从粗水解产物生产琥珀酸的方法

专利名称：从粗水解产物生产琥珀酸的方法
背景技术：
1.发明领域这个发明涉及生产琥珀酸的发酵方法，更具体而言，这个发明涉及产生能够利用多种糖生产琥珀酸作为主要发酵产物的细菌菌株的方法。
2.发明背景羧酸类有希望作为许多化学品的潜在前体。例如，琥珀酸可以用作塑料前体如1，4丁二醇(BDO)、四氢呋喃和γ-丁内酯(gamma-butyroactone)的原料。从琥珀酸衍生的新产品正在开发中，这些中最值得注意的是通过连接琥珀酸和BDO而制造的聚酯。一般地，琥珀酸的酯类具有成为可以代替更有害溶剂的新的、“绿色”溶剂的潜力。总体上，琥珀酸可以用作每年总市场价值超过十亿美元的几百万磅化学品的前体。与琥珀酸一起，其它4-碳二羧酸，例如马来酸和延胡索酸也具有原料潜力。
这些来自可再生原料(在这个情况下通过发酵方法)的羧酸的生产是代替能源消耗量更大的从不可再生来源得到这样酸的方法的途径。琥珀酸盐是通过产丙酸盐细菌厌氧发酵的中间体，但是那些方法导致低收率和浓度。
厌氧瘤胃细菌如栖瘤胃普雷沃氏菌(Bacteroides ruminicola)和嗜淀粉瘤胃杆菌(Bacteroides amylophilus)也生产琥珀酸盐。然而，瘤胃生物在发酵过程中在特性上是不稳定的。
早已经知道，从E.coli发酵生产酸的混合物，如Stokes，J.L.1949″Fermentation of glucose by suspensions of Escherichia coli″J.Bacteriol.57147-158中所详述。然而，对于每摩尔发酵的葡萄糖，仅生产1.2摩尔甲酸、0.1-0.2摩尔乳酸和0.3-0.4摩尔琥珀酸。因而，发酵生产羧酸的努力已导致相对大量的生长底物如葡萄糖还未转化成所希望的产品。
一些细菌，例如在发酵方法中使用的产琥珀酸厌氧螺菌(A.succiniciproducens)，如在授予Glassner等美国专利号5,143,834中所概述，在适度的数升中自然生产琥珀酸仅达到约35-40克每升(g/L)。产琥珀酸厌氧螺菌宿主菌株已表现出不是高耐渗透的，因为它不能耐受高浓度盐并且还受中等浓度的产物抑制。最后，产琥珀酸厌氧螺菌存在操作问题，因为作为专性厌氧菌，使用所述生物的过程必须在不存在氧的情况下进行。并且，用于接种的培养基的制备需要加入色氨酸。
本发明人早期的生产琥珀酸的努力导致了突变体细菌的分离和利用。所述突变体，作为ATCC序号202021可得到，是美国专利再颁发申请号09/429,693的主题。通过参考结合于此的再颁发申请号09/429,693教导了一种从其前身自发突变的生产琥珀酸的细菌菌株(stain)(AFP 111)。所述突变体能够在葡萄糖上发酵生长以高收率生产琥珀酸，而它的前身做不到这样。然而，利用这个方法的琥珀酸生产的明显缺点是它限于单一突变体。
本发明人的其它努力(美国专利号6,159,738)导致了构建具有增加的琥珀酸产量的细菌菌株的方法。所述方法教导大肠杆菌(E.coli)磷酸转移酶基因的改变引起所述细菌生产更多的琥珀酸。这个方法的缺点是它限于单一的改变。
发酵生产琥珀酸方法的需要存在于本技术领域中，由此所述方法不归类于单一突变体或基因。应当由任何具有特定并且容易确定的基因型的生物使所述方法可行。所述方法应当能够在使用鲁棒(robust)生物(即，具有高反馈抑制阈的那些)的相对惰性条件下进行，并且也以便消除复杂环境控制测量的需要。所述方法应当产生利用从木质纤维素原料水解得到的糖混合物的结果，因为这些底物提供较便宜的糖的来源，并且同样地，它们的使用可以减少琥珀酸的生产成本。
发明概述本发明的目的是提供生产琥珀酸的方法，所述方法克服了许多现有技术的缺点。
本发明的另一个目的是提供生产高收率琥珀酸的发酵方法。本发明的一个特征是利用含有多个突变基因的细菌基因组使所述方法可行。本发明的一个优点是可以容易地操作细菌以生产多个突变体。备选地，不用进一步的操作就可以利用已含有多个突变的细菌。
本发明的再另一个目的是提供操作细菌以生产大量琥珀酸的方法。本发明的一个特征是中断细菌中糖代谢的正常调节。本发明的一个优点是具有操作多种细菌以促进用于生产琥珀酸的发酵过程中相对高的产物对生长底物比(即，在1∶1或之上)的能力。本发明的另一个优点是具有利用成为葡萄糖代谢者和非葡萄糖代谢者的细菌的能力。
本发明还有另一个目的是发酵生产琥珀酸。本发明的一个特征是含改变的磷酸转移酶(pts)体系、丙酮酸甲酸裂合酶(pyruvate formate lyase)(pfl)体系和乳酸脱氢酶(ldh)体系的利用。本发明的一个优点是所述细菌可以从使用这些酶体系用于糖发酵的许多属得到。
简言之，提供了从工业级水解产物生产琥珀酸的方法，该方法包含供应含有基因ptsG、pflB和ldhA突变的生物；容许所述生物累积生物量；并且容许所述生物体代谢水解产物。
也提供了细菌突变体，其特征在于它以琥珀酸对底物在0.6∶1和1.3∶1之间的比例(举例来说，在0.6和1.3克琥珀酸/克总耗糖之间)从工业级水解产物中含有的底物生产琥珀酸。
附图简述从下面在附图中说明的本发明实施方案的详细描述可以最好地理解本发明以及上面的和其它目的和优点，其中

图1是描述根据本发明的特征在含突变基因菌株的转化之后琥珀酸提高的产量的曲线图；图2是描述根据本发明的特征经由三重突变生物的工业水解产物发酵的曲线图；和图3是描述根据本发明的特征经由三重突变生物的合成糖发酵的曲线图。
发明详述本发明人已开发了发酵生产高收率琥珀酸的方法。所述方法开发了所选生物的改变的分解代谢物抑制机理以便使所述生物能够利用葡萄糖和非葡萄糖原料生产琥珀酸。
在详细地建立本发明之前，提供了下面的倘若在这里出现的定义“载体”是另一个DNA区段可以连接到的复制子，例如质粒、噬菌体或粘粒，以便产生并连区段的复制。
“复制子”是作为体内DNA复制的自主单元即能够在其自身控制下复制而起作用的任何遗传因子(例如，质粒、染色体、病毒)。
“盒”指的是能够在特定的限制酶切位点插入到载体中的DNA区段。DNA的区段编码目的多肽，并且设计所述盒和限制酶切位点以确保所述盒插入在正确的读框中用于转录和翻译。
细胞已经被外源或异源DNA“转染”，那时这样的DNA已被引入所述细胞。
细胞已经被外源或异源DNA“转化”，那时所述转染的DNA产生表型改变。
“异源的”DNA指的是非自然定位于所述细胞中或者所述细胞染色体位点中的DNA。优选地，所述异源DNA包括和所述细胞无关的基因。
“核酸分子”指的是磷酸酯多聚形式的核糖核苷(腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷；“RNA分子”)或脱氧核糖核苷(脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸腺嘧啶核苷或脱氧胞苷；“DNA分子”)，或者其任何磷酸酯类似物，例如以单链形式或者以双链螺旋的硫代磷酸酯和硫代酸酯。可以是双链的DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋。所述术语核酸分子，并且特别是DNA或RNA分子，仅指的是所述分子的一级和二级结构，并且不限制它为任何特殊的三级形式。因而，这个术语包括双链DNA，特别是在线状或环状DNA分子(例如限制酶切片段)、质粒和染色体中发现的。在讨论特殊的双链DNA分子的结构中，可以在这里根据正常的惯例仅沿着DNA的非转录链(即，具有与mRNA序列同源性的链)给出5′至3′方向的序列描述序列。“重组体DNA分子”是已经经历过分子生物学操作的DNA分子。
当单链形式的核酸分子可以在适当的温度和溶液离子强度条件(参见Sambrook等，见上)下退火到其它核酸分子，核酸分子对另一种核酸分子是“可杂交的”，例如cDNA、基因组DNA或RNA。温度和离子强度条件确定所述杂交的“严格性”。对于同源核酸的初步筛选，可以使用低严格性的杂交条件，对应于Tm为55℃，例如，5×SSC、0.1％SDS、0.25％奶、并且无甲酰胺；或30％甲酰胺、5×SSC、0.5％SDS)。中等严格性的杂交条件对应于更高的Tm，例如40％甲酰胺、5×或6×SCC。高严格性的杂交条件对应于最高的Tm，例如，50％甲酰胺、5×或6×SCC。杂交需要两种核酸含有互补的序列，尽管依赖于所述杂交的严格性，但是碱基间的错配是可能的。用于杂交核酸的适当严格性依赖于所述核酸的长度和互补程度，本领域中众所周知的变量。两个核苷酸序列之间相似或相同的程度越大，具有那些序列的核酸的杂交Tm的值越大。核酸杂交的相对稳定性(对应于更高的Tm)以下列顺序减少RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。对于在长度上大于100个核苷酸的杂交，已经得到了计算Tm的方程式(参见Sambrook等，见上，9.50-0.51)。对于用更短核酸的杂交，即，寡核苷酸，错配的位置变得更重要，并且所述寡核苷酸的长度决定其特异性(参见Sambrook等，见上，11.7-11.8)。优选可杂交的核酸的最小长度是至少约12个核苷酸；优选至少约18个核苷酸并且更优选所述长度是至少约27个核苷酸；并且最优选约36个核苷酸。
“同源重组”指的是在染色体中载体的外源DNA序列的插入。优选地，所述载体将特定的染色体位点作为目标用于同源重组。对于特定的同源重组，所述载体将对于所述染色体含有足够长的同源区域以使所述载体能够互补结合并且掺入到所述染色体中。同源的区域越长，序列相似程度越大，可以增加同源重组的效率。
DNA“编码序列”是当置于适当的调节序列的控制下时在体外或体内细胞中转录并翻译成多肽的双链DNA序列。编码序列的边界由5′(氨基)末端的起始密码子和3′(羧基)末端的翻译终止密码子确定。编码序列可以包括，但不限于，原核序列、来自真核MRNA的cDNA、来自真核(例如，哺乳动物)DNA的基因组DNA，并且甚至是合成的DNA序列。如果意欲将所述编码序列在真核细胞中表达，那么聚腺苷酸化信号和转录终止序列将通常位于所述编码序列的3′。
转录和翻译控制序列是DNA调节序列，例如启动子、增强子、终止子等，其提供宿主细胞中编码序列的表达。在真核细胞中，聚腺苷酸化信号是控制序列。
“启动子序列”是细胞中能够结合RNA聚合酶和启动下游(3′方向)编码序列转录的DNA调节区域。例如，所述启动子序列在它的3′末端被转录启动位点所限制并且向上游(5′方向)延伸以包括在背景上可检测水平启动转录所必需的最小数目的碱基或元件。在所述启动子序列中不仅将发现转录启动位点(例如，便利地通过用核酸酶S1图谱定义)，也将发现负责结合RNA聚合酶的蛋白质结合区(共有序列)。
在细胞中，当RNA聚合酶将所述编码序列转录成mRNA时，编码序列在转录和翻译控制序列的“控制下”，然后将所述mRNA反式RNA(trans-RNA)剪接并翻译成由所述编码序列编码的蛋白质。
如这里所用，在全部其语法形式中的术语“序列同源性”指的是具有“共同进化起源”的蛋白质之间的关系，包括来自超家族的蛋白质(例如免疫球蛋白超家族)和来自不同种的同源蛋白质(例如，肌球蛋白轻链等)[Reeck et al.，Cell，50667(1987)]。
因此，在全部其语法形式中的术语“序列相似性”指的是在不共享共同进化起源的核酸或蛋白质的氨基酸序列之间的同一性或一致性的程度[参见Reeck et al.，1987，见前]。然而，在通常用法中和目前的申请中，当所述术语“同源的”用一个副词“高度地”修饰时，可以指的是序列相似性并且不是共同进化起源。
当至少约50％(优选至少约75％并且最优选至少约90％、95％或99.9％)的核酸与限定长度的DNA序列相配时，两种DNA序列是“基本同源的”或“基本相似的”。基本同源的序列可以通过利用在序列数据库中提供的标准软件比较所述序列而确认，或者例如在对那个特定体系限定的严格条件下在Southern杂交实验中确认。限定适当的杂交条件是在本领域的技术范围内。例如，参见，Maniatis等，见前；DNA Cloning，Vols.I&II，见前；Nucleic Acid Hybridization，见前。
类似地，当大于30％的氨基酸是相同的或者大于约60％是相似的(功能上相同)时，两种氨基酸序列是“基本同源的”或“基本相似的”。优选地，例如，利用GCG(Genetics Computer Group，Program Manual for theGCG Package，第7版，麦迪逊，威斯康星)堆积程序通过序列比对确认相似或同源序列。
术语“对应于”在这里用于指相似的或同源的序列，不论确切的位置是相同的或者不同于测量相似性或同源性的分子。因而，所述术语“对应于”指的是序列相似性，而不是所述氨基酸残基或核苷酸碱基的编号。
得到的突变体和方案导致琥珀酸根对原料的比例高达1.3∶1，并且典型地是0.9∶1。实现了琥珀酸根的积累在60g/L和75g/L之间。典型方案的持续时间是大于70小时，并且通常在120和170小时之间。例如在160小时后获得了70g/L的收率。所述方法在25℃和45℃之间是可行的，优选的范围是约30至39℃。约5和9之间的pH是适合的，更优选的范围是约6.1和7.2。
本发明的突变体是发酵方案的特别能生存的成分，因为它们具有增加的发酵产物耐受性。例如，在不产生反馈抑制的情况下，72g/L琥珀酸根、22g/L乙酸根、14g/L乙醇和8g/L乳酸根的浓度是可实现的。
原料详请本发明的方法和突变体的突出特征是工业原料的直接利用。可以利用多种原料，包括，但不限于轻质浸泡水(light steep water)、通过多种水解方法产生的木质纤维素水解产物、玉米来源的糖溶液(例如玉米浆)、来自乳清的乳糖和其它工业级糖类。例如，通过浓酸水解或稀酸水解、酶水解产生的木质纤维素水解产物或通过这些方法的组合产生的水解产物都是适合的。玉米来源的糖溶液也是适合的。
工业原料一般是葡萄糖和其它糖的混合物，最普通的非葡萄糖的糖是木糖。图2通过本发明突变体之一描绘了葡萄糖和木糖的利用。
根据前述的，任何含有葡萄糖和/或非葡萄糖的糖的原料是适合的。同样地，含有葡萄糖、山梨糖醇、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、乳糖、葡糖醛酸、半乳糖、果糖和它们的组合的原料是适当的。
生物详请本发明的方法利用含有生物的分解代谢产物抑制体系中改变的生物。具体而言，本发明人已发现当改变存在于细菌的磷酸转移酶(pts)体系、丙酮酸甲酸裂合酶(pfl)体系和乳酸脱氢酶(ldh)体系时，这些细菌适于用在本发明的琥珀酸生产方法中。pflAB和ldhA是分别编码丙酮酸甲酸裂合酶和发酵的乳酸脱氢酶的基因。
因而，在本发明发酵方法中利用的生物类型的唯一局限性是所述生物必须原本具有这些体系。可以利用天然包含这些体系的改变的生物(即，自发的突变体)，或者是特定改变的生物。
在所述细菌是变异的情况下，没有或具有低琥珀酸成品收率(即，小于0.5摩尔/1摩尔供给的生长底物)的发酵的细菌被转化成具有高琥珀酸成品收率的细菌(即，大于或等于1摩尔/1摩尔供给的生长底物)。
能够发酵制造任何琥珀酸的任何细菌是特别适合的转导候选者，包括但不限于革兰氏阴性和革兰氏阳性的发酵细菌。优选地，适合的菌株包括但不限于大肠杆菌(E.coli)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、欧文氏菌(Erwinia)和乳杆菌(Lactobacilus)。
利用噬菌体P1通过连续转导来修饰要改变成包括所述三个敲除的生物。利用标准的P1转导方案，一个例举性的方案公开在J.H.Miller，ed.Experimeiits in Molecular Genetics 1972(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.)中，并且通过参考结合于此。使用这个方法，可以使用野生型或接近野生型的细菌菌株(例如，E.coli的C600菌株；ATTC序号23724)产生缺少一个、两个或三个选自pfl、ldh、ptsG功能基因的突变亚株。
“基因敲除”指沉默细胞中特定基因表达的方法。所述沉默方法可以包括，例如，基因靶技术或反义阻断。基因靶技术指将核酸构造引入到细胞中与目的基因特异性重组。所述核酸构造使所述目的基因失活。可以通过将终止密码子引入到编码区中或者通过将阻遏位点引入到调节序列中实现失活。反义阻断指将指导反义RNA合成的表达序列结合到细胞中而阻断目的基因的表达。反义RNA杂交到目的基因的mRNA以抑制表达。
包含三种可以用在本发明中的突变的E.coli菌株的一个实例命名为AFP 184(ATCC序号PTA 5132，2003年4月9日保藏)(AFP＝备选原料规划)。AFP 184具有特意插入到接近野生型E.coli菌株中的pfl缺失、ldh敲除和不同的ptsG突变体形式。也可以使用另一个称为APP 415的菌株。APP 415只在具有ptsG的敲除方面不同于APP 184。它表现类似于APP184。
令人惊奇并出乎意料地，本发明人发现APP 184和APP 415的代谢速率和滴度优于美国专利号5,770,435(现在是再颁发申请号09/429,693)和6,159,738中公开的W1485的衍生细胞。
表1提供了由AFP 184和W1485衍生细胞(APP 111)的琥珀酸产量的比较。值得注意的是尽管W1485衍生细胞利用相当精细的原料，但是APP184仍然用工业级水解产物提供更高的值。
也可以利用已经含有一种或两种基因异常的细菌并且然后诱导剩余的敲除而产生含有全部三种敲除的突变。在这个情况下，能生存的起始生物是W1485，ATCC序列号12435。APP 400(ATCC序号PTA 5583，2003年10月10日保藏)是特意制造的三重敲除。它含有由August Bock进行的pfl缺失并且由伊利诺斯大学的David Clark插入到W1485中而产生FMJ123。依据P.K.Bunch et al.(1997)Microbiology 143，187-195中获得的方案产生FMJ123并通过参考结合于此。AFP 400也含有ldhA敲除，并且插入到FMJ123而产生DC1327。依据Chatterjee et al，Appl.Environ.Microbial.67，ppl48-l54中获得的方案产生DC1327并通过参考结合于此。APP 400含有ptsG敲除，如Chatterjee参考中所述。
表1不同E.Coli谱系的琥珀酸生产的比较
也通过将三种敲除引入到菌株C600构建了三重敲除的AFP404(ATCC序号PTA 5133，2003年4月9日保藏)。APP404类似于APP184但是具有ptsG的敲除而不是所述基因的点突变。它也以大约1mol/mol葡萄糖的收率生产琥珀酸。
也在R Chatterjee等中获得了从野生菌株的三重突变开发的方案。指示每一个所述敲除存在的典型抗生素标记包括，但不限于，Cam、Tet和Kan。因而产生了含有所述敲除和所述抗生素标记的新E.coli菌株APP 400和APP 404。那个方案如下插入失活ptsG基因的构建和引入利用靶向所述蛋白质的N-和C-末端的引物通过PCR从W1485制备的基因组DNA克隆E.coli的天然ptsG基因，不扩增另外的基因组序列。将所述基因克隆在载体pFJ118EH中而得到pJ7FptsG。通过将用EcoRI切除的pUC-4K的卡那霉素抗性盒(Pharmacia)插入到pJFptsG中ptsG基因的MfeI位点中来破坏所述基因，从而得到质粒pTSGK。因为NZN111已经包括卡那霉素抗性标记，所以通过从菌株SE1752将Tn10-失活的ldhA基因转导到FMJ123中构建等效菌株。得到的菌株DC1327在其生理学上与NZN111是不能区别的。通过用pTSGK转化所述细胞将被破坏的ptsG基因转移在DC1327中，在卡那霉素存在并且氨苄青霉素不存在的情况下培养细胞约30世代，然后将培养物在含有葡萄糖的LB平板上平板接种并厌氧培养。将能够发酵生长的菌落纯化并筛查它们对两种抗生素的敏感性，如下面的实施例中所详细描述。
将菌株AFP400分离作为稳定的卡那霉素抗性的、氨苄青霉素敏感的菌株，其将葡萄糖发酵成琥珀酸盐、乙酸盐和乙醇。通过PCR证实破坏的ptsG基因的正确整合。利用在所述基因的编码区外匹配旁侧序列大约110个碱基对的引物从AFP400 DNA扩增破坏的基因。这些序列不存在于整合载体中。得到的产物大小是3.0kb，如从已知的序列ptsG、它的旁侧区和卡那霉素插入片段所预测。将产物用ClaI(卡那霉素盒中的位点)和AgeI(ptsG中的位点)消化，并产生用于将所述盒插入到ptsG的MfeJ位点所期望的片段(ClaI的1.95和1.05kb，和Agel的2.3和0.7kb)。
利用与上述相同的方案从接近野生型E.coli K12菌株C600得到了另一株包含所述三种敲除的菌株APP 404。
从如上讨论的本发明人的在前研究(美国专利号6,159,738，和Chatteijee等)已经知道所述敲除的定位。利用具有抗性标记的敲除基因的拷贝引入所述敲除用于转化细胞。通过宿主酶使同源重组容易发生。然后选择含有所述标记的染色体。这样引入ptsG敲除。经由PCR，在前面通过参考结合的Chatteijee等中详述了它插入的证据。
生长详请由本发明人生产的三重突变体生物不是专性厌氧菌。因而，生物量的初始累积可以需氧地发生，其后建立发酵条件。这个两阶段方法(即，需氧的-然后厌氧的)方案的优点图解于图2中，其中相比图1的单阶段厌氧方案生长曲线，琥珀酸生产率更大。
一般地，当生物量达到约等于108至1011细胞/毫升(或者约2至5克细胞干重/升)的点时，使发酵罐成为厌氧的。在实验室中，在大约6小时后达到这个浓度点。
在工业方案中，用轻质浸泡水加上木质纤维水解产物填充发酵罐。如必要以下列浓度包括抗生素100μg羧苄青霉素/ml、30μg卡那霉素/ml、10μg四环素/ml和30μg氯霉素/ml。丰富液体培养基含有(/升)，10g胰蛋白胨、5g的NaCl和1g酵母提取物。用于平板的固体培养基含有1.5％(重量/体积)的Difco Bacto-Agar。如Vogel，H.J.1956 Acetylornithinasein E.coli，.Biol.Chem.21897-103中所描述制备基本培养基E，并且通过参考结合于此。
发酵的实验室条件如下在含有10ml用0.5g的MgCO3(为了在发酵过程中维持培养基的pH而加入)、抗生素和大约10g/L葡萄糖补加的LB培养基的密闭血清试管中进行发酵生长。可以利用多种生长底物，包括但不限于糖类、糖醇类、糖酸类和它们的组合。在厌氧生长中下列糖以5g/L的浓度代替葡萄糖进行试验海藻糖、甘露糖、果糖、山梨糖醇和葡糖醛酸。
通过在补加抗生素的LB培养基中需氧培养过夜而制备厌氧液体培养的接种体。将过夜培养物的样品在新鲜培养基中稀释100倍并使其需氧生长到A600约为1；用1ml接种体接种厌氧生长培养基。
在适当时间从密闭的试管无氧取样用于残留的葡萄糖(或备选的糖底物)和形成的发酵产物的水平分析。对于固体培养基上的厌氧生长，琼脂平板在37℃接种在通过使用Gas-Pak产生的H2-CO2气氛的厌气瓶中。
β-半乳糖苷酶活性的平板测定(plate assay)用于检验菌株中正常分解代谢产物抑制的存在。LB或培养基E-琼脂是可以利用的数种培养基的两种。培养基E-琼脂是Vogel，H.J.，1956 Acetylornithase in E.coli，J.Biol.Chem 21897-103中使用和讨论的基本营养培养基并且通过参考结合于此。在例举的方案中，LB或培养基E-琼脂是用4g/L葡萄糖、4g/L乳糖、3mg/L的5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷(Xgal)和抗生素补加的。这些培养基在上下文中称为X-gal/葡萄糖琼脂。蓝色菌落的形成指示在葡萄糖存在下β-半乳糖苷酶的表达，原因在于没有正常的分解代谢产物抑制。相反地，白色菌落的形成指示正常的分解代谢产物抑制存在，并因此不存在裂解二糖乳糖的酶。
本发明人也已经设计了在连续过程中利用所述突变体的方法。在这个连续过程中，进行了重复实验，其中在培养物已经生产约50g/L琥珀酸后，将1毫升的混合物加入到含有LB培养基、葡萄糖和MgCO3的新鲜封入物(enclosure)。这个新的接种体继续有效地生产琥珀酸。重复这个过程3-4次，在所有情况下导致琥珀酸的有效生产。
实施例1-利用工业水解产物的琥珀酸生产将APP 184置于含有来自稻草的真正水解产物的发酵罐中。例举的水解产物是从Mission Viejo，CA的Arkenol Inc.经由其浓酸水解方法在商业上制备和制造的。所述稻草培养基含有大约600g/L葡萄糖和169g/L木糖作为两种主要糖组分，加上较少量的其它糖。实验数据可以在表2和图2中找到。
下面是基于AFP 184发酵方法的方案发酵培养基含有下列组分Difco酵母提取物5g/L、胰蛋白胨10g/L、(NH4)2SO42g/L、MgSO4-7H2O0.2g/L、NaCl 10g/L、K2HPO47g/L、KH2PO43g/L、Arkenol’s水解产物16.5mg/L和卡那霉素30mg/L。工业水解产物含有600g/L葡萄糖和169g/L木糖作为两种主要糖组分，加上较少量的其它糖。含有除抗生素之外的全部组分的培养基在121℃高压灭菌20分钟。当冷却时加入卡那霉素。将这个培养基用于种子培养物烧瓶和1-升的发酵罐。对于接种物，将50mg培养基置于250-mg摇瓶中并用0.2mg保存在30％甘油中和-70℃下的AFP184储用培养物接种。将所述摇瓶在37℃和250rpm的摇床中过夜(约16小时)培养。然后将全部摇瓶含量用于接种维持在37℃的发酵罐。将发酵罐中的培养基通气以使所述生物快速生长。六小时后当达到所需的细胞量，进行下列操作1.关闭空气以运用厌氧条件，其将引起琥珀酸的生产；2.将二氧化碳气体以0.03mg/分钟的速率鼓泡到培养基中；和3.向发酵罐中加入用水稀释到总葡萄糖加上木糖的浓度为500g/L的含有Arkenol的水解产物的补料溶液而实现发酵培养基中的总糖浓度为50g/L。在实验过程中，当发酵罐中糖浓度低时，加入更多的补料为琥珀酸的生产提供充足的底物。当细胞生产琥珀酸时，pH下降。通过经由自动pH控制器的操作加入1.5M Na2CO3溶液将其保持在pH6.5。每隔一段时间取样并分析光密度、葡萄糖、木糖、琥珀酸、乙酸、乳酸和乙醇。
表2用含有异常ptsG、ldh和pfl的突变体从Arkenol生产琥珀酸、乙酸和乙醇
实施例2-从合成糖混合物生产琥珀酸利用AFP 184与合成糖原料的组合开发了发酵方案。可以在图3中注意到，直到80小时琥珀酸盐的生产是快速的，并且稍微达到稳定水平，之后在大约140小时后达到最终的高水平为60g/L。
发酵培养基含有下列组分Difco酵母提取物5g/L、胰蛋白胨10g/L、(NH4)2SO42g/L、MgSO4-7H2O 0.2g/L、NaCl 10g/L、K2HPO47g/L、KH2PO43g/L、葡萄糖7.6g/L、木糖1.85g/L和卡那霉素30mg/L。含有除抗生素之外的全部组分的培养基在121℃高压灭菌20分钟。当冷却时加入卡那霉素。将这个培养基用于种子培养物烧瓶和1-升的发酵罐。对于接种物，将50mg培养基置于250-mg摇瓶中并用0.2mg保存在30％甘油中和-700℃下的AFP184储用培养物接种。将所述摇瓶在370℃和250rpm的摇床中过夜(约16小时)培养。然后将全部摇瓶含量用于接种维持在370℃的发酵罐。
将发酵罐中的培养基通气以使所述生物快速生长。六小时后当达到所需的细胞量，进行下列操作1.关闭空气以运用厌氧条件，其将引起琥珀酸的生产；2.将二氧化碳气体以0.03mg/分钟的速率鼓泡到培养基中；和3.将含有400g/L葡萄糖和84g/L木糖的补料溶液加入到发酵罐中而实现发酵培养基中的总糖浓度为50g/L。
在实验过程中，当发酵罐中糖浓度低时，加入更多的补料为琥珀酸的生产提供充足的底物。当细胞生产琥珀酸时，pH下降。通过经由自动pH控制器的作用加入1.5M Na2CO3溶液将其保持在pH6.5。每隔一段时间取样并分析光密度、葡萄糖、木糖、琥珀酸、乙酸、乳酸和乙醇。
以下，表3和图3图解了由所述合成糖混合物的利用而引起的琥珀酸生产。
在实施例1和实施例2的比较中可以注意到，当使用工业水解产物时相比使用合成原料时，所述突变体的琥珀酸盐生产是相等的(分别参见表2和表3的时间点120和122)。这个结果说明了本发明方案的鲁棒性，因为工业级水解产物固有的任何有毒原料不降低收率。
表3利用合成糖的发酵方案中的琥珀酸生产
虽然根据图解实施方案的细节已描述了本发明，但是这些细节无意限制后附权利要求中所限定的本发明的范围。
PCT/RO/134表的中文译文PCT/US2004/0l3605
涉及保藏的微生物或其它生物材料的指示(PCT细则13bis)
PCT/RO/134表的中文译文PCT/US2004/013605
涉及保藏的微生物或其它生物材料的指示(PCT细则13bis)
PCT/RO/134表的中文译文PCT/US2004/013605
涉及保藏的微生物或其它生物材料的指示(PCT细则13bis)
权利要求
1.一种从工业级水解产物生产琥珀酸的方法，该方法包含a)提供含有基因ptsG、pflB、和ldhA突变的生物；b)容许所述生物累积生物量；和c)容许所述生物代谢所述水解产物。
2.如权利要求1中所述方法，其中所述生物是来自选自由大肠杆菌(Escherichia.coli)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、欧文氏菌(Erwinia)和乳杆菌(Lactobacillus)组成的组的属。
3.如权利要求1中所述方法，其中所述生物量累积到大约108至1011细胞/毫升之间。
4.如权利要求1中所述方法，其中所述工业级水解产物是木质纤维素水解产物或玉米来源的糖溶液。
5.如权利要求1中所述方法，其中所述温度在约25℃和45℃之间选择。
6.如权利要求1中所述方法，其中所述生物量在需氧气氛下累积。
7.如权利要求1中所述方法，其中所述pH在约5和9之间选择。
8.如权利要求1中所述方法，其中所述水解产物是以第一原料量包含的并且所述方法在外加第二原料量的情况下被制成连续的。
9.如权利要求1中所述方法，其中当琥珀酸浓度大约是50g/L时加入所述第二原料量。
10.一种细菌突变体，其特征在于它从工业级水解产物中含有的底物生产琥珀酸，琥珀酸对底物的比例在0.6∶1和1.3∶1之间。
11.如权利要求10中所述突变体，其中所述底物是选自由葡萄糖、乳糖、山梨糖醇、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡糖醛酸、半乳糖、果糖或它们的组合组成的组的糖。
12.如权利要求10中所述突变体，其中所述突变体含有无效的磷酸转移酶体系、无效的丙酮酸甲酸裂合酶体系和无效的乳酸脱氢酶体系。
13.如权利要求12中所述突变体，其中所述无效的磷酸转移酶体系是点突变的结果。
14.如权利要求10中所述突变体，其中所述突变体同时利用一种以上的底物同时生产琥珀酸。
全文摘要
一种从工业级水解产物生产琥珀酸的方法，使用含有基因ptsG、pflB、和ldhA突变的生物并且使所述生物能够累积生物量，并且使所述生物能够代谢所述水解产物。细菌突变体从工业级水解产物中含有的底物生产琥珀酸，琥珀酸对底物的比例在0.6∶1和1.3∶1之间。
文档编号C12P7/64GK101018866SQ200480043506
公开日2007年8月15日 申请日期2004年5月3日 优先权日2004年5月3日
发明者N·P·恩吉埃姆, M·唐纳利, C·Y·圣维利－米勒德 申请人:Ut巴特勒有限公司, 尤芝加哥阿尔贡有限公司