳定的转化体，编码asAA的核酸由此被稳定整合进宿主菌株染色体中，然后，通过已知技术纯化转化体。在一个非限制性例子中，通过它们在含有乙酰胺的固体培养基上的更快的生长速率和具有平滑而非粗糙轮廓的环状菌落的形成，将含有amds标记的稳定转化体与不稳定转化体区分开来。另外，在一些情况下，通过使转化体在固体非选择性培养基(即，缺乏乙酰胺的培养基)上生长、从该培养基收集孢子并测定这些孢子随后在含乙酰胺的选择培养基上萌发和生长的百分比，进行进一步的稳定性试验。可选地，可以用本领域中已知的其它方法选择转化体。在一个具体的实施方式中，用于转化的木霉属某种的制备包括从真菌菌丝体制备原生质体。(参见Campbelletal.，(1989)Curr.Genet.1653-56)。在一些实施方式中，菌丝体得自萌发的营养孢子。用消化细胞壁的酶处理菌丝体，得到原生质体。然后，在悬浮培养基中，用于存在渗透稳定剂，原生质体得到保护。这些稳定剂包括山梨醇、甘露醇、氯化钾、硫酸镁和类似稳定剂。通常，这些稳定剂的浓度在0.8M和1.2M之间变化。优选的是，在悬浮培养基中使用1.2M山梨醇溶液。DNA向宿主木霉属某种菌株的吸收取决于钙离子浓度。通常，约10mMCaCl2和50mMCaCl2之间被用在吸收溶液中。在吸收溶液中除了需要钙离子，通常包括的其它化合物是缓冲体系例如TE缓冲液(10mMTris，pH7.4；1mMEDTA)或10mMMOPS，pH6.0缓冲液(吗啉丙烷磺酸)和聚乙二醇(PEG)。据认为，聚乙二醇起着融合细胞膜的作用，从而允许培养基的内容物被输送至木霉属某种菌株的细胞质中以及质粒DNA被转移到核。该融合通常使得多拷贝质粒DNA整合进宿主染色体。通常，在转化中应用含有木霉属某种原生质体或细胞的悬浮液，所述原生质体或细胞已经以105至107/mL的密度接受渗透性处理，优选2×106/mL。在适宜溶液(例如1.2M山梨醇；50mMCaCl2)中的100μL体积的这些原生质体或细胞与期望DNA混合。通常，高浓度的PEG被加入到吸收溶液。从0.1至1体积的25％PEG4000可以被加入到原生质体悬浮液。然而，优选将约0.25体积加入到原生质体悬浮液中。添加剂例如二甲基亚砜、肝素、亚精胺、氯化钾和类似添加剂也可以被加入到吸收溶液并帮助转化。对于其它真菌宿主细胞，相同的步骤也可以利用。(参见，例如美国专利6,022,725和6,268,328，两者都被引入作为参考)。通常，该混合物随后在大约0℃下温育10至30分钟之间的一段时间。然后，向混合物中加入另外的PEG，以进一步增强期望基因或DNA序列的吸收。25％PEG4000通常以转化混合物的体积的5至15倍体积被加入；然而，更多或更少的体积可以是适合的。25％PEG4000优选地是转化混合物的体积的约10倍。加入PEG之后，然后，转化混合物在加入山梨醇和CaCl2溶液之前在室温下或在冰上温育。然后，原生质体悬浮液被进一步加入到生长培养基的熔融等分试样。该生长培养基仅允许转化体生长。通常，细胞在含有生理盐和养分的标准培养基中培养(参见，例如Pourquie，J.etal.，BIOCHEMISTRYANDGENETICSOFCELLULOSEDEGRADATION，eds.Aubert，J.P.etal.，AcademicPress，pp.71-86，1988和llmen，M.etal.，(1997)Appl.Environ.Microbiol.631298-1306)。普通商业制备的培养基(例如酵母麦芽提取物(YM)肉汤、LuriaBertani(LB)肉汤和沙氏葡萄糖(SabouraudDextrose)(SD)肉汤)也在本发明中有用。培养条件也是标准的，(例如，在振荡培养或发酵罐中在适宜的培养基中于约28℃培养培养物直至达到asAA表达的期望水平)。对于给定的丝状真菌，优选的培养条件在本领域中是已知的，可以在科学文献中和/或从真菌来源例如AmericanTypeCultureCollection和FungalGeneticsStockCenter找到。在建立起真菌生长后，细胞被暴露于有效导致或允许asAA表达的条件中，如本文所限定。在具有GSH活性的asAA编码序列处于诱导型启动子的调控下的情况下，诱导剂(例如糖、金属盐或抗微生物剂)，以有效诱导asAA表达的浓度被加入到培养基。asAA活性的鉴定为了评价通过已经用编码本发明包含的asaA的异源多核苷酸转化的细胞系对具有GSH活性的asAA的表达，可以在蛋白质水平、RNA水平或使用特定于α淀粉酶活性和/或产量的功能生物试验进行测定。通常，所使用的试验包括，RNA印迹法(Northernblotting)、斑点印迹法(dotblotting)(DNA或RNA分析)、RT-PCR(反转录酶聚合酶链式反应)或原位杂交，其中使用适当标记的探针(基于核酸编码序列)，和常规的DNA印迹法(Southernblotting)和放射自显影。另外，具有GSH活性的asAA的产生和/或表达可以在样品中直接测量，例如，通过直接测量培养基中的还原糖例如葡萄糖的试验和通过测量葡糖淀粉酶活性、表达和/或产生的试验。对测量GSH活性有用的底物包括颗粒淀粉底物。例如，葡萄糖浓度可以通过任何方便的方法被确定，例如通过使用葡萄糖试剂试剂盒No15-UV(SigmaChemicalCo.)或仪器例如TechniconAutoanalyzer。还参考从InstrumentationLab.(Lexington，MA)商购可得的葡萄糖氧化酶试剂盒和葡萄糖己糖试剂盒。另外，基因表达可以通过免疫方法评价，例如细胞、组织切片的免疫组化染色，或组织培养培养基的免疫测定，如通过蛋白质印迹或ELISA。此类免疫测定可以被用于定性或定量评价asaA的表达。此类方法的细节对于本领域普通技术人员而言是已知的并且用于实践这类方法的许多试剂是商业可得的。另外，基因表达可以通过免疫方法评价，例如细胞、组织切片的免疫组化染色，或组织培养培养基的免疫测定，如通过蛋白质印迹或ELISA。此类免疫测定可以被用于定性或定量评价asaA的表达。此类方法的细节对于本领域普通技术人员而言是已知的并且用于实践这类方法的许多试剂是商业可得的。α淀粉酶活性可以通过使用DNS法测定，如在MilleR，G.L.(1959)Anal.Chem.31426-428中所描述。葡糖淀粉酶活性可以通过3，5-二硝基水杨酸(DNS)法(参见，Gotoetal.，(1994)Biosci.Biotechnol.Biochem.5849-54)测定。在本发明的一些实施方式中，由木霉属或曲霉属宿主表达的具有GSH活性的asAA为每升培养基1克蛋白质(g/L)以上、2g/L以上、5g/L以上、10g/L以上、20g/L以上、25g/L以上、30g/L以上、50g/L以上，也可以是100g/L以上。纯化asAA的方法通常，细胞培养物中产生的asaA(包括n-asAA或r-asAA)被分泌到培养基中并且可以通过例如从细胞培养培养基中除去不需要的组分而被纯化或分离。在一些情况下，AsaA可以在细胞形式中产生，使从细胞裂解液回收成为必要。在这样的情况下，使用本领域普通技术人员常规采用的技术，从产生酶的细胞中分离该酶。例子包括，但不限于，亲和层析(Tilbeurghetal.，(1984)FEBSLett.16215)；离子交换色谱法(Goyaletal.，(1991)Biores.Technol.3637；Fliessetal.，(1983)Eur.J.Appl.Microbiol.Biotechnol.17314；Bhikhabhaietal.，(1984)J.Appl.Biochem.6336；和Ellouzetal.，(1987)Chromatography396307)，包括使用具有高分辨力的物质的离子交换(Medveetal.，(1998)J.ChromatographyA808153)；疏水相互作用色谱法(TomazandQueiroz，(1999)J.ChromatographyA865123)；两相分配(Brumbauer，etal.，(1999)Bioseparation7287)；乙醇沉淀；反相HPLC；硅石上或阳离子交换树脂例如DEAE上的层析；层析聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀和使用例如SephadexG-75的凝胶过滤。发酵在本发明的一些实施方式中，表达异源葡糖淀粉酶和/或asAA的真菌细胞在分批或连续发酵条件下生长。传统的分批发酵是封闭的系统，其中培养基的组成在发酵开始时设定并且在发酵期间不进行人工调整。因此，在发酵开始时，用期望的生物体接种培养基。在此方法中，在不向系统加入任何成分的情况下进行发酵。典型地，依据碳源的加入，分批发酵可称为“分批”，并且经常努力控制因素例如pH和氧浓度。分批系统的代谢物和生物物质组成持续变化，直至发酵停止的时刻。在分批培养物中，细胞由迟缓期进入到高速生长的对数期，最终达到生长速率降低或停止的稳定期。如果不处理，处于稳定期的细胞最终死亡。通常，处于对数期的细胞负责大量产生终产物。在标准分批体系中的变化是“喂料-分批发酵(fed-batchfermentation)”系统，该系统也在本发明中有用。在典型的分批系统的这种变化中，随着发酵的进程，底物以一定增量加入。当分解代谢物阻遏倾向于抑制细胞代谢和期望在培养基中具有限量的底物时，喂料-分批系统是有用的。测量喂料-分批系统中的实际底物浓度是困难的，因此，根据可测量的因素例如pH、溶解的氧和废气例如CO2分压的变化进行估计。分批和喂料-分批发酵在本领域中是常见和熟知的。连续发酵是开放系统，其中限定的发酵培养基被连续加入到生物反应器中，同时移出等量的条件培养基，以进行发酵。连续发酵通常使培养物维持在恒定的高密度，其中细胞主要处于对数生长期。连续发酵允许调节影响细胞生长和/或终产物浓度的一种因素或任意数量的因素。例如，在一个实施方式中，限制性营养物例如碳源或氮源被维持在固定的速率，所有其它参数允许调节。在其它系统中，影响生长的许多因素可以持续改变，而由培养基浊度测量的细胞浓度保持恒定。连续系统努力保持稳态生长条件。因此，由于培养基的排除导致的细胞损失必须依据发酵中的细胞生长速率进行平衡。调节营养物和生长因素以进行连续发酵工艺的方法以及使产物形成速率最大化的技术是工业微生物领域熟知的。组合物和方法在一个实施方式中，使颗粒淀粉底物与具有GSH活性的asAA接触，其中asAA作为无细胞滤液得到(例如其中asAA分离自培养基)。在另一个实施方式中，使颗粒淀粉底物与具有GSH活性的asAA接触，其中asAA在含有表达和分泌具有GSH活性的asAA的真菌宿主细胞的培养基中获得。在其它实施方式中，在同一步骤中，使颗粒淀粉底物与具有GSH活性的asAA和葡糖淀粉酶(GA)接触，以水解颗粒淀粉。GA也可以作为无细胞滤液或在含有表达和分泌GA的宿主细胞的培养基中获得。根据本发明特别有用的颗粒淀粉水解酶组合物包括GA(例如DISTALLASE)和与SEQIDNO3具有至少90％或至少95％的序列同一性的asAA的混合物。在一些实施方式中，以活性测量的存在于该混合物中的asAA的范围是从0.01至15.0SSU，并且在该组合中有用的葡糖淀粉酶量是0.1至10.0GAU/gds的范围。特别有用的酶组合物包括与SEQIDNO3有至少95％序列同一性的asAA和具有0.1至10GAU/gds的GA的混合物。另一个特别有用的酶组合物包括与SEQIDNO3有至少98％序列同一性的asAA和具有0.1至10GAU/gds的GA的混合物。在一些实施方式中，具有GSH活性(SSU)的asAA与GA活性(GAU)的比率为15∶1至1∶15的范围内。在进一步的实施方式中，该比率(SSU比GAU)将在约10∶1至1∶10的范围内；约10∶1至1∶5；约5∶1至1∶5；约4∶1至1∶4；约3∶1至1∶3；约2∶1至1∶4和约2∶1至1∶2的范围内。在一些优选的实施方式中，SSU与GAU的比率将在约4∶1至2∶1之间。在一个实施方式中，包括单独的asAA或asAA与葡糖淀粉酶的组合的酶组合物将被加入到颗粒淀粉底物的浆体中并且混合物在一步中发酵。浆体可以具有约10-50％ds；约10-45％ds；约15-40％ds；约20-40％ds；约25-40％ds；或约25-35％ds。本发明的组合物和方法包括的组分的精确量取决于所应用的酶以及所处理的颗粒淀粉的类型的组合。在一些实施方式中，本发明涉及产生终产物的方法，包括在一步中使颗粒淀粉底物浆体与包括葡糖淀粉酶和具有颗粒淀粉(GSH)活性的酸稳定性α淀粉酶(asAA)的酶组合接触，产生终产物。在一些实施方式中，asAA和GA被分别加入，在其它实施方式中，asAA和GA以组合掺混物加入。在优选的实施方式中，接触步骤在颗粒淀粉的淀粉糊化温度以下的温度下进行。根据本发明的方法所使用的精确温度取决于所使用的具体淀粉底物。通常的淀粉糊化温度范围公开在Swinkels，STARCHCONVERSIONTECHNOLOGY第32-38页，edsVanBeynumetal.，(1985)MarcelDekkerInc.，NY和THEALCOHOLTEXTBOOK，AREFERENCEFORTHEBEVERAGE，FUELANDINDUSTRIALALCOHOLINDUSTRIES，3rdEd.，edsJacquesetal.，1999，NottinghamUniversityPress，UK。在一些实施方式中，温度为至少约10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃和65℃。在其它实施方式中，该温度将在约30-65℃、约35-65℃、约40-65℃和约45-65℃之间。在其它实施方式中，该温度将在约25-45℃、约25-40℃、约30-40℃和约30-35℃之间。在优选的实施方式中，淀粉底物从不经受用于液化的热条件。在一些实施方式中，本方法的停留时间为从约2至300小时，但更通常从2至120小时。在一些实施方式中，该步骤进行约5至100小时。在其它实施方式中，该步骤进行约5至80小时。在其它实施方式中，该步骤进行至少约5小时但在100小时以下。在其它实施方式中，该步骤进行至少约10小时但在约100小时以下。在一些实施方式中，至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、94％、95％、96％、97％、98％和99％的颗粒淀粉的干固体被水解。在一些实施方式中，颗粒淀粉底物被完全水解。在一些实施方式中，在100小时中，至少90％的颗粒淀粉被水解。在某些实施方式中，在24小时的时间段内，至少90％的颗粒淀粉底物被水解。在其它实施方式中，在24小时的时间段内，至少95％的颗粒淀粉底物被水解。葡萄糖产量(总的溶解的干固体的百分比)可以是至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％和98％。然而，在一个优选的实施方式中，葡萄糖被连续产生并基本上所有葡萄糖都被用在该方法中，以产生终产物例如乙醇。(参考MOLECULARSTRUCTUREANDFUNCTIONOFFOODCARBOHYDRATE，ED.G.G.BIRCHETAL，APPLIEDSCIENCEPUBLISHERS，LONDON)。另外的酶可以被包括在本发明包含的组合物和方法中。这些在本发明中有用的另外的酶包括脱支酶例如支链淀粉酶(E.C.3.2.1.41)和异淀粉酶(E.C.3.2.1.68)。这类酶水解α-1，6-糖苷键。因此，在淀粉的水解期间，脱支酶从淀粉的非还原端连续除去葡萄糖单元。可以用在本发明的组合物中的另一个酶是β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)。这些是外部作用生麦芽糖淀粉酶(exo-actingmaltogenicamylases)，其催化直链淀粉、支链淀粉和相关的葡萄糖聚合物中的1，4-α-糖苷键的水解。这些酶的特征在于具有从4.5至7.0的最适pH范围和从40℃至65℃的最适温度范围。商业β淀粉酶是可得自GenencorInternationalInc.。可以被使用的进一步另外的酶是蛋白酶，例如真菌和细菌蛋白酶。真菌蛋白酶包括例如得自曲霉属、毛酶属和根霉属的那些蛋白酶，例如黑曲霉、泡盛曲霉、米曲霉和米赫毛霉(M.miehei)。其它酶包括但不限于纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶和角质酶。欲包括在本发明的方法中的这些酶的有效量可以被本领域的普通技术人员容易地确定。在一些实施方式中，抗微生物剂可以被加入到本发明的组合物和发酵培养基中。抗微生物剂是杀死或抑制微生物生长的化合物。在另一个实施方式中，颗粒淀粉底物可以在与asAA和任选与GA接触之前被预处理。预处理包括在与产乙醇微生物发酵或培养之前将颗粒淀粉底物优选含生底物的浆体加热到淀粉底物的淀粉糊化温度以下的温度。在优选的实施方式中，预处理包括应用α淀粉酶，例如细菌α淀粉酶(即SPEZYME和GZYME997(GenencorInternational，Inc.))。在一些实施方式中，预处理将包括在含有根据本发明的具有GSH活性的asAA以及任选含有葡糖淀粉酶的培养中。在其它实施方式中，预处理将从包括具有GSH活性的asAA和任选包括葡糖淀粉酶的培养中被分开。在一些实施方式中，预处理将从约2至24小时发生。在其它实施方式中，预处理将从约2至8小时发生。在一些优选的实施方式中，该方法包括同步糖化发酵(SSF)，其中颗粒淀粉水解步骤和发酵步骤同时进行。包括与具有GSH活性的asAA接触的颗粒淀粉底物的培养基还包括微生物，例如细菌、真菌或酵母，特别是产乙醇微生物，所述具有GSH活性的asAA或者在无细胞滤液中供应或者由培养物中的真菌宿主表达。在一些实施方式中，发酵系统可以包括至少两种细胞培养物。在一些优选实施方式中，除了与具有GSH活性的asAA接触外，SSF将包括使颗粒淀粉底物与葡糖淀粉酶接触。在一些优选的实施方式中，产乙醇微生物将包括酵母，例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)(美国专利4,316,956)。产乙醇微生物的优选例子还包括表达醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶的细菌，例如可以用运动发酵单胞菌(Zymomonasmoblis)获得或从运动发酵单胞菌中获得(美国专利5,028,539；5,424,202；5,487,989；5,482,846；5,554,520；和5,514,583)。在另外的实施方式中，产乙醇微生物表达木糖还原酶和木糖醇脱氢酶，它们是将木糖转化成木酮糖的酶。酵母的商业来源包括FALI、REDSTAR(RedStar)、FERMIOL(DSMSpecialties)和SUPERSTART(Alltech)。在一些实施方式中，同步糖化发酵的停留时间将为约2至300小时，但优选从2至120小时。在一些实施方式中，该时间为约5至100小时。在其它实施方式中，该时间为约5至80小时。在再其它的实施方式中，该时间为至少5小时但为100小时以下。在其它实施方式中，在10-40℃的温度下并优选在25-40℃下以及3.5至6.0的pH下，该处理时间(processtime)为至少约10小时但为100小时以下。酵母在发酵中的使用是熟知的并参考THEALCOHOLTEXTBOOK，K.JACQUESETAL.，EDS.1999，NOTTINGHAMUNIVERSITYPRESS，UK。在一些实施方式中，至少5％体积、至少8％体积、至少10％体积、至少12％体积、至少15％体积和至少18％体积的乙醇在发酵培养基中产生。在其它实施方式中，发酵培养基中所产生的乙醇的量将在5-30％之间、也在5-25％之间以及在5-20％之间。在发酵之后，可以通过本领域中已知的方法从发酵培养基回收醇(即乙醇)。在一些实施方式中，发酵过的培养基中的醇可以被蒸馏，例如通过加热或真空蒸馏。然后，乙醇可以被用作例如燃料乙醇或饮用乙醇。被称为釜馏物的剩下的残留物也可以被回收，并且重复用于下次发酵的釜馏物的成分或釜馏物可以被分成可溶馏分或不可溶馏分。当釜馏物例如通过离心或筛选为可溶馏分和不可溶馏分而被分离时，这些馏分可以被用来制备酒糟可溶物(distiller’ssolubles)或可溶性干酒糟(distiller’sdriedsolubles)或被一起混合而制备含可溶物干酒糟(DDGS)。本领域普通技术人员熟悉通常形成DDGS和酒糟的方法。在本发明的一些实施方式中，当在发酵过程中乙醇百分比提高时，DDGS的量降低。然而，本发明包括的方法的一个显著的优点可以是在DDGS中总蛋白百分比提高，参考实施例10。DDGS随后可以用在例如动物饲料配制中。在一些实施方式中，本发明包括的SSF方法将导致含有30％以下、15％以下、10％以下、9％以下、8％以下、7％以下、6％以下、5％以下、4％以下、2％以下和1％以下的残留淀粉的DDGS。预期的是，尽管与现有技术的方法制备的DDGS相比具有较低的残留淀粉含量，根据本发明的方法得到的DDGS确实具有提高的蛋白总量，从而对用在动物饲料中具有另外的益处。从发酵中回收的残留淀粉可以与酶和/或微生物一起被重复利用，并经受重新的发酵。在一个实施方式中，当发酵进行到预定的醇含量(例如8至30％)时，同时用asaA和葡糖淀粉酶以及微生物发酵20-50％ds的颗粒淀粉浆体的方法将产生残留淀粉。残留淀粉、微生物和/或残留酶可以按照需要与新鲜颗粒淀粉和另外的酶等分试样混合，产生用于另一次发酵的发酵物料。然而，意图不是将本发明限制为重复利用酶和/或微生物及残留淀粉。在一些实施方式中，微生物在重复利用残留淀粉之前从残留淀粉中除去，而在其它实施方式中，仅仅微生物被重复利用。本文中介绍的多个实施方式的一个例子见于图12。尽管在优选的实施方式中，期望的终产物是乙醇，但期望的终产物可以是能够通过颗粒淀粉底物的酶促转化产生的任何产物。颗粒淀粉水解得到的葡萄糖可以被生物转化成许多产物，例如但不限于抗坏血酸中间体(葡糖酸、2-酮-L-古洛糖酸、艾杜糖酸、5-酮-葡糖酸和2，5-二酮葡糖酸)；1，3-丙二醇；芳族氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸)；有机酸(例如乳酸、琥珀酸、异柠檬酸和草酰乙酸)；氨基酸(丝氨酸和甘氨酸)；丙酮酸和其它。本领域技术人员知道可以用在这些终产物的生产中的多种发酵条件以及测量蛋白质表达水平的酶试验。实验提供下面的实施例供，用以说明和进一步阐述本发明的某些优选的实施方式和方面，并不被解释为限制本发明的范围。实际上，预期的是，这些教导将在进一步优化本文中描述的方法系统中有用。在随后的公开内容和试验部分，使用下列缩写具有GSH活性的asAA(具有颗粒淀粉水解活性的酸稳定性α淀粉酶)；asaA(具有颗粒淀粉水解活性的酸稳定性α淀粉酶，如SEQIDNO3所示，得自白曲霉中asAA的内源性表达)；Tr-asaA(在里氏木霉宿主中表达的白曲霉酸稳定性α淀粉酶)；AkAA(具有SEQIDNO3的酸稳定性α淀粉酶，有时与asaA互换使用)；以及其它缩写，包括GA(葡糖淀粉酶)；wt％(重量百分比)；℃(摄氏度)；rpm(转/每分钟)；H2O(水)；dH2O(去离子水)；dIH2O(去离子水，Milli-Q过滤)；aa(氨基酸)；bp(碱基对)；kb(千碱基对)；kD(千道而顿)；g或gm(克)；μg(微克)；mg(毫克)；μL(微升)；ml和mL(毫升)；mm(毫米)；μm(微米)；M(摩尔)；mM(毫摩尔)；μM(微摩尔)；U(单位)；V(伏特)；MW(分子量)；sec(秒)；min(s)(分钟)；hr(s)(小时)；PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)；DO(溶解氧)；邻苯二甲酸盐缓冲液(水中的邻苯二甲酸钠，20mM，pH5.0)；PBS(磷酸缓冲盐[150mMNaCl，10mM磷酸钠缓冲液，pH7.2])；SDS(十二烷基硫酸钠)；Tris(三羟甲基氨基甲烷)；w/v(重量体积比)；w/w(重量比)；v/v(体积比)；Genencor(GenencorInternational，Inc.，PaloAlto，CA)；DDGS(含固体干酒糟)；MT(公吨)；和EtOH(乙醇)。下面的试验和方法被用在下面提供的实施例中葡糖淀粉酶试验使用熟知的试验测量葡糖淀粉酶活性，该试验基于葡糖淀粉酶催化对硝基苯基-α-D-比喃葡萄糖苷(PNPG)水解成葡萄糖和对硝基苯酚的能力。在碱性pH下，硝基苯酚形成黄颜色，所述颜色与葡糖淀粉酶活性成比例，并且是在400nm下检测并与以GAU测定的酶标准品比较。1个“葡糖淀粉酶活性单位”(GAU)被定义为产生1克还原糖的酶的量，计算为在pH4.2和60℃下每小时得自可溶性淀粉底物(4％ds)的葡萄糖。酸稳定性α淀粉酶活性的测量是基于在pH4.5、50℃下，酶样品等分试样对可溶马铃薯淀粉底物(4％ds)的水解程度。使用DNS法测量还原糖含量，如Miller，GL.(1959)Anal.Chem.31426-428所描述。1单位酶活性(SSU，可溶性淀粉单位(solublestarchunit))等价于在特定的温育条件下每分钟释放1mg葡萄糖的还原能力。总淀粉含量的测定酶-酶淀粉液化和糖化方法被用于测定总淀粉含量。在通常的分析中，2g干样品被放入100ml科耳劳奇瓶(Kohlraucshflask)并且加入45mlpH7.0的MOPS缓冲液。浆体被充分搅拌30分钟。加入1.0mlSPEZYMEFRED(1∶50稀释于水中)并加热到沸腾3-5分钟。该瓶被置于压热器中，维持在121℃下15分钟。在压热后，该瓶被置于95℃水浴中并加入1ml1∶50稀释的SPEZYMEFRED温育45分钟。调节pH到pH4.2，而温度降到60℃。随后加入20ml醋酸盐缓冲液，pH4.2。通过加入1.0ml1∶100稀释的OPTIDEXL-400(来自GenencorInternationalInc.的葡糖淀粉酶)进行糖化，于60℃持续温育18小时。于95℃加热10分钟终止酶反应。使用葡萄糖作为标准品，通过HPLC分析，测定总糖组成。来自在室温下无酶处理的样品的水抽提物的可溶淀粉水解产物从总糖中被减去。残留淀粉碘试验醪(beer)(发酵肉汤)样品在2ml塑料离心管中离心。滗出上清液，含有粒状沉淀的管被置于冰浴中。将几滴0.025N碘溶液(0.1N碘，来自VWR目录号VW3207-1稀释4X)加入该粒状沉淀并混合。阳性(+)淀粉显示从蓝色到紫色的颜色范围，并且颜色强度与淀粉浓度成正比例。阴性结果(-)保持淡黄色。总蛋白分析使用Kieldhal法(AmericanAssoc.CerealChemists(AACC)，(1983)，Methods22B608thEd.StPaul，MN)，测定样品配制物中的总氮(N)。蛋白质含量用6.25×总氮计算。乙醇和糖类测定使用HPLC法测定样品中乙醇和糖类组成，如本文所述a)使1.5mLEppendorf离心管装满发酵罐醪并在冰上冷却10分钟b)将该样品管在Eppendorf台式离心机(Eppendorftabletopcentrifuge)中离心1分钟；c)将0.5mL上清液样品转移到含0.05mLKill溶液(1.1NH2SO4)的测定管中并使其静止5分钟；d)向测定管样品中加入5.0mL水，然后通过0.45μmNylonSyringeFilter过滤到HPLC瓶中；和e)在HPLC上运行。HPLC条件a)乙醇系统柱PhenomenexRezexOrganicAcidColum(RHM-单糖)#00H-0132-KO(等价于Bio-Rad87H)柱温60℃流动相0.01NH2SO4流速0.6mL/min检测器RI注射体积20μLb)糖类系统柱PhenomenexRezexCarbohydrate(RCM-单糖)#00H-0130-KO(等价于Bio-Rad87H)柱温70℃流动相纳米纯DIH2O流速0.8mL/min检测器RI注射体积10μL(3％DS材料)该柱基于糖的分子量分离，所述糖被指为DP1(单糖)；DP2(二糖)；DP3(三糖)和DP+4(具有大于3的聚合度的寡糖)。如下制备用在实施例7-12中的asaA。在表达asaA的里氏木霉(根据实施例2和3制备)发酵结束时，通过离心分离生物材料，使用10,000分子量截留超滤膜浓缩澄清培养物滤液。具有(90SSU/g)的超滤浓缩物被使用。如下制备用在实施例7-12中的葡糖淀粉酶使用如在USP3,249,514中描述的经选择的黑曲霉真菌菌株。发酵后，使用包括过滤和离心的常规分离方法分离真菌菌丝体。通过在5℃下超滤，浓缩澄清滤液达到规定活性。实施例1克隆白曲霉酸稳定性α淀粉酶基因从白曲霉菌丝体过夜培养物中提取基因组DNA。根据制造商对真菌的指示，使用FastDNAKit(QbioGene，Carlsbad，CA)SPINTM方案。对于匀浆，样品在FastPrepInstrument上以速度4.0被处理30秒。在A.Kaneko，etal.(Kanekoetal.，(1996)，J.FermBioeng81292-298)的asaA序列的基础上设计PCR引物。正向引物包含用于定向克隆到pENTR/D载体(Invitrogen)的基序。α6引物的序列是CACCATGAGAGTGTCGACTTCAAG(SEQIDNO.6)，Akaa3引物的序列是CTACCTCCACGTATCAACCAC(SEQIDNO.7)。通过凝胶提取(GelPurificationkit，Qiagen)纯化2.36kbPCR产物，并根据InvitrogenGateway系统的方案克隆入pENTR/D。然后，载体被转化进化学感受态Top10大肠杆菌(E.coli)(Invitrogen)，带有卡那霉素选择。用限制性酶消化来自几个克隆的质粒DNA，确认正确大小插入片段。从几个克隆对α淀粉酶基因插入片段(SEQIDNO1)进行测序(Sequetech，MountainView，CA)。来自1个克隆的质粒DNA，pENTR/DAkaa#11，被加入到与pTrex3g/amdS目标载体DNA的LR克隆酶反应(clonasereaction)中(InvitrogenGateway系统)。在LR克隆酶反应中，重组使目标载体的CmR和ccdB基因替换为来自pENTR/D载体的白曲霉asaA。该重组在目标载体的cbhl启动子和终止子之间定向插入asaA。48和80bp的重组位点序列分别保持在α淀粉酶的上游和下游。LR克隆酶反应的等分试样被转化进化学感受态Top10大肠杆菌并在羧苄青霉素选择下过夜生长。来自几个克隆的质粒DNA被限制性消化，以确认正确的插入片段大小。用EcoRI消化米自克隆pTrex3g_Akalpha#1的质粒DNA(图4)，释放包括cbhl启动子asaAcbhl终止子amdS表达盒。使用标准技术通过琼脂糖提取纯化该7.8kb的表达盒，并且使之转化到源自公众可得的菌株QM6a的里氏木霉菌株，如下面进一步描述。实施例2里氏木霉的生物射弹转化里氏木霉孢子悬浮液被铺在MABA转化平板的～6cm直径的中心上(150μl5×107-5×108孢子/ml的悬浮液)。然后，该平板在生物排风罩(hood)中被风干。阻挡屏(Stoppingscreens)(BioRad165-2336)和微载体固定器(macrocarrierholders)(BioRad1652322)被浸泡在70％的乙醇中并风干。DriRite干燥剂被置于小培养皿(6cmPyrex)中并被用Whatman滤纸覆盖。该含有微载体(BioRad165-2335)的微载体固定器被平放于滤纸上面，将培养皿盖重新放回去。通过加入60mg钨M-10粒子(微载体，0.7微米，BioRad#1652266)到Eppendorf管中，制备钨粒子悬浮液。加入1ml乙醇(100％)。在乙醇溶液中涡旋(votex)钨并使其被浸泡15分钟。Eppendorf管以最大速度短暂地被微量离心(microfuge)，以沉淀钨。轻轻倒出乙醇并用无菌蒸馏水洗涤3次。在水洗涤液被第三次轻倒出后，钨被重悬在1ml无菌50％甘油中。至少每2周配制新鲜钨。对于每个转化，通过加入25μl悬浮钨到1.5mlEppenderf管而制备转化反应物。随后顺序加入0.5-5μlDNA(Xbal消化的表达盒)、25μl2.5MCaCl2、10μl0.1M亚精胺。该反应物被连续涡旋5-10分钟，保持钨被悬浮。然后，Eppendorf管被短暂地微量离心并轻轻倒出液体。用200μl70％的乙醇洗涤钨粒状沉淀，短暂微量离心沉淀并被倾去液体。用200μl100％的乙醇洗涤沉淀，短暂微量离心沉淀，并被倾去液体。钨沉淀被重悬于24μl100％的乙醇中。Eppendorf管被置于超声水浴中15秒，且8μl等分试验被转移到干燥过的微载体的中心上。该微载体在干培养皿中干燥。He罐被打开到1500psi。1000psi可裂膜(rupturediscs)(BioRad165-2329)被用在ModelPDS-1000/HeBiolisticParticleDeliverySystem(BioRad)。当钨溶液是干的，阻挡屏和微载体固定器被插入PDS-1000。含有靶里氏木霉孢子的MABA板被置于阻挡屏以下6cm。29英寸Hg的真空度被加到室上并被保持。HeBiolisticParticleDeliverySystem(氦生物弹射粒子输送系统)开枪。使该室通风，并且MABA被移出以于28℃培养直至菌落出现(5天)。对于这个实施例2，下面的溶液被配制，改性amds生物射弹琼脂(MABA)每升部分I，在500mldH2O中制备1000×盐1ml高质量琼脂20gpH达6.0，高压灭菌部分II，在500mldH2O中制备乙酰胺0.6gCsCl1.68g葡萄糖20gKH2PO415gMgSO4·7H2O0.6gCaCl2·2H2O0.6gpH达4.5，0.2微米过滤除菌；放入150℃烘箱中温热，加到琼脂上，混合，倒板。室温下保存。1000×盐每升FeSO4·7H2O5gMnSO4·H2O1.6gZnSO4·7H2O1.4gC0Cl2·6H2O1g加到1LdH2O0.2微米过滤除菌实施例3里氏木霉的PEG介导原生质体融合转化将孢子萌发菌丝体(在Difco马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)上于30℃生长5天)的1-2cm2琼脂块(agarplug)接种到250ml、4挡板摇瓶中的50mlYEG(5g/L的酵母提取物，其中含20g/L葡萄糖)液体培养基中，并以200rpm于30-37℃温育16-20小时。通过将摇瓶内容物转移进50ml锥形管中并以2500rpm旋转10分钟来回收菌丝体。上清液被丢弃而菌丝体沉淀被转移到250ml、0.22mCA或PESCorning过滤瓶中，该过滤瓶含有40ml过滤过的β-D葡聚糖酶溶液。该溶液在30℃下以200rpm被温育2小时，以产生原生质体。原生质体通过过滤收集，经过无菌Miracloth(CalBiochem，LaJolla，CA)，进入50ml锥形管中。通过以2000rpm离心5分钟，沉淀原生质体，并且丢弃上清液。用50ml1.2M山梨醇洗涤原生质体沉淀1次；离心(2000rpm，5分钟)并丢弃上清液。用25ml山梨醇/CaCl2洗涤沉淀。使用血球计对原生质体进行计数，然后通过以2000rpm离心5分钟而被沉淀。丢弃上清液，并将原生质体沉淀重悬于山梨醇/CaCl2中，该山梨醇/CaCl2的体积足以产生原生质体浓度为1.25×108/ml的原生质体溶液。对于每一转化，20μg等分试样的表达载体DNA(体积不大于20μl)被转移到冰上的15ml锥形管中。原生质体悬浮液(200μl)和50μlPEG溶液被加到每一管中。这被缓慢混合并在冰上孵育20分钟。PEG(2ml)溶液被加到每一转化管中并在室温下孵育5分钟。4ml山梨醇/CaCl2溶液被加入到每一管中(总体积6.2ml)并被缓慢混合。然后，2ml转化混合物被加入到3个熔融(50℃)的上层琼脂管中的每一个。每一上层琼脂混合物被倒在单独的转化板上并于30℃培养4至7天。对于用amdS选择的转化，乙酰胺/山梨醇板和上层琼脂被使用。选择板与转化板相同，但不含山梨醇。推定的转化体通过转移分离的克隆到新鲜的含乙酰胺的选择培养基中而被纯化。培养基和溶液被如下配制。1)40mlβ-D-葡聚糖酶溶液-在40ml1.2M山梨醇中溶解600mgβ-D-葡聚糖酶(InterSpexProductsInc.，SanMateo，CA)和400mgMgSO4·7H2O。2)200mlPEG混合物-在200mldlH2O中溶解50gPEG4000(BDHLaboratorySuppliesPoole，England)和1.47gCaCl2·2H2O。每月新鲜配制。3)山梨醇/CaCl2溶液-在1.2M山梨醇中溶解50mMCaCl2。4)乙酰胺/山梨醇琼脂-部分I-在200mldlH2O中溶解了0.6g乙酰胺(Aldrich，99％升华)、1.68gCsCl、20g葡萄糖、20gKH2PO4、0.6gMgSO4·7H2O、0.6gCaCl2·2H2O、1ml1000×盐(参见下面)，调节pH到pH5.5，用dH2O使体积达到300毫升，并过滤除菌。部分II-20g高质量琼脂和218g山梨醇被加到lL量筒中，用dlH2O使体积达到700毫升，并高压灭菌。部分II被加到部分I，得到1L的最终体积。5)1000×盐—混合5gFeSO4·7H2O、1.6gMnSO4·H2O、1.4gZnSO4·7H2O、1gCoCl2·6H2O，并用dlH2O使体积达到1L。过滤除菌。实施例4黑曲霉的PEG介导原生质体融合转化从孢子萌发黑曲霉板取出2cm2琼脂块，接种到250ml、4挡板摇瓶中的50mlYEG(5g/L含20g/L葡萄糖的酵母抽提物)液体培养基中。将琼脂块以200rpm于30-37℃培养16-20小时，菌丝体通过无菌Miracloth滤器被收集并且用溶液A(SolutionA)洗涤。洗涤过的菌丝体被无菌转移到40ml原生质体化溶液(protoplastingsolution)中并于30℃以200rpm培养1-2小时，原生质体化进展被显微监测。原生质体化反应物通过无菌Miracloth被过滤到2个50ml无菌一次性离心管中并用溶液B(SolutionB)使每一管的体积达到45毫升。在2500rpm下离心原生质体5分钟，以获得沉淀，并丢弃上清液。用20ml体积的溶液B又洗涤沉淀2次。该沉淀被重悬在10ml的溶液B中，并使用血球计进行计数。原生质体被再次离心并丢弃上清液。原生质体被重悬在溶液B中，以获得～1×107/100μl。在冰上，100μl原生质体溶液被加入到预冷的15ml管中，每一转化一管。10μgDNA以不超过10μl的体积被加入。加入溶液C(12.5μl)，缓慢混合，并在冰上孵育20分钟。MMS上层琼脂(每一转化3管各10ml)被熔融并保持在55℃。从冰上移走原生质体并且溶液C(1ml)和溶液B(2ml)被加入到被每个管中并缓慢混合所述管。1ml原生质体混合物被加入到3个上层琼脂管中的每一个并且所述上层琼脂被倒在MMS板上。对于每一转化，这被重复，并且板于30℃被孵育4-7天。溶液A(SolutionA)(每500ml)-0.44gK2HPO4、0.34gKH2PO4、48.156g无水MgSO4(FW120.37)；以及加入dlH2O，达到500ml的最终体积，pH5.5。过滤除菌并在室温下储藏。原生质体化溶液-在40ml溶液A中溶解了180单位β-D-葡聚糖酶(InterSpexProducts，Inc)。0.2微米，过滤除菌。溶液B(SolutionB)(每500ml)-5ml1MTris，pH7.5；2.77gCaCl2(FW110.99)；109.32g山梨醇(FW182.2；1.2M)；以及加入dlH2O，达到500ml的最终体积。过滤除菌并在室温下储藏。溶液C(SolutionC)(每500ml)-250gPEG4000；2.77gCaCl2；5ml1MTris，pH7.5；以及加入dlH2O，达到500ml的最终体积。过滤除菌。MMS琼脂*-在1LdlH2O中溶解6g/LNaNO3；0.52g/LKCl；1.52g/LKH2PO4；218.5g/LD-山梨醇；1ml/L痕量元素(参见下面)；10g/L琼脂(上层琼脂中的低熔点琼脂糖)。高压灭菌。灭菌后，无菌加入到10ml50％葡萄糖和1.25ml20％MgSO4·7H2O中。*表示amdS选择，用0.59g/L乙酰胺和3.4g/LCsCl代替MMS中的硝酸盐。痕量元素溶液在250mldlH2O中溶解，1g/LFeSO4·7H2O8.8g/LZnSO4·7H2O0.4g/LCuSO4·5H2O0.15g/LMnSO4·4H2O0.1g/LNa2B4O7·10H2O50mg/L(NH4)6Mo7O24·4H2O混合并加入0.2ml浓HCl以溶解。用dlH2O使体积达到1L。过滤除菌。实施例5用asaA基因转化的里氏木霉的发酵和在里氏木霉克隆中的活性测定一般地，遵照Foremanetal.(Foremanetal.(2003)J.Biol.Chem27831988-31997)中所述的发酵步骤。更具体地，对于图5所示菌株的每一个，进行重复发酵试验。将0.8L含有5％葡萄糖的Vogels基本培养基(Davisetal.，(1970)METHODSINENZYMOLOGY17A，第79-143页和Davis，Rowland，NEUROSPORA，CONTRIBUTIONSOFAMODELORGANISM，OxfordUniversityPress，(2000))接种1.5ml冷冻孢子悬浮液。48小时后，每一培养物被转移到在14LBiolafitte发酵罐中的6.2L相同培养基中。该发酵罐在每分钟8标准升的空气流下于25℃以750PRM运行。初始葡萄糖被消耗完后1小时，25％(w/w)乳糖进料被启动并且以碳限制模式进料，以防止乳糖堆积。分别使用葡糖氧化酶测定试剂盒或带有加入的以切割乳糖的β-半乳糖苷酶的葡糖己糖激酶测定试剂盒，监测葡萄糖和乳糖的浓度(InstrumentationLaboratoryCo.，Lexington，MA)。定期取样，以监测发酵进展。收集的样品在InternationalEquipmentCompany(NeedhamHeights，MA)医用离心机上于50ml离心管中以3/4速度旋转。在具有MOPS(吗啡啉丙磺酸)SDS运行缓冲液(runningbuffer)和LDS样品缓冲液的还原条件下，使样品上清液进行4-12％BIS-TRISSDS-PAGE凝胶试验(图5)。实施例6天然和重组的具有GSH活性的白曲霉酸稳定性α淀粉酶(asaA)的pH稳定性的比较在pH4.5下用20mM醋酸盐缓冲液将如上所述的重组产生的asaA(Tr-asaA)样品和天然asaA样品稀释到相同的蛋白质浓度。反应在3至7的pH水平下于50℃在100mM柠檬酸/NaOH缓冲液中进行30分钟。1.0mL的反应物被加到样品管中5mL10％玉米淀粉(CargillFoods，MN)中，该玉米淀粉在100mM、pH4.5的醋酸盐中。管于50℃被振荡20分钟。然后，加入0.5mL2.0％NaOH。管被旋转并且使用二硝基水杨酸分析法(DinitoSalicylicAcid(DNS)Assay)(Gotoetal.，(1994)，见上文)测定0.5ml上清液的还原糖。结果被描述在图6中。r-asaA在pH3.9下表现出100％的残余活性。比较之下，n-asaA在pH4.5下表现出100％的残余活性。实施例7在未蒸煮过的整粒粉碎玉米粉(wholegroundcorn)底物的同步糖化发酵(SSF)期间Tr-asaA浓度的影响在来自无细胞培养物滤液的葡糖淀粉酶(GA)的两个水平(0.5和1.0GAU/g)下评价Tr-asaA。百分之三十六的玉米面粉淤浆被制备，其含有干玉米浸渍液(drycornsteep)(占玉米面粉的2.5％)。用稀硫酸调节该淤浆的pH到4.8。淤浆的总干固体是33.85％。在含有100gm醪液(mash)(淤浆)的125ml烧瓶中进行发酵。期望水平的酶被加入，然后，3ml增殖的酵母淤浆被加入，以起动发酵。通过加入0.26gm的干Fali酵母到100gm含有GA活性为0.9GAU/g原材料固体的醪液中，制备酵母接种物。该淤浆被置于32℃的水浴中并缓慢混合约17小时。在不同的时间间隔，取出发酵样品(发酵醪)，进行HPLC分析。72小时后，终止发酵并且发酵醪于60℃干燥，以获得DDGS。测定DDGS的淀粉含量，并且通过加入碘，抽样调查终止发酵后发酵醪中的不可溶固体。在该研究中所使用的酶是黑曲霉GA。表1总结了乙醇水平、醪液固体的碘染和DDGS的淀粉百分比。表1在酵母发酵条件下颗粒玉米淀粉转化成乙醇期间asaA的效应表1中所示的结果证实了Tr-asaA增强葡糖淀粉酶对颗粒玉米淀粉的水解。实施例8通过葡糖淀粉酶和α淀粉酶的颗粒淀粉底物的转化在0.5GAU/gds的葡糖淀粉酶存在下，在同步糖化发酵条件下，不同来源的商业α淀粉酶被与Tr-asaA比较。使用在前所述的可溶性淀粉底物(solublestarchsubstrate(SSU))法试验，测定商业α淀粉酶的活性。表2**表示重组菌使用如实施例7所述的整粒粉碎玉米进行乙醇发酵。来自表2所列来源的α淀粉酶以每克整玉米1.0SSU被加入，并且葡糖淀粉酶以0.5GAU/g被加入。在发酵过程期间，取样并分析乙醇含量(图7)。在发酵之后，不可溶固体(DDGS)被分离并且玉米醪液的残留淀粉含量在pH5.0下被测定。结果总结于表3中。表3平均(Ave)％v/vEtOH表3中的结果清楚地显示出Tr-asaA在帮助葡糖淀粉酶在使用酵母的乙醇发酵条件下水解颗粒淀粉中是非常有效的。另外，如从表中所观察，在使用本发明的酶组合时，在发酵中所产生的乙醇百分比(18.44)较大；并且DDGS中残留淀粉百分比(9.0)显著较低。实施例9在使用Tr-asaA的乙醇发酵中整粒磨碎小麦(wholegroundwheat)的评价干玉米浸渍液被以基于整粒磨碎小麦重量为2.5％被加入到36％整粒磨碎小麦淤浆中。在含有100gm醪液的125ml烧瓶中进行发酵。用稀硫酸将淤浆的pH调到4.8。醪液被稀释到33.85％ds的终浓度。葡糖淀粉酶(0.5GAU/g磨碎小麦)和asaA(1.0SSU/g整粒磨碎小麦)被加到醪液中。随后加入3.0ml繁殖的酵母，以起动发酵。通过加入0.26gm的干Fall酵母到100gm的醪液中，制备酵母接种物。在温和搅拌的同时于32℃水浴中进行发酵。在不同的时间间隔取出发酵培养基(发酵醪)，离心，以进行糖类组成和乙醇的HPLC分析(表4)。表4用于乙醇生产的酵母发酵中的整粒磨碎小麦颗粒淀粉实施例10底物处理对乙醇产量和含固体干酒糟(DDGS)组成的影响对于燃料醇发酵，使用锤磨机，使整玉米底物经受常规的干滚工艺，以减小颗粒大小。制备3种不同的醪液。处理1(Treatment1(Trt1))是高温处理，其包括根据现有技术步骤，通过喷射蒸煮(jetcooking)，在pH5.6下，用3.5U/gSPEZYMEETHYL分批液化36％ds的、含有0.9％干玉米浸渍液(drycornsteep(DCS))的玉米面粉。该淤浆被置于90℃的浴中1.5小时，混合，然后冷却到30℃，用稀硫酸将pH调节到5.0。用水进一步稀释淤浆到32.71％ds。处理2(Treatment2(Trt2))是低温处理。通过于60℃，用稀硫酸将pH调节到5.0，温育36％ds的、含有0.9％DCS的玉米面粉3小时而制备醪液。在温育之前，加入0.05GAU/g葡糖淀粉酶。处理3(Treatment3(Trt3))是室温处理—在将玉米淤浆用在与0.5GAU葡糖淀粉酶/g玉米和1.0SSU/g玉米的Tr-asaA的发酵之前，在室温下获得玉米淤浆。然后，对每一处理进行如实施例7所述的酵母发酵。在发酵后，测定乙醇产量并通过离心分离每一处理的不可溶固体，于60℃干燥，并且测定总糖类含量和氮含量。结果在表5中被说明，其中Trt3是本发明包括的方法。表5在使用酵母的乙醇发酵条件下整玉米的不同处理的乙醇产量和DDGS组成的比较如从表5示出的结果所观察到，根据本发明的方法(Trt3)所处理的DDGS中的残留淀粉百分比小于得自现有技术处理(Trt1)或低温处理(Trt2)的残留淀粉百分比。值是3.5％(Trt3)，相对于Trt1和Trt2的4.8％或3.8％。相比于现有技术处理(Trt1)，根据本发明的Trt3所产生的DDGS的总蛋白含量和乙醇的量较高。实施例11颗粒玉米淀粉与纯化的白曲霉α淀粉酶和纯化的黑曲霉葡糖淀粉酶的温育酶纯化采用使用AkTA(AmershamPharmacia，Biotech.，NJ)的制备型高压液相色谱(HPLC)法，黑曲霉葡糖淀粉酶(GA)和白曲霉α淀粉酶(AkAA)都从培养物滤液被纯化。在典型的试验中，使用离心柱(Bio-Rad，CA)，用10mMMES缓冲液(pH5.75)使两个粗酶样品脱盐，以降低电导率。使样品达到2MNH4SO2。上样到Q-Sepharose柱(Amersham，Biosciences，NJ)并用20mMMES缓冲液(pH5.75)稀释，使用1.5MKCl梯度。具有相应活性的部分被合并在一起并被浓缩，用于进一步的试验。颗粒玉米淀粉和纯化酶温育纯化酶制备物被如下加入到0.1M醋酸盐缓冲液(pH4.5)中的4.0％颗粒玉米淀粉(Cargill，Minneapolis，MN)，用于扫描电子显微镜(SEM)分析。在32℃下孵育0.5GAU/g玉米淀粉的纯化GA、1.0SSU/g淀粉的纯化AkAA和组合的GA和AkAA并温和搅拌。在2、4和8小时的时间间隔时取出等分试样(0.75ml)，离心并且通过上面的实施例中所述的方法测定可溶性糖。沉淀被重悬于蒸馏水(5ml)并被离心。沉淀再次重悬于5ml无水乙醇(99％)中，搅拌以均匀混合并离心。醇处理的沉淀在管中被风干并用于SEM分析。SEM分析约200μl干体积被转移到1.5mlEppendorf管并且加入0.8ml无水乙醇。组分被涡旋以制备淀粉颗粒悬浮液。几滴悬浮液被置于刚清洁过的玻璃盖片上并被风干。碳粘合胶片(carbonadhesivetabs)将盖片安放在样品台上，用胶体银粘合剂(ElectronMicroscopySciences，Ft.Washington，PA)在盖片四周围围涂抹并在ScanCoatSixSputterCoater(EdwardsHighVacuumIntl.Crawley，UK)上用薄层金涂覆。使用Quanta200FEG扫描电子显微镜(FEIInc.，Hillsboro，Ore)，在1,000和5,000×的仪器放大倍率下，在二级电子成像模式下于5kv下进行扫描电子显微术。从样品台上不同的区域获得8到10个图像。单独或结合的酶处理对于颗粒玉米淀粉的影响在图8和9中被说明。水解和显微检查图8说明了还原糖(mg/ml还原当量)，其被测定为4小时后所释放出的葡萄糖，所述释放出的葡萄糖是AkAA和GA的颗粒淀粉水解的结果。单独使用葡糖淀粉酶的颗粒淀粉的降解是4.9mg/ml；单独使用AkAA的颗粒淀粉的降解仅仅是0.3mg/ml。然而，使用GA和AkAA组合的颗粒淀粉降解是12.1mg/ml。组合酶的降解值说明了协同相互作用。其显著大于酶的加和值。使用扫描电子显微镜观察如这个实施例所述处理的淀粉颗粒。如图9所示，与纯化AkAA孵育的玉米淀粉颗粒确实显示出较小的表面改变。这些被观察为针刺小孔。与纯化GA孵育的玉米淀粉颗粒显示出许多小的有限范围的深孔。显著地，与GA和AkAA组合孵育的玉米淀粉颗粒显示出无数宽的和深的穿透腔。另外，在与GA和AkAA组合孵育的颗粒中观察到暴露了颗粒中心的层化结构的表面腐蚀。实施例12颗粒玉米淀粉淤浆的干固体百分含量对乙醇产量的影响用水使玉米面粉浆化，获得36％ds的醪液(mash)。在用硫酸将pH调节到4.5之前，小量玉米浸渍液(淤浆(slurry)的0.2％)被与400ppm(0.04％)脲一起被加入到醪液中。淤浆的干固体含量从20至36％ds被调节。在含有总共100g醪液的125ml烧瓶中进行发酵。酶被稀释，使得对于每一种酶使用恒定体积0.5ml。每一烧瓶与3ml酵母孵育，酵母在使用前繁殖17小时。酵母繁殖步骤包括在32℃水浴中温和混合时将0.5％干Fali酵母加入到含0.5GAU/gGA和1.5SSU/gAkAA的25％ds醪液中。在约24小时的时间间隔下于60℃干燥发酵醪样品，以获得DDGS。表6DS含量对在75小时下乙醇产量和DDGS中残留淀粉的影响几乎所有在发酵期间产生的葡萄糖(DP-1)都被转化成乙醇，除了在高固体下(数据未示出)。对于每一个测试的％DS，AkAA增加了乙醇的速率和量。图10A总结了在每一固体水平下的最终乙醇水平，而图10B显示了对于每一固体水平，相对于醪液固体，使用AkAA的乙醇增加百分比。两个图证实了AkAA对水解颗粒淀粉尤其在高固体百分含量下具有正面效应。在图10A中还观察到，当溶解的固体增加，有AkAA和无AkAA的残留淀粉的差别也增加。如在图10B所观察到，当玉米淤浆中％ds增加时，AkAA对乙醇产量的影响也增加。表6和图11的结果清楚显示了在本发明的方法中使用AkAA和GA组合物的益处。在所有情况下，当AkAA与GA结合使用时，DDGS中的淀粉百分比下降，并且进一步地，当相比于未添加AkAA的DDGS中的淀粉百分比时，在来自具有高至36％的％ds的玉米淀粉底物的DDGS中发现的淀粉百分比被减半。权利要求1.颗粒淀粉水解酶组合物，包括a)具有颗粒淀粉水解活性的、并与氨基酸序列SEQIDNO3具有至少90％的序列同一性的酸稳定性α淀粉酶(asAA)；和b)葡糖淀粉酶。2.权利要求1所述的酶组合物，其中所述asAA与葡糖淀粉酶活性的比率为10∶1至1∶10。3.权利要求2所述的酶组合物，其中所述asAA与葡糖淀粉酶活性的比率为5∶1至1∶5。4.权利要求3所述的酶组合物，其中所述asAA与葡糖淀粉酶活性的比率为4∶1至1∶2。5.权利要求1所述的酶组合物，其中所述asAA在木霉属(Trichoderma)宿主中产生。6.权利要求5所述的酶组合物，其中所述木霉属宿主是里氏木霉(T.reesei)。7.权利要求1所述的酶组合物，其中所述asAA与SEQIDNO3有至少95％的序列同一性。8.权利要求7所述的酶组合物，其中所述asAA与SEQIDNO3有至少98％序列的同一性。9.权利要求1所述的酶组合物，其中所述酶组合物，在合适的发酵条件下，在发酵中被同时与颗粒淀粉底物淤浆和产乙醇微生物混合，以产生醇。10.权利要求9所述的酶组合物，其中所述颗粒淀粉底物得自玉米、小麦或者水稻。11.权利要求10所述的酶组合物，其中其中所述颗粒淀粉底物得自玉米。12.权利要求1所述的酶组合物，其中所述葡糖淀粉酶从黑曲霉(Aspergillusniger)菌株产生。13.权利要求1所述的酶组合物，进一步包括第三种酶。14.权利要求13所述的酶组合物，其中所述第三种酶选自蛋白酶、支链淀粉酶和纤维素酶。15.颗粒淀粉水解酶组合物，包括具有颗粒淀粉水解活性、并与氨基酸序列SEQIDNO3有至少90％的序列同一性的酸稳定性α淀粉酶(asAA)。16.发酵培养基，包括从木霉属(Trichoderma)细胞的培养物中产生的具有颗粒淀粉水解活性的酸稳定性α淀粉酶(asAA)，所述木霉属细胞包括编码与SEQIDNO3具有至少90％的序列同一性的asAA的异源多核苷酸。17.权利要求16所述的发酵培养基，其中所述木霉属细胞是里氏木霉(T.reesei)。18.权利要求16所述的发酵培养基，其中所述多核苷酸编码与SEQIDNO3具有至少95％序列同一性的asAA。19.在丝状真菌宿主细胞中产生具有颗粒淀粉水解(GSH)活性的酸稳定性α淀粉酶(asAA)的方法，包括a)用DNA构建物转化丝状真菌宿主细胞，所述DNA构建物包括在所述丝状真菌宿主细胞中具有转录活性的启动子，所述启动子可操纵性连接到编码具有GSH活性并与SEQIDNO3具有至少90％的序列同一性的asAA的异源多核苷酸，b)在合适的培养基中培养所述转化的丝状真菌宿主细胞，以允许所述asAA的表达，和c)产生所述asAA。20.权利要求19所述的方法，进一步包括回收所产生的asAA。21.权利要求19所述的方法，其中所述丝状真菌宿主细胞是木霉属(Trichoderma)细胞。22.权利要求21所述的方法，其中所述木霉属细胞是里氏木霉(T.reesei)细胞。23.权利要求19所述的方法，其中所述asAA与SEQIDNO3具有至少95％的序列同一性。24.根据权利要求21获得的木霉属细胞。25.作为终产物的乙醇的生产方法，包括使权利要求1所述的酶组合物与颗粒淀粉底物组合；并且，在合适的发酵条件下、并于25至40℃的温度下，同时用产乙醇微生物发酵以及产生乙醇。26.权利要求25所述的方法，进一步包括回收所述乙醇。27.作为终产物的乙醇的生产方法，包括同期使权利要求15所述的酶组合物与颗粒淀粉底物和葡糖淀粉酶组合；并且，在合适的发酵条件下，同时用产乙醇微生物发酵以及产生乙醇，所述合适的发酵条件包括25℃至40℃的温度。28.权利要求27所述的方法，进一步包括回收所述乙醇。29.作为终产物的醇的生产方法，包括使颗粒淀粉底物与i)葡糖淀粉酶；ii)具有颗粒淀粉(GSH)活性并与SEQIDNO3有至少90％的序列同一性的酸稳定性α淀粉酶(asAA)，和iii)微生物在合适的发酵条件下在一步中接触，以获得具有5至30％的醇的发酵培养基，其中所述发酵是在20℃至60℃的温度下进行。30.权利要求29所述的方法，其中所述温度是25℃至40℃。31.权利要求29所述的方法，进一步包括从所述发酵培养基中分离所述醇。32.权利要求31所述的方法，进一步包括从所述分离步骤获得釜馏物副产物。33.权利要求32所述的方法，进一步包括再循环步骤，其中所述釜馏物的成分被再循环用于另一个发酵循环中。34.权利要求32所述的方法，其中所述釜馏物被分离成可溶性成分和不溶性成分。35.权利要求29所述的方法，其中所述颗粒淀粉底物得自玉米、小麦或水稻。36.权利要求29所述的方法，其中所述颗粒淀粉底物，在与所述葡糖淀粉酶和asAA接触之前，被浆化；并具有20％至45％的干固体含量。37.权利要求36所述的方法，其中所述干固体含量是30％至40％。38.权利要求29所述的方法，其中来自所述颗粒淀粉底物的淀粉固体的至少50％是在2至100小时后被水解。39.权利要求29所述的方法，其中在所述发酵中使用的葡糖淀粉酶的量是0.01至5.0GAU/g。40.权利要求29所述的方法，其中在所述发酵中使用的asAA的量是0.1至5.0SSU/g。41.权利要求29所述的方法，其中所述微生物是乙醇生产微生物。42.权利要求41所述的方法，其中所述乙醇生产微生物是酵母。43.权利要求29所述的方法，其中所述醇终产物是乙醇。44.权利要求43所述的方法，其中所产生乙醇在5％至20％之间。45.从颗粒玉米淀粉底物生产乙醇的方法，包括在合适的发酵条件下，使颗粒玉米淀粉淤浆与i)葡糖淀粉酶；ii)具有颗粒淀粉(GSH)活性并与SEQIDNO3有至少90％的序列同一性的酸稳定性α淀粉酶(asAA)，和iii)产乙醇微生物在一步中于25-40℃的温度下发酵，以获得具有5至20％的乙醇的发酵培养基。46.权利要求45所述的方法，其中测量为活性的asAA与GA比率为10∶1至1∶10。47.权利要求46所述的方法，其中测量为活性的asAA与GA比率为5∶1至1∶5。48.权利要求45所述的方法，其中所述颗粒玉米淀粉具有25-40％的干固体含量(ds)。49.权利要求45所述的方法，进一步包括从所述发酵培养基中分离所述乙醇。50.降低含固体干酒糟(DDGS)中残留淀粉含量的方法，包括根据权利要求29所述的方法产生醇、从发酵培养基中分离所述醇从而得到釜馏物、以及将所述釜馏物转化成DDGS。51.权利要求50所述的方法，其中所述颗粒淀粉底物具有约25％至40％的ds。52.权利要求50所述的方法，其中在所述DDGS中的所述残留淀粉含量为15％以下。53.权利要求50所述的方法，其中所述颗粒淀粉底物是来自玉米。全文摘要本发明涉及颗粒淀粉水解酶组合物，其包括具有颗粒淀粉水解活性的酸稳定性α淀粉酶(asAA)。本发明还涉及用于产生醇的一步法，其包括使颗粒淀粉底物与具有颗粒淀粉水解(GSH)活性的酸稳定性α淀粉酶(asAA)和葡糖淀粉酶(GA)在发酵步骤中接触，以获得具有5％至20％的乙醇的发酵培养液，所述发酵步骤在25至40℃的温度下还包括产乙醇微生物。文档编号C12N9/34GK1981037SQ200480043512公开日2007年6月13日申请日期2004年11月30日优先权日2004年5月27日发明者N·迪恩-科莱曼,O·小兰特罗,J·K·希泰,S·E·兰茨,M·J·佩普森申请人:金克克国际有限公司