专利名称：植物细胞或组织简易灌注式生物反应器培养系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种光生物反应器培养系统，具体是一种植物细胞或组织简易灌注式生物反应器培养系统，用于植物细胞工程技术领域。
背景技术：
植物细胞或组织能合成许多具有重要价值的次级代谢产物，包括药用活性物质、食品添加剂、杀虫剂、饲料、精细化工产品等。利用生物反应器大规模悬浮培养植物细胞或组织生产植物有用代谢产物在近年来取得了很大发展，在反应器研制方面主要着重于混合效率较高、剪切强度较低的生物反应器的设计和制作。另一方面，探索最佳的植物细胞培养条件，尤其是营养物质的供应方式也是扩大其重要次级代谢产物的有效途径。目前营养物质供应方式主要包括批次、补料、灌注和连续四种培养方式。近年来，随着灌注培养方式在哺乳动物细胞培养中的较广泛应用，这种培养方式也渐渐应用到了陆生植物和海洋中大型海藻的生物反应器培养。灌注培养方式有别于连续培养方式，它只涉及培养液在生物反应器内外的流动，即新鲜培养液从反应器下端进入，被细胞消耗的培养液再以相同速度从反应器上端流出。灌注培养方式的主要目的是进行快速的细胞扩增，以及及时输出培养物分泌的重要的药用物质(主要是重组蛋白类物质)。
经对现有技术文献的检索发现，Wei Wen Su等人在《Journal ofBiotechnology》1996，50(2-3)225-233上发表的“A perfusion air-liftbioreactor for high density plant cell cultivation and secreted proteinproduction”(灌注气升式光生物反应器高密度培养植物细胞生产分泌蛋白，《生物技术杂志》)一文中，提出了一种气升式灌注培养生物反应器，该系统由新鲜培养液储罐、蠕动泵、生物反应器，废液收集罐组成。由于使用蠕动泵灌注培养液到反应器内部，该培养系统能在培养过程中，精确控制培养液灌注入反应器的速度，同时获得较可靠的数据。灌注速率(单位时间灌注入生物反应器内的培养液体积)是由培养液日更新率(灌注培养液体积/培养液总体积)和培养液总体积两者决定的。一般而言，植物细胞尤其是大型海藻细胞的生长速度相当缓慢，即对培养液中营养的需求不很高，而且，当培养液日更新率超过一定阀值后，培养物生物量的扩增不再显著，另外，实验室规模的生物反应器体积并不大，所以通常，培养植物细胞的灌注速率较小。这样对于蠕动泵的速度和精确性要求就很高，相应的其价格也大大提升；但事实上，对于许多精确性要求不很高的植物细胞灌注培养，完全可以使用简易的灌注培养装置代替昂贵的蠕动泵，从而实现生物量的快速扩增或是对灌注培养方式进行简单的初步研究。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种植物细胞或组织简易灌注式生物反应器培养系统，使其大大降低现有技术中植物细胞灌注培养装置系统的构建成本，从而扩大植物细胞灌注培养方式的应用面。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括新鲜培养液灌注系统、改良生物反应器和量筒，所述的新鲜培养液灌注系统包括培养液储罐、第一胶塞、第二胶塞、一次性输液器，第一胶塞和第二胶塞设在培养液储罐上，一次性输液器穿过第一胶塞和第二胶塞，新鲜培养液灌注系统的末端和改良生物反应器的入口端直接相连，改良生物反应器的出口端通过硅胶输液管和量筒相接，新鲜培养液灌注系统是封闭的，改良生物反应器与外部相通。
所述的培养液储罐，主体为底面直径大于30cm的半封闭式圆柱型玻璃容器，在其下底面一侧设有两个圆柱型玻璃接口灌注液出入接口和空气进气接口。
所述的灌注液出入接口和空气进气接口，在灌注液出入接口上设有第一胶塞，在空气进气接口上设有第二胶塞。
所述的一次性输液器包括穿刺器进气针和输液针系统，穿刺器进气针刺穿第一胶塞，输液针系统刺穿第二胶塞。
所述的输液针系统包括输液针、滴斗、流量调节器和输液导管，输液导管顺次连接输液针、滴斗和流量调节器，输液针是输液针系统的始端，输液导管是输液针系统的末端，输液导管是新鲜培养液灌注系统的末端，所述的输液针刺穿第二胶塞。
所述的改良生物反应器，在其侧壁下端近底部处设第一孔(孔径直径参数为3-5mm)，在第一孔外部设有侧壁下接口，在改良生物反应器上端(反应器内溶液达到反应器工作体积的液面处)和侧壁下接口对应的侧壁处打第二孔(孔径直径参数为6-8mm)，在第二孔上覆盖并紧密粘合孔径直径为0.15-8μm的尼龙膜，在第二孔外部设有侧壁上接口。
所述的侧壁上接口是一个圆柱型玻璃接口，其内径比侧壁下接口大6-8mm，侧壁上接口外径和硅胶输液管内径一致，侧壁上接口外壁设有螺纹，以增加其同硅胶输液管间的密合度。所述的侧壁上接口是改良生物反应器的出口端。
所述的侧壁下接口是一个细口的圆柱型玻璃接口，其外径和输液导管内径一致，侧壁下接口外壁设有螺纹，以增加其同输液导管间密合度。所述的侧壁下接口是改良生物反应器的入口端。
本发明工作时，将培养液储罐、两个胶塞、改良光生物反应器进行高温灭菌，在超净工作台上将一个胶塞设在培养液储罐的空气进气接口处，无菌的新鲜培养液通过灌注液出入接口注入培养液储罐中，然后将另一个胶塞设在该灌注液出入接口处；取出一次性输液器中的穿刺器进气针和输液针系统，关闭流量调节器，再将穿刺器进气针和输液针分别插入位于空气进气接口和灌注液出入接口上的两个胶塞中，并另穿刺器进气针和输液针同培养液储罐内的液体相通；将培养液储罐固定于高处(高出改良生物反应器工作液面一定距离即可)，输液针系统末端的输液导管和已接入某一植物细胞或组织，并已经安装固定好的改良生物反应器的侧壁下接口相连，改良生物反应器的侧壁上接口通过硅胶输液管和量筒相接；调节输液针系统中的流量调节器以控制培养液灌注入改良生物反应器内的速度，即灌注速度，每天同一时间观察并记录量筒内培养液的体积以确定日灌注量，并将该废液及时倒去，同时观察培养液储罐内液面的高度，一般下降数厘米后即可添加新鲜培养液(或完全更新罐内培养液)以维持原先的灌注速率，同时也可适当微调流量调节器以基本维持原先的灌注速率。
系统运行过程中每天同一时间观察并记录量筒内培养液的体积以确定日灌注量，并将该废液及时倒去，同时观察培养液储罐内液面的高度，一般下降数厘米后即可添加新鲜培养液(或完全更新罐内培养液)以维持原先的灌注速率，同时也可适当微调流量调节器以基本维持原先的灌注速率。另外，定期从改良生物反应器内取样测定生物量和营养盐浓度，从而了解培养过程中植物细胞或组织消耗营养和营养盐浓度的维持情况，同时获得该培养物所处于的生长阶段和生长状况等信息。
用本发明研究培养大型褐藻海带配子体细胞的最佳灌注速率，发现当培养液(改良的APSW人工海水)日更新速率选取20％时，很好地满足了藻体细胞的生长需求，培养39天，其生物量增长倍数约16.08倍，是批次培养增长倍数的5.49倍。本发明装置系统的制作和构建相当简便和经济，其设计充分利用液体自身重力产生的压强作为灌注能量源，而且培养液储罐大表面积的特点可以基本忽略在培养液在灌注过程中因液面下降而引起的液体压强的减少，即本发明装置系统的设计大大节约了能源，因为无需蠕动泵，所以耗资极少，这对于许多精确性要求不很高的植物细胞灌注培养方式，以获得一定的种质细胞生物量，或者对灌注培养方式进行初步的研究意义非常重大，最重要的是本发明植物细胞或组织简易灌注式生物反应器培养系统的简单设计可以大大提高灌注培养方式在植物细胞培养中的应用面和应用度。
图1为本发明结构示意2为本发明一次性输液器结构示意图具体实施方式
如图1、2所示，本发明包括新鲜培养液灌注系统1、改良生物反应器2和量筒3，所述的新鲜培养液灌注系统1包括培养液储罐4、第一胶塞5、第二胶塞6、一次性输液器7，第一胶塞5和第二胶塞6设在培养液储罐4上，一次性输液器7穿过第一胶塞5和第二胶塞6，新鲜培养液灌注系统1的末端和改良生物反应器2的入口端直接相连，改良生物反应器2的出口端通过硅胶输液管19和量筒3相接，新鲜培养液灌注系统1是封闭的，改良生物反应器2与外部相通。
所述的培养液储罐4，主体为底面直径大于30cm的半封闭式圆柱型玻璃容器，在其下底面一侧设有两个圆柱型玻璃接口灌注液出入接口8和空气进气接口9。
所述的灌注液出入接口8和空气进气接口9，在灌注液出入接口8上设有第一胶塞5，在空气进气接口9上设有第二胶塞6。
所述的一次性输液器7包括穿刺器进气针10和输液针系统11，穿刺器进气针10刺穿第一胶塞5，输液针系统11刺穿第二胶塞6。
所述的输液针系统11包括输液针12、滴斗13、流量调节器14和输液导管15，输液导管15顺次连接输液针12、滴斗13和流量调节器14，输液针12是输液针系统11的始端，输液导管15是输液针系统11的末端，输液导管15是新鲜培养液灌注系统1的末端，所述的输液针12刺穿第二胶塞6。
所述的改良生物反应器2，在其侧壁下端近底部处设第一孔(孔径直径参数为3-5mm)，在第一孔外部设有侧壁下接口16，在改良生物反应器2上端(反应器内溶液达到反应器工作体积的液面处)和侧壁下接口16对应的侧壁处打第二孔(孔径直径参数为6-8mm)，在第二孔上覆盖并紧密粘合孔径直径为0.15-8μm的尼龙膜17，在第二孔外部设有侧壁上接口18。
所述的侧壁上接口18是一个圆柱型玻璃接口，其内径比侧壁下接口16大6-8mm，侧壁上接口18外径和硅胶输液管19内径一致，侧壁上接口18外壁设有螺纹，以增加其同硅胶输液管19间的密合度。所述的侧壁上接口18是改良生物反应器2的出口端。
所述的侧壁下接口16是一个细口的圆柱型玻璃接口，其外径和输液导管15内径一致，侧壁下接口16外壁设有螺纹，以增加其同输液导管15间密合度。所述的侧壁下接口16是改良生物反应器2的入口端。
权利要求
1.一种植物细胞或组织简易灌注式生物反应器培养系统，包括新鲜培养液灌注系统(1)、改良生物反应器(2)，其特征在于，还包括量筒(3)，所述的新鲜培养液灌注系统(1)包括培养液储罐(4)、第一胶塞(5)、第二胶塞(6)、一次性输液器(7)，第一胶塞(5)和第二胶塞(6)设在培养液储罐(4)上，一次性输液器(7)穿过第一胶塞(5)和第二胶塞(6)，新鲜培养液灌注系统(1)的末端和改良生物反应器(2)的入口端直接相连，改良生物反应器(2)的出口端通过硅胶输液管(19)和量筒(3)相接，新鲜培养液灌注系统(1)是封闭的，改良生物反应器(2)与外部相通。
2.根据权利要求1所述的植物细胞或组织简易灌注式生物反应器培养系统，其特征是，所述的培养液储罐(4)，主体为底面直径大于30cm的半封闭式圆柱型玻璃容器，在其下底面一侧设有两个圆柱型玻璃接口灌注液出入接口(8)和空气进气接口(9)。
3.根据权利要求2所述的植物细胞或组织简易灌注式生物反应器培养系统，其特征是，所述的灌注液出入接口(8)和空气进气接口(9)，在灌注液出入接口(8)上设有第一胶塞(5)，在空气进气接口(9)上设有第二胶塞(6)。
4.根据权利要求1所述的植物细胞或组织简易灌注式生物反应器培养系统，其特征是，所述的一次性输液器(7)包括穿刺器进气针(10)和输液针系统(11)，穿刺器进气针(10)刺穿第一胶塞(5)，输液针系统(11)刺穿第二胶塞(6)。
5.根据权利要求4所述的植物细胞或组织简易灌注式生物反应器培养系统，其特征是，所述的输液针系统(11)包括输液针(12)、滴斗(13)、流量调节器(14)和输液导管(15)，输液导管(15)顺次连接输液针(12)、滴斗(13)和流量调节器(14)，输液针(12)是输液针系统(11)的始端，输液导管(15)是输液针系统(11)的末端，输液导管(15)是新鲜培养液灌注系统(1)的末端，输液针(12)刺穿第二胶塞(6)。
6.根据权利要求1所述的植物细胞或组织简易灌注式生物反应器培养系统，其特征是，所述的改良生物反应器(2)，在其侧壁下端近底部处设第一孔，在第一孔外部设有侧壁下接口(16)，在改良生物反应器(2)上端和侧壁下接口(16)对应的侧壁处打第二孔，在第二孔上覆盖并紧密粘合有尼龙膜(17)，在第二孔外部设有侧壁上接口(18)。
7.根据权利要求6所述的植物细胞或组织简易灌注式生物反应器培养系统，其特征是，所述的第一孔，其孔径直径参数为3-5mm；所述的第二孔，其孔径直径参数为6-8mm。
8.根据权利要求6所述的植物细胞或组织简易灌注式生物反应器培养系统，其特征是，所述的尼龙膜(17)，其孔径直径为0.15-8μm。
9.根据权利要求6所述的植物细胞或组织简易灌注式生物反应器培养系统，其特征是，所述的侧壁上接口(18)是一个圆柱型玻璃接口，其内径比侧壁下接口(16)大6-8mm，侧壁上接口(18)外径和硅胶输液管(19)内径一致，侧壁上接口(18)外壁设有螺纹，侧壁上接口(18)是改良生物反应器(2)的出口端。
10.根据权利要求6所述的植物细胞或组织简易灌注式生物反应器培养系统，其特征是，所述的侧壁下接口(16)是一个细口的圆柱型玻璃接口，其外径和输液导管(15)内径一致，侧壁下接口(16)外壁设有螺纹，侧壁下接口(16)是改良生物反应器(2)的入口端。
全文摘要
一种植物细胞或组织简易灌注式生物反应器培养系统，用于植物细胞工程技术领域。本发明包括新鲜培养液灌注系统、改良生物反应器和量筒，所述的新鲜培养液灌注系统包括培养液储罐、第一胶塞、第二胶塞、一次性输液器，第一胶塞和第二胶塞设在培养液储罐上，一次性输液器穿过第一胶塞和第二胶塞，新鲜培养液灌注系统的末端和改良生物反应器的入口端直接相连，改良生物反应器的出口端通过硅胶输液管和量筒相接，新鲜培养液灌注系统是封闭的，改良生物反应器与外部相通。本发明大大降低现有技术中植物细胞灌注培养装置系统的构建成本，从而扩大植物细胞灌注培养方式的应用面。
文档编号C12M3/00GK1710058SQ200510027058
公开日2005年12月21日 申请日期2005年6月23日 优先权日2005年6月23日
发明者陈思晔, 齐瀚实, 张宝红, 黄娜, 郑伯年 申请人:上海交通大学