专利名称：具有改善稳定性的新的合成的异水蛭素的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的合成的异水蛭素，由于在Asp-Gly基链区段的交换作用，因此它具有改善的稳定性。这一方面使生产时产率增加，另一方面可以制备待用的可直接注射的溶液剂药物制剂。
已知可由水蛭中得到具有医疗价值的对凝血酶有高亲和力的抑制剂，它可用作人的治疗药，人们期望血栓形成的治疗有重大的进展。这些肽类抑制剂称作水蛭素，并且已知有许多种天然的异水蛭素，它们只是在序列中有几个氨基酸不同。天然异水蛭素例如在EP-A142860，EP-A158564，E-A158986，EP-A168342，EP-A171024，EP-A193175，EP-A200655，EP-A-209061，EP-A-227938中已有叙述。过去十年中DNA重组技术的进展有可能使用经遗传操作加以修饰的微生物以工业规模制备水蛭素。例如在EP-A171024和EP-A200655有其引用的文献中叙述了根据天然序列制备异水蛭素的方法。
然而，现今一个药物要满足的条件远远超过治疗活性。这些条件包括制造的费用，临床应用的方便和长期使用时有较高的稳定性。
为了使改进的治疗能够有利于广大患者，其中包括经济费用，必须使该药物制造的费用较低。对于遗传工程产物，可通过开发优化的表达系统来实现，但也要使药物适合于该表达系统。异水蛭素在这方面的结构优化，叙述于例如EP-A324712和EP-A448093。
长期使用的药物应考虑其有较高的稳定性，以避免生成的分解产物引起治疗学和药理上的并发症。由水蛭中已知的异水蛭素和从经遗传操作修饰的微生物得到的脱硫水蛭素，在这方面是令人不满意的，由于它们在结构上内部发生化学变化，易于生成副产物。从制造过程的经济观点看，预先能杜绝副产物的生成是有利的，因为无需将其除去。这就会使产率提高。
改善稳定性还可以使制剂能够贮存并可将用药费用降到最低程度。在水蛭素的情况下，稳定的、可直接注射的随时可用的溶液剂还应当有长期可利用性这一特点。在这一点上，已知的异水蛭素的化学不稳定性事实上是个限制因素，因为溶解后的物质受温度影响形成副产物，即使贮存在冰箱中，这种制剂也只能在有限的(短)期间应用，所以很难达到经济的目的。
已知的天然异水蛭素和在药物开发中由它得到的脱硫水蛭素，只是在几个氨基酸单元上有区别，因此可以把氨基酸序列中的易变区段和保守区段区分开。保守区段包括的序列是-Ser32-Asp(Asn)33-Gly34-和-Asn52-Asp(Asn)53-Gly54-Asp55-。该编号是Dodt等在FEBS LETTERS.165(1984)180-183中发表的含有65个氨基酸的序列。水蛭素分解产物的蛋白质化学分析现已表明，这些序列的基链主要支配着水蛭素的化学不稳定性。在这个意义上不需要考虑天冬酰胺脱酰胺生成天冬氨酸的作用，因为这生成另一种天然的异水蛭素。水蛭素分解的实质是在两个-Asp-Gly顺序上的异构化和消旋化作用。由文献中已知蛋白质分解时这些反应的重要性(JBC262，1987，785-793页和JBC264，1989，6164-6170页))。同样水蛭素的羧基端结构对于它与凝血酶的高亲和力结合的重要意义也是已知的。在序列中具有保守性质并且参与结合的区段处的氨基酸交换，会有丧失亲和力的危险。现在令人惊奇地发现，可以在保守区段进行一些改善稳定性的修饰，而不减弱对凝血酶的亲和力，因而不会减低活性(实施例7，表1和实施例8，表2)。
另外，还有令人惊奇的情况，即尽管进行了氨基酸的交换，甚至不止一个，仍不会增加抗原性。
此外，还发现两个-Asp-Gly-序列对水蛭素的不稳定性产生相同的影响。只要改变这两个序列区段，就可显著地减低副产物的生成(实施例9，表2)。
在酸性条件(实施例11，图3)和生理pH条件(实施例10，图4)下，母体化合物和优化的脱硫水蛭素形成副产物的时间过程表明，氨基末端对稳定性无影响，因而对它的改变无助于稳定化作用。从上述情况可以看出，实例〔Vla1，Thr2〕脱硫水蛭素所显示的优化作用可适用于具有不同的氨基末端的异水蛭素(例如〔Val1，Aal2〕-和〔Ile1，Thr2〕-脱硫水蛭素。
然而，深入地分析各种合成的异水蛭素的稳定性显示，对于像〔Ala1，Thr2，Glu33，Glu53〕脱硫水蛭素，只改换天冬氨酸并没有最佳的作用，〔Ala1，Thr2，Glu33，Gln52，Glu53，Ala54〕-脱硫水蛭素和〔Ala1，Thr2，Glu33，Glu52，Glu53，Glu55〕-脱硫水蛭素的优良的稳定性令人惊奇地表明，在52位用谷氨酰胺改换掉天冬酰胺，对稳定化作用具有重要的作用。
因此，本发明涉及具有改善了稳定性的异水蛭素，其中，在33位为Glu，52位为Gln，Glu，Asn或Asp，53位为Glu，54位为Gly或Ala，55位为Glu或Asp。
优选的化合物为式Ⅰ10A1-A2-Tyr-Thr-Asp-Cys-Thr-Glu-Ser-Gly-Gln-Asn-Leu-Cys20Leu-Cys-Glu-Gly-Ser-Asn-Val-Cys-Gly-Gln-Gly-Asn-Lys-3040Cys-Ile-Leu-Gly-Ser-B-Gly-Glu-Lys-Asn-Gln-Cys-Val-Thr-5052535455Gly-Glu-Gly-Thr-Pro-Lys-Pro-Gln-Ser-His-C-D-E-F60-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln式中 A1是Leu，Ala，Ile或Val，A2是Thr或Val，
B是Glu，C是Gln或Glu，D是Glu，E是Gly或Ala，F是Asp或Glu。
特别优选的化合物是〔Ala1或Leu1，-Thr2，Glu33，Gln52-Glu53-Ala54-〕-脱硫水蛭素和〔Ala1或Leu1，-Thr2，Glu33，Gln52-Glu53，Glu55-〕脱硫水蛭素。
本发明合成的水蛭素衍生物可用微生物或者用化学合成的方法制备，产生菌优先选用面包酵母或大肠杆菌。
优化了的异水蛭素的化学稳定性以及非常有效的表达系统，使得制造方法比较简单和低耗费。在这个意义上，将本身已知的生物化学方法结合起来，会使制造方法相互间略有不同。本发明还涉及这类化合物的衍生物的制备方法。例如〔Ala1，Thr2〕脱硫水蛭素的衍生物可以按欧洲专利申请EP-A448093公布的表达系统制备，该方法只包括几步发酵结束后的细胞悬浮液或无细胞培养物的滤液酸化到pH2-4(例如用甲酸，HCl酸化)，产生的含蛋白质的沉淀可用离心法或过滤方法除去。在最简单的情况下，即可以用培养基时，可用反相层析法自澄清的上清液中高度浓缩产物。另一方面，当用复杂培养基时，减低溶液中盐的含量是有利的，例如用超过滤-透析过滤法，以便后来在阳离子交换剂上进行离子交换层析，例如用Frac-togel
EMD-SO-3。在超过滤时，也可在适宜的树脂上进行疏水吸附，如同例如在欧洲专利申请EP-A316650中所述。由阳离子交换层析得到的产物可直接进入反相层析(例如在Lichroprep
RP18层析柱上)，从而得到高纯产物。如若需要除去遗留的杂质，还可以用另一种阴离子交换层析柱，例如用Q-琼脂糖进行层析。通过对各个步骤适当的优化，收率可超过50%。
当使用欧洲专利申请EP-A316650中所公布的表达系统制备稳定的〔Leu1，Thr2〕-脱硫水蛭素衍生物时，可用类似的方法进行，在这种情况下，在进行阳离子交换层析之前，如在欧洲专利申请EP-A316650中所叙述，经分批的阴离子交换剂步骤进一步浓缩产物是可取的。
实施例1载体pCMT203的构建生物技术操作，例如建立种子细胞库或菌株的发酵最好使所用的宿主/载体系统置于选择压力下进行。这会将外来微生物污染的危险减小到最低程度。根据美国卫生当局的准则，在制备重组蛋白质时不应使用抗生素氨苄青霉素。
在欧洲专利申请EP-A448093中叙述了质粒pCM7051和pCM7053。由已知的对四环素的耐受性扩增载体DNA，可以实现该质粒在上述方面的改进。
为此，用NruI使质粒pCM7051的DNA线性化，并与由质粒pCM7053所得到的1.1KbNruI片段连接。该DNA片段含有从质粒pCM7051中失去的四环素抗性基因的5′-末端部分用连接混合物转化大肠杆菌Mc1061菌株的感受态细胞并涂布在含有12.5mg/l四环素的NA琼脂平板上。于37℃保温过夜后得到转化体。从转化体中再分离出质粒DNA并用限制性内切酶分析加以鉴定。最后将正确质粒的DNA按制造者的说明与酶AvaI和NdeI反应，再用凝胶电泳分级分离。分离出两个片段自我的较大者，用Klenow聚合酶补平末端，然后使片段连接并再转化到大肠杆菌Mc1061中。用限制性内切酶分析鉴定DNA后，得到的质粒称作pCMT203(
图1)。
实施例2N-末端氨基酸为丙氨酸的水蛭素变体的构建以丙氨酸开始的水蛭素变体要在大肠杆菌中表达。在实施例1中叙述的载体pCM7053和pcmT203以及在EP-A171024中叙述的图示3所示的质粒用于克隆过程，该质粒具有合成水蛭素的DNA顺序，称作DNA顺序I，本文以后称此质粒为质粒pK152。此外，用AppliedBiosystems公司的“391DNA合成仪”合成了如下的寡核苷酸Hir15'-CCCGAAACCGCAGTCTCACCAGGAAGGCGAATT-3'Hir25'-CGAATTCGCCTTCCTGGTGAGACTGCGGTTTCGGGGTAC-3'Hir55'-GATCCGAAGGTGAAAAGAACCAGTGCGTTACTGGCGAAGGTAC-3'Hir65'-CTTCGCCAGTAACGCACTGGTTCTTTTCACCTTCG-3'Hir135'-CCCGAAACCGCAGTCTCATAACGAGGGCGACTT-3'Hir145'-CGAAGTCGCCCTCGTTATGAGACTGCGGTTTCGGGGTAC-3'Hir155'-CCCGAAACCGCAGTCTCATCAGGAGGCTGACTT-3'Hir165'-CGAAGTCAGCCTCCTGATGAGACTGCGGTTTCGGGGTAC-3'
实施例2a水蛭素变体13(Ala1，Glu33，Gln52，Glu53，Glu55)在质粒pSCH13中的构建质粒pK152的DNA与酶BamHI和KpnI反应，得到两个片段，用凝胶电泳分离开。分出较大的片段并于T4DNA连接酶反应中与Hir5和Hir6预先杂交成双股的寡核苷酸序列进行连接反应。用连接混合物转化感受态大肠杆菌细胞Mc1061。与此相平行的转化是pK153载体片段进行自我连接并也进行转化。将该转化混合物涂布于含有20mg/l氨苄青霉素的NA平板上，37℃保温过夜。次晨对实验作评价。当连接于寡核苷酸片段产生的转化子比自我连接作用至少多100倍时，该克隆化可认为是有希望的。然后从克隆化反应得到的转化子中分离出质粒DNA，并用限制性分析加以鉴定。将含有水蛭素肽序列32-65并且用Glu55代替了Asp55的表明有正确的限制性图谱的BamHI/HindⅢ的DNA片段由质粒DNA中分离出。该片段连接到用BamHI/HindⅢ切开的载体pCM7053上，所获得的重组质粒是pCM7053Var3。该质粒含有的修饰的水蛭素的DNA序列，其55位的氨基酸为Glu。
由质粒pK152得到的DNA用限制性内切酶KpnI和BstbI切割。用凝胶电泳分离后，分离出较大的载体片段。将该片段和预先杂交成双股的HirI和HirⅡ的双股寡核苷酸片段连接。按照上述的方法，产生了质粒pK153的一个衍生物，称作变体1。由该质粒上分离出BamHI/HindⅢ片段并连接到用BamHI/HindⅢ切开的载体pCM7053上。结果为质粒pCM7053Varl，它编码在52，53和55位上变成Gln、Glu和Glu的经修饰的水蛭素。该质粒与pCM7053的区别还在于有限制性酶EcoRI的识别位点。
质粒pCM7053Varl和pCM7053Var3的DNA用KpnI和MluI进行双酶切并用凝胶电泳加以分离。每一种情况都产生两个片段，从pCM7053Var1的酶切片段中分离出较大的一个，而从pCM7053Var3酶切物中分离出较小的片段。这两个片段再重新连接成新的质粒pVar13，它在大肠杆菌Mc1061中得到表达。按实施例5所述方法分离出水蛭素并用氨基酸分析进行鉴定。质粒pVar13构建的正确性也由预期的氨基酸组成所证实。
将质粒pCMT203和pVar13的DNA用限制性内切酶MluI和PvuI进行酶切，并经凝胶电泳分离。每种质粒都产生两个片段，均分离出较大的片段。将这两个较大的片段进行连接得到质粒pSCH13。其结构用限制性酶分析和DNA顺序分析得到证实。将这个质粒转化到大肠杆菌K12分泌突变体中，后者叙述于欧洲专利申请EP-A448093。
实施例2b水蛭素变体83(Ala1，Glu33，Glu53)在质粒pSCH83中的构建将实施例2α叙述的KpnI/BstbI载体片段与Hir13和Hir14预先杂交成双股的寡核苷酸片段连接，产生一种称作变体8的质粒。按实施例2α所述，由此质粒分离出BamHI/HindⅢ片段，并引入到用BamHI/HindⅢ切开的载体pCM7053上，产生了pCMVar8，并且从中分离出较小的KpnI/MluI片段，并将其连接到由质粒pCMVar3得到的大的KpnI/MluI片段上。获得质粒pVar83，它能在大肠杆菌Mc1061菌株中表达。从表达产物中分离出水蛭素衍生物并且作氨基酸分析后，确证该质粒的结构。如实施例2α所述从该质粒分离出MluI/PvuI片段，并将其连接到由质粒pCMT203得到的大的MluI/PvuI载体片段上，得到质粒pSCH83，将此质粒引入到上述的分泌突变体中。
实施例2c水蛭素突变体93(Ala1，Glu33，Gln52，Glu53，Ala54)在质粒pSCH93中的构建质粒pSCH93的构建按实施例2b类似的方法进行。在第一次克隆步骤时，需要将BstbI/KpnIpK152片段与杂交成双股的寡核苷酸Hir15和Hir16进行连接反应，生成的质粒称作变体9。
实施例3质粒pSCH13，pSCH83和pSCH93的表达如在欧洲专利申请EP-A448093中所述，质粒pSCH13，pSCH83和pSCH93的表达既可用摇瓶法，也可以10升的规模进行。该专利申请中所述的菌株或变种应用于此处。以立方米规模表达培养物时所用的培养基，诱导条件和发酵时间，可根据它们的性质而变动，这是本专业领域的技术人员皆知的。
实施例4水蛭素变体13和93在面包酵母中的克隆和表达在欧洲专利申请EP-A324712中叙述了人工合成的水蛭素，它改变了天然序列，其N-末端氨基酸为亮氨酸。这种水蛭素还可进一步优化，即在前面的修饰变体13和93时，在亮氨酸之后从第二个氨基酸进行改换。在这一点上，要按照本申请中所述的载体和菌株实施例的方法进行。本专业领域的技术人员都了解，也可以应用能分泌水蛭素或其变体的各种其它的酵母表达系统。
将在欧洲专利申请EP-A324712中所述的克隆载体7用BamHI和HindⅢ切开，并在每一种情况下，连接在从质粒pSCH13或pSCH93分离出的BamHI/HindⅢ片段上，该片段构成了水蛭素氨基酸序列的羧基末端部分，它在每种克隆载体中已失去。产生的质粒p713和p793用限制性分析加以鉴定。然后从这些质粒的正确DNA中分离出EcoRI/HindⅢ片段。用Klenow聚合酶补平突出末端。将这种方法制备的两种片段分别连接到如欧洲专利申请EP-A324712的实施例1所叙述的质粒yEP13中的平末端载体片段上。产生的质粒其中两个为pHABVar131和pHABVar132，它们的区别只是插入片段的方向不同，并且均编码具有氨基酸为Leu1，Glu33，Gln52，Glu53和Glu55的水蛭素衍生物，产生的质粒另外两个为pH ABVar931和pHABVar932，它们的区别也只是插入片段的方向不同，均编码具有氨基酸为Leu1，Glu33，Gln52，Glu53和Ala54的水蛭素衍生物。这些质粒按实施例的方法转化到该专利申请所叙述的酵母菌株中。水蛭素衍生物的表达和产物纯化按照该专利申请所述的方法进行。皆知，在用例如微孔Pellicon超过滤系统纯化时，可以免除离心和后来的吸附层析。这里所应用的方法是实验室规模的，以立方米规模培养时，会需用另外的发酵时间，培养条件和处理步骤。这是本专业领域的技术人员皆知的。
实施例5〔Ala1，Thr2，Glu33，Gln52，Glu53，G55〕脱硫水蛭素的纯化通过加入甲酸将每升含有3.6g水蛭素的无细胞培养物上清液调节到pH3。于室温1h后进行CEPA离心分离生成的沉淀。上清液经透析过滤使其电导率降低到＜2.5mS/cm，然后于Fractogel-EMD-SO-3，Lichroprep
RP18和Q-琼脂糖上进行连续层析，制备出高纯度的产品。
由Q-琼脂糖的洗脱液经联合的超过滤/透析过滤，可除去剩余的盐和缓冲液的成份，之后经冷冻干燥可以得到干燥的产物。
实施例6〔Ala1，Thr2，Glu33，Gln52，Glu53，Ala54〕-脱硫水蛭素的纯化发酵毕，在细胞物质的存在下将培养溶液酸化至pH3，用分离器将生物量与生成的沉淀分开。将5%(W/V)的DiaionHP20加到澄清的上清液中，使水蛭素定量的吸附，经过滤方法降去母液后，用水洗涤树脂一次。将30%浓度的异丙醇酸化到pH3，并用其使产物解吸附。澄清的洗脱液再按实施例5进行处理，先用阳离子交换层析，再经冷冻干燥得到高纯度的干燥产物。
实施例7被优化的异水蛭素的比较Ki值的测定Ki值的测定按照Stone和Hofsteenge的方法(Biochemistry25，4622-4628页，1986)0.2ml的1.25mMD-HHT-Gly-Arg-pNa的溶液于25℃下与1.7ml0.1Mtris，0.2MNaCl和0.1%(V/V)TritonX-100(pH8.3)和0.1ml的待测异水蛭素于145mMNaCl的溶液混合平衡。加入0.05ml凝血酶溶液使结合作用开始。在10-20分钟内记录于405nm处的吸收。
该反应遵循如下的方程式〔P〕＝V＊3t+(VO-VS)(1-e-k·t)K+d式中〔P〕＝产物的浓度(硝基苯胺)VO＝开始的速率VS＝平衡态的反应速率d＝t为0时的〔P〕用非线性回归计算速率常数k按照公式 k＝k＊on〔l〕/(1+S/Km)+koff以不同的抑制剂浓度外推k到〔l〕＝0，得到速率常数kon和koff，因而Ki＝koff/kon。
实施例8优化的〔Ala1，Thr2〕脱硫水蛭素类似物对恒河猴的部分凝血酶原激酶时间(PTT)的影响体重为6.5±1.6kg的雄性恒河独居按0.5mg/kg剂量静脉注射〔Leu1，Thr2〕脱硫水蛭素，〔Ala1，Thr2〕脱硫水蛭素，〔Ala1，Thr2，Glu33，Gln52，Glu53，Glu55〕脱硫水蛭素和〔Ala1，Thr2，Glu33，Gln52，Glu53，Ala54〕脱硫水蛭素。在一定的间隔采集血样以测定凝血参数。部分凝血酶原激酶时间(PTT)的测定方法如下(图2)0.1ml含柠檬酸盐的血浆和由人血小板制取的0.1ml的PTT试剂(Behring)于预先加温到37℃的试管中混合，并于37℃维持2分钟整，以使内在的凝血系统完全激活。然后，加入0.1ml0.025M氯化钙溶液，于凝血仪上测定凝血作用(按Schnitger和Gross法)。
实施例9〔Ala1，Thr2〕脱硫水蛭素类似物于pH7和60℃下20小时的稳定性待测化合物溶解于20mM NaP(pH7)，300mM NaCl，使浓度为0.5mg/ml，于60℃保温20h。于时间t＝0和t＝20h采集样品，用反相HPLC(Nucleosil
)和阴离子交换层析(Mono Q
)进行分析。计算新生成副产物的含量。
实施例10〔Ala1，Thr2〕脱硫水蛭素类似物于pH6.5和60℃的稳定性纯化的异水蛭素如冻干剂，溶解于水，浓度为1mg/ml，用1M Na2HPO4调节至pH6.5。经过滤灭菌后，溶液在避光下于振荡水浴中60℃保温。于时间t＝0，5，24，48，72和96h采样，用反相HPLC(Nucleosil
)和离子交换层析(Mono Q
)分析其中副产物的含量。于时间t＝x的纯度以相对于t＝0的纯度表示，用每种情况下两种分析系统较差的数值作为基准(图4)。
实施例11〔Ala1，Thr2〕脱硫水蛭素类似物于pH4和60℃的稳定性纯化的异水蛭素，如冻干剂，溶解于水，浓度为1mg/ml，用1M乙酸调节至pH4。按实施例10进行保温和分析(图3)。
权利要求
1.具有改善稳定性和如下氨基酸的异水蛭素的制备方法，33位Glu，52位Gln，Glu，Asn或Asp，53位Glu，54位Gly或Ala，55位Asp或Glu，该方法包括以下步骤a)制备编码该异水蛭素的载体；b)在适宜的宿主细胞中表达该载体；c)分离表达的异水蛭素。
2.根据权利要求1的方法，其中所用的载体编码具有下式的异水蛭素10A1-A2-Tyr-Thr-Asp-Cys-Thr-Glu-Ser-Gly-Gln-Asn-Leu-Cys20Leu-Cys-Glu-Gly-Ser-Asn-Val-Cys-Gly-Gln-Gly-Asn-Lys-30 40Cys-Ile-Leu-Gly-Ser-B-Gly-GLu-Lys-Asn-Gln-Cys-Val-Thr-50 52 53 54 55Gly-Glu-Gly-Thr-Pro-Lys-Pro-Gln-Ser-His-C-D-E-F60式中A1是Leu，Ala，Ile或Val，A2是Thr或Val，B是GluC是Gln或Glu，D是Glu，E是Gly或Ala，F是Asp或Glu。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所用的载体编码1位是Ala或Leu，2位是Thr，33位是Glu，52位是Gln，53位是Glu，54位是Gly和55位是Glu的异水蛭素。
4.根据权利要求1或2的方法，其中所用的载体编码1位是Ala或Leu，3位是Glu，52位是Gln，53位是Glu，54位是Ala和55位是Asp的异水蛭素。
5.根据权利要求1到4的异水蛭素的制备方法，其中在pH≤4时经酸沉淀法分离出宿主细胞的蛋白，然后经连续的层析纯化从培养基中制备高纯度的产物，层析纯化至少包括一种阳离子交换剂和一种反相层析法。
全文摘要
本发明涉及具有改善稳定性和在33，52，53，54与55位有不同氨基酸的异水蛭毒，以及用遗传工程制备这类异水蛭素的方法，在酵母菌或大肠杆菌中获得表达的产物，经离子交换和反相层析法得到高纯度的异水蛭素。
文档编号C12N15/12GK1073978SQ9211414
公开日1993年7月7日 申请日期1992年12月7日 优先权日1991年12月7日
发明者P·科劳斯, P·哈伯曼, D·特皮尔, W·厄尔默, G·施密德 申请人:赫彻斯特股份公司