新的漆酶及其应用的制作方法

专利名称：新的漆酶及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及可应用于许多领域的新的漆酶。本发明也涉及了为酶编码的核酸、制品载体、宿主细胞和用于生产酶的方法以及含有酶的酶制品。此外，本发明涉及了处理斜纹粗棉布的方法、清除染污的方法、处理天然或人造的纤维或木质纤维的方法、处理羊毛制品的方法、处理毛发的方法以及漂白纸浆和印染厂废水的方法和使染料脱色的方法。本发明还涉及了可以用于上述领域的各种用途和制剂组合物。
背景技术：
漆酶(EC.1.10.3.2对苯二酚氧氧化还原酶)属于多铜氧化酶家族。漆酶广泛分布于高等植物、真菌、某些昆虫和细菌中。它们的特征在于具有低的底物特异性，可以氧化多种多样的底物，包括二酚、多酚、各种不同取代的酚、二胺、芳香胺、以及甚至无机化合物例如碘。漆酶通过单电子氧化机制氧化它们的底物，它们使用分子氧作为电子受体。在不同漆酶中，一级序列、诱导机制、物理化学(例如等电点和碳水化合物含量)和生物化学性质是不同的。然而，漆酶的铜结合位点是严格保守的。
以前，已经分离到了几种漆酶蛋白以及编码这些漆酶的基因。例如WO 01/92498描述了从Melanocarpus albomyces菌株中分离到的真菌漆酶，专利公开EP 0765394 B1(对应于美国专利No.5,981,243)描述了嗜热蚀丝霉(Myceliophthora thermophila)中漆酶基因的克隆及其在曲霉(Aspergillus)中的表达。
Chefetz等(1998a)描述了从堆积的城市土壤废物中分离的漆酶及其初步的性质鉴定。产生该漆酶的微生物后来被鉴定为嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)，该酶被进一步纯化并进行了性质研究(Chefetz et al.，1998b)。报导的酶等电点为5.1。漆酶在70℃ 1小时保持稳定，在40和50℃半衰期分别为24小时和12小时。酶在pH5到10稳定，最适pH为6。Saito等(2003)描述了毛壳菌科(Chaetomiaceae)真菌的细胞外漆酶的纯化和性质。酶的分子量为大约73到80kDa，等电点为3.5。氧化丁香醛连氮的最适pH是7.0，最适温度是42℃。漆酶在4℃可以稳定达288小时，在25和40℃的半衰期估计分别为150和20小时。
漆酶有许多潜在的工业应用，例如木浆的脱木质素、处理含有木质素的纤维的方法、处理木纤维以便使它们功能化或粘合纤维的方法、从可再生原材料生产燃料乙醇的方法的改进、食品应用(例如烘焙和啤酒或白酒的澄清化)、各种生物处理过程和纺织应用，例如斜纹粗棉布的处理、染污的清除、用于纺织工业的各种纤维的处理、使染料脱色的方法和处理印染厂废水的方法，或用于染发制剂、硬表面清洁或洗涤剂制剂中。
近年来，“砂洗”外观或磨损外观成为斜纹粗棉布生产者的兴趣所在。传统的用浮石洗涤降低了织物的强度，并需要负担洗衣设备。近年来已经趋向于酶法斜纹粗棉布整理工艺。斜纹粗棉布的“漂白外观”通常通过漂白化学物质例如次氯酸钠获得。迄今为止，用次氯酸钠漂白对于用靛蓝染色的斜纹粗棉布来说是最有效的漂白方法，因为可以获得几乎所有的色调。然而，次氯酸盐方法对环境非常有害，它难以控制，并且很容易损坏织物。对于用户来说它也是非常不方便或甚至有害的方法，它不能用于含有合成弹力纤维(Lycra)的产品，并且需要几个浸泡/清洗步骤来进行脱氯处理。因此，需要开发生态学危害较低的替代次氯酸钠的方法，具体来说，漆酶就是为此目的而研究的。
WO 97/25468描述了在一种方法中使用漆酶为染色的斜纹粗棉布提供磨损外观。该方法包含了纤维素酶处理，同时或随后用酚氧化酶例如漆酶以及增强剂例如丁香酸甲酯进行处理。嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)中的漆酶是上述专利公开中漆酶的例子。
近年来，在纺织工业中，新的材料、修饰剂和染料不断被开发。尽管这些新的进展具有许多有利的性质，例如易干、防污防水、或织物颜色鲜艳，但是它们通常具有的缺点是必须在低温洗涤。优选低温也因为经济的原因，因为使用低温可以节约能量。因此对能够在低温起作用的漆酶有需求。尽管已有大量出版物描述了来自不同微生物的漆酶，但对于能够更有效地发挥作用、以及更适合于不同应用中的不同条件的新的漆酶，仍然有需求。
发明简述本发明的目的是消除至少一些与现有工艺相关的问题。具体来说，本发明的目的是提供具有适合于不同应用的各种性质的新漆酶。
本发明是基于下述的惊人发现，即可以从相同的属、种、甚至从相同的菌株中分离到具有新的和不同性质的漆酶。某些漆酶特别适合于在相对低的温度下使用。
本发明的一个对象是含有氨基酸序列SEQ ID 41(TaLcc2)或与序列SEQ ID NO41显示出至少60％同一性的序列的漆酶。
更具体来说，本发明的漆酶具有在权利要求1的特征部分中陈述的性质。
酶优选从微生物获得，更优选从有丝状真菌中获得，特别是从梭孢壳菌属(Thielavia)中获得，更特别从Thielavia arenaria种中获得。有利的是，酶可以从2004年9月2日保藏于荷兰Centraalbureau voorSchimmelcultures(Upsalalaan 8，3584 CT，Utrecht，the Netherlands)的菌株CBS 116071中获得。
酶可以在从pH3到9的宽广的pH范围内起作用，优选在pH4到8的范围内，更优选在pH4.5到6.5的范围内起作用。酶也可以在宽广的温度范围内起作用。例如在斜纹粗棉布的处理中，酶在30到80℃的范围内有效，优选在40到60℃的温度范围内有效。酶在温度40到50℃下活性最高，因此在较低温度下更有利的应用中非常有用。
具体来说，在斜纹粗棉布的处理中，可以在低温下使用的漆酶比在常规温度例如大约60℃下作用较好的漆酶有优势。较低的温度节约能量，更为经济。
本发明的漆酶也适合于其它低温更为有利的应用。这样的应用例如其它的纺织工业应用例如清除染污，或例如染发。
本发明的另一个目的是含有序列SEQ ID 43(TaLcc3)或与序列SEQ ID NO43显示出至少58％的同一性的序列的漆酶。
更具体来说，本发明的漆酶具有在权利要求17的特征部分中陈述的性质。
酶优选从微生物获得，更优选从有丝状真菌中获得，特别是从梭孢壳菌属(Thielavia)中获得，更特别从Thielavia arenaria种中获得。有利的是，酶可以从2004年9月2日保藏于荷兰Centraalbureau voorSchimmelcultures(Upsalalaan 8，3584 CT，Utrecht，the Netherlands)的菌株CBS 116071中获得。
酶可以在从pH3.5到7.5的范围内起作用，优选在pH4到6.5的范围内起作用。
本发明的另一个目的目的是含有序列SEQ ID 45(TaLcc4)或与序列SEQ ID NO45显示出至少78％的同一性的序列的漆酶。
更具体来说，本发明的漆酶具有在权利要求23的特征部分中陈述的性质。
酶优选从微生物获得，更优选从有丝状真菌中获得，特别是从梭孢壳菌属(Thielavia)中获得，更特别从Thielavia arenaria种中获得。有利的是，酶可以从2004年9月2日保藏于荷兰Centraalbureau voorSchimmelcultures(Upsalalaan 8，3584 CT，Utrecht，the Netherlands)的菌株CBS 116071中获得。
酶可以在从pH3.5到7.5的范围内起作用，优选在pH4到7的范围内起作用，更优选在pH5到6.5的范围内起作用。
本发明的另一个目的是含有序列SEQ ID 47(CtLcc1)或与序列SEQ ID NO47显示出至少74％的同一性的序列的漆酶。
更具体来说，本发明的漆酶具有在权利要求29的特征部分中陈述的性质。
酶优选从微生物获得，更优选从有丝状真菌中获得，特别是从毛壳菌属(Chaetomium)中获得，更特别从嗜热毛壳菌种中获得。有利的是，酶可以从1995年11月8日保藏于荷兰Centralbureau VoorSchimmelcultures(Oosterstraat 1，3742 SK B AARN，The Netherlands)的菌株CBS 730.95中获得。
酶可以在从pH3.5到8的范围内起作用，优选在pH4到7的范围内，更优选在pH4.5到6的范围内起作用。例如在斜纹粗棉布的处理中，酶在30到80℃的范围内有效，优选在40到70℃的温度范围内有效，更优选在50到60℃的温度范围内有效。
本发明的另一个目的是含有氨基酸序列SEQ ID 49(CtLcc2)或与序列SEQ ID NO49显示出至少55％的同一性的序列的漆酶。
更具体来说，本发明的漆酶具有在权利要求42的特征部分中陈述的性质。
酶优选从微生物获得，更优选从有丝状真菌中获得，特别是从毛壳菌属(Chaetomium)中获得，更特别从嗜热毛壳菌种中获得。有利的是，酶可以从1995年11月8日保藏于荷兰Centralbureau VoorSchimmelcultures(Oosterstraat 1，3742 SK BAARN，The Netherlands)的菌株CBS 730.95中获得。
本发明的一个对象是含有氨基酸序列SEQ ID 51(CtLcc3)或与序列SEQ ID NO51显示出至少53％的同一性的序列的漆酶。
更具体来说，本发明的漆酶具有在权利要求46的特征部分中陈述的性质。
酶优选从微生物获得，更优选从有丝状真菌中获得，特别是从毛壳菌属(Chaetomium)中获得，更特别从嗜热毛壳菌种中获得。有利的是，酶可以从1995年11月8日保藏于荷兰Centralbureau VoorSchimmelcultures(Oosterstraat 1，3742 SK BAARN，The Netherlands)的菌株CBS 730.95中获得。
具体来说，本发明涉及与氨基酸序列SEQ ID NO41(TaLcc2)显示出至少60％同一性的漆酶，与氨基酸序列SEQ ID NO43(TaLcc3)显示出至少58％同一性的漆酶，与氨基酸序列SEQ ID NO45(TaLcc4)显示出至少78％同一性的漆酶，与氨基酸序列SEQ ID NO47(CtLcc1)显示出至少74％同一性，并且在40到60℃的温度范围内最有效的漆酶。
本发明的另一个目的是为本发明的至少一个酶编码的核酸序列。
核酸序列具有在权利要求56的特征部分中陈述的性质。
本发明的另一个目的是含有核酸序列的载体和含有核酸序列或载体的宿主、以及生产具有漆酶活性的多肽的方法。
本发明的另一个目的是获得含有多肽或酶的酶制品的方法，包括培养含有编码酶的核酸序列的宿主细胞或含有核酸序列的载体的宿主细胞、以及从细胞中回收多肽或从培养基中分离细胞并获得上清液的步骤。此外，本发明的一个目的是含有本发明的漆酶的酶制品。
本发明的一个目的是处理斜纹粗棉布的方法，包含将斜纹粗棉布在水性介质中与本发明的酶或酶制品在适合于酶作用的条件下进行接触。
本发明的一个对象是清除染污的方法，包含将用该方法处理的材料与本发明的漆酶在适合于酶作用的条件下进行接触。
本发明还提供了通过使用本发明的漆酶漂白纸浆的方法、处理天然或人造纤维的方法、处理羊毛的方法、处理毛发的方法、处理印染厂废水的方法和使染料脱色的方法。
本发明的其它目的是本发明的漆酶在各种不同的实践和组合物中的应用。
通过在斜纹粗棉布的漂白中使用本发明的漆酶可以获得许多优势。通过使用本发明的漆酶，可以降低甚至避免次氯酸钠的环境有害影响。如果不使用次氯酸钠，就不需要脱氯处理。通过本发明的漆酶，也可能获得象次氯酸钠漂白那样的各种不同的色调。本发明的漆酶的一个优点是处理不损坏织物。漆酶也可以用于处理含有合成弹力纤维(Lycra)的产品。此外，漆酶处理对于用户来说也很方便。
此外，酶可以在宽广的温度和pH范围内起作用。某些酶特别适合于在较低温度下使用，特别是在40到50℃的温度范围内。
从下面的描述和随附的权利要求中，本发明的其它特征、特点和优点将变得明显。
附图简述

图1A在50ml摇瓶培养中生产梭孢壳菌漆酶。
图1B在50ml摇瓶培养中生产毛壳菌漆酶。
图2A显示了梭孢壳菌漆酶的纯化的SDS-PAGE(15％)。1道为分子量标准物(175、83、62、47、32.5、25、16.5和6.5kDa)，2道为培养物上清液，3道为DEAE琼脂糖层析后的级分，4-7道为凝胶过滤后的级分分，每条道大约上样3-6μg蛋白。蛋白用考马斯亮蓝染色。
图2B显示了毛壳菌漆酶的纯化的SDS-PAGE(12％)。1道为培养物上清液(60μg)，2道为离子交换层析后(14.5μg)的级分，3道为分子量标准物(175、83、62、47.5、32.5、25、16.5和6.5kDa)，4-9道为HIC后的级分(3.5、3.3、3.1、2.4、2.0和1.5μg)，10道为培养物上清液(30μg)。
图3A用邻甲氧基苯酚确定的纯化的梭孢壳菌漆酶(PTL)和粗酶(CE)的pH最适条件。
图3B用邻甲氧基苯酚确定的纯化的毛壳菌漆酶(PTL)和粗酶(CE)的pH最适条件。
图4A梭孢壳菌漆酶在50和60℃下的热稳定性。
图4B毛壳菌漆酶在50和60℃下的热稳定性。
图5、设计用于克隆Thielavia arenaria ALKO4197和嗜热毛壳菌ALKO4265的漆酶基因的PCR引物的肽序列。显示了所有可能的编码序列的密码子。A从几种真菌漆酶序列的比对中选择的同源肽序列。肽II和III中的第一个甲硫氨酸(圆括号中)在所有漆酶序列中没有出现。B从纯化的Thielavia arenaria ALKO4197的TaLcc1获得的胰蛋白酶肽序列。C从纯化的嗜热毛壳菌ALKO4265的CtLcc1获得的N-末端序列和胰蛋白酶肽序列。
图6A-G、Thielavia arenaria ALKO4197和嗜热毛壳菌ALKO4265漆酶基因的核苷酸和推断的氨基酸序列。终止密码子用序列下方的星号显示。序列中推断的内含子的位置和共有的内含子拼接信号(5′GTPuNGPy，3′PyAG，内部的NNCTPuAPy)分别使用小写字母和粗体字母标记。使用SignalP V2.0程序分析而推测的从纯化的重组TaLcc1和TaLcc2蛋白确定的信号肽以及成熟的C端氨基酸序列被下划线。由较长的Talcc2基因编码的其它潜在的信号序列用双下划线标记。CtLcc1的N末端肽的位置和从纯化的TaLcc1和CtLcc1获得的胰蛋白酶肽序列用序列下方的虚线标记。参与铜结合的保守残基被加亮。推测的N-糖基化(N-X-S/T)位点用粗体标记。TaLcc2和CtLcc3的两个推测的翻译起始位点被加框。ATalcc1，BTalcc2，CTalcc3，DTalcc4，ECtlcc1，FCtlcc2，GCtlcc3。
图7A-C、用于转化里氏木霉(Trichoderma reesei)原生质体生产重组真菌漆酶的表达盒。漆酶基因在cbh1(ce17A)启动子(p cbh1)的控制之下，通过使用cbh1终止子序列(t cbh1)确保转录的终止。包含了amdS基因作为转化标记，cbh1 3′-侧翼区域与cbh1启动子一起被用来确保表达盒通过同源重组定位到cbh1位点中。
图8、在实施例7中描述的条件下，在不同pH值下，漆酶制品在斜纹粗棉布漂白中的性能。
图9、在实施例8中描述的条件下，在不同温度下，漆酶制品在斜纹粗棉布漂白中的性能。
图10A和B、在实施例9描述的条件下CtLcc1漆酶在60℃及TaLcc2和TaLcc4漆酶在50℃下对草渍的效果。在两种温度下介体对照不含酶。A亮度值；Ba*-值(-a表示向绿色方向，+a表示向红色方向)。
图11A和B、在实施例9描述的条件下CtLcc1漆酶在60℃及TaLcc2和TaLcc4漆酶在50℃下对茶渍的效果。在两种温度下介体对照不含酶。A亮度值；Ba*-值(-a表示向绿色方向，+a表示向红色方向)。
图12A和B、在实施例10描述的条件下不同剂量的漆酶制品在40℃下对草渍的效果。A亮度值；Ba*-值(-a表示向绿色方向，+a表示向红色方向)。
图13A和B、在实施例10描述的条件下不同剂量的漆酶制品在40℃下对茶渍的效果。A亮度值；Ba*-值(-a表示向绿色方向，+a表示向红色方向)。
序列SEQ ID NO1肽1，Thielavia arenaria ALKO4197的TaLcc1蛋白的胰蛋白酶肽的序列。
SEQ ID NO2肽2，Thielavia arenaria ALKO4197的TaLcc1蛋白的胰蛋白酶肽的序列。
SEQ ID NO3肽3，Thielavia arenaria ALKO4197的TaLcc1蛋白的胰蛋白酶肽的序列。
SEQ ID NO4嗜热毛壳菌ALKO4265的CtLcc1蛋白的N-末端序列。
SEQ ID NO5肽18.9，嗜热毛壳菌ALKO4265的CtLcc1蛋白的胰蛋白酶肽的序列。
SEQ ID NO6肽22.4，嗜热毛壳菌ALKO4265的CtLcc1蛋白的胰蛋白酶肽的序列。
SEQ ID NO7肽22.7，嗜热毛壳菌ALKO4265的CtLcc1蛋白的胰蛋白酶肽的序列。
SEQ ID NO8寡聚核苷酸引物POX1的序列。
SEQ ID NO9寡聚核苷酸引物POX2的序列。
SEQ ID NO10寡聚核苷酸引物POX22的序列。
SEQ ID NO11寡聚核苷酸引物POX3的序列。
SEQ ID NO12寡聚核苷酸引物POX16的序列。
SEQ ID NO13寡聚核苷酸引物POX23的序列。
SEQ ID NO14寡聚核苷酸引物POX26的序列。
SEQ ID NO15寡聚核苷酸引物POX27的序列。
SEQ ID NO16寡聚核苷酸引物POX28的序列。
SEQ ID NO17寡聚核苷酸引物POX29的序列。
SEQ ID NO18寡聚核苷酸引物POX30的序列。
SEQ ID NO19寡聚核苷酸引物POX31的序列。
SEQ ID NO20寡聚核苷酸引物POX4的序列。
SEQ ID NO21寡聚核苷酸引物POX5的序列。
SEQ ID NO22寡聚核苷酸引物POX6的序列。
SEQ ID NO23寡聚核苷酸引物POX7的序列。
SEQ ID NO24寡聚核苷酸引物POX8的序列。
SEQ ID NO25寡聚核苷酸引物POX9的序列。
SEQ ID NO26寡聚核苷酸引物POX10的序列。
SEQ ID NO27寡聚核苷酸引物POX11的序列。
SEQ ID NO28寡聚核苷酸引物POX12的序列。
SEQ ID NO29寡聚核苷酸引物POX13的序列。
SEQ ID NO30寡聚核苷酸引物POX14的序列。
SEQ ID NO31寡聚核苷酸引物POX15的序列。
SEQ ID NO32使用引物POX27和POX31从Thielavia arenariaALKO4197获得的PCR片段的序列。
SEQ ID NO33使用引物POX4和POX11从Thielavia arenariaALKO4197获得的PCR片段的序列。
SEQ ID NO34使用引物POX27和POX9从Thielavia arenariaALKO4197获得的PCR片段的序列。
SEQ ID NO35使用引物POX8和POX11从嗜热毛壳菌ALKO4265获得的PCR片段的序列。
SEQ ID NO36使用引物POX4和POX9从嗜热毛壳菌ALKO4265获得的PCR片段的序列。
SEQ ID NO37使用引物POX8和POX11从嗜热毛壳菌ALKO4265获得的PCR片段的序列。
SEQ ID NO38Thielavia arenaria ALKO4197 Talcc1基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO39Thielavia arenaria ALKO4197 Talcc1推断的氨基酸序列。
SEQ ID NO40Thielavia arenaria ALKO4197 Talcc2基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO41Thielavia arenaria ALKO4197 Talcc2推断的氨基酸序列。
SEQ ID NO42Thielavia arenaria ALKO4197 Talcc3基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO43Thielavia arenaria ALKO4197 Talcc3推断的氨基酸序列。
SEQ ID NO44Thielavia arenaria ALKO4197 Talcc4基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO45Thielavia arenaria ALKO4197 Talcc4推断的氨基酸序列。
SEQ ID NO46嗜热毛壳菌ALKO4265 Ctlcc1基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO47嗜热毛壳菌ALKO4265 Ctlcc1推断的氨基酸序列。
SEQ ID NO48嗜热毛壳菌ALKO4265 Ctlcc2基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO49嗜热毛壳菌ALKO4265 Ctlcc2推断的氨基酸序列。
SEQ ID NO50嗜热毛壳菌ALKO4265 Ctlcc3基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO51嗜热毛壳菌ALKO4265 Ctlcc3推断的氨基酸序列。
保藏Thielavia arenaria ALKO4197于2004年9月2日保藏于荷兰的Centralbureau Voor Schimmelcultures(Upsalalaan 8，3584 CT，Utrecht，the Netherlands)，被指派的登记号为CBS 116071。
嗜热毛壳菌ALKO4265于1995年11月8日保藏于荷兰的Centralbureau Voor Schimmelcultures(Oosterstraat 1，3742 SK BAARN)，被指派的登记号为CBS 730.95。在本保藏期结束后，样品将在协议下保存，以便使菌株在专利的可实施期之外可以被获得。
包含质粒pALK1342的大肠杆菌菌株于2003年3月7日保藏于德国的Deutsche Sammlung von Mikroorganisraen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)(Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，Germany)，被指派的登记号为DSM 15484。
包含质粒pALK1347的大肠杆菌菌株于2003年3月7日保藏于德国的Deutsche Sammlung von Mikroorganisraen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)(Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，Germany)，被指派的登记号为DSM 15486。
包含质粒pALK1345的大肠杆菌菌株于2003年3月7日保藏于德国的Deutsche Sammlung von Mikroorganisraen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)(Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，Germany)，被指派的登记号为DSM 15485。
包含质粒pALK1664的大肠杆菌菌株于2003年3月7日保藏于德国的Deutsche Sammlung von Mikroorganisraen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)(Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，Germany)，被指派的登记号为DSM 15487。
包含质粒pALK1304的大肠杆菌菌株于2002年6月27日保藏于德国的Deutsche Sammlung von Mikroorganisraen und ZellkulturenGmbH(DSMZ)(Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，Germany)，被指派的登记号为DSM 15075。
包含质粒pALK1305的大肠杆菌菌株于2002年6月27日保藏于德国的Deutsche Sammlung von Mikroorganisraen und ZellkulturenGmbH(DSMZ)(Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，Germany)，被指派的登记号为DSM 15076。
包含质粒pALK1685的大肠杆菌菌株于2003年11月20日保藏于德国的Deutsche Sammlung von Mikroorganisraen und ZellkulturenGmbH(DSMZ)(Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，Germany)，被指派的登记号为DSM 16040。
发明详述本发明提供了几种漆酶，它们具有各种不同的性质，适合于不同的应用。
“本发明的漆酶(单数或复数)”在这里是指在本文中描述的和权利要求中定义的那样的漆酶组。
本发明中的“漆酶”是指根据酶命名法分类为EC 1.10.3.2的酶。漆酶可以源自任何生物，包括植物，优选情况下源自微生物。它可以源自细菌，例如来自从包含芽孢杆菌属、固氮螺菌属(Azospirillum)和链霉菌属(Streptomyces)的组中选择的属。优选情况下酶源自真菌(包括有丝状真菌和酵母)，例如来自从包含梭孢壳菌属(Thielavia)、毛壳菌属(Chaetomium)、Achaetomium、曲霉属(Aspergillus)、葡萄孢属(Botrytis)、金钱菌属(Collybia)、层孔菌属(Fomes)、腐质霉属(Humicola)、肉座菌属(Hypocrea)、菇属(Lentinus)、Melanocarpus、毁丝霉属(Myceliophthora)、脉孢菌属(Neurospora)、射脉菌属(Phlebia)、侧耳属(Pleurotus)、足孢虫属(Podospora)、多孔菌属(Polyporus)、丝核菌属(Rhizoctonia)、柱霉属(Scytalidium)、密孔菌属(Pycnoporus)、栓菌属(Trametes)和木霉属(Trichoderma)的组中选择的属。
根据本发明的优选实施方案，本发明的漆酶可以从梭孢壳菌属(Thielavia)中获得，更优选情况下从Thielavia arenaria获得。根据本发明的最优选实施方案，酶可以从保藏在Centraalbureau voorSchimmelcultures的登记号为CBS 116071的菌株获得。
根据本发明的另一个优选实施方案，本发明的漆酶可以从毛壳菌属(Chaetomium)中获得，更优选情况下从嗜热毛壳菌获得。根据本发明的最优选实施方案，酶可以从保藏在Centraalbureau voorSchimmelcultures的登记号为CBS 730.95的菌株获得。
本发明的漆酶的来源不限于梭孢壳菌属或T.arenaria种或毛壳菌属或嗜热毛壳菌(C.thermophilum)种。使用本文提供的描述，本领域的专业技术人员可以从其它属的真菌、从其它的微生物以及从高等生物例如植物中发现和分离到本发明的漆酶。
本发明的漆酶可以从任何产生漆酶的生物中分离。优选情况下，本发明的漆酶从微生物来源分离。可以筛选能够产生漆酶的生物，可以确定对各种底物的活性，可以研究酶的性质。例如，酶起作用的pH和温度范围、最适pH和温度、以及酶在不同温度的稳定性可以被测定。此外，可以分离各种生物中编码漆酶的基因，这些基因编码的氨基酸序列可以与在本文的实施例中分离和研究性质的漆酶的氨基酸序列进行比较。这其中包括了从环境样品中直接克隆。
产生本发明的漆酶的微生物可以从自然界分离，它们也可以从已经分离并鉴定的菌株培养物保藏中通过使用本领域的专业人员熟知的筛选方法进行筛选。筛选可以通过测量酶活性以研究在平板培养的固体培养物上或液体培养基中酶的产生来进行。适合于测量活性的底物包括ABTS、二甲氧基酚(DMP)、邻甲氧基苯酚和丁香醛连氮。真菌可以通过例如实施例1中提到的方法，使用指示剂例如Remazol亮蓝R-478和邻甲氧基苯酚或ABTS来筛选它们生产漆酶的能力。也可以从高等生物例如植物中分离适合的漆酶并克隆编码它们的基因。
作为筛选的结果而被发现的微生物菌株可以在适当的培养基上培养，培养溶液或平板中漆酶的形成可以被观察到。在足够量的所需漆酶产生后，可以将酶纯化，并对其性质进行更全面的研究。
产生的漆酶可以通过使用常规的蛋白质化学方法来分离和纯化，例如盐沉淀、超滤、离子交换层析以及疏水相互作用层析。纯化可以通过蛋白测定、酶活性分析和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳来监测。纯化的酶在不同温度和pH值下的酶活性可以被测定；同样地，分子量和等电点也可以被测定。
纯化的酶是指除了漆酶蛋白之外没有其它蛋白或其它蛋白的量非常低的酶制品。获得的基本上不含其它蛋白的漆酶的纯度大于等于90％。
实施例1中已经例举了本发明的优选漆酶的纯化。将梭孢壳菌浓缩的培养过滤液上样Q Sepharose FF柱，用逐渐增加的盐梯度将蛋白洗脱，将有漆酶活性的级分上样Sephacryl S100凝胶过滤树脂。在纯化后进行活性分析，然后进行SDS-PAGE，随后用考马斯亮蓝染色。为了获得高纯度的样品，可以包含额外的Resource Q阴离子交换步骤。通过超滤将毛壳菌漆酶的培养上清液浓缩，并将缓冲液改变成结合缓冲液。将蛋白结合到DEAE Sepharose FF上，用硫酸钠梯度洗脱，将有漆酶活性的级分合并，进一步用疏水相互作用层析进行纯化。最后通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分析活性级分的纯度。自然，通过使用其它已知的纯化方法代替或加入到这里描述的方法中以分离本发明的酶也是可能的。
例如在实施例2中描述，漆酶的分子量可以在SDS-PAGE上按照Laemmli(1970)的方法来测定，漆酶的等电点可以使用等电聚焦来测定，含有漆酶活性的条带可以通过用ABTS染色凝胶来看见。
漆酶在不同温度下活性的测定可以象实施例1中描述的那样，使用ABTS作为底物，按照Niku-Paavola等(1988)发展的方法或文献中描述的其它方法来进行。
漆酶的最适pH可以使用适当的底物，在具有不同pH值的适当的缓冲液中通过测量活性来确定。
热稳定性可以通过将酶样品在具有确定pH值的适当的缓冲液中在不同温度下保温不同的时间来测定。可以通过测量活性确定在规定的pH值下酶在每种温度下的残留活性。
纯化的漆酶的比活性可以针对不同的漆酶底物例如ABTS、二甲氧基酚(DMP)、丁香醛连氮和邻甲氧基苯酚来测定。
各种抑制剂对漆酶活性的影响可以在存在抑制剂的情况下通过例如在密封并完全充气的容器中使用氧电极测量酶与ABTS反应过程中氧气的消耗、或通过比色方法测量酶活性来确定。
蛋白的N末端以及内部肽可以按照实施例2中描述的Edman降解化学方法[Edman和Begg(1967)]或文献中描述的其它方法来测序。
从Thielavia arenaria和嗜热毛壳菌培养上清液中分离到的纯化的主要漆酶的分子量都大约为80kDa。纯化的梭孢壳菌漆酶在等电聚焦中在等电点为5.5、5.9、6.4、6.8和6.9处显示出多条条带。纯化的毛壳菌漆酶在等电聚焦中在等电点为4.1到4.3之间显示出3-4条条带。
纯化的梭孢壳菌漆酶用邻甲氧基苯酚测定的最适pH是5.5，酶在pH7时仍显示出相当高的活性。纯化的毛壳菌漆酶的最适pH是5.0。测量的准确性是±0.5。
梭孢壳菌漆酶的比活性以ABTS为底物时最高，在pH4.5时为1020nkat/mg蛋白。在pH5.5时以DMA为底物比活性为260、以丁香醛连氮为底物为490、以邻甲氧基苯酚为底物为63nkat/mg蛋白。毛壳菌漆酶的比活性以ABTS为底物时最高，在pH4.5时为750nkat/mg蛋白。在pH5.5时以DMP为底物比活性为290、以丁香醛连氮为底物为400、以邻甲氧基苯酚为底物为85nkat/mg蛋白。
显示出有利性质的漆酶既可以通过原始菌株生产，也可以通过重组宿主生产，其方法包括在适当的条件下培养已经导入了编码该漆酶的DNA序列和表达该酶所需的序列的宿主，并且也可以分离该酶。生产宿主可以是任何能够表达漆酶的生物。优选的宿主是微生物细胞，更优选是真菌。最优选的宿主是丝状真菌。在优选情况下，重组宿主被修饰以便表达和分泌漆酶作为其主要活性或主要活性之一。用过的生产宿主的培养基也可以这样使用，或者可以将它浓缩、过滤或分级。它也可以被干燥。
适合表达和生产的宿主系统例如为真菌宿主木霉开发的生产系统(EP 244 234)，或曲霉(Aspergillus)例如A.oryzae或A.niger开发的生产系统(WO 9708325 a和WO 9533386、US 5,843,745、US5,770,418)，或为镰孢属(Fusarium)的真菌菌种例如F.oxysporum开发的生产系统(Malardier等，1989)。为细菌开发的适合的生产系统是例如为枯草芽孢杆菌(B.subtilis)或大肠杆菌或放线菌链霉菌属(Streptomyces)开发的生产系统。为酵母开发的适合的生产系统是为酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Shizosaccharomyces)或巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)开发的系统。某些其它微生物或哺乳动物细胞中的生产系统也可以使用。
生产本发明的漆酶的优选宿主具体来说是木霉属(Trichoderma)或曲霉属(Aspergillus)的菌株。
将编码选定的漆酶的核酸序列导入宿主所用的载体也在本发明的保护范围内。有利于漆酶编码序列的表达和分泌的序列、例如启动子和信号序列，也在本发明的保护范围内。
在漆酶的克隆过程中、即在DNA的分离和酶法处理、在大肠杆菌转化过程等中，可以使用标准的分子生物学方法。所用的基本方法在标准的分子生物学手册中有描述，例如Sambrook等(1989)及Sambrook和Russell(2001)。
用通过PCR制备的探针对从选定的宿主生物制备的基因组文库进行筛选。用于PCR反应的寡聚核苷酸引物的序列是基于从天然宿主生产的纯化的漆酶获得的肽的氨基酸序列，以及真菌漆酶的共有序列。获得的DNA产物的性质通过测序以及与用几种限制性酶消化的梭孢壳菌和毛壳菌基因组DNA进行Southern印迹杂交来研究。
从梭孢壳菌分离到了4个漆酶基因，从毛壳菌分离到了3个漆酶基因。所有这些基因被加入到质粒载体中，转入到大肠杆菌菌株中保存于DSMZ保藏中心。全长的梭孢壳菌漆酶基因Talcc1被包含在质粒pALK.1342中，保存的登记号为DSM 15484。同样地，梭孢壳菌漆酶基因Talcc2被包含在质粒pALK1347中，保存的登记号为DSM 15486，基因Talcc3被包含在质粒pALK1345中，保存的登记号为DSM 15485，基因Talcc4被包含在质粒pALK1664中，保存的登记号为DSM 15487。毛壳菌漆酶基因Ctlcc1被包含在质粒pALK1304中，保存的登记号为DSM15075。Ctlcc2被包含在质粒pALK1305中，保存的登记号为DSM15076。Ctlcc3被包含在质粒pALK1685中，保存的登记号为DSM16040。从DNA序列分析推测出了漆酶的氨基酸序列。
漆酶基因和推测的漆酶蛋白的序列显示在图6中。与基因和推测的氨基酸序列相关的信息分别被概述在表8和9中。
例如，包括终止密码子的Talcc2基因的长度是1957bp(或1737bp，这依赖于翻译起始位点)，基因含有两个内含子。推测的蛋白序列由589个氨基酸(推测的较短氨基酸序列含有579个氨基酸)组成，包括了29/24个氨基酸的推测的信号序列，在DSGL共有序列之后没有“尾巴”。成熟的多肽的推测分子量为61811/62274Da，推测的等电点为4.65/4.65(除去信号肽后)。推测的氨基酸序列包含12个推定的N-糖基化位点。
Ctlcc1基因的长度是2127bp(包括终止密码子)，基因含有5个内含子。推测的蛋白序列由607个氨基酸组成，包括了20个氨基酸的推测的信号序列，在DSGL共有序列之后有13个氨基酸的“尾巴”。成熟的多肽的推测分子量为63905Da(不包括信号序列和尾巴)，推测的等电点为6.09(除去信号肽后)。推测的氨基酸序列包含9个推定的N-糖基化位点。
TaLcc1和CtLcc1的推测的氨基酸序列被发现彼此之间最为同源，TaLcc3和CtLcc2之间也是同样(在基因水平上也是这样，例如在相应基因的内含子的组织方面)。使用Needleman-Wunsch全面比对(EMBLOSUM62，空隙罚分10.0，扩展罚分0.5；欧洲分子生物学开放软件套装程序包，2.9.0版；Rice等，2000)获得的TaLcc1和CtLcc1之间的同一性值是69.5％，TaLcc3和CtLcc2之间的同一性值是67.3％(表10)。从表10中可以看到，当其它漆酶蛋白彼此之间进行比对以及与TaLcc1、CtLcc1、TaLcc3和CtLcc2进行比对时，同一性值较低。
此处的术语“同一性”是指两个氨基酸序列之间进行比较，从相应的基因编码的第一个氨基酸到最后一个氨基酸之间的同一性。全长序列的同一性使用Needleman-Wunsch全面比对程序进行测量，使用EMBOSS(欧洲分子生物学开放软件套装)程序包，2.9.0版，使用下列的参数EMBLOSUM62，空隙罚分10.0，扩展罚分0.5。
本发明的范围内包括了含有具有漆酶活性并且与氨基酸序列SEQID NO41(TaLcc2)显示出至少60％同一性的氨基酸序列的酶或多肽。优选的酶包含显示出至少65％、更优选至少70％、更优选至少75％的同一性的氨基酸序列。更优选情况下，氨基酸序列显示出与氨基酸序列SEQ ID NO41具有至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、最优选至少95％的同一性。
本发明的范围内还包括了含有具有漆酶活性并且与氨基酸序列SEQ ID NO43(TaLcc3)显示出至少58％同一性的氨基酸序列的酶或多肽。优选的酶包含显示出至少65％、更优选至少68％、更优选至少75％的同一性的氨基酸序列。更优选情况下，氨基酸序列与显示出氨基酸序列SEQ ID NO43具有至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、最优选至少95％的同一性。
本发明的范围内还包括了含有具有漆酶活性并且与氨基酸序列SEQ ID NO45(TaLcc4)显示出至少78％同一性的氨基酸序列的酶或多肽。优选的酶包含显示出至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％的同一性的氨基酸序列。更优选情况下，氨基酸序列显示出与氨基酸序列SEQ ID NO45具有至少95％的同一性。
本发明的范围内还包括了含有具有漆酶活性并且与氨基酸序列SEQ ID NO47(CtLcc1)显示出至少74％同一性的氨基酸序列的酶或多肽。优选的酶包含显示出至少76％、更优选至少80％、更优选至少85％的同一性的氨基酸序列。更优选情况下，氨基酸序列与氨基酸序列SEQID NO47显示出至少90％、最优选至少95％的同一性。
本发明的范围内还包括了含有具有漆酶活性并且与氨基酸序列SEQ ID NO49(CtLcc2)显示出至少55％同一性的氨基酸序列的酶或多肽。优选的酶包含显示出至少60％、更优选至少68％的同一性的氨基酸序列。更优选情况下，氨基酸序列与氨基酸序列SEQ ID NO49显示出至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、最优选至少95％的同一性。
本发明的范围内还包括了含有具有漆酶活性并且与氨基酸序列SEQ ID NO51(CtLcc3)显示出至少53％同一性的氨基酸序列的酶或多肽。优选的酶包含显示出至少60％、更优选至少65％、更优选至少70％的同一性的氨基酸序列。更优选情况下，氨基酸序列与氨基酸序列SEQID NO51显示出至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、最优选至少95％的同一性。
本发明的范围内还包括了酶和截短的多肽，它们与上面定义的相同，但是缺少了信号序列或尾巴或两者。信号序列或尾巴或两者可以在例如生产的翻译后阶段、或在用过的培养基中、或在培养基或酶制品的储存过程中被切掉。此外，蛋白的前肽可以被宿主切开。截短也可以通过例如在为多肽编码的基因转化到生产宿主中之前将其缩短而获得。
本发明的漆酶可以生产到它的天然宿主或重组宿主的培养基中，然后通过使用现有的蛋白质化学方法将其从中分离和纯化。如果培养基中含有足够高的漆酶量并且没有其它有害蛋白，就可能可以通过简单地分离细胞而使用培养基。如果需要，可以将培养溶液浓缩、过滤、分级和/或纯化。它也可以被干燥。在各种应用中，优选使用含有较大量漆酶的酶制品。这样的酶制品可以通过基因技术手段或最适化培养条件通过在生产宿主的培养基中产生增加量的漆酶来制备。增加量是指漆酶的量超过天然宿主自然产生的漆酶的量。此处的“用过的培养基”是指含有产生的酶的宿主培养基。
根据本发明的优选实施方案，梭孢壳菌和毛壳菌漆酶可以在丝状真菌宿主中生产，优选在木霉宿主中生产。在实施例4中对生产进行了更详细的描述。在实施例5中描述了重组漆酶的纯化和最适pH、热稳定性以及等电点等性质。以邻甲氧基苯酚为底物时，梭孢壳菌漆酶TaLcc2的最适pH为pH5.5，TaLcc3的最适pH为pH5.0，以DMP为底物时，TaLcc4的最适pH为pH6.0。以邻甲氧基苯酚为底物时，CtLcc1的最适pH为pH5.0。
以邻甲氧基苯酚为底物测定时，TaLcc2酶在从pH3到9的宽广的pH范围内起作用，优选从pH4到8，最优选从pH4.5到6.5。以邻甲氧基苯酚为底物测定时，TaLcc3酶在从pH3.5到7.5的pH范围内起作用，优选从pH4到6.5。以DMP为底物测定时，TaLcc4酶在从pH3.5到7.5的pH范围内起作用，优选从pH4到7，最优选从pH5到6.5。
以邻甲氧基苯酚为底物测定时，CtLcc1酶在从pH3.5到8的pH范围内起作用，优选从pH4到7，最优选从pH4.5到6。
在上述的pH范围中，第一个pH范围是指在该范围内有最大活性的20％或以上，第二个pH范围是指在该范围内有活性的40％或以上。第三个pH范围是指在该范围内有活性的80％或以上。
以ABTS、DMP、丁香醛连氮和邻甲氧基苯酚为底物测定的比活性按照实施例6中的描述进行。TaLcc2的比活性以ABTS为底物时最高，在pH4.5时为360 nkat/mg蛋白，TaLcc3的比活性在pH4.5时为8.3nkat/mg蛋白，TaLcc4的比活性在pH4.5时为1000nkat/mg蛋白。CtLcc1的比活性在pH4.5时为705nkat/mg蛋白。
在本发明的范围内还包括了与氨基酸序列SEQ ID NO41(TaLcc2)显示出至少60％的同一性、并且以ABTS为底物时pH4.5时比活性至少为300、优选至少为350nkat/mg蛋白的漆酶，以及与氨基酸序列SEQID NO43(TaLcc3)显示出至少58％的同一性、并且以ABTS为底物时pH4.5时比活性至少为7、优选至少为8nkat/mg蛋白的漆酶，以及与氨基酸序列SEQ ID NO45(TaLcc4)显示出至少78％的同一性、并且以ABTS为底物时pH4.5时比活性至少为900、优选至少为1000nkat/mg蛋白的漆酶。
在本发明的范围内还包括了与氨基酸序列SEQ ID NO47(CtLcc1)显示出至少74％的同一性、并且以ABTS为底物时pH4.5时比活性至少为600、优选至少为700nkat/mg蛋白的漆酶。
漆酶的生产也可以通过最适化野生或重组菌株的培养基和培养条件来改进。碳/氮比可以被最适化成最适合于酶的产生。生长条件、pH值、温度、混合和空气供应可以被最适化成最可能适合于所需的酶的生产。在发酵中，也可以使用漆酶生产的诱导物例如藜芦基醇、二甲代苯胺或木质素或其它芳香族化合物。添加诱导物的方式和时间、以及它们的浓度可以被最适化。
术语“酶制品”在此处是指其中含有至少一种漆酶的任何酶产品。因此，这样的酶制品可以是用过的培养基或滤液，其中含有一种或多种漆酶、或一种或多种漆酶与其它酶、被分离的漆酶、或一种或多种漆酶的混合物或一种或多种漆酶和一种或多种其它酶的混合物。除了漆酶活性之外，这样的制品可以含有添加剂，例如介体、稳定剂、缓冲液、防腐剂、表面活性剂和/或培养基成分。优选的添加剂是那些通常用于酶制品中的添加剂，以便用于使用酶制品的应用中。酶制品可以采用液体、粉末或颗粒的形式。
除了漆酶之外，酶制品可以含有一种或多种其它的酶，它们可以是例如淀粉酶、纤维素酶和/或过氧化物酶。此外，在进行本发明的漆酶处理之前、期间或之后，可以进行另一种酶处理。酶处理可以包含例如一种或多种淀粉酶处理、一种或多种纤维素酶处理和/或一种或多种过氧化物酶处理。在酶制品中包含哪些其它的酶或在酶处理中使用哪些其它的酶，依赖于具体的应用。
酶制品可以含有一种或多种本发明的漆酶，或同时含有其它的漆酶与一种或多种本发明的漆酶。例如，具有不同性质的漆酶可以被合并，使得酶制品更适用于不同的条件。
本文中的“介体”是指为了增强漆酶的效果所通常需要的添加剂。现有的漆酶中有许多在不存在介体的情况下不能起作用或不能有效地起作用。可以从梭孢壳菌或毛壳菌获得的漆酶，在存在介体的情况下也能更有效地起作用。适合的介体包括例如丁香酸甲酯、乙酰丁香酮、丁香酸乙酯、丁香酸丁酯和丁香酸十二烷基酯、丙酸-酚噻嗪(PPT)、2，2′连氮基双-3-乙基苯甲基噻唑-6-磺酸(ABTS)、2，2，6，6-四甲基-1-哌啶基氧(Tempo)、1-羟基苯并三唑(HBT)、紫尿酸、N-羟基-乙酰苯胺(NHA)。根据具体的应用，介体的使用量在0.1到100mg/g或0.1到100mg/l处理材料的范围内，优选在1到10mg/g或1到10mg/l处理材料的范围内。
斜纹粗棉布的漂白本发明的酶特别适合于斜纹粗棉布的漂白。在本文中，对斜纹粗棉布来说“增加光亮度”是指斜纹粗棉布织物中光亮度的可以看到的并可以测量的增加。对斜纹粗棉布来说“增加光亮度”具体来说是指在斜纹粗棉布的外露面上增加斜纹粗棉布的光亮度。增加的测量可以通过例如用色度计使用L*a*b*颜色空间坐标测量颜色作为反射率值来进行，如实施例7-10中所描述的那样。
“漂白外观”是指在现有工艺中利用漂白化学物质例如次氯酸钠在斜纹粗棉布织物上获得的效果。到目前为止，“氯漂白”对于用靛蓝染色的斜纹粗棉布来说是最有效的漂白方法，因为使用它可以获得几乎所有的色调。如果需要获得“白色漂白”效果，漂白可以在不同的处理池中一次接一次地进行2到3次，或者使用高浓度的次氯酸盐来进行。已经建议使用葡萄糖、亚磺酸衍生物或漆酶代替次氯酸钠来进行斜纹粗棉布的处理。
按照现有工艺，为了增加斜纹粗棉布的光亮度，需要用各种不同的漂白化学物质或酶进行处理。漂白通常在用纤维素酶处理或浮石处理或二者共同处理之后进行。
当使用本发明的漆酶时，如果需要更加发白的效果，可以使用较高的剂量，或者酶法处理可以重复或与其它漂白方法结合。本发明的漆酶处理也可以与任何其它的漂白处理、与一种或多种化学漂白处理、或与一种或多种能够增加斜纹粗棉布的光亮度的酶法处理相结合。
本发明的斜纹粗棉布处理一般来说含有下列步骤-脱浆或任选脱浆的纤维素酶处理的斜纹粗棉布，在水性介质中与有效量的漆酶在适合漆酶发挥作用的条件下相接触；以及-用水进行一次或多次清洗。
漆酶处理优选于纤维素酶处理的斜纹粗棉布上进行。漆酶处理后用热水或冷水进行一次或多次清洗，水中可以任选含有清洁剂。在漆酶处理后通常不需要对酶进行失活，因为它不降低织物的强度，但是如果需要的话，可以通过本领域的专业技术人员所熟知的方法来进行。处理一般在纺织工业中通常用于湿法加工的设备中进行，例如用于洗涤、纤维素酶处理、染色或织物整理的工业机器。
在本发明中“斜纹粗棉布”是指斜纹粗棉布织物，通常是指牛仔布。
本发明的漆酶制品在不同pH值下的性能被例举，如同在实施例7中所描述的那样。测试使用Thrichoderma作为宿主生产的重组漆酶制品用来漂白斜纹粗棉布的能力，并与来自Novozymes公司的商品化漆酶制品DeniLite II Base进行了比较。
如同在表18和图8中所示，与现有的漆酶相比，CtLcc1和TaLcc2漆酶在pH值为6和7的条件下对于靛蓝染色的斜纹粗棉布的脱色更加有效。特别是在pH6下，斜纹粗棉布织物的外观颜色更浅。
测试本发明的漆酶在不同温度下漂白斜纹粗棉布的能力，并与现有的漆酶进行了比较，如同在实施例8中描述的那样。
与现有的漆酶相比，CtLcc1、特别是TaLcc2漆酶在40到50℃下对于斜纹粗棉布的脱色更加有效(光亮度增加得更多)。因此，这两种酶非常适合于在更加优选低温的应用中使用。但是，CtLcc1在60℃下更加有效，因此能够在宽广的温度范围内起作用。
根据本发明的优选实施方案，使用本发明的漆酶处理斜纹粗棉布在30到80℃的温度范围内进行，优选在40到70℃的温度范围内，更优选在40到60℃的温度范围内。处理过程中的pH可以在pH3到9的范围内，优选在pH 4到8的范围内，最优选在pH5到7的范围内。处理可以进行15分钟到2小时，优选30分钟到90分钟，更优选30分钟到60分钟。
用于处理的剂量可以是每克织物2到500nkat，更优选每克织物20到200nkat，最优选每克织物20到100nkat。
使用本发明的漆酶可以处理任何种类的斜纹粗棉布织物。优选的斜纹粗棉布是靛蓝染色的斜纹粗棉布。此处的“靛蓝染色”是指被处理的斜纹粗棉布是用靛蓝、靛蓝衍生物染色的，或斜纹粗棉布是用靛蓝和某些其它染料染色的，例如硫染做底的靛蓝染色的斜纹粗棉布。
斜纹粗棉布织物可以是纤维素酶处理的或砂洗的或两者同时处理的，或者斜纹粗棉布织物可以在脱浆后用本发明的漆酶处理。当用漆酶处理纤维素酶处理过的织物时，可以获得斜纹粗棉布浅度的较大增加。
“脱浆”工艺一般是牛仔布的第一道湿法处理步骤，是指除去通常用于经纱以防止其在编织过程中损坏的淀粉或其它上浆剂。α-淀粉酶被用于除去基于淀粉的浆料以改善湿法工艺并使其均一。
此处的术语“磨损的”是指斜纹粗棉布织物当用纤维素酶或砂洗处理或用两者同时处理时的外观。作为去除染料不均匀的结果，在染色区域和去除染料的区域之间存在反差。同义的表述方式是“砂洗外观”或“磨损外观”。纤维素酶处理可以使用中性或酸性纤维素酶、或同时使用二者进行。如果织物没有用纤维素酶处理或没有砂洗，织物的外观被称为“不鲜明的”，因为失去了流行的反差。
染污去除本发明的漆酶也可以在与斜纹粗棉布漂白相同的条件下被用于除去染污。
根据本发明的优选实施方案，使用本发明的漆酶处理斜纹粗棉布在30到80℃的温度范围内进行，优选在40到70℃的温度范围内，更优选在40到60℃的温度范围内。处理过程中的pH可以在pH3到9的范围内，优选在pH 4到8的范围内，最优选在pH5到7的范围内。处理可以进行15分钟到2小时，优选30分钟到90分钟，更优选30分钟到60分钟。
用于处理的剂量可以是每克织物0.2到2000nkat，更优选每克织物1到500nkat，更优选每克织物2到200nkat。
实施例9中描述了对本发明的漆酶和Denilite II Base漆酶制品去除染污能力的测试。在测试中，使用了草渍和茶渍人工染污的布料，其中含有或不含介体(丁香酸甲酯)。酶的剂量是每克织物20到200nkat，测试在40、50或60℃和pH6下进行60分钟。
正如在表21和22以及图10到13中可以看到的，在含有介体的情况下，CtLcc1漆酶在60℃能够有效除去草渍和茶渍，TaLcc2漆酶在50℃能够有效。在40℃也能够看到效果。
染料的脱色本发明的漆酶也可用于染料的脱色。例如印染厂的废水不能不将染料降解和/或将它们脱色，就排放到自然界的水体中。脱色可以在与斜纹粗棉布漂白中使用的相同的条件下进行。适合的酶剂量和处理时间依赖于被脱色的染料的量和处理条件。
根据本发明的优选实施方案，使用本发明的漆酶脱色染料在30到80℃的温度范围内进行，优选在40到70℃的温度范围内，更优选在40到60℃的温度范围内。处理过程中的pH可以在pH3到9的范围内，优选在pH4到8的范围内，最优选在pH5到7的范围内。
酶的剂量和处理时间可以被试验，并选择最适合于所需的应用的。作为指导可以使用每升处理溶液0.2到2000nkat的剂量。处理时间优选为15分钟到24小时，更优选为30分钟到12小时。如果处理在低温例如18到30℃下进行，处理时间可以更长。
如同在实施例10中所描述的那样，本发明的漆酶对不同染料的脱色能力在存在或不存在介体的情况下被测试。CtLcc1和TaLcc2漆酶能够非常有效地脱色靛蓝胭脂红和Remazol亮蓝。Cibacron和亮红3B-P也可以被部分脱色。
其它应用因为本发明的漆酶对各种不同底物具有高的氧化能力，因此它们也非常适合于许多工业应用。这样的应用例如纤维产品的制造以及森林工业的应用、化妆品工业和制备个人护理用品的工业中的应用以及其它应用。在这些应用中，温度和pH在本发明的漆酶起作用的范围内。剂量和处理时间可以根据具体的应用和所处理的材料来选择。
可能需要介体作为添加剂以增强本发明的漆酶的效力。此外，为反应供应足够的氧是必需的。如果需要，氧可以通过通入空气或氧气或富含氧气的空气加入到反应混合物中。
本发明的漆酶适合于使用在纺织工业中，用于处理人造的或天然的纤维或它们的组合。酶适合于处理纤维素类的纤维以及蛋白质类的纤维，例如羊毛或丝绸。
本发明的漆酶适合于使用在森林工业中。可以将含有木质素的纤维与漆酶接触。由于漆酶的处理，纤维的强度性质被改进，这可以被应用在例如纤维板的制造、纸及纸板产品和复合物中，它们由机械研磨的含有木质素的纤维制成。木纤维也可以用本发明的漆酶处理，以使它们功能化或粘合纤维。
本发明的漆酶也非常适合于各种化合物的解聚。通过使用本发明的漆酶，硫酸盐纸浆(kraft pulp)中的木质素可以被解聚，从而产生具有较低的木质素含量的纸浆。因此，漆酶可以用于漂白纸浆以减少漂白化学物质的使用。由于具有较好的纸浆漂白能力，在漆酶处理之后漂白化学物质的随后消耗量减少了，当使用含有氯的化学物质时，这就导致环境中不希望有的有机氯化合物的形成减少。
本发明的漆酶也可以用来聚合化合物例如木质素，以产生高分子量的化合物。
由于酶的高氧化能力，它可以被用在化妆品工业或生产个人护理产品的工业中，用来氧化染料或染料前体或生色的化合物。染料的氧化导致化合物的脱色。这种效果可以用于例如染发或漂白牙齿。为了进行染发，通常需要染料前体或改性剂。
本发明的漆酶也可以用来改进造纸机的运行性能。漆酶可以通过使源自木质素和提取物的化合物聚合、以及通过降低造纸机中微生物的有害生长来改进造纸机的运行性能。
可以使用本发明的漆酶的其它可能的应用包括改进烘烤应用中的生面团的方法、使啤酒和白酒澄清的方法，用于改进从可再生原材料生产燃料乙醇的方法、用于各种生物处理过程以及用于硬表面清洁或洗涤剂制剂中。
总得来说，在上述的应用中处理温度优选在30到80℃的温度范围内，更优选在40到70℃的温度范围内，尽管反应也可以在较低的温度下进行。pH可以在pH3到9的范围内，优选在pH4到7的范围内。处理时间可以是15分钟到24小时，优选为30分钟到2小时。剂量可以是每克或每升被处理的材料0.1到2000nkat，优选为1到1000nkat，更优选为2到200nkat。可以加入适合量的介体。
用于上述应用的制剂含有有效量的本发明的酶或酶制品，并且也可以含有适用于所指应用的添加剂。用于纺织工业的组合物可以含有例如适当量的表面活性剂、缓冲液、稳定剂和防腐剂，用于森林工业的制剂可以含有例如适当量的缓冲液、稳定剂和防腐剂。在所有组合物中应该避免对环境和人类(或动物)应用有害的物质。特别是用于化妆品工业和个人护理产品工业的组合物中，不应该含有对皮肤有伤害效果或消化后有伤害效果的物质。
本发明提供了含有本发明的漆酶或酶制品的用于处理斜纹粗棉布的组合物。本发明也提供了含有本发明的漆酶或酶制品的去除染污的组合物、漂白纸浆的组合物、为纺织工业处理纤维的组合物、为森林工业处理纤维的组合物、处理羊毛的组合物、处理毛发的组合物、处理印染厂废水的组合物、用于染料脱色的组合物。
下面的实施例目的在于说明本发明，从任何方面都不应当被解释为对本发明的限制。
实施例1、Thielavia arenaria和嗜热毛壳菌漆酶的生产和纯化Thielavia arenaria和嗜热毛壳菌漆酶的生产按照Kiiskinen等(2004)中描述的方法，使用指示剂Remazol亮蓝R-478、丹宁酸和邻甲氧基苯酚对来自Roal Oy菌种保藏中心的各种菌株生产漆酶的能力进行筛选。当将溶解在25mM琥珀酸缓冲液(pH4.5)或25mM Mcllvaine缓冲液(pH6.0)中的5mM ABTS溶液滴加到琼脂平板中的新鲜菌丝体上时，Thielavia arenaria ALKO4197在邻甲氧基苯酚和Remazol亮蓝R-478上显示出阳性反应，，嗜热毛壳菌ALKO4265显示出强烈的阳性反应。
两种真菌都在PD琼脂(Difco)上维持在+4℃。接种和生产培养基含有25g/l葡萄糖(AnalaR)，27.5g/l细菌酵母提取物(Difco)，0.5mg/ml纯松木素AT(Sigma)，0.04l/l无机盐溶液(1.0g/l CaCl2·2H2O(Riedel-de Haen)，1.0g/l FeSO4·7H2O(Riedel-de Haen)，0.1g/l ZnSO4·7H2O(Merck)，0.16g/l CuSO4·5H2O(Merck)，1.0g/l Na2EDTA(Riedel-de Haen))。葡萄糖被分开灭菌并与培养基无菌合并。
Thielavia arenaria ALKO4197菌株被培养在50或200ml体积中，在旋转摇床上(200rpm)于37℃培养。培养基用5或20ml长好的菌丝体接种。漆酶活性被监测直到8天，最高的漆酶活性(大约20nkat/ml)在培养6天后达到(图1A)。进行6个平行的培养。通过离心(10000g，10分钟，+4℃)从发酵培养液中除去细胞，培养物滤液被进一步纯化。
嗜热毛壳菌ALKO4265菌株被培养在50或200ml体积中，在旋转摇床上(200rpm)于42℃培养。培养基用5或20ml长好的菌丝体接种。漆酶活性被监测直到4天，最高的漆酶活性(大约170nkat/ml)在培养3天后达到(图1B)。进行6个平行的培养。通过离心(10000g，10分钟，+4℃)从发酵培养液中除去细胞，培养物滤液被进一步纯化。
梭孢壳菌和毛壳菌漆酶的纯化首先将梭孢壳菌漆酶粗酶的浓缩培养物滤液上样到预先用10mMTris HCL(pH8.5)平衡好的Q Sepharose FF柱(Pharmacia，体积为26ml)中。用增加的盐梯度(在5倍柱体积中使用溶于平衡缓冲液的0-500mM Na2SO4)将蛋白洗脱。漆酶的活性级分在70-150mM盐浓度中被洗脱，将它们合并，然后上样到预先用含有200mM NaCl的20mMTris缓冲液(pH7.0)平衡好的Sephacryl S100凝胶过滤树脂(Pharmacia，体积为160ml)中。纯化后进行考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE(图2A)。将漆酶阳性的级分合并并浓缩。将盐去除，将缓冲液改变为20mM Tris缓冲液(pH7.0)。为了获得高纯度的样品，加入了另一个Resource Q阴离子交换步骤。将样品上样到用10mM TrisHCl(pH8.5)平衡好的Resource Q柱(Pharmacia，体积为1ml)中。在12倍柱体积中用1-300mM Na2SO4线性盐梯度将蛋白洗脱。
通过超滤(MWCO 10000)将嗜热毛壳菌(C.thermophilum)的培养上清液浓缩并将缓冲液改变为结合缓冲液。蛋白在20mM Tris缓冲液(pH8.0)中被结合到DEAE Sepharose FF(Pharmacia，柱体积25ml)上。用硫酸钠梯度(0-500mM)将蛋白洗脱。漆酶的活性级分在150-200mM盐浓度中被洗脱，将它们合并，然后用疏水相互作用层析(Phenyl Sepharose FF，Pharmacia，柱体积22ml)进一步纯化。蛋白在20mM Tris缓冲液(pH7.0)的500mM硫酸钠浓度下被结合，然后用减少的盐梯度(500-0mM)洗脱。漆酶阳性级分用20mM Tris缓冲液洗脱。级分的纯度用SDS-PAGE来分析，然后用考马斯亮蓝染色(图2B)。
酶活性分析使用ABTS作为底物测量了来自培养上清液的漆酶活性。活性分析按照Niku-Paavola等(1988)开发的方法来进行。样品用0.025M琥珀酸缓冲液(pH4.5)稀释。将0.350ml ABTS溶液(11g/l)加入到1.15ml稀释液中，使用Perkin Elmer Lambda 20分光光度计在436nm波长监测反应2分钟。活性用纳开特(nano katals)表示。
蛋白含量的测定蛋白含量根据Lowry等(1951)开发的方法使用Bio-Rad的DC蛋白分析试剂盒测定。分析按照制造商的说明书进行，使用Perkin ElmerLambda 20分光光度计在750nm波长测量在反应中形成的颜色的强度。使用浓度为0.25-1.25g/l的牛血清白蛋白(BSA，Bio-Rad)确定标准曲线。
实施例2纯化的嗜热毛壳菌(C.thermophilum)漆酶的性质分子量和等电点T.arenaria和嗜热毛壳菌(C.thermophilum)漆酶的分子量在SDS-PAGE上按照Laemmli(1970)的方法测定。SDS-PAGE分析中使用的凝胶是预制的12％Tris HCl凝胶(BioRad)。蛋白条带用考马斯亮蓝(R 350；Pharmacia)染色进行可视化，并与分子量标准(预染的广范围分子量标准#7708 S；New England BioLabs，Beverly，Mass.)进行比较。两种漆酶的分子量都为大约80kDa。漆酶的等电点通过在pH3-9范围内的等电聚焦(Pharmalyte IEF，Pharmacia)来确定，使用LKB 2117Multiphor II电泳系统(LKB Pharmacia，Bromma，Sweden)按照制造商的说明书进行。含有漆酶活性的条带通过用溶于25mM琥珀酸缓冲液(pH4.5)的2mM ABTS染色凝胶来可视化，蛋白用考马斯亮蓝染色来可视化。纯化的梭孢壳菌漆酶在等电聚焦中在等电点为5.5、5.9、6.4、6.8和6.9的位置上显示出多个条带。纯化的嗜热毛壳菌(C.thermophilum)漆酶在等电聚焦中在等电点为4.1-4.3的范围内显示出3-4条条带。
最适pH在pH范围为2.2-8.0的通用Mcllvaine缓冲液中使用邻甲氧基苯酚作为底物测定了T.arenaria和嗜热毛壳菌(C.thermophilum)漆酶的最适pH。图3A中显示了梭孢壳菌漆酶的纯酶和粗酶的最适pH。正如在图3A中显示的那样，梭孢壳菌漆酶的最适pH是5.5，酶在pH7时仍有相当高的活性，pH再升高时活性开始下降。嗜热毛壳菌(C.thermophilum)漆酶的纯酶和粗酶的最适pH是5.0(图3B)。
热稳定性通过将酶溶液(0.3gl-1)在60mM柠檬酸缓冲液(pH6)中保温测定了漆酶的热稳定性。以ABTS为底物测定了残留的酶活性。正如结果所示，梭孢壳菌漆酶的半衰期在50和60℃分别为26和5.5小时(图4A)，嗜热毛壳菌(C.thermophilum)漆酶的半衰期在50和60℃分别为30和6小时(图4B)。
比活性使用不同的漆酶底物测定了纯化的T.arenaria和嗜热毛壳菌(C.thermophilum)漆酶的比活性。活性以ABTS(Niku-Paavola等，1988)、二甲氧基酚(DMP)(Schlosser等，1997)、丁香醛连氮(Paszczynski等，1985)和邻甲氧基苯酚(Leonowicz&Grzywnowicz，1981)为底物测定。对于ABTS来说，活性测量在25mM琥珀酸缓冲液(pH4.5)中在25℃下进行，对于其它底物，测量在25mM MES缓冲液(pH5.5)中进行。结果显示在表1中。
表1、纯化的野生型梭孢壳菌漆酶(TaLcc)和毛壳菌漆酶(CtL)的比活性
漆酶的抑制通过在密封的完全充满的锥形瓶中使用Orion Research 081010氧电极(软件SensorLinkTMPCM800；Orion，Espoo，Finland)测量以ABTS为底物的酶反应中氧气的消耗，确定了各种抑制剂对漆酶活性的影响。氧的消耗速度从含有适量漆酶、2mM ABTS和不同浓度的各种抑制剂的溶液的50mM柠檬酸缓冲液(pH5)中在30ml的反应体积中测量。
表2、野生型梭孢壳菌漆酶(TaLcc)和毛壳菌漆酶(CtL)的抑制
N-末端及内部氨基酸序列测定蛋白的N-末端以及内部肽按照Edman降解化学(Edman和Begg，1967)方法使用PE Biosystems Procise Sequencer进行测序。为了准备肽，将冻干的蛋白用二硫苏糖醇还原，用碘乙酰胺进行羧甲基化，用测序级胰蛋白酶(Promega)以酶/底物质量比1∶100的用量在0.1M碳酸氢铵(pH8.3)缓冲液中于37℃水解12小时(Stone等，1988)。产生的肽通过反向高效液相色谱(RP-HPLC，Vydac C-18柱)使用线性乙腈梯度(溶于0.1％三氟乙酸的℃-60％乙腈)进行分离。梭孢壳菌漆酶的内部肽序列显示在表3中(SEQ ID NO1-3)。蛋白的N-末端不能获得，因为推测它被阻断了。从毛壳菌漆酶获得的氨基酸序列显示在表4中(SEQ ID NO4-7)。来自毛壳菌漆酶的肽22.4和22.7的序列是在相应的漆酶基因被克隆后获得的。
表3、从梭孢壳菌漆酶(ALKO4197)测定的内部肽序列。蛋白的N末端被推测阻断。
表4、嗜热毛壳菌漆酶(ALKO4265)的N-末端和内部肽序列
实施例3、Thielavia arenaria ALKO4197和嗜热毛壳菌ALKO4265漆酶基因的克隆在DNA(质粒，DNA片段)的分离和酶法处理、大肠杆菌的转化等中使用了标准的分子生物学方法。所用的基本方法在标准的分子生物学手册中有描述，例如Sambrook等(1989)和Sambrook和Russell(2001)。
按照供应商的说明书使用Lambda DASHII载体(Stratagene，USA)构建了Thielavia arenaria ALKO4197和嗜热毛壳菌ALKO4265的基因组文库。将使用Raeder和Broda(1985)的方法分离的染色体DNA用Sau3A部分消化。被消化的DNA按照大小分级，将具有选定大小(9-23kb)的片段脱磷酸化，连接到BamHI消化的lambda载体臂中。将连接混合物使用Gigapack III XL(Thielavia)或Gigapack III Gold(Chaetomium)包装提取液、按照制造商的说明书(Stratagene，USA)进行包装。梭孢壳菌和毛壳菌基因组文库的滴度分别为1.2×106和3.6×106pfu/ml，扩增的文库的滴度分别为1.1×1010和6.5×1010pfu/ml。
用于筛选基因库的探针是通过PCR扩增的，在反应中使用了梭孢壳菌ALKO4197和毛壳菌ALKO4265的基因组DNA作为模板。首先，设计了几个引物(简并的寡聚核苷酸)并在PCR反应中测试(表5，SEQ ID NO8-31)。按照保守的漆酶序列(图5)设计了基于纯化的TaLcc1和CtLcc1的肽的氨基酸序列的同源引物和异源引物的序列(图5)。保守序列通过将以前发表的脉孢霉(Neurospora)、足孢虫(Podospora)、隐丛赤壳(Cryphonectria)、毁丝霉(Myceliophthora)、柱霉(Scytalidium)和鬼伞(Coprinus)漆酶(EMBL登记号P10574、P78722、Q03966，、AAE68088、AAE68087、AAE63570、AAE63572和AAE63571)的氨基酸序列进行比对而鉴定。此外，从粗糙脉孢霉(N.crassa)漆酶基因(来自粗糙脉孢霉(N.crassa)菌株ATCC9277的基因组DNA用作模板)，使用按照发表的核苷酸序列设计的引物POX12和POX13(表5)扩增了异源的探针。用于PCR反应的探针组合按照肽或肽同源物在发表的漆酶序列中的位置来选择。PCR反应混合物含有50mM Tris-HCl(pH9.0)、15mM(NH4)28O4、0.1％Triton X-100、5％DMSO、1.5-3mM MgCl2、0.2mM dNTPs、5μM各种引物和1-2单位Dynazyme EXT DNA聚合酶(Finnzymes，Finland)以及1-5μg基因组DNA。PCR反应的条件如下起始变性为95℃ 5分钟，然后进行95℃1分钟、50℃(以梭孢壳菌DNA为模板)或42℃(以毛壳菌DNA为模板)复性1分钟、72℃延伸2分钟的循环25-30个，最后在72℃延伸7-10分钟。
表5、被试验用作PCR引物以扩增用于筛选漆酶基因的探针的寡聚核苷酸。Oligo表示寡聚核苷酸；Oligo location表示用于设计寡聚核苷酸序列的肽的氨基酸位置。
(a为了减少简并性，某些密码子按照真菌的偏好性选择。
(bD＝A或G或T，H＝A或C或T，R＝A 或G，S＝C或G，W＝A或T，X＝I(肌醇)或C，Y＝T或C；括弧中的″s″表示正义链，括弧中的″as″表示反义链。
(c在图A中包含的肽序列。
(d使用粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)的密码子(来自序列EMBLM18334)。
(e按照从嗜热毛壳菌(C.thermophilum)ALKO4265分离的木聚糖酶基因xynllA、xynllB和xynllC(EMBL AJ508931-508933)选择的密码子用法。
具有预期大小(从发表的真菌漆酶序列计算的)的DNA产物从几个反应中获得。在某些PCR反应中，检测到几条具有非常相似的大小的条带；例如使用引物POX8和POX11从毛壳菌DNA的反应中获得了3条大约为0.2kb的条带。这表明可能发现了几个漆酶基因。从最特异的PCR反应中分离了具有预期大小的DNA片段，将它们克隆到pCRBlunt-TOPO载体中(Invitrogen，USA)。插入片段通过测序和与用几种限制性酶消化的基因组DNA进行Southern印记杂交而定性。
根据杂交图形和测序结果，发现从梭孢壳菌和毛壳菌反应获得的PCR产物中含有来自3个不同基因的序列。从梭孢壳菌和毛壳菌反应中选择了3个PCR片段，各代表不同的推测的漆酶基因(表6，SEQ IDNO32-37)用作探针以筛选基因库。从所有这些探针推测的氨基酸序列都与几种发表的漆酶序列具有同源性(NCBI的BLAST程序，2.2.9版本，国家生物技术信息中心；Altschul等，1990)。除了同源探针之外，异源的粗糙脉孢霉(N.crassa)漆酶片段也被用于筛选两个基因库。
表6、用于PCR反应的引物和被选择用于漆酶基因筛选的探针。显示了基因组模板DNA和含有探针片段的质粒的名称。
使用地高辛(Roche，Germany)按照供应商的说明书对表6中所列的质粒中的粗糙脉孢霉(N.crassa)漆酶片段和插入片段进行标记。使用同源探针片段和粗糙脉孢霉(N.crassa)漆酶片段对扩增的基因组文库(8×104-1×106噬斑)进行筛选。滤膜的杂交温度为68℃，当使用同源探针时，滤膜在室温用2xSSC-0.1％SDS洗两次，每次5分钟，然后在68℃用0.1xSSC-0.1％SDS洗两次，每次15分钟。用粗糙脉孢霉(N.crassa)漆酶片段探测的滤膜在室温用2xSSC-0.1％SDS洗两次，每次5分钟，然后在68℃用2xSSC-0.1％SDS洗两次，每次15分钟。从每个杂交获得了几个阳性的噬斑。某些阳性噬斑与所用的探针杂交很强，但是，此外有许多噬斑与探针的杂交弱得多。这也表明在基因组中存在其它的漆酶基因，与所用的探针有交叉反应。从每个筛选中纯化了2到8个强烈杂交的噬斑。分离噬菌体DNA，通过Southern印记杂交定性。选择的与探针杂交的限制性片段被亚克隆到pBluescript IIKS+或SK+载体中，对被克隆的相关区域进行测序。
从Thielavia arenaria ALKO4197克隆了总共4个漆酶基因，从嗜热毛壳菌ALKO4265克隆了总共3个漆酶基因。表7概述了用于筛选基因的探针、用于分离基因的噬菌体克隆、含有全长基因及其启动子和终止子区域的选择的限制性片段、质粒的名称、以及带有这些质粒的大肠杆菌菌株的DSM保藏编号等信息。
表7、用于克隆漆酶基因的探针、选择的噬菌体克隆和亚克隆、质粒编号和相应的大肠杆菌菌株的保藏编号。
图6中显示了漆酶基因的序列。关于基因和推测的蛋白序列的相关信息分别概述在表8和表9中。
从含有Talcc1和Ctlcc1基因的克隆的推测的氨基酸序列中发现了纯化的TaLcc1和CtLcc1(表3和4)的肽序列(某些情况下一些不准确的地方是在获得了推测的氨基酸序列之后从肽序列中发现的)。因此，可以推断克隆到了为纯化的漆酶蛋白TaLcc1和CtLcc1编码的基因。当按照TaLcc1肽序列设计PCR引物时(POX28+POX31和POX27+POX31)，可以成功地从Talcc1基因合成PCR片段。但是，由于肽测序的不准确性，只有在使用从同源的真菌漆酶序列衍生的引物时，才能够成功克隆Ctlcc1。通过在基因组文库的筛选中使用粗糙脉孢霉(N.crassa)探针，获得了梭孢壳菌漆酶基因Talcc4。从用N.crassa漆酶片段探测的毛壳菌文库中挑取和纯化的噬斑中没有发现其它的漆酶基因。
表8、从Thielavia arenaria ALKO4197和嗜热毛壳菌ALKO4265中分离的漆酶基因的概述
(a包括终止密码子。
(b不包括终止密码子。
(cCtlcc3中的另一个翻译起始位点，删除第一个内含子，将产生长度为1958bp的基因，编码区为1821bp(图6)。
(dTalcc2中的另一个翻译起始位点将产生长度为1927bp的基因，编码区为1737bp(图6)。
表9、从Thielavia arenaria ALKO4197和嗜热毛壳菌ALKO4265中推测的漆酶序列的概述。ss代表信号序列。
(a使用SignalP V2.0(Nielsen等，1997；Nielsen和Krogh，1998)程序进行信号序列预测；NN值使用神经网络获得，HMM值使用隐藏的Markov模型获得。
(bC末端的“共有”氨基酸序列(DSGX)和保守序列后的氨基酸数量。
(c不包括预测的信号序列和C末端尾巴。预测使用BxPASy服务器上的计算机等电点/分子量工具(Gasteiger等，2003)进行。TaLcc2和TaLcc3标示的两个值是在删除了两个可能的信号序列后计算出的。
(d序列N-X-S/T的数量。
(eTalcc2基因有两个可能的翻译起始位点。预测的信号肽和其它值是使用较长的序列获得的。较短的基因编码的多肽(推测的序列含有579个氨基酸)的推测的信号序列为17个氨基酸。
(fCtlcc3基因有两个可能的翻译起始位点。较短的多肽的推测的氨基酸序列有607个氨基酸，分子量为62029Da，等电点为4.65。从推测的氨基酸序列没有检测到推断的信号序列。
TaLcc1和CtLcc1的推测的氨基酸序列被发现彼此之间最为同源，TaLcc3和CtLcc2之间也是同样(在基因水平上也是这样，例如在相应基因的内含子的组织方面)。使用Needleman-Wunsch全面比对(EMBLOSUM62，空隙罚分10.0，扩展罚分0.5；欧洲分子生物学开放软件套装程序包，2.9.0版)获得的TaLcc1和CtLcc1之间的同一性值是69.5％，TaLcc3和CtLcc2之间的同一性值是67.3％(表10)。当彼此之间以及与TaLcc1、CtLcc1、TaLcc3和CtLcc2进行比对时，其它漆酶蛋白的同一性值较低(表10)。
表10、从梭孢壳菌ALKO4197和毛壳菌ALKO4265漆酶推测的氨基酸序列的比对获得的同一性值(％)(Needleman-Wunsch全面比对，EMBLOSUM62，空隙罚分10.0，扩展罚分0.5)
(a在比对中使用了从推测的序列(图6)的第一个甲硫氨酸开始的推测的TaLcc2和CtLcc3氨基酸序列。
与推测的TaLcc1和CtLcc1序列最为同源的(NCBI的BLAST程序，2.2.9版，国家生物技术信息中心；Altschul等，1990)是来自Melanocarpus albomyces、鹅粪稀孢壳葛(Podospora anserina)和粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)(EMBL登记号CAE00180、LAC2 PODAN、LAC1 NEUCR/XP 323881/KSNCLO)的漆酶。在专利数据库中与TaLcc1和CtLcc1序列最为一致的漆酶是来自嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)(EP 0765394 B1)和Scytalidiumthermophilum(US 5,750,388)的漆酶。其它推测的漆酶序列不与以前发表的序列具有那样高的同一性。与TaLcc3和CtLcc2具有最高同一性的是稻瘟菌(Magnaporthe grisea)的假设蛋白(EAA57158.1)和Collecotrichum lagenarium的漆酶(BAB32575)。其它漆酶与以前发表的序列的最高同源性如下TaLcc2与粗糙脉孢菌(N.crassa)假设蛋白(XP_330977)，TaLcc4与玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)假设蛋白(EAA68613)，CtLcc3与粗糙脉孢菌(N.crassa)和稻瘟菌(Magnaporthegrisea)假设蛋白(XP_324706和EAA47633)。因此，其它的真菌物种也具有相似的序列，但是这些序列还没有被鉴定为漆酶。表11中显示了从数据库中发现的、与梭孢壳菌ALKO4197和毛壳菌ALKO4265漆酶的推测的氨基酸序列具有至少50％同一性的序列。
表11、与梭孢壳菌ALKO4197和毛壳菌ALKO4265漆酶的推测的氨基酸序列具有至少50％同一性的序列。比对使用Needleman-Wunsch全面比对方法进行(EMBLOSUM62，空隙罚分10.0，扩展罚分0.5)。
实施例4、在里氏木霉(Trichoderma reesei)中生产重组漆酶为了生产重组TaLcc1、TaLcc2、TaLcc3、TaLcc4、CtLcc1和CtLcc2蛋白构建了表达质粒。由于在推测的氨基酸序列中缺少推测的信号序列，生产CtLcc3的表达盒没有构建。构建的表达质粒列于表12中。通过PCR将漆酶基因、包括它们自己的信号序列、与里氏木霉(T.reesei)的cbh1(ce17A)启动子精确地融合。如同在Karhunen等(1993)中描述的那样包含了cbh1启动子、cbh1终止子、amdS标记和cbh13′侧翼区域。从载体骨架分离了线性的表达盒(图7)，并转化到里氏木霉(T.reesei)A47的原生质体中。转化按照Penttila等(1987)中描述的方法使用Karhunen等(1993)中描述的修改方法进行。转化子在选择平板上通过单个分生孢子进行纯化，然后在PD上使它们形成孢子。
表12、为了在里氏木霉(Trichoderma reesei)中生产嗜热毛壳菌ALK04265和Thielavia arenaria ALKO4197漆酶而构建的表达盒。表达盒的完整结构描述在图7中。除了在pALK1326和pALK1327中之外，漆酶基因与cbh1启动子精确地融合，而在pALK1326和pALK1327中，Ctlcc1基因与载体多肽(Ce16A CBD A+B或A+B+B′)和合成的Kex2连接物(包括氨基酸RDKR)融合。与这两个质粒类似的结构pALK1285和pALK1286在Paloheimo等(2003)中有描述。
(a用于里氏木霉(T.reesei)转化的表达盒通过使用EcoRI消化载体骨架而分离得到，除了在pALK1671的情况下使用NotI消化之外。
(b在终止密码子之后距离基因组漆酶终止子区域的核苷酸的数目。用于从3’末端切除基因组基因片段的限制性位点包括在括号中。
(c使用了从第一个推测的翻译起始位点获得的Talcc2基因(基因长度为1957bp，包括内含子和终止密码子；图6和表8)。
(d使用了从第二个推测的翻译起始位点获得的Talcc2基因(基因长度为1927bp，包括内含子和终止密码子；图6和表8)。
从摇瓶培养(50ml)的培养上清液中分析了转化子的漆酶生产。转化子在一种复合的基于乳糖的纤维素酶诱导的培养基(Joutsjoki等，1993)中生长7天，培养基用5％KH2PO4缓冲并添加了0.1mM CuSO4，pH为6.0。按照实施例1中的描述以ABTS为底物分析了漆酶的活性。从所有的构建物中都获得了漆酶活性。使用点杂交(Minifold I-SRC 96点杂交仪，Schleicher&Schuell，Dassel，Germany)或Western杂交筛选表达盒在cbh1(ce17A)位点的可能的定位为CBHI阴性表现型。CBHI蛋白的检测使用单克隆抗体CI-258或CI-261(Aho等，1991)和ProtoBlotWestern blot AP system(Promega)来进行。被选择的转化子的基因型通过使用Southern杂交来证实，在Southern杂交中包含了几种基因组消化产物，并使用相应的表达盒作为探针。
将选择的CBHI阴性的转化子在发酵罐中培养，以获得为重组蛋白的纯化(实施例5)和应用试验(实施例7-10)所需的材料。
实施例5、重组的梭孢壳菌和毛壳菌漆酶的纯化使用常用的层析方法从培养滤液中纯化了异源生产的Thielaviaarenaria和嗜热毛壳菌的漆酶。在使用Sephadex G25树脂(Pharmacia)进行凝胶过滤层析步骤之前先将培养滤液的缓冲液改变为适当的平衡缓冲液。每种漆酶的纯化步骤概述在表13中。
表13、异源生产的Thielavia arenaria和嗜热毛壳菌的漆酶的纯化。
HIC疏水相互作用层析；EB平衡缓冲液。
实施例6、梭孢壳菌和毛壳菌漆酶的性质按照实施例2中的描述对纯化的梭孢壳菌和毛壳菌漆酶的最适pH、温度稳定性和pI等性质进行了研究。分子量如前所述(Palonen等，2003)通过MALDI-TOF质谱在UltraflexTM飞行时间仪器(BrukerDaltonics，Germany)上测定。对于CtLcc和TaLcc2漆酶来说，T1铜的氧化还原电位通过测定光度的铜滴定方法测定，滴定在0.1MKH2PO4(pH6.0)中按照Xu等(1996)的描述进行，使用了氧化还原滴定偶联剂K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6。TaLcc1的氧化还原电位在pH5.0下使用复合的Pt-AgCl/KCl微电极按照Sigoillot等(2004)描述的方法测定。性质的结果集中在表14中。
表14、重组的梭孢壳菌和毛壳菌漆酶的性质概要。nd＝未测定。
按照实施例2中的描述测定了不同化合物对漆酶活性的影响，只有Talcc4例外，它的抑制是使用分光光度计活性测试来分析的。没有使用在ABTS反应中使用的氧消耗方法，而是使用分光光度计方法测定TaLcc4的酶活的。因为TaLcc3对于所有的测试底物的活性都非常低，该酶的抑制实验没有进行。结果显示在表15中。
表15、不同化合物对重组的梭孢壳菌和毛壳菌漆酶的抑制。TaLcc4的抑制试验通过使用分光光度计ABTS分析来进行，其它漆酶的抑制通过氧消耗测量来测定。
按照实施例2中的描述以ABTS、二甲氧基酚(DMP)、丁香醛连氮和邻甲氧基苯酚作为底物测定了纯化的梭孢壳菌和毛壳菌漆酶的比活性。ABTS活性测量在25℃下在pH4.5的25mM琥珀酸缓冲液中进行，其它的活性在pH5.5的25mM MES缓冲液中测定。结果显示在表16中。
表16、梭孢壳菌和毛壳菌漆酶的比活性与来自Melanocarpusalbomyces的熟知的真菌漆酶的比活性的比较。MaLMelanocarpusalbomyces漆酶。
梭孢壳菌和毛壳菌漆酶的动力学参数以ABTS、2，6-二甲氧基苯酚(DMP)和丁香醛连氮为底物测定了动力学参数，Michaelis-Menthen常数Km、转换数Kcat和特异性常数(Kcat/Km)。以ABTS为底物的测量在pH4.5的25mM琥珀酸缓冲液中进行。以丁香醛连氮和DMP为底物的测量使用pH6的40mM MES缓冲液。所有的活性分析都在25℃下进行。动力学参数使用非线性回归曲线拟合来确定。结果显示在表17中。它们的值与Melanocarpusalbomyces MaL漆酶的值进行了比较。
表17、以ABTS、DMP和丁香醛连氮为底物测定的梭孢壳菌和毛壳菌漆酶的动力学参数及其与MaL的值的比较。
此处显示的生物化学数据清楚地表明重组CtLcc1和从培养上清液中纯化的野生型毛壳菌漆酶是相同的蛋白，重组TaLcc1和从培养上清液中纯化的野生型梭孢壳菌漆酶是相同的蛋白。
实施例7、漆酶制品在不同pH值下在斜纹粗棉布漂白中的性能使用木霉作为宿主生产的重组漆酶制品被用于实施例7-10中所有的应用试验中。重组漆酶CtLcc1、TaLcc2和TaLcc4分别来自菌株RF5469、RF5573和RF5687，被试验了它们漂白斜纹粗棉布的能力。来自Novozymes的商业化的漆酶制品DeniLite II Base被用作对照。
被脱浆和用中性ECOSTONE纤维素酶处理的Lee Cooper牛仔布(MASI公司Oy，Finland)被用作试验材料。漆酶处理在LP-2槽洗机(Launder Ometer)中如下进行将大约10克斜纹粗棉布样品(15×14cm)放置在含有200ml pH5、6或7的Mc Ilvaine柠檬酸磷酸缓冲液的1.2升的容器中，将容器加热。加入带有或不带有介体(丁香酸甲酯，DeniLite II Assist，Novozymes)的酶作为漆酶活性单位。酶的剂量为每克织物200nkat，介体量为每克织物10mg。在所有的实施例7-10中用ABTS作为底物测量酶活(实施例1)，但是使用柠檬酸磷酸缓冲液。槽洗机在50℃运行30分钟，然后将槽洗机中的温度升高到80℃并保持10分钟。将样品用温水仔细漂洗，在滚筒中干燥至半干，然后空气干燥。
漂白效果通过使用Minolta色度计CM 1000(Minolta Co.)使用L*a*b*颜色空间坐标(光源D65)测量颜色作为反射率值来评估。测量在漆酶处理之前和之后样品布两面的颜色。每个测量取几次测量的平均值。
表18和图8显示，与DeniLite II Base相比，CtLcc1和TaLcc2漆酶在pH值为6和7的条件下对于靛蓝染色的斜纹粗棉布的脱色更加有效。通过目视评估，在pH6下，使用这两种漆酶处理的斜纹粗棉布织物的外观颜色也比用DeniLite处理的明显更浅。不使用介体时漆酶对斜纹粗棉布没有明显的效果(表19)。
表18、在槽洗机中在pH5-7下用漆酶制品和介体处理的斜纹粗棉布正面的颜色测量。L*表示浅度，-b*表示蓝色方向，+b*表示黄色方向。
表19、在槽洗机中在pH5-7下用不含介体的漆酶制品或只用介体处理的斜纹粗棉布正面的颜色测量。L*表示浅度，-b*表示蓝色方向，+b*表示黄色方向。
实施例8、漆酶制品在不同温度下在斜纹粗棉布漂白中的性能试验了漆酶CtLcc1、TaLcc1(实施例7)和TaLcc2(菌株RF5573)在不同温度下漂白斜纹粗棉布的能力，并与来自Novozymes的商业化漆酶制品DeniLite II Base进行了比较。
试验系统和斜纹粗棉布与实施例7中的相同，只是在槽洗机中漆酶和介体处理过程中的条件是30分钟、pH6和温度30-70℃(DeniLiteII Base也在80℃)，以及槽洗机中的酶不是通过升高温度而是用下面描述的碱处理来失活。从容器中取出样品布，在含有NaOH(pH 11.5)的温水中浸泡10分钟，然后用温水仔细清洗。样品布在滚筒中干燥至半干，然后空气干燥。漂白效果象实施例7中那样通过测量颜色作为反射率值来评估。
表20和图9显示，与商业化漆酶DeniLite II Base相比，CtLcc1、特别是TaLcc2漆酶在40到50℃和pH6下对于斜纹粗棉布的脱色更加有效(浅度增加得更多)。TaLcc2漆酶是最适合用于在低温下进行的应用的酶。与DeniLite II Base在最适温度下相比，CtLcc1和TaLcc2在它们的最适温度下也具有较好的漂白效果。
表20、在槽洗机中在不同温度下用漆酶制品和介体处理的斜纹粗棉布正面的颜色测量。L*表示浅度，-b*表示蓝色方向，+b*表示黄色方向。
实施例9、使用漆酶清除染污测试了漆酶CtLcc1、TaLcc2、TaLcc4和Denilite II Base(实施例7)清除染污的能力。使用了下列的人工染渍的测试布料草渍(Art.164，EMPA Testmaterialen，Germany)、茶渍(Art.167，EMPA Testmaterialen，Germany)。将织物分割成5.8×5.8cm的样品布。漆酶处理在LP-2槽洗机中如下进行。将大约5克染渍的织物放置在含有150ml pH6的Mc Ilvaine柠檬酸磷酸缓冲液的1.2升的容器中，将容器加热。作为漆酶活性单位加入带有或不带有介体(丁香酸甲酯，DeniLite II Assist，Novozymes)的酶(实施例7)。酶的剂量为每克织物200nkat，介体量为每克织物10mg，但是在40℃时，使用的剂量为每克织物20nkat和2mg。槽洗机在pH6下于40、50或60℃运行60分钟。然后将样品布在含有温水的摇瓶中用流水仔细清洗，然后空气干燥。
染污清除效果通过使用L*a*b*颜色空间坐标测量颜色作为反射率值来评估(实施例7)。测量在漆酶处理之前和之后样品布的颜色。
染污清除试验的结果显示在表21-22和图10-13中。在存在介体的情况下，CtLcc1漆酶在60℃能够有效清除草渍，TaLcc2漆酶在50℃能够有效清除草渍，这可以从图10中浅度的增加以及特别是绿色值的减少看出，也可以通过目测清楚地看出。在40℃下也能看到同样的趋势(图12)。CtLcc1漆酶在没有介体的情况下也有一些效果，特别是在60℃下。TaLcc4漆酶在50℃下对草渍有轻微效果(绿色减少大约2单位)。没有介体的情况下漆酶清除染污的效率较低，特别是在40℃下。
在存在介体的情况下，CtLcc1漆酶在60℃能够有效清除茶渍，TaLcc2漆酶在50℃能够有效清除草渍，这可以从红色值的减少以及特别是图11中浅度的增加看出，也可以通过目测清楚地看出。在40℃下也能看到同样的趋势(图13)。没有介体的情况下漆酶对茶渍的效率较低，特别是在40℃下。
表21、在50℃和60℃下漆酶清除染污的颜色测量。L*表示浅度，-b*表示蓝色方向，+b*表示黄色方向，+a*表示红色方向，-a*表示绿色方向。未处理的人工染渍的试验布料和介体和缓冲液对照被用于比较。
表22、在40℃下漆酶清除染污的颜色测量。L*表示浅度，-b*表示蓝色方向，+b*表示黄色方向，+a*表示红色方向，-a*表示绿色方向。未处理的人工染渍的试验布料和介体和缓冲液对照被用于比较。
实施例10、使用漆酶制品进行染料脱色在含有和不含有丁香酸甲酯介体(实施例7)的情况下试验了来自木霉(Trichodernia)菌株(实施例7)的重组漆酶CtLcc1、TaLcc2和TaLcc4使不同染料脱色的能力。实验在含有50ml溶于pH6的柠檬酸磷酸缓冲液的染料的100ml摇瓶中进行。使用的染料浓度为5mg/50ml。酶的剂量为每50ml 100nkat，介体剂量为每50ml 5mg。对照样品只含有染料溶液。摇瓶在50℃保温30、60和120分钟。取3.5ml样品到试管中进行目测评估。
结果显示在表23和24中。在存在介体的情况下，CtLcc1和TaLcc2漆酶能够极大地或完全地使靛蓝胭脂红和Remazol亮蓝(反应蓝19)脱色，部分地使Cibacron亮红3B-P脱色。靛蓝胭脂红的降解很快，在30分钟或更短的时间内蓝色已经变成浅黄色。对于所有染料来说反应似乎在60分钟后都完成了，因为样品的颜色不再能观察到目测可检测的改变。
表23、使用CtLcc1漆酶使染料脱色。处理时间30和60分钟。-没有目测可检测的改变，+目测可检测的褪色，++相当大的褪色，+++完全/几乎完全脱色。
表24、使用TaLcc2漆酶使染料脱色。处理时间30和60分钟。-没有目测可检测的改变，+目测可检测的褪色，++相当大的褪色，+++完全/几乎完全脱色。
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<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(19)<223>Sequence of Peptide 1，a tryptic peptide from Thielavia arenariaALKO 4197 Ta Lcc1 protein<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(12)..(12)<223>Xaa can be Gln or Ile<400>1Tyr Gln Gly Ala Pro Asn Thr Leu Pro Thr Asn Xaa Gly Leu Pro Val1 5 10 15Pro Asn His<210>2<211>11<212>PRT<213>Thielavia arenaria ALKO4197<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(11)<223>Sequence of Peptide 2，a tryptic peptide from Tielavia arenariaALKO 4197 Ta Lcc1 protein<400>2Glu Asn Trp Ile Gly Pro Asp Gly Val Leu Lys1 5 10<210>3<211>9<212>PRT<213>Thielavia arenaria ALKO4179<220>
<221>UNSURE<222>(1)..(1)<223>First amino acid is unsure<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(9)<223>Sequence of Peptide 3，a tryptic peptide from Thielavia arenariaALKO 4197 Ta Lcc1 protein<400>3Ser Leu Phe Leu Ala Val Gly Gln Arg1 5<210>4<211>20<212>PRT<213>Chaetomium thermophilum ALKO4265<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(20)<223>N-terminal sequence from Chaetomium thrmophilum ALKO4265 CtLcc1protein<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(20)<223>N-terminal sequence from Chaetomium thermophilum ALKO4265 CtLcc1protein<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(20)<223>Xaa can be Glu，Ala or Asp<400>4Xaa Gly Pro Gly Pro Cys His Thr Pro Ala Asn Tyr Ala Cys Trp Ala1 5 10 15Pro Gly Phe Asp20<210>5<211>15<212>PRT<213>Chaetomium thermophilum ALKO4265<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(15)<223>Sequence of Peptide 18.9，a tryptic peptide from Chaetomiumthermophilum ALKO 4265 Ct Lcc1 protein<400>5Leu Thr Glu Asn Asp Asn Trp Thr Gly Pro Asp Gly Val Val Lys1 5 10 15<210>6<211>16<212>PRT<213>Chaetomium thermophilum ALKO4265<220>
<221>MISC FEATURE<222>(1)..(16)<223>Sequence of Peptide 22.4，a tryptic peptide from Chaetomiumthermophilum ALKO4265 Ct Lcc1 protein<400>6Asp His Asn Cys Leu Asp Leu Leu Asp Leu Val Pro Val Val Pro Arg1 5 10 15<210>7<211>11<212>PRT<213>Chaetomium thermophilum ALKO4265<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(1)<223>Xaa may be Thr or Ser<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(7)..(7)<223>Xaa mav be Thr or Leu<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(10)..(10)<223>Xaa may be any naturally occuring aminoacid<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(10)..(10)<223>Xaa unsure；may be any naturally occuring aminoacid<400>7Xaa Leu Gly Gly Thr Pro Xaa Phe Val Xaa Lys1 5 10<210>8<211>17<212>DNA<213>artificial<220>
<223>Sequence of the oligonucleotide primer POX1<220>
<221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>n can be c or i<400>8aaytaygcnt gytgggc 17<210>9<211>17<212>DNA<213>artificial<220>
<223>Sequence of the oligonucleotide primer POX2
<220>
<221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>n can be c or i<400>9gcccarcang crtartt17<210>10<211>32<212>DNA<213>artificial<220>
<223>Sequence of the oligonucleotide primer POX22<400>10tgccayacsc ccgcyaacta cgcytgctgg gc 32<210>11<211>17<212>DNA<213>artificial<220>
<223>Sequence of oligonucleotide primer POX3<400>11gtccarttrt crttytc17<210>12<211>17<212>DNA<213>artificial<220>
<223>Sequence of the oligonucleotide primer POX16<400>12garaaygaya aytggac17<210>13<211>32<212>DNA<213>artificial<220>
<223>Sequence of the oligonucleotide primer POX23<400>13gagaacgaya actggacsgg ccccgayggc gt 32<210>14<211>26<212>DNA<213>artificial<220>
<223>Sequence of the oligonucleotide primer POX26<400>14gagaactgga tcggycccga yggygt 26
<210>15<211>17<212>DNA<213>artificial<220>
<223>Sequence of the oligonucl eotide primer POX27<220>
<221>misc_feature<222>(15)..(15)<223>n can be c or i<400>15garaaytgga thggncc17<210>16<211>20<212>DNA<213>artificial<220>
<223>Sequence of the ologonucleotide primer POX28<400>16ctcttcctcg cygtsggyca20<210>17<211>20<212>DNA<213>artificial<220>
<223>Sequence of the ologonucleotide primer POX29<400>17tgrccsacrg cgaggaagag 20<210>18<211>20<212>DNA<213>artificial<220>
<223>Sequence of the oligonucleotide primer POX30<400>18taccagggyg cyccsaacac 20<210>19<211>20<212>DNA<213>artificial<220>
<223>Sequence of the oligonucleotide primer POX31<400>19gtgttsggrg crccctggta 20<210>20<211>17
<212>DNA<213>artificial<220>
<223>Sequence of the oligonucleotide primer POX4<220>
<221>misc_feature<222>(12)..(12)<223>n can be c or i<400>20tggtaycayw sncaytt 17<210>21<211>17<212>DNA<213>artificial<220>
<223>Sequence of the oligonucleotide primer POX5<220>
<221>misc_feature<222>(6)..(6)<223>n can be c or i<400>21aartgnswrt grtacca17<210>22<211>20<212>DNA<213>arfificial<220>
<223>Sequence of the oligonucleotide primer POX6<220>
<221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>n can be c or i<220>
<221>misc_feature<222>(15)..(15)<223>n can be c or i<400>22atgcayytnc ayggncayga 20<210>23<211>20<212>DNA<213>artificial<220>
<223>Sequence of the oligonucleotide primer POX7<220>
<221>misc_feature<222>(6)..(6)
<223>n can be c or i<220>
<221>misc_feature<222>(12)..(12)<223>n can be c or i<400>23tcrtgnccrt gnarrtgcat20<210>24<211>17<212>DNA<213>artificial<220>
<223>Sequence of the oligcnucleotide primer POX8<220>
<221>misc_feature<222>(6)..(6)<223>n can be c or i<220>
<221>misc_feature<222>(12)..(12)<223>n can be c or i<400>24cayytncayg gncayga17<210>25<211>17<212>DNA<213>artificial<220>
<223>Sequence of the oligonucleotide primer POX9<220>
<221>misc_feature<222>(6)..(6)<223>n can be c or i<220>
<221>misc_feature<222>(12)..(12)<223>n can be c or i<400>25tcrtgnccrt gnarrtg 17<210>26<211>23<212>DNA<213>artificial<220>
<223>Sequence of the oligonucleotide primer POX10<220>
<221>misc_feature<222>(6)..(6)
<223>n can be c or i<400>26tgccangcda trtgrcartg cat 23<210>27<211>20<212>DNA<213>artificial<220>
<223>Sequence of the oligonuclootide primer POX11<220>
<221>misc_feature<222>(6)..(6)<223>n can be i or c<400>27tgccangcda trtgrcartg 20<210>28<211>17<212>DNA<213>artificial<220>
<223>Sequene of the oligonucleotide primer POX12<400>28tggtaccact cgcattt 17<210>29<211>17<212>DNA<213>artificial<220>
<223>Sequence of the oligonucleotide primer POX13<400>29tcgtggccgt gcaggtg 17<210>30<211>23<212>DNA<213>artificial<220>
<223>Sequence of the oligonucleotide primer POX14<400>30tgccaggcaa tgtggcagtg cat 23<210>31<211>20<212>DNA<213>artificial<220>
<223>Sequence of the oligonucleotide primer POX15<400>31
tgccaggcaa tgtggcagtg 20<210>32<211>1056<212>DNA<213>Thielavia arenaria ALKO4197<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1056)<223>Sequence of the PCR fragment obtained from Thielavia arenariaALKO4197 using the primers POX27 and POX31<400>32gagaactgga tcgggcccga tggcgttctc aagaatgtgg tgatgttggt caatggtacg 60ttgatgtcca attctgtata aagagaagaa acgtgctgat acgctccctt cgtctagaca120agattatagg tatgttgtca aacccgctgt aaccccaacc gccaagacct ggaggctcct180cgcctggacg tgttgtacaa tatgctgacc tcgccgccag ggccaaccat ccgcgcgaac240tggggtgaca atatcgaagt cactgtcatc aacaatctca aaaccaatgg gtacgaccac300ttgaatcatc ccgggcctac ccctaacaca aaatctcaac gtgcatccga tctgacgtat360tatatccatc tagtacctcg atgcactggc atggccttcg tcagctgggt aacgttttca420acgacggtgc caacggcgtg actgagtgcc caatcccgcc caaaggaggg cgcaagacgt480acaagttccg tgcgacacag tatggcacca gctggtatca ctcccacttc tcggcccagt540acggcaacgg cgtggtcggc accatccaga tcgacggccc tgcctctctg ccatatgaca600ttgatctggg cgtgttccct ctcatggact actactacag gtcggccgat gagctggtgc660acttcaccca gagcaacggc gccccgccaa gcgacaacgt cctcttcaat ggcaccgccc720gtcaccctga gacgggggca ggccagtggt acaacgtcac gctgactcca ggcaagcgac780accgcctgcg catcatcaac acgtcgaccg acaaccactt tcaggtgtcg cttgtcggcc840acaacatgac cgtcattgcc accgacatgg tccccgtcaa cgcctttact gtcagcagcc900tattcctcgc cgtaggccag cgatacgatg tcaccatcga cgccaatagc ccggtgggca960actactggtt caacgtgact ttcggcgatg ggttgtgcgg ctccagtaac aacaaattcc 1020cagccgccat cttccgctac cagggcgccc cgaaca 1056<210>33<211>1296<212>DNA<213>Thielavia arenaria ALKO4197<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1296)<223>Sequence of the PCR fragment obtained from Thielavia arenariaALKO4197 using the primers POX4 and POX11<400>33tggtaccaca gccacttcag cctccagtac gccgagggtc tcttcggggg catgattctc 60cgggggccca gcacggccaa ctgggacgag gacctcggag tcttgtttct gcaggactgg120
tcacacgtcg aagccttcac taggtggcat gaagcgaaag ccgggtttcc tccatcactc 180gatggcggcc tgatcaacgg cacaaacaca tttgactgct ccacactgtc gccgacggac 240cccaagtgca ccggcaatgg caagaagttc gagaccgtct tcgaacccgg caagaagtat 300cttatccgcc tcatcaacgt ggcaatcgac ggagtgttcc agttcagcat cgacggacac 360agcctcaccg tcatagcgac ggatttggtg ccgattgtcc cctacacgac cgacagcgtc 420cagatcacca tcggccagcg ttatgatatc attgtcgagg caaacgcaac gccgggaaac 480tactggatgc gggccgactg ggtcacagcc tgcgtgacca acgatcaccc cgagcacatg 540acgggcatcg ttcgctatga cgcgagcagc atcgaccccc cgacgtccga aagcaacgtc 600acaaaaacca gcagctgcct cggcgagccg aatgagaaaa cgatcccgca tttgtcgctc 660gatgtcacca acattggcgg caccaacgtc gaggaactgt cctttgacac cacctctggc 720gactacttcc agtggactct caatacgagc agcctggtgc tcgattgggg gaacccgacg 780atggcccgaa tcttcaacgg ggatgccatc ttccccaccg agtacaacgt cgttgccgtc 840aacgtgagtc tccccatgtt tgcagtaacc ccgaacccct agagagtgcg gcgatttcgc 900taatcatggt tccctatccg cagaaaaccg gcactggacc ggaatggaca gtcctagtga 960ttcaagatca aagcaatttg ccgtaagcct cccaaattcc caatccactt gtccctgccc1020ttgcaagtca ggtgcgctgc gtgggaatgg gatcccagct gacgtcaagg ctttttcatt1080tgtttgcagc attgcgcatc cgatccacct gcacggccac gacttttggg tgctggcggc1140cgaggagggc gtcttcaatg gcaacattag cagcttcaac acgaggaacc cggcgcggcg1200cgacgtcgcc acgctgccgg gcagaggcta cctggccatc gccttccaga tcgacaaccc1260gggcacctgg ctgacccact gccacattgc ctggca 1296<210>34<211>1295<212>DNA<213>Thielavia arenaria ALKO4197<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1295)<223>Sequence of the PCR fragment obtained from Thielavia arenariaALKO4197 using the primers POX27 and POX9<400>34gagaactgga ttggccctga tggggttcgg aagcctgcca tgcttataaa cggtgtgttg 60ccagagccca caagatcctc caaggtcact tctgacaaca aggcaggctc attccctggt120cccacaatct cagccgactg gggcgactac attattgtca atgtccacaa tgacatgcaa180gataacgggt aagaaatgca gcacggtacc cccggcatcc tcaaacctgc ttgctaacac240ataggtagaa cgtcaatcca ttggcatgga atccgtcagc ttggcgagag caaccaggac300ggcgcaaacg gcgtaacgga atgccccatt cctcccggat ccagcaaaac ctacgacttc360catgtgacgc agtacggcac ctcgtggtac cacagccact actccaacca gtacggcaat420
ggggtcgtgg gcgccctgat cgtgcgcggc ccggcatcag ccaactacga catcgacctc480ggtccctacc tgatcagtga ctactactac gaaaccgcag accgcctcca tctccgagcc540gagctggtca gcaacggccc accgccagac agcgacaaca tcctgttccg cggcaaaaac600atcaacccca agcgtgcagg cagcggctcc tacgaccgcc tcgtcctaac ccccggcaag660aagcatctaa tccggctcat caacgccagc gtggacaact ccttcgtcat ctccctcgtc720ggccacaact tcaccgtcat ctccaccgac atggtcccca tcacccctgt cgtgcgcagc780tccttattca tgggcgtcgg ccagcggtac gacgtcattg tcgaagccaa ccagcccgtg840ggcaactact ggctcaacgc gacgctcgag gcccagaaca actgcgggca ttcggtcaac900cccttccccg cggctattgt ccagtacgag ggcgccagct ccaccgccct gccgaccaac960cgcgggacgc ccctgacggc gacatgcaat ggcgagaaag ggttttcgcc cattgttaag 1020cggacagttt caagttccct gttccagccg tctaccctgc cagtcagcct tgaattcccc 1080actacagacc gcgggcaggt gtttgagtgg cgggttaaga acacgccgat aagcgtcgaa 1140tgggagcatc ccgtgctgga gtacattttg caggggaaca cctccttccc ggcaaaggcc 1200aatctcattg aagtcccgca ggcaaatgtc tggacgttct gggtgattca gaacgggttt 1260gggctgccgc acccgattca cctgcacggg cacga 1295<210>35<211>224<212>DNA<213>Chaetomium thermophilum ALKO 4265<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(224)<223>Sequence of the PCR fragment obtained from Chaetomiumthermophilum ALKO4265 using the primers POX8 and POX11<400>35catctccatg ggcacgactt cctcattgtc ggccgctccc ccgacgtccc gccgggctcg 60aaccagcgct acaacttcga ccccgccacc gacatctacc gcctgcgcgg tcagaacccg120acccgtcgtg acgtcgccat gcttcctgcc ggcggctggc tgctgctcgc cttcctcacc180gacaaccccg gtgcctggct cttccactgc cacatcgcct ggca 224<210>36<211>929<212>DNA<213>Chaetomium thermophilum ALKO4265<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(929)<223>Sequence of the PCR fragment obtained from Chaetomiumthermophilum ALKO4265 using the primers POX4 and POX9<400>36tggtatcatt gccacttctc caaccagtac ggcaacggcg tgctcggcgc actggtggtc 60aaaggcccgg cttccgccaa ctacgacatc gacctcggcc cgtacatcat tagcgactac120
taccacgaga cggccgacag attacatctc caggcagagc tactccgcaa cgggccccct180ccagacagcg acaacatcct cttcaggggc aagaacatca accctgacgg ctcgggccgc240ggctcttatg accgattaac cctcatccca ggcaagaaac acctgctgcg tctgatcaac300gcaagcgtgg ataactcctt cacggtctcc ctcgtgggac acaacttcac ggtcattgcg360accgatatgg tcccggtcca gccaaccgtc cgcaggagcc tgttcatggc cgtcggccag420cgttatgatg ttattgttac cgccgaccag cccgtagata attattggct gaacgtcacc480ctggaagcaa acaacaactg cggccgctct cgcaacccct acccagcagc catcatccac540tacgagggag ccagcccaac cgccctcccc accaaccgtg gcacccccct cgtagcaacc600tgcaccggcg agacaggctt cacccccgtc gtgccgcgga atatcccccc caacttcttc660cgcccttccg acatcgcctc caataccctg ccaatcggcc tcaacattgt caaccacacc720actaaaggcc aaatcttctc ctggcatgtg aagaacacgc ctatttccgt ggaatggggg780catccagtat tagagtacat cctcgaaggg aattactcct ttcccgcagc ggttaatctg840attcaactca accaaaaaga cacctggaca ctctttttgg tgcatagttc gttatcatta900ccgcacccaa tccacctcca cgggcacga 929<210>37<211>251<212>DNA<213>Chaetomium thermophilum ALKO4265<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(251)<223>Sequence of the PCR fragment obtained from Chatomium thermophilumALKO465 using the primers POX8 and POX11<400>37cacttccacg ggcacgactt ttacatcctc cacgagggcc ccggcgactg ggatggcacc 60atggtccggc caagcaaccc ccacagacgg gacgtctacc tggtacgcgg gtttggtcat120cttgttctgc aattcgatgg tgaacctggt acgtgtgccg tagttctcag ccagactccg180tgtgcgcttg gaggaaggca atctaacaac ataataggag tctgggcctt ccactgtcac240atcgcgtggc a 251<210>38<211>2680<212>DNA<213>Thielavia arenaria ALKO4197<220>
<221>misc_feature<222>(178)..(2456)<223>Talcc1<220>
<221>Intron<222>(406)..(456)
<220>
<221>Intron<222>(536)..(597)<220>
<221>Intron<222>(610)..(700)<220>
<221>Intron<222>(771)..(853)<220>
<221>Intron<222>(1824)..(1902)<220>
<221>Intron<222>(1975)..(2033)<400>38ggatccccgg gtcagtctat ataaggggct gagtgtccag ctcttccatg cctttgattc 60tcttgaatca ccaggacact cgggcggctt cagtcttgca taactcgggt cttcccttcc 120tctcactgct tttcttcgct cagatatatt tcaggcgacc tcaaacagct cgccatcatg 180aagtcttggg ccgccgccgt ggcgctcatg gtgggcattc tcagccctca tgctgccgcc 240gcacctcctg caaacccggt ccagagagac atgctccagg tccttgaggc gagacagtct 300ggcccgactt gcaacacccc gtccaatcgt gcgtgctgga ccaatggttt cgacatcaac 360accgactatg aagtcagcac tcctaatacc ggacgtactg tggccgtaag cttcccctcc 420ctttaaggag gcagagctag gactaacaag caccagtacc aacttaccct cactgagaaa 480gagaactgga tcggtcccga tggcgttctc aagaatgtgg tgatgttggt caatggtacg 540ttgatgtcca attctgtata aagagaagaa acgtgctgat acgctccctt cgtctagaca 600agattatagg tatgttgtca aacccgctgt aaccccaacc gccaagacct ggaggctcct 660cgcctggacg tgttgtacaa tatgctgacc tcgccgccag ggccaaccat ccgcgcgaac 720tggggtgaca atatcgaagt cactgtcatc aacaatctca aaaccaatgg gtacgaccac 780ttgaatcatc ccgggcctac ccctaacaca aaatctcaac gtgcatccga tctgacgtat 840tatatccatc tagtacctcg atgcactggc atggccttcg tcagctgggt aacgttttca 900acgacggtgc caacggcgtg actgagtgcc caatcccgcc caaaggaggg cgcaagacgt 960acaagttccg tgcgacacag tatggcacca gctggtatca ctcccacttc tcggcccagt1020acggcaacgg cgtggtcggc accatccaga tcgacggccc tgcctctctg ccatatgaca1080ttgatctggg cgtgttccct ctcatggact actactacag gtcggccgat gagctggtgc1140acttcaccca gagcaacggc gccccgccaa gcgacaacgt cctcttcaat ggcaccgccc1200gtcaccctga gacgggggca ggccagtggt acaacgtcac gctgactcca ggcaagcgac1260accgcctgcg catcatcaac acgtcgaccg acaaccactt tcaggtgtcg cttgtcggcc1320acaacatgac cgtcattgcc accgacatgg tccccgtcaa cgcctttact gtcagcagcc1380tattcctcgc cgtaggccag cgatacgatg tcaccatcga cgccaatagc ccggtgggca1440
actactggtt caacgtgact ttcggcgatg ggttgtgcgg ctccagtaac aacaaattcc1500cagccgccat cttccgctac cagggcgccc ccgctacgct cccgacggat cagggtctac1560ccgtgcccaa tcacatgtgt ttggacaacc tgaacctaac tcctgtggtg acacggagcg1620cgcccgtcaa caactttgtc aagcgtccgt ccaacacgct gggcgtcact ctcgatatcg1680gcggcacgcc gctctttgtg tggaaggtca acggcagcgc catcaacgtc gactggggca1740agccgatcct tgactatgtc atgagcggca acacgagcta cccggtcagc gataacattg1800tgcaggtgga cgctgttgac caggtacgcc cctcttgaag cccctagcag ttcacgctag1860tatacaatac aagtacatgc taacacttcc ctccctattc agtggactta ctggctgatc1920gagaacgacc cgaccaatcc cattgtcagc ttgccgcacc cgatgcatct gcacgtacgt1980tcaaacctcc ccccaccccc cacttcatac aaaatatact gacaaatcga cagggccacg2040acttcctcgt cctgggccga tcacccgacg agctccccag cgcgggggtc cgtcacatct2100ttgacccggc caaggacctg ccccggctta agggcaacaa ccccgtgcgg cgggacgtga2160cgatgcttcc ggcgggcggc tggctgctgc tggcgttcaa gacggacaac ccgggcgcat2220ggctgttcca ctgccacatt gcgtggcacg tgtcgggcgg cctgtcggtc gacttcctcg2280agcggcccaa cgaccttcgc acgcagctca acagcaacgc caagcgcgcc gaccgcgacg2340acttcaaccg cgtctgccgc gagtggaacg cctactggcc taccaacccg ttccccaaga2400tcgactcggg cttgaggcac cggtttgttg aggagagcga gtggatggtt cgctaaactg2460cctggctgtg ccaattgatt tgatgggtac atgtacctgt tggtgttact gttgacgagg2520ctgtgtaagt accatggcaa aggggtgttt tcaggggtgc tctggggtaa ttggcacagt2580acatggaggg gtctggggtt gggtatacaa ggcttgctgc tccgttttta tcttttggct2640tgattaagac tttcttgtct gatgtacgag tcaggccgcc 2680<210>39<211>617<212>PRT<213>Thielavia arenaria ALKO4197<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(617)<223>Deduced amino acid sequence of Thielavia arenaria ALKO4197 TaLcc1<400>39Met Lys Ser Trp Ala Ala Ala Val Ala Leu Met Val Gly Ile Leu Ser1 5 10 15Pro His Ala Ala Ala Ala Pro Pro Ala Asn Pro Val Gln Arg Asp Met20 25 30Leu Gln Val Leu Glu Ala Arg Gln Ser Gly Pro Thr Cys Asn Thr Pro35 40 45Ser Asn Arg Ala Cys Trp Thr Asn Gly Phe Asp Ile Asn Thr Asp Tyr
50 55 60Glu Val Ser Thr Pro Asn Thr Gly Arg Thr Val Ala Tyr Gln Leu Thr65 70 75 80Leu Thr Glu Lys Glu Asn Trp Ile Gly Pro Asp Gly Val Leu Lys Asn85 90 95Val Val Met Leu Val Asn Asp Lys Ile Ilc Gly Pro Thr Ile Arg Ala100 105 110Asn Trp Gly Asp Asn Ile Glu Val Thr Val Ile Asn Asn Leu Lys Thr115 120 125Asn Gly Thr Ser Met His Trp His Gly Leu Arg Gln Leu Gly Asn Val130 135 140Phe Asn Asp Gly Ala Asn Gly Val Thr Glu Cys Pro Ile Pro Pro Lys145 150 155 160Gly Gly Arg Lys Thr Tyr Lys Phe Arg Ala Thr Gln Tyr Gly Thr Ser165 170 175Trp Tyr His Ser Hi s Phe Ser Ala Gln Tyr Gly Asn Gly Val Val Gly180 185 190Thr Ile Gln Ile Asp Gly Pro Ala Ser Leu Pro Tyr Asp Ile Asp Leu195 200 205Gly Val Phe Pro Leu Met Asp Tyr Tyr Tyr Arg Ser Ala Asp Glu Leu210 215 220Val His Phe Thr Gln Ser Asn Gly Ala Pro Pro Ser Asp Asn Val Leu225 230 235 240Phe Asn Gly Thr Ala Arg His Pro Glu Thr Gly Ala Gly Gln Trp Tyr245 250 255Asn Val Thr Leu Thr Pro Gly Lys Arg His Arg Leu Arg Ile Ile Asn260 265 270Thr Ser Thr Asp Asn His Phe Gln Val Ser Leu Val Gly His Asn Met275 280 285Thr Val Ile Ala Thr Asp Met Val Pro Val Asn Ala Phe Thr Val Ser290 295 300Ser Leu Phe Leu Ala Val Gly Gln Arg Tyr Asp Val Thr Ile Asp Ala305 310 315 320Asn Ser Pro Val Gly Asn Tyr Trp Phe Asn Val Thr Phe Gly Asp Gly325 330 335
Leu Cys Gly Ser Ser Asn Asn Lys Phe Pro Ala Ala Ile Phe Arg Tyr340 345 350Gln Gly Ala Pro Ala Thr Leu Pro Thr Asp Gln Gly Leu Pro Val Pro355 360 365Asn His Met Cys Leu Asp Asn Leu Asn Leu Thr Pro Val Val Thr Arg370 375 380Ser Ala Pro Val Asn Asn Phe Val Lys Arg Pro Ser Asn Thr Leu Gly385 390 395 400Val Thr Leu Asp Ile Gly Gly Thr Pro Leu Phe Val Trp Lys Val Asn405 410 415Gly Ser Ala Ile Asn Val Asp Trp Gly Lys Pro Ile Leu Asp Tyr Val420 425 430Met Ser Gly Asn Thr Ser Tyr Pro Val Ser Asp Asn Ile Val Gln Val435 440 445Asp Ala Val Asp Gln Trp Thr Tyr Trp Leu Ile Glu Asn Asp Pro Thr450 455 460Asn Pro Ile Val Ser Leu Pro His Pro Met His Leu His Gly His Asp465 470 475 480Phe Leu Val Leu Gly Arg Ser Pro Asp Glu Leu Pro Ser Ala Gly Val485 490 495Arg His Ile Phe Asp Pro Ala Lys Asp Leu Pro Arg Leu Lys Gly Asn500 505 510Asn Pro Val Arg Arg Asp Val Thr Met Leu Pro Ala Gly Gly Trp Leu515 520 525Leu Leu Ala Phe Lys Thr Asp Asn Pro Gly Ala Trp Leu Phe His Cys530 535 540His Ile Ala Trp His Val Ser Gly Gly Leu Ser Val Asp Phe Leu Glu545 550 555 560Arg Pro Asn Asp Leu Arg Thr Gln Leu Asn Ser Asn Ala Lys Arg Ala565 570 575Asp Arg Asp Asp Phe Asn Arg Val Cys Arg Glu Trp Asn Ala Tyr Trp580 585 590Pro Thr Asn Pro Phe Pro Lys Ile Asp Ser Gly Leu Arg His Arg Phe595 600 605
Val Glu Glu Ser Glu Trp Met Val Arg610 615<210>40<211>3084<212>DNA<213>Thielavia arenaria ALKO4197<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(2600)<223>Nucleotide sequence of Thielavia arenaria ALKO4197 Talcc2 gene.
<220>
<221>misc_feature<222>(644)..(2600)<223>Talcc2<220>
<221>misc_feature<222>(644)..(646)<223>putative start，ATG<220>
<221>misc_feature<222>(674)..(676)<223>putative start，ATG<220>
<221>Intron<222>(2003)..(2082)<220>
<221>Intron<222>(2142)..(2248)<400>40ggatcccgta gtcaacaaga cccagcaccc agggtaacca tcctatacgg ggcaagatct 60accacttgca gcgatatatt gaagtccaat acatcgtcac tgtagtagtc atggtgttct120gtaagttccg gcagggactg tagtactcga cgggttcctc tccttccagt tagccctcgt180agagcatgtt gacgttacga taggtttccc cccccccatt tggagctgtg atatactttc240aagttgttga aggcctttag ctgagcataa cgatcgtggc tgacgaaagc ctccgtgcgg300cacacctaaa attacgattc cgaatgctcc tccaaggagt tgtcatatga tactattgat360gtgagcttca ggggagcagg cccattacgg aaggtagacc agggacaact ccttctcggc420ttaaccgggc cggatcgtgg aatgcctcgc caaagactca ttgcgaggcg acatggagcc480aagcccacct tctcttgagg ctctgatatt gatgctgtac gagtataaag tcgatgatct540cctgcaatgt cccagagtct atccaagcag ctcttggacc aaggaagcca tcggtcactc600aacaggcgcg gccacattcg ttcaactttg aattggtagc accatgttaa ccgagacact660caagtcaaga aacatgttgc aatcaatcct tgctcttctt gccaccgccc tgggctcatc720tgccttcgcc atccctgaac tcccagaggt ctcgcttcag ccccggcaag cttgcgagaa780cactgcaacg tctcgccaat gctggggtga cctttcaatc gacaccaact actatgaagt840tcttcccagc accgggcgcc cgccgcagga gtattggctg agtgtcgtgg aaggcccttg900
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<221>Intron<222>(1326)..(1390)<223>Intron2<220>
<221>Intron<222>(2187)..(2255)<223>Intron3<400>50ccgcggctga tactaccaga aaacgcccca gttacacata tacacgccgg gaatctctgt 60acaggttgtc tcaactgtgt cggttccgct cctgggaacg acattagcac cacctctttg120agccgtcata atatttttct ttcttctttt cccccgtgct acgcaatcca gacaaccctg180gcaaagattg cctattgaga gctgggaaac tgccaagatg gcaacgctga ccggcgatca240tctgtcgaga cagcattaac gctcaacagc caccggcaac catccctaga cactgccaac300ttgctgccgt gtgccctgca ctacatgtgg cgtgacatgg atacgatgtt ttcggatatc360cagaaagctt catccgccga taggtctgct atctctctct tttctgccct ttcctgtctt420ttccaggacc ccctaaaatt tcatatgctc tcacatcggg gccagcatat ctattccatg480tctcccggtt ccatggtctt catcacccgt cacagattct gttccttctg ttattgcttc540
ttactggcag agtgtgttgg cttgtggtga aagaccacct gctgcccctt cctagccatc 600atgggggtca ttttggagga tttaaacaac attgcgtccg tggtagagca ggctctcagt 660accgtggtag agaaggtcac ctccgcccta tcacagctgg acactaatgg gtacgtcagt 720gacaggtcca ctccccttga atgtaccgac cctaactcag ctatgtagat actcgatctg 780gggaactttg cttgcctcct cattggctcc ctttttgaca gataacccgc tgcctgatgg 840atatccatgg ggcaacttga cggactacgg caacaacccg tatcgtgaat gtccacatac 900cggcattact agatcctatc acttcaccat cagtcgggga gtcattgctc cagatggcta 960cgaacgcgag gtgctccttg tgaacggggc cttcccggga ccacttattg aagcaaattg1020gggagacacc atcattgtga aagttttcaa caatatatca aaccccgaag agggcacctc1080catacactgg cacggcttcc tccagcacca cactccctgg gaagatggca ctcctggcat1140cacccaatgt cccatcccct cgggaaaagc ttacacctac aagttcaacg ccagtctgta1200cggtacaacc tggtatcatg cccattactc agcccaatat gctggtggca ttgttgggcc1260tattgttatc catggaccaa ccaaagaagg ctatgatatt gatgtcggtc ctgtcatgct1320gggtggtaag ctctatccga ccgggagatg actggcaact agatgtcacg aagactcata1380acttccacag attggtatca ccaagaatac tacaatatcg tcaagacaat gctgagcccc1440agcgaaagtc ctctccgggt ttattccgac aacaacctga tcaacggcaa gatggacttc1500aactgttcga ccgtctctga agacgacccg caccgatgca caccaaacgc ggggatatcc1560aaattccgct tccaggccgg tcaggttcat cgcttgcgcc tcatcaacct aggcggcgac1620ggtatccagc gcttctccat agatgagcac gtcctaaccg tcatcgccga ggactttgtg1680ccggtcaagc cgtacaacac gacagtggta gtgctgggcg tcggccagcg cgctgatgtt1740ttggtgactg ccaatgcggg agggcccaag tctacgttct ggatgcgctc cagcctcacg1800acatgctcgc cggccaggca gccgaacgct gtggctgttg tgttgtatga tgaggcggac1860gagaatgcgg tgccgaatag caagccgtgg gagataccga atcctgatgt gtgtgctaat1920ctgccgctgg agatcaccga gccactgtac ccaattccgc tgcctgagcc gacctttaca1980gagagaatgg agatcgagat cttcaaaaat gagtccaaga tttggctgtg gaagttcaat2040gatatatcaa tgcggacgca ttacaacaag ccggtgctgc tgctcgccaa ccaaggagaa2100tatgactacc ccgaagaatg gaacgtcgtg aactactatc aaaacgagtc cgtccgaatt2160gttgtgaaaa acaactctcc taccccgtag gtatacctca gaggaatctt ctgctcttgt2220tgtccgcata ccatgactaa cccctgactc aacagccacc cgatgcatct ccacggccac2280aacttttaca tcctccacga gggccccggc gactgggatg gcaccatggt ccggccaagc2340aacccccaca gacgggacgt ctacctggta cgcgggtttg gtcatcttgt tctgcaattc2400gatggtgaac ctggtacgtg tgccgtagtt ctcagccaga ctccgtgtgc gcttggagga2460aggcaatcta acaacataat aggagtctgg gccttccact gccatattgc atggcacgca2520tcgggtggtt ttctagcgac gcttattgtc cagccggata cggttgagaa attcaacgtt2580ccggaggatg tgtggaataa ctgcaacgcg tgggatcact acacaaagca taacgttgtt2640
gagcagattg acagtggtac ataattttta ggttcgtttc gttggccgag tgcggcagct2700gataggacac ggtttaaatt ccccgtcgga ataatgtcga tgtagttttt gcatatatac2760tcatcgttga tggagactca cagtcaacac tcgaaattgg atcgtaatac atggcagttt2820gtgcacagcc aaattgcacg aaaatgtgct tattgagcga ccgtgggcat tatatcattc2880aagaagcaaa caactgtaca tcgcacgtac gtactgtcaa ggagtcgata catgcatcat2940aaaccgaata tcaggccaag gtattcaagc aaaaatgata gacagtccgt gagtctgagt3000ccagtccaaa cccgagtcca agctt 3025<210>51<211>623<212>PRT<213>Chaetomium thermophilum ALKO4265<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(623)<223>Deduced amino acid sequence of Chaetomium thermophilum ALKO4265CtLcc3<400>51Met Gly Val Ile Leu Glu Asp Leu Asn Asn Ile Ala Ser Val Val Glu1 5 10 15Gln Ala Leu Ser Thr Val Val Glu Lys Val Thr Ser Ala Leu Ser Gln20 25 30Leu Asp Thr Asn Gly Tyr Ser Ile Trp Gly Thr Leu Leu Ala Ser Ser35 40 45Leu Ala Pro Phe Leu Thr Asp Asn Pro Leu Pro Asp Gly Tyr Pro Trp50 55 60Gly Asn Leu Thr Asp Tyr Gly Asn Asn Pro Tyr Arg Glu Cys Pro His65 70 75 80Thr Gly Ile Thr Arg Ser Tyr His Phe Thr Ile Ser Arg Gly Val Ile85 90 95Ala Pro Asp Gly Tyr Glu Arg Glu Val Leu Leu Val Asn Gly Ala Phe100 105 110Pro Gly Pro Leu Ile Glu Ala Asn Trp Gly Asp Thr Ile Ile Val Lys115 120 125Val Phe Asn Asn Ile Ser Asn Pro Glu Glu Gly Thr Ser Ile His Trp130 135 140His Gly Phe Leu Gln His His Thr Pro Trp Glu Asp Gly Thr Pro Gly145 150 155 160
Ile Thr Gln Cys Pro Ile Pro Ser Gly Lys Ala Tyr Thr Tyr Lys Phel65 170 175Asn Ala Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Trp Tyr His Ala His Tyr Ser Ala180 185 190Gln Tyr Ala Gly Gly Ile Val Gly Pro Ile Val Ile His Gly Pro Thr195 200 205Lys Glu Gly Tyr Asp Ile Asp Val Gly Pro Val Met Leu Gly Asp Trp210 215 220Tyr His Gln Glu Tyr Tyr Asn Ile Val Lys Thr Met Leu Ser Pro Ser225 230 235 240Glu Ser Pro Leu Arg Val Tyr Ser Asp Asn Asn Leu Ile Asn Gly Lys245 250 255Met Asp Phe Asn Cys Ser Thr Val Ser Glu Asp Asp Pro His Arg Cys260 265 270Thr Pro Asn Ala Gly Ile Ser Lys Phe Arg Phe Gln Ala Gly Gln Val275 280 285His Arg Leu Arg Leu Ile Asn Leu Gly Gly Asp Gly Ile Gln Arg Phe290 295 300Ser Ile Asp Glu His Val Leu Thr Val Ile Ala Glu Asp Phe Val Pro305 310 315 320Val Lys Pro Tyr Asn Thr Thr Val Val Val Leu Gly Val Gly Gln Arg325 330 335Ala Asp Val Leu Val Thr Ala Asn Ala Gly Gly Pro Lys Ser Thr Phe340 345 350Trp Met Arg Ser Ser Leu Thr Thr Cys Ser Pro Ala Arg Gln Pro Asn355 360 365Ala Val Ala Val Val Leu Tyr Asp Glu Ala Asp Glu Asn Ala Val Pro370 375 380Asn Ser Lys Pro Trp Glu Ile Pro Asn Pro Asp Val Cys Ala Asn Leu385 390 395 400Pro Leu Glu Ile Thr Glu Pro Leu Tyr Pro Ile Pro Leu Pro Glu Pro405 410 415Thr Phe Thr Glu Arg Met Glu Ile Glu Ile Phe Lys Asn Glu Ser Lys420 425 430
Ile Trp Leu Trp Lys Phe Asn Asp Ile Ser Met Arg Thr His Tyr Asn435 440 445Lys Pro Val Leu Leu Leu Ala Asn Gln Gly Glu Tyr Asp Tyr Pro Glu450 455 460Glu Trp Asn Val Val Asn Tyr Tyr Gln Asn Glu Ser Val Arg Ile Val465 470475 480Val Lys Asn Asn Ser Pro Thr Pro His Pro Met His Leu His Gly His485 490 495Asn Phe Tyr Ile Leu His Glu Gly Pro Gly Asp Trp Asp Gly Thr Met500 505 510Val Arg Pro Ser Asn Pro His Arg Arg Asp Val Tyr Leu Val Arg Gly515 520 525Phe Gly His Leu Val Leu Gln Phe Asp Gly Glu Pro Gly Thr Cys Ala530 535 540Val Val Leu Ser Gln Thr Pro Cys Ala Leu Gly Gly Arg Gln Ser Asn545 550 555 560Asn Ile Ile Gly Val Trp Ala Phe His Cys His Ile Ala Trp His Ala565 570 575Ser Gly Gly Phe Leu Ala Thr Leu Ile Val Gln Pro Asp Thr Val Glu580 585 590Lys Phe Asn Val Pro Glu Asp Val Trp Asn Asn Cys Asn Ala Trp Asp595 600 605His Tyr Thr Lys His Asn Val Val Glu Gln Ile Asp Ser Gly Thr610 615 620
权利要求
1.一种漆酶，其特征为含有选自下列序列的氨基酸序列SEQ ID41(TaLcc2)或与序列SEQ ID NO41显示出至少60％同一性的序列，SEQ ID 43(TaLcc3)或与序列SEQ ID NO43显示出至少58％同一性的序列，SEQ ID 45(TaLcc4)或与序列SEQ ID NO45显示出至少78％同一性的序列，SEQ ID 47(CtLcc1)或与序列SEQ ID NO47显示出至少74％同一性的序列，SEQ ID 49(CtLcc2)或与序列SEQ ID NO49显示出至少55％同一性的序列，以及SEQ ID 51(CtLcc3)或与序列SEQ IDNO51显示出至少53％同一性的序列。
2.权利要求1的漆酶，其中的酶可以从微生物来源获得。
3.权利要求1或2的漆酶，其中的酶可以从丝状真菌获得。
4.权利要求1的漆酶，其中的酶含有氨基酸序列SEQ ID 41(TaLcc2)或与序列SEQ ID NO41显示出至少60％同一性的序列。
5.权利要求1到4的漆酶，其中的酶可以从梭孢壳菌属中获得。
6.权利要求1到5之一的漆酶，其中的酶可以从保藏菌株CBS116071获得。
7.权利要求5或6的漆酶，其中的酶由保藏在登记号为DSM15486的大肠杆菌中的pALK1347编码。
8.权利要求4到6之一的酶，其中的酶在适当条件下在pH3-9的范围内起作用，优选在pH4-8的范围内起作用，最优选在pH4.5-6.5的范围内起作用。
9.权利要求4到8之一的酶，其中的酶在适当的条件下最适pH为大约pH5.5。
10.权利要求4到9之一的酶，其中的酶在30-80℃的温度范围内有效，优选在40-60℃的温度范围内有效，更优选在40-50℃的温度范围内有效。
11.权利要求4到10之一的漆酶，其中的酶能够漂白斜纹粗棉布。
12.权利要求4到11之一的漆酶，其中的酶在大约40-50℃的温度范围内对斜纹粗棉布的漂白最有效。
13.权利要求4到12之一的漆酶，其中的酶在大约pH6下对斜纹粗棉布的漂白最有效。
14.权利要求4到13之一的漆酶，其中的酶对染污的清除有效。
15.权利要求4到14之一的漆酶，其中的酶能够使染料脱色。
16.权利要求4到15之一的漆酶，其中的酶在存在一种或多种介体的情况下最有效。
17.权利要求1的漆酶，其中的酶含有氨基酸序列SEQ ID 43(TaLcc3)或与序列SEQ ID NO43显示出至少58％同一性的序列。
18.权利要求1到3或17之一的漆酶，其中的酶可以从梭孢壳菌属的菌株中获得。
19.权利要求17或18的漆酶，其中的酶可以从保藏菌株CBS116071获得。
20.权利要求17或19的漆酶，其中的酶由保藏在登记号为DSM15485的大肠杆菌中的pALK1345编码。
21.权利要求17到20之一的酶，其中的酶在适当条件下在pH3.5-7.5的范围内起作用，优选在pH4-6.5的范围内起作用。
22.权利要求17到21之一的酶，其中的酶在适当的条件下最适pH为大约pH5.0。
23.权利要求1的漆酶，其中的酶含有氨基酸序列SEQ ID 45(TaLcc4)或与序列SEQ ID NO45显示出至少78％同一性的序列。
24.权利要求1到3或23之一的漆酶，其中的酶可以从梭孢壳菌属的菌株中获得。
25.权利要求23或24的漆酶，其中的酶可以从保藏菌株CBS116071获得。
26.权利要求23到25之一的漆酶，其中的酶由保藏在登记号为DSM15487的大肠杆菌中的pALK1664编码。
27.权利要求23到26之一的酶，其中的酶在适当条件下在pH3.5-7.5的范围内起作用，优选在pH4-7的范围内起作用，最优选在pH5-6.5的范围内起作用。
28.权利要求23到27之一的酶，其中的酶在适当的条件下最适pH为大约pH6。
29.权利要求1的漆酶，其中的酶含有氨基酸序列SEQ ID 47(CtLcc1)或与序列SEQ ID NO47显示出至少74％同一性的序列。
30.权利要求1到3或29之一的漆酶，其中的酶可以从毛壳菌属的菌株中获得。
31.权利要求29或30的漆酶，其中的酶可以从保藏菌株CBS730.95获得。
32.权利要求29到31之一的漆酶，其中的酶由保藏在登记号为DSM15075的大肠杆菌中的pALK1304编码。
33.权利要求29到32之一的酶，其中的酶在适当条件下在pH3.5-8的范围内起作用，优选在pH4-7的范围内起作用，最优选在pH4.5-6的范围内起作用。
34.权利要求29到33之一的酶，其中的酶在适当的条件下最适pH为大约pH5.0。
35.权利要求29到34之一的酶，其中的酶在30-80℃的温度范围内有效，优选在40-70℃的温度范围内有效，更优选在50-60℃的温度范围内有效。
36.权利要求29到35之一的漆酶，其中的酶能够漂白斜纹粗棉布。
37.权利要求29到36之一的漆酶，其中的酶在大约50-60℃的温度范围内对斜纹粗棉布的漂白最有效。
38.权利要求29到37之一的漆酶，其中的酶在大约pH6下对斜纹粗棉布的漂白最有效。
39.权利要求29到38之一的漆酶，其中的酶对染污的清除有效。
40.权利要求29到39之一的漆酶，其中的酶能够使染料脱色。
41.权利要求29到39之一的漆酶，其中的酶在存在一种或多种介体的情况下最有效。
42.权利要求1的漆酶，其中的酶含有氨基酸序列SEQ ID 49(CtLcc2)或与序列SEQ ID NO49显示出至少55％同一性的序列。
43.权利要求1到3或42之一的漆酶，其中的酶可以从毛壳菌属的菌株中获得。
44.权利要求42或43的漆酶，其中的酶可以从保藏菌株CBS730.95获得。
45.权利要求42到44之一的漆酶，其中的酶由保藏在登记号为DSM15076的大肠杆菌中的pALK1305编码。
46.权利要求1中的漆酶，其中的酶含有氨基酸序列SEQ ID 51(CtLcc3)或与序列SEQ ID NO59显示出至少53％同一性的序列。
47.权利要求1到3或46之一的漆酶，其中的酶可以从毛壳菌属的菌株中获得。
48.权利要求46或47中的漆酶，其中的酶可以从保藏菌株CBS730.95获得。
49.权利要求46到48之一的漆酶，其中的酶由保藏在登记号为DSM16040的大肠杆菌中的pALK1685编码。
50.前述权利要求之一的漆酶，其中的酶缺少信号序列。
51.前述权利要求之一的漆酶，其中的酶缺少尾巴。
52.前述权利要求之一的漆酶，其中的酶在异源生产宿主中生产。
53.前述权利要求之一的漆酶，其中的漆酶在微生物宿主中生产。
54.前述权利要求之一的漆酶，其中的漆酶在丝状真菌宿主中生产。
55.前述权利要求之一的漆酶，其中的酶在木霉属或曲霉属的宿主中生产。
56.核酸序列，其特征为它编码在权利要求1到55之一定义的酶。
57.载体，其特征为它含有权利要求56的核酸序列。
58.权利要求57的载体，其中的核酸序列已经与允许在原核或真核宿主细胞中表达的表达控制序列可操作地连接。
59.宿主细胞，其特征为已经在其中导入了权利要求56的核酸序列或权利要求57或58的载体。
60.权利要求59的宿主细胞，其中的宿主细胞是微生物宿主细胞。
61.权利要求59或60的宿主细胞，其中的宿主细胞属于木霉属或曲霉属。
62.生产具有漆酶活性的多肽的方法，包括培养权利要求59到61之一的宿主细胞，以及回收多肽的步骤。
63.具有漆酶活性的多肽，其由权利要求56的核酸序列或权利要求57或58的载体编码的并可以通过权利要求62的方法获得。
64.获得含有权利要求63的多肽的酶制品的方法，包括培养权利要求59到61之一的宿主细胞，以及或者从细胞回收多肽或者从宿主培养基中分离细胞并获得上清液的步骤。
65.可以通过权利要求64的方法获得的酶制品。
66.含有权利要求1到55之一的漆酶的酶制品。
67.权利要求65或66的酶制品，其中的酶制品还包含选自稳定剂、缓冲液、介体和防腐剂的适当的添加剂。
68.权利要求65到67之一的酶制品，其中的酶制品是生产宿主用过的培养基。
69.权利要求65到68之一的酶制品，其中的酶制品为液体、粉末或颗粒形式。
70.处理斜纹粗棉布的方法，其包括在使酶发挥作用的适当条件下，在水性介质中将斜纹粗棉布与权利要求1到55之一的漆酶或权利要求65到69之一的酶制品相接触。
71.权利要求70的方法，其中的处理在存在适当介体的情况下进行。
72.权利要求70或71的方法，其中的处理在30-80℃的温度范围内进行，优选在40-70℃的温度范围内进行，更优选在40到60℃的温度范围内进行。
73.权利要求70到72之一的方法，其中的处理在pH3-8的pH范围内进行，优选在pH4-7的pH范围内进行，最优选在pH4.5-6.5的pH范围内进行。
74.权利要求70到73之一的方法，其中的处理进行15分钟到2小时，优选进行30分钟到90分钟，最优选进行30分钟到60分钟。
75.权利要求70到74之一的方法，其中处理中使用的酶的剂量是每克织物2到500nkat，优选为每克织物20到200nkat，更优选为每克织物20到100nkat。
76.权利要求70到75之一的方法，其中的处理被重复一次或多次。
77.清除染污的方法，其包括，将待处理的材料与权利要求1到55之一的漆酶或与权利要求65到69之一的酶制品在适合使酶发挥作用的条件下相接触。
78.漂白纸浆的方法，其包括将该纸浆与权利要求1到55之一的漆酶或与权利要求65到69之一的酶制品在适合使酶发挥作用的条件下相接触的步骤。
79.处理天然或人造纤维的方法，其将纤维与权利要求1到55之一的漆酶或与权利要求65到69之一的酶制品在适合使酶发挥作用的条件下相接触。
80.处理木质纤维素纤维的方法，其将纤维与权利要求1到55之一的漆酶或与权利要求65到69之一的酶制品在适合使酶发挥作用的条件下相接触。
81.处理羊毛的方法，其包括将羊毛与权利要求1到55之一的漆酶或与权利要求65到69之一的酶制品在适合使酶发挥作用的条件下相接触。
82.处理毛发的方法，其包括将毛发与权利要求1到55之一的漆酶或与权利要求65到69之一的酶制品在适合使酶发挥作用的条件下相接触。
83.处理印染厂废水的方法，其包括将印染厂废水与权利要求1到55之一的漆酶或与权利要求65到69之一的酶制品在适合使酶发挥作用的条件下相接触。
84.使染料脱色的方法，其包括将染料或含有染料的材料与权利要求1到55之一的漆酶或与权利要求65到69之一的酶制品在适合使酶发挥作用的条件下相接触，以使酶发挥作用。
85.权利要求1到55之一的漆酶或权利要求65到69之一的酶制品用于斜纹粗棉布的处理、染污的清除、纸浆的漂白、纤维的处理、羊毛的处理、毛发的处理、印染厂废水的处理或染料或含染料材料的脱色。
全文摘要
本发明涉及可以从梭孢壳菌属(Thielavia)或毛壳菌属(Chaetomium)的菌株中获得的新的漆酶。本发明也涉及编码这些酶的核酸序列、被导入了核酸序列的重组宿主、以及在重组宿主中生产酶的方法。本发明的酶适合于几种应用，例如用于处理粗斜纹棉布和用于清除染污。
文档编号C12N15/53GK101023166SQ200580031836
公开日2007年8月22日 申请日期2005年9月21日 优先权日2004年9月21日
发明者玛丽亚·帕洛黑莫, 泰尔希·普拉宁, 莱纳·瓦尔塔卡里, 克里斯蒂纳·克鲁斯, 亚尔诺·卡利奥, 阿里亚·门蒂莱, 理查德·法格斯特伦, 彭蒂·奥亚帕洛, 亚里·韦赫曼佩雷 申请人:生化酶股份有限公司