专利名称：中国葡萄属野生种刺葡萄抗白粉病候选基因序列及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及葡萄常规杂交育种、分子标记辅助育种、基因定位与作图及基因克隆的方法与技术，特别涉及抗中国葡萄属野生种刺葡萄抗白粉病候选基因序列及应用。
背景技术：
葡萄白粉病(Uncinula necator Schw.Burr.)是危害欧洲葡萄最为严重的真菌病害之一，遍布于世界各葡萄产区。对于白粉病的防治，早期以化学防治为主，但是，化学防治不仅增加生产成本，造成环境污染，还可能引起葡萄病害生理小种的变异及病原菌的抗药性，同时降低葡萄及其加工产品的产量和品质。科学研究和生产实践证明，利用植物自身抗病性，培育抗病、优质葡萄新品种是最经济有效的措施之一。欧洲葡萄抗病能力差，美洲葡萄种及其品种抗病性强，但果实的“狐”味及其显性遗传的特点，又限制了其进一步应用；圆叶葡萄与欧洲葡萄杂交效率低。中国是葡萄属植物重要的起源地之一，我国的野生葡萄资源不仅抗病，而且和欧洲葡萄杂交亲和性好，可以有效地将抗病基因与欧洲葡萄品质性状相结合，因而将中国野生葡萄白粉病抗性基因与欧洲葡萄品种优良品质基因有效结合，培育抗病优良葡萄新品种和创造新型葡萄种质是生产实践中急需解决的实际问题。
植物能对特定的病原微生物进行识别并产生抗性，这是由抗病基因决定的。基因对基因假说认为，抗病基因是病原微生物致病基因的受体，能与致病因子复合物通过一系列信号传导起始抗病反应，如发生过敏性反应、细胞壁增厚、坏死斑的出现以及防卫基因的表达等。抗病基因根据编码的蛋白质结构上的异同，可以将除Hm1外的其他基因分为4大类，即含有核苷酸结合位点(NBS)和富含亮氨酸重复(LRR)的胞内受体蛋白基因；丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(STK)基因；含有胞外LRR结构的跨膜受体蛋白基因以及同时含有胞外LRR和胞内STK结构的跨膜受体蛋白基因，这些不同植物来源的抗病基因在结构上的保守性暗示了利用同源序列法分离抗病基因的潜在可能性。而基于同源序列的基因分离方法目前已逐渐受到重视，其中小麦抗叶锈病基因Lr10的分离是利用同源序列法进行抗病基因分离的首次成功报道。
发明内容
本发明的目的在于，提供中国葡萄属野生种刺葡萄抗白粉病候选基因基因序列及其应用。
本发明是在对中国葡萄属野生种进行抗病性鉴定，获得刺葡萄(V.davidiiFoex)福建-4、塘尾2个株系抗病种质的基础上，采用同源序列克隆法分离葡萄抗白粉病候选基因片段，进行序列同源性分析，为进一步利用cDNA末端快速扩增技术获得抗病基因全长序列奠定基础。
为了实现上述目的，本发明首次采用抗病基因同源序列技术进行中国葡萄属野生种抗白粉病(Uncinula necator Schw.Burr.)候选基因克隆，获得了抗白粉病候选基因DNA片段3个，其大小分别为507bp、513bp、513bp。以该核苷酸序列为基础，可以进行抗白粉病基因标记辅助育种，用作葡萄育种中检测葡萄抗白粉病基因的探针；可以根据这些片段在中国野生葡萄与欧洲葡萄杂种后代中的分离情况，进行中国野生葡萄抗白粉病基因定位与作图；可以根据这些片段设计特异引物，采用cDNA末端快速扩增技术(Rapidamplification of cDNA ends，RACE)(Frohman et al，Proc.Natl.Acad.Sci，1988)克隆中国葡萄野生种抗白粉病基因，为通过基因工程改良葡萄品种的抗病性奠定基础。
图1是中国葡萄属野生种刺葡萄抗白粉病特异DNA片段的获得图谱，其中M1.100bp DNA ladder，1、7、13引物为F1R1，2、8、14引物为F1R2，3、9、15引物为F1R3，4、10、16引物为F2R1，5、11、17引物为F2R2，6、12、18引物为F2R3；1-6.福建-4，7-12.塘尾，13-18.宁强-6；M.DNA Marker DGL2000；图2是中国葡萄属野生种刺葡萄(V.davidii Foex)福建-4抗白粉病候选基因序列；图3是中国葡萄属野生种刺葡萄(V.davidii Foex)刺葡萄塘尾(3)抗白粉病候选基因序列；图4是中国葡萄属野生种刺葡萄(V.davidii Foex)刺葡萄塘尾(5)抗白粉病候选基因序列；图5是特异DNA片段在刺葡萄塘尾X欧洲葡萄粉红玫瑰杂交后代中的分离情况图谱，其中M.DNA Marker DGL 2000，1.塘尾，2-19.塘尾X粉红玫瑰杂交后代。
以下结合发明人给出的实施例对本发明作进一步的详细说明。
具体实施例方式
本发明获得的中国葡萄属野生种刺葡萄(V.davidii Foex)福建-4、塘尾2个株系共3个抗白粉病候选基因序列具体操作步骤如下A.采用改进的CTAB法(西北植物学报，王西平等，2003，23(3)473-476)提取中国葡萄属野生种刺葡萄福建-4、塘尾2个株系叶片基因组DNA。
B.根据抗病基因N、L6及RPS2位于P-环(P-loop)上的GVGKTT，及位于基因弱疏水区上的GLPLAL保守结构域设计简并PCR引物F1.5‘GGD GTD GGN AAR ACW AC 3’，F2.5‘GGT GGG GTT GGGAAG ACA AAG 3’与R1.5‘GAG GGC TAA AGG AAG GCC 3’，R2.5‘AGNGCY AAN GGY AAN CC 3’，R3.5‘CAA CGC TAG TGG CAA TCC 3’，共组成6对PCR引物进行扩增。这些引物由大连Takara公司合成。
在25μl PCR反应体积中加入PCR buffer(含Mg2+)2.5μl，dNTP 0.5μl，模板DNA 100ng，引物11.5μl，引物21.5μl，Taq DNA聚合酶1U(5U/μl)，用双蒸水补被齐体积至25μl，加入25.0μl矿物油。PCR扩增程序为94℃ 2min，94℃ 1min；50℃ 1min，72℃ 2min共35个循环；72℃，10min。取反应产物6.0μl跑1.5％琼脂糖凝胶电泳(5V·cm-1)约40min，6对引物都获得了扩增产物，其中引物对F1R3获得了一条长度约为500bp的DNA特异带(图1)。
C.用DNA胶回收试剂盒将获得的这一条约500bp左右的DNA条带回收，连接pGEM-T easy载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有Amp(100μg·ml-1)和X-gal/IPTG的LB平板上培养，蓝、白斑筛选鉴定挑选白色菌落培养。用UNIQ-10柱式质粒小量抽提试剂盒回收质粒，用EcoR I酶切鉴定有外源DNA片段插入的阳性克隆。将阳性克隆送大连宝生生物公司测序，测序结果表明获得刺葡萄DNA特异片段3个(图2-图4)，大小分别为507bp、513bp、513bp。
以下是发明人给出的实施例，但不局限于这些实施例。
实施例1以保存于西北农林科技大学葡萄种质资源圃已进行抗白粉病鉴定的中国野生葡萄刺葡萄福建-4、塘尾(贺普超等，中国农业科学，1991；Wang Y etal，HortScience，1998；Wang Y et al，Vitis，1995)与欧洲葡萄粉红玫瑰、白玉霓的种间杂交后代65株及抗病杂种后代自交179株为试材，采用改良的CTAB法提取基因组DNA，根据获得的抗白粉病候选基因序列设计特异引物，进行PCR扩增，据特异DNA片段在杂种材料中的表现情况(图5)，对照上述葡萄材料的抗白粉病田间鉴定结果，获得与葡萄抗白粉病基因紧密连锁的DNA片段和抗白粉病基因DNA片段。
实施例2用保存于西北农林科技大学葡萄种质资源圃的中国葡萄属野生种刺葡萄福建-4、塘尾、宁强-6等(贺普超等，中国农业科学，1991；Wang Y et al，HortScience，1998；Wang Y et al，Vitis，1995)与欧洲葡萄优良品种红地球、皇家秋天杂交，获得抗白粉病杂种植株。采用改良的CTAB法提取上述葡萄材料基因组DNA，根据实施例1获得的与抗白粉病基因紧密连锁的DNA片段设计引物，对上述葡萄材料基因组DNA进行PCR扩增，凡扩增产物出现DNA特异片段的杂种材料，为抗白粉病杂种植株，或者是抗白粉病基因的携带者，这些可以用做进一步抗病品种选育的材料和育种种质。
实施例3采用田间自然鉴定、田间接种鉴定对实施例2的葡萄杂种材料进行抗白粉病鉴定，获得抗病杂种与感病杂种。据实施例2获得的与抗白粉病基因紧密连锁的DNA片段设计的引物，对上述葡萄杂种材料进行PCR扩增，据DNA片段在杂种中的扩增与分离情况，结合田间鉴定结果，利用MAPMAKER软件进行抗白粉病基因定位与作图，获得抗病基因连锁图谱，为进一步通过图谱克隆分离抗白粉病基因鉴定基础。
实施例4将实施例1获得的中国葡萄属野生种抗白粉病基因部分DNA片段序列，用DNASTAR软件设计特异5’RACE引物GSP1与3’RACE引物GSP2，用改进的SDS/酚法(果树学报，张今今等，2003，20(3)178-181)提取中国葡萄属野生种刺葡萄福建-4、宁强-6、塘尾葡萄叶片总RNA，逆转录分别合成5’RACE与3’RACEcDNA第一链。用5’RACE引物GSP1与3’RACE引物GSP2分别进行5’RACE与3’RACE PCR扩增。将5’RACE PCR产物与3’RACE PCR产物分别进行1.2％琼脂糖凝胶电泳获得5’RACE与3’RACE全长序列。分别回收5’RACE与3’RACE全长序列并连接T载体。克隆、测序后，进行序列同源性分析，据5’RACE与3’RACE序列重叠区域合并成完整的cDNA全长序列，从而克隆了中国葡萄属野生种抗白粉病基因，获得抗白粉病基因序列，为通过基因工程提高欧洲葡萄品种的抗病性提供基因资源。
基因序列中国葡萄属野生种刺葡萄(V.davidii Foex)福建-4抗白粉病候选基因序列1GGGGTAGGGA AGACAACGCT CGCACGGCTT GTTTACAATG ATGATTTGGC CAAAAATTTT61 GAACTAAAAG CGTGGGTTTG TGTGACTGAT GTGTTTGATG TGGAGAATAT AACAAAAGCA121 ATTCTCAATT CGGTGTTAAA TTCTGATGCA AGTGGCTCTT TGGACTTCCA ACAAATTCAA181 AGGAAATTGA CAGACACGTT AGCAGGGAAA ACTCTTTTTC TCATTCTAGA CGACGTGTGG241 AACGAAAATT ATTGTAATTG GGATCGTTTG CGGGCTCCTT TGAGTGTAGT GGCAAAAGGA301 AGCAAAGTCA TAGTTACAAC ACACAAAAAA AATGTTGCAT TGATGATGGG AGCTGCCAAG361 AATGTTCATG AACTAAACCC TTTATCTGAA GATGATTGTT GGTCTGTGTT TGAGAAGCAT421 GCATTTGAAC ATAGAAATAT CAATGATCAT CCGAATCTGG TGTCCATTGG TAGGAAAATT481 GTTGGCAAAT GTGGTGGATT GCCACTAGCG TTG中国葡萄属野生种刺葡萄(V.davidii Foex)塘尾(3)抗白粉病候选基因序列1GGTGTTGGTA AGACTACCCT TTTGACCCAA ATCAACAATG AGTTCCTCAA AACAACTCAT61 GATTTTGATG TTGTGATCTG GGCTGTGGTG TCACGAGATC CAGACTTTCC CAAGGTTCAA121 GATGAAATTG GGAAAAAGGT TGGGTTTTGT GATGGTATAT GGAGAAATAA AAGCAAGGAT181 GAAAAAGCCA TAGACATCTT TAGAGCCTTG CGCAAAAAGA GGTTTGTGTT GTTAGATGAC241 ATATGGGAGC CGGTAAATCT ATCAGTCTTG GGTGTTCCAG TTCCAAATGA AGAAAATAAG301 TCCAAGCTAG TATTCACAAC CCGATCCGAG GATGTATGCC GCCAAATGGA AGCTCATAAG361 AATATCAAAG TGGAGTGCTT GGCATGGCAG GAATCCTGGG ATTTGTTTCA GAAGAAGGTT421 GGACAAGATA CTCTTGACTC CCATGCAGAA ATCCCCATGC AAGCTGAAAT GGTTGCCAAA481 GAATGTTGCG GATTGCCACT AGCGTTG中国葡萄属野生种刺葡萄(V.davidii Foex)刺葡萄塘尾(5)抗白粉病候选基因序列1GGTGTGGGTA AGACTACGCT CGCACGGCTT GTTTACAATG ATGATTTGGC CAAAAATTTT61 GAACTAAAAG CGTGGGTTTG TGTGACTGAT GTGTTTGATG TGGAGAATAT AACAAAAGCA121 ATTCTCAATT CGGTGTTAAA TTCTGATGCA AGCGGCTCTT TGGACTTCCA ACAAGTTCAA181 CGGAAATTGA CAGTCACATT AGCAGGGAAA ACTCTTTTAC TCATTCTAGA TGACGTGCGG241 AACGAAAATT ATTGTAATTG GGATCGTTTG CGGGCTCCTT TGAGTGTAGT GGCAAAAGGA301 AGCAAAGTCA TAGTTACAAC ACGCAATAAA AATGTTGCAT TGATGATGGG AGCTGCCAAG361 AATGTTCATA AACTAAACCC TTTATCTAAA GATGATTGTT GGTCTGTGTT TGAGAAGCAT421 GCATTTGAAC ATAGGAATAT GGAAGATCAT CCAAACTTGG TGTCCATTGG TAGGAAAATT481 GTTGGCAAGT GTGGGGGATT GCCACTAGCG TTG
权利要求
1.中国葡萄属野生种刺葡萄抗白粉病候选基因序列，其特征在于，包括福建-4、塘尾2个株系共3个中国葡萄属野生种刺葡萄抗白粉病候选基因序列，这些中国葡萄属野生种刺葡萄抗白粉病候选基因序列分别是刺葡萄福建-4抗白粉病候选基因序列1 GGGGTAGGGA AGACAACGCT CGCACGGCTT GTTTACAATG ATGATTTGGC CAAAAATTTT61 GAACTAAAAG CGTGGGTTTG TGTGACTGAT GTGTTTGATG TGGAGAATAT AACAAAAGCA121ATTCTCAATT CGGTGTTAAA TTCTGATGCA AGTGGCTCTT TGGACTTCCA ACAAATTCAA181AGGAAATTGA CAGACACGTT AGCAGGGAAA ACTCTTTTTC TCATTCTAGA CGACGTGTGG241AACGAAAATT ATTGTAATTG GGATCGTTTG CGGGCTCCTT TGAGTGTAGT GGCAAAAGGA301AGCAAAGTCA TAGTTACAAC ACACAAAAAA AATGTTGCAT TGATGATGGG AGCTGCCAAG361AATGTTCATG AACTAAACCC TTTATCTGAA GATGATTGTT GGTCTGTGTT TGAGAAGCAT421GCATTTGAAC ATAGAAATAT CAATGATCAT CCGAATCTGG TGTCCATTGG TAGGAAAATT481GTTGGCAAAT GTGGTGGATT GCCACTAGCG TTG刺葡萄塘尾(3)抗白粉病候选基因序列1 GGTGTTGGTA AGACTACCCT TTTGACCCAA ATCAACAATG AGTTCCTCAA AACAACTCAT61 GATTTTGATG TTGTGATCTG GGCTGTGGTG TCACGAGATC CAGACTTTCC CAAGGTTCAA121GATGAAATTG GGAAAAAGGT TGGGTTTTGT GATGGTATAT GGAGAAATAA AAGCAAGGAT181GAAAAAGCCA TAGACATCTT TAGAGCCTTG CGCAAAAAGA GGTTTGTGTT GTTAGATGAC241ATATGGGAGC CGGTAAATCT ATCAGTCTTG GGTGTTCCAG TTCCAAATGA AGAAAATAAG301TCCAAGCTAG TATTCACAAC CCGATCCGAG GATGTATGCC GCCAAATGGA AGCTCATAAG361AATATCAAAG TGGAGTGCTT GGCATGGCAG GAATCCTGGG ATTTGTTTCA GAAGAAGGTT421GGACAAGATA CTCTTGACTC CCATGCAGAA ATCCCCATGC AAGCTGAAAT GGTTGCCAAA481GAATGTTGCG GATTGCCACT AGCGTTG刺葡萄塘尾(5)抗白粉病候选基因序列1 GGTGTGGGTA AGACTACGCT CGCACGGCTT GTTTACAATG ATGATTTGGC CAAAAATTTT61 GAACTAAAAG CGTGGGTTTG TGTGACTGAT GTGTTTGATG TGGAGAATAT AACAAAAGCA121ATTCTCAATT CGGTGTTAAA TTCTGATGCA AGCGGCTCTT TGGACTTCCA ACAAGTTCAA181CGGAAATTGA CAGTCACATT AGCAGGGAAA ACTCTTTTAC TCATTCTAGA TGACGTGCGG241AACGAAAATT ATTGTAATTG GGATCGTTTG CGGGCTCCTT TGAGTGTAGT GGCAAAAGGA301AGCAAAGTCA TAGTTACAAC ACGCAATAAA AATGTTGCAT TGATGATGGG AGCTGCCAAG361AATGTTCATA AACTAAACCC TTTATCTAAA GATGATTGTT GGTCTGTGTT TGAGAAGCAT421GCATTTGAAC ATAGGAATAT GGAAGATCAT CCAAACTTGG TGTCCATTGG TAGGAAAATT481GTTGGCAAGT GTGGGGGATT GCCACTAGCG TTG。塘尾(3)抗白粉病候选基因序列1 GGTGTTGGTA AGACTACCCT TTTGACCCAA ATCAACAATG AGTTCCTCAA AACAACTCAT61 GATTTTGATG TTGTGATCTG GGCTGTGGTG TCACGAGATC CAGACTTTCC CAAGGTTCAA121GATGAAATTG GGAAAAAGGT TGGGTTTTGT GATGGTATAT GGAGAAATAA AAGCAAGGAT181GAAAAAGCCA TAGACATCTT TAGAGCCTTG CGCAAAAAGA GGTTTGTGTT GTTAGATGAC241ATATGGGAGC CGGTAAATCT ATCAGTCTTG GGTGTTCCAG TTCCAAATGA AGAAAATAAG301TCCAAGCTAG TATTCACAAC CCGATCCGAG GATGTATGCC GCCAAATGGA AGCTCATAAG361AATATCAAAG TGGAGTGCTT GGCATGGCAG GAATCCTGGG ATTTGTTTCA GAAGAAGGTT421GGACAAGATA CTCTTGACTC CCATGCAGAA ATCCCCATGC AAGCTGAAAT GGTTGCCAAA481GAATGTTGCG GATTGCCACT AGCGTTG塘尾(5)抗白粉病候选基因序列1 GGTGTGGGTA AGACTACGCT CGCACGGCTT GTTTACAATG ATGATTTGGC CAAAAATTTT61 GAACTAAAAG CGTGGGTTTG TGTGACTGAT GTGTTTGATG TGGAGAATAT AACAAAAGCA121ATTCTCAATT CGGTGTTAAA TTCTGATGCA AGCGGCTCTT TGGACTTCCA ACAAGTTCAA181CGGAAATTGA CAGTCACATT AGCAGGGAAA ACTCTTTTAC TCATTCTAGA TGACGTGCGG241AACGAAAATT ATTGTAATTG GGATCGTTTG CGGGCTCCTT TGAGTGTAGT GGCAAAAGGA301AGCAAAGTCA TAGTTACAAC ACGCAATAAA AATGTTGCAT TGATGATGGG AGCTGCCAAG361AATGTTCATA AACTAAACCC TTTATCTAAA GATGATTGTT GGTCTGTGTT TGAGAAGCAT421GCATTTGAAC ATAGGAATAT GGAAGATCAT CCAAACTTGG TGTCCATTGG TAGGAAAATT481GTTGGCAAGT GTGGGGGATT GCCACTAGCG TTG。
2.中国葡萄属野生种刺葡萄抗白粉病候选基因序列，包括福建-4、塘尾2个株系共3个中国葡萄属野生种刺葡萄抗白粉病候选基因序列在进行抗白粉病标记辅助育种，用作葡萄育种中检测葡萄抗白粉病基因的探针，以及抗病基因定位与作图、克隆中国葡萄属野生种抗白粉病基因的应用。
全文摘要
本发明涉及葡萄常规杂交育种、分子标记辅助育种、基因定位与作图及基因克隆的方法与技术。本发明采用抗病基因同源序列法(Resistant geneanalogus，RGAs)获得中国葡萄属野生种刺葡萄(V.davidii Foex)福建－4、塘尾2个株系抗白粉病候选基因DNA片段3个，对这些片段克隆测序后，其大小分别为507bp、513bp、513bp。以这些序列为依据，可以进行抗白粉病标记辅助育种，用作葡萄育种中检测葡萄抗白粉病基因的探针；可以根据这些片段在中国野生葡萄与欧洲葡萄杂种后代中的分离情况，进行抗白粉病基因定位与作图；也可以根据这些片段设计特异引物，采用cDNA末端快速扩增技术(Rapid amplification of cDNA ends，RACE)(Frohman etal，Proc.Natl.Acad.Sci，1988)克隆中国野生葡萄刺葡萄抗白粉病基因，为通过基因工程改良葡萄品种的抗病性奠定基础。
文档编号C12N15/82GK1683538SQ200510041759
公开日2005年10月19日 申请日期2005年3月7日 优先权日2005年3月7日
发明者王跃进, 王西平 申请人:西北农林科技大学