专利名称：三价金属介导的均相发光邻近试验的制作方法
相关申请的交叉参考本申请要求2004年9月17日提交的题为“三价金属介导的均相发光邻近试验”的美国临时专利申请号60/610,799的优先权，将其全部内容纳入本文作参考并用于所有目的。
背景技术：
本发明涉及进行生物试验，具体是激酶试验的材料和方法。
各种胞内蛋白质和脂质底物的磷酸化在许多细胞过程(如生长、增殖、凋亡、分化和细胞周期行进)中起到重要作用。激酶，负责磷酸化细胞中的酶(包括其它激酶)，激酶和脂质被鉴定为可能的治疗介入的主要靶点。广义上，将激酶分为酪氨酸(即在酪氨酸氨基酸残基上发生磷酸化)或丝氨酸/苏氨酸(即在丝氨酸或苏氨酸氨基酸残基上发生磷酸化)激酶。在迄今鉴定的大约518种人激酶中，约85％是丝氨酸/苏氨酸(S/T)激酶，其余分类为酪氨酸激酶。Manning，G.，Whyte，D.B.，Martinez，R.，Hunter，T.和Sudarsanam，S.“人类基因组的蛋白激酶组”(The protein kinase complement of thehuman genome).Science 298，1912-34(2002)。
已经描述了在可能的激酶抑制性化合物存在下高通量测定激酶活性的许多体外试验。关于现有的高通量筛选(HTS)激酶试验，以及任何HTS试验，我们关心的包括检测试剂的成本和评价和优化该试验的时间成本。为此，高度优选非放射性试验，因为放射性废料的处置非常昂贵。同时，均相试验(即不需要洗涤步骤的试验)需要较少的试验步骤，同时出现的筛选人工副产物(artifact)的可能来源减少且更适合HTS，一般提供较高的试验通量以及较低的与设备采购和维护相关的首次和后续资金成本。
一种满足这些要求的目前可用的体外激酶试验技术是Perkin Elmer LAS，Inc.的AlphaScreenTM(放大发光邻近均相试验)。AlphaScreenTM依靠偶联供体和受体珠(直径约为250nm)之间的生物分子相互作用。Ullman，E.F.等，“发光氧沟流免疫试验通过化学发光测定颗粒结合动力学”(Luminescent oxygen channeling immunoassaymeasurement of particle binding kinetics by chemiluminescence).Proc Natl Acad Sci USA91，5426-30(1994)。在AlphaScreenTM激酶试验中，将生物素化的肽或蛋白质底物结合于供体珠，如果是磷酸化的，则与偶联于磷酸化特异性抗体(一般是磷酸化-酪氨酸特异性)的受体珠接近。Warner，G.，Illy，C，Pedro，L.，Roby，P.和Bosse，R.“AlphaScreenTM激酶HTS平台”(AlphaScreenTMkinase HTS platforms).Curr.Med.Chem.11，721-730(2004)。彼此相距约200nm以内的供体和受体珠发出发光信号，读出为520-620nm之间发出的光。AlphaScreenTM激酶试验的信噪比(S/B)通常大于10(Warner，G.，Illy，C，Pedro，L.，Roby，P.和Bosse，R. AlphaScreen激酶HTS平台”(AlphaScreenTMkinase HTS platforms).Curr.Med.Chem.11，721-730(2004))，该试验可用于大蛋白质底物。然而，虽然可获得用于依赖磷酸化-特异性抗体进行检测的试验技术的高质量抗-磷酸化酪氨酸抗体，但普通抗-磷酸化丝氨酸或抗-磷酸化苏氨酸抗体的质量一般不够高，以致于不能产生强烈信号。因此，需要磷酸化序列特异性抗体，这将增加试验优化和评价所需的时间，并增加总试验成本。在筛选具体S/T激酶或不能获得高亲和性或高特异性抗体的其它酶类型时，采用磷酸化特异性抗体排除了采用AlphaScreenTM。
另一种目前可用的体外均相、非放射性激酶试验技术是Molecular DevicesCorporation的IMAPTM(固定的磷酸金属亲和)。EVIAPTM利用表面上络合有三价金属离子的纳米颗粒。Sportsman，J.R.，Daijo，J.和Gaudet，E.A.信号转导发现中的荧光偏振试验(Fluorescence polarization assays in signal transduction discovery).Comb.Chem.High Throughput Screen 6，195-200(2003)。已知三价过渡金属(如Ga3+、Fe3+、Al3+、In3+、Ru3+、Sc3+、Y3+)可以高亲和力和特异性结合于磷酸基团。Osterberg，R.“O-磷酸丝氨酸的金属和氢离子结合特性”(Metal and hydrogen-ion binding properties ofO-phosphoserine).Nature 179，476-477(1957)；Muszynska，G.，Andersson，L.和Porath，J.“磷酸化蛋白选择性吸附于凝胶固定的铁螯合物上”(Selective adsorption ofphosphoproteins on gel-immobilized ferric chelate).Biochemistry 25，6850-3(1986)；和Posewitz，M.C.和Tempst，P.“磷酸化肽的固定镓(III)亲和色谱”(Immobilized gallium(III)affinity chromatography of phosphopeptides).Anal Chem.71，2883-2892(1999)。IMAPTM依赖磷酸化后结合IMAPTM纳米颗粒时荧光标记肽底物的荧光偏振增加。此系统的优点是能够结合肽底物中的游离磷酸基团，而不影响周围的氨基酸，这与磷酸化抗体不同。然而，因为荧光偏振测定的是分子流动性的改变，在生物系统中最大信号范围(S-B)一般限于约350mP。这使生物试验中信噪比(S/B)在理论上最大约为8，然而在实际中，S/B常常为2或更低(参见例如J. Biomolecular Screening 8(6)694-700(2003))。而且，因为大分子的固有偏振很高(即背景B显著增加)，在底物是蛋白质或大蛋白质片段时，S/B变得太小，以致于不能使用。信噪比低的试验更可能产生假阳性结果，假阳性结果可显著影响HTS程序的总有效性和重复性。Walters，W.P.和Namchuk，M.设计筛选如何使你的努力成为成功(Designing screenshow to makeyour hits a hit).Nat.Rev.Drug Dis.2，259-266(2003)。
因此，需要有助于在潜在激酶抑制性化合物存在下可靠地高通量测定激酶活性的改进的体外试验技术。
发明概述本发明通过提供体外激酶试验技术解决了这些问题，该技术的特征如下(1)试验信噪比(S/B)和范围(S-B)高；(2)均相；(3)非放射性；和(4)不需要磷酸化特异性抗体。由于如本文所述的本发明能鉴定蛋白质(或组成部分，如多肽或肽)或其它生物大分子(如单核苷酸、二核苷酸或三核苷酸，环状核苷酸或磷酸取代的肌醇)上是否存在磷酸基团，可将其广泛应用于任何磷酸化或去磷酸化反应酶，并提供用于蛋白激酶和其它酶类型，包括脂质(lipid)激酶、磷酸酶、磷酸二酯酶等的非常强效且灵活的试验形式。
在一种情况下，该试验包括将放大发光邻近试验供体和受体珠与激酶和激酶抑制性候选化合物混合。珠中的一种，通常是供体珠，其表面上结合有能够被激酶磷酸化的生物分子，如蛋白质、脂质或核酸(或其组成部分，如蛋白质的组成部分-肽)。另一种珠，通常是受体珠，表面上(例如)通过合适键合基(linker)络合有三价金属离子，键合基有(例如)三乙酸腈(NTA；也称为羧甲基-赖氨酸)、亚氨基二乙酸(IDA)或合适取代的含N杂环，如叠氮杂环，如叠氮环壬烷并壬烷，如1-丙基氨基-4-乙酸基(acetato)-1，4，7-三氮杂环壬烷。当供体和受体颗粒足够接近时产生化学发光信号，这发生在激酶磷酸化该生物分子并且三价金属离子结合于磷酸基团时。如果激酶抑制性候选化合物是激酶抑制性化合物，那么相对于缺少抑制性候选化合物的对照组合物发出的化学光，试验组合物发出的化学光减少或消失到激酶被抑制的程度。这提供了激酶抑制的指标或测定方法，或二者。
也提供了可用于进行这些试验的组合物和试剂盒。
如上所述，虽然本文主要参照蛋白质或组成部分(包括多肽或肽)激酶试验描述了本发明，但它可广泛应用于任何磷酸化或去磷酸化反应酶。本发明的组合物和方法也可用于其他类型酶，包括脂质激酶、磷酸酶和磷酸二酯酶的试验。
对脂质激酶而言，比如PI3K，磷酸化反应是PI-4，5-P2至PI-3，4，5-P。PI(磷脂酰肌醇)本身也可用作底物。一旦PI或PIP2被磷酸化，该珠显示出化学发光信号增加。
对于磷酸酶和磷酸二酯酶而言，该试验以与激酶试验相反的方式进行，因为磷酸酶和磷酸二酯酶去除磷酸基团，例如，磷酸酶或磷酸二酯酶抑制剂会产生比对照高的化学发光信号。下面详细描述本发明这些和其它的方面和优点。
附图简要说明
图1说明了适合按照本发明进行三价金属介导的均相发光邻近激酶试验的组合物组分。
图2和3是实施例1所测试的各条件下的发光计数图。
图4-7是实施例2所测试的各条件下的发光计数图。
发明详述下面详细描述本发明具体实施方式
。附图中说明了具体实施方式
的例子。虽然结合这些具体实施方式
描述了本发明，但是应理解，本发明不受限于这些具体实施方式
。相反，旨在覆盖替代、修改或等价形式，这些可包括在所附权利要求书限定的本发明构思和范围内。在以下说明书中，列出了许多具体细节，以全面理解本发明。可在没有一些或全部这些具体细节的情况下实施本发明。在其它情况下，没有详细描述公知的操作方法，是为了不多余地使本发明难以理解。
概述本发明提供了具有以下特征的体外激酶试验技术试验信噪比(S/B)和范围(S-B)高；(2)均相；(3)非放射性；和(4)不需要磷酸化特异性抗体。由于如本文所述的本发明能鉴定蛋白质、蛋白质(或组成部分，如多肽或肽)或其它生物大分子(如单核苷酸、二核苷酸或三核苷酸，环状核苷酸或磷酸取代的肌醇)上是否存在磷酸基团，可将其广泛应用于任何磷酸化或去磷酸化反应酶，提供用于蛋白激酶和其它酶类型，包括脂质激酶、磷酸酶、磷酸二酯酶等的非常强效且灵活的试验形式。
在一个实施方式中，该试验包括将放大发光邻近试验供体和受体珠与激酶和激酶抑制性候选化合物混合。珠中的一种，通常是供体珠，其表面上结合有能够被激酶磷酸化的生物分子，如蛋白质、脂质或核酸(或其组成部分，如蛋白质的组成部分-肽)。另一种珠，通常是受体珠，表面上(例如)通过合适键合基络合有三价金属离子(如Ga3+、Fe3+、Al3+、In3+、Ru3+、Sc3+、Y3+)，键合基有(例如)三乙酸腈(NTA；也称为羧甲基-赖氨酸)、亚氨基二乙酸(IDA)或合适取代的含N杂环，如叠氮杂环，如叠氮环壬烷并壬烷，如1-丙基氨基-4-乙酸基(acetato)-1，4，7-三氮杂环壬烷。应理解，在此激酶试验和按照本发明的任何试验中，珠的表面组分可颠倒，如三价金属离子可以在供体珠上，激酶底物(用于磷酸化/去磷酸化的生物分子)可以在受体珠上。
当供体和受体颗粒足够接近时产生化学发光信号，这发生在激酶磷酸化生物分子并且三价金属离子结合于磷酸基团时。出于本申请目的，化学发光(或形容词，化学发光的)指从一种化合物(化学发光化合物)与反应性化学物质(包括单线态氧)的化学反应直接或间接产生的发光，包括发射任何荧光或磷光光子。如果激酶抑制性候选化合物实际上是激酶抑制性化合物，那么相对于缺少抑制性候选化合物的对照组合物发出的化学光，试验组合物发出的化学光减少或消失到激酶被抑制的程度。这提供了激酶抑制的指标或测定方法，或二者。
也提供了可用于进行这些试验的组合物和试剂盒。
下面参照一种实施方式--激酶试验，主要是蛋白激酶试验描述本发明。
三价金属介导的均相发光邻近激酶试验已知，三价过渡金属，包括Fe3+可以高亲和力和特异性结合于磷酸基团，这一现象已被用于发展激酶试验，尤其是上述IMAPTM技术。然而，激酶试验而非IMAPTM中采用三价金属离子是未知的。由于在供体珠上产生单线态氧并传达至受体珠对操作现有的放大发光邻近均相试验技术至关重要，如上所述，所以在现有技术中单态离子猝灭剂的存在是禁忌的。上述AlphaScreenTM试验技术的供应商明确指出，某些过渡金属离子，包括Fe3+，已证明是有效的单线态氧淬灭剂，在与AlphaScreenTM产品一起提供的文献中强烈推荐避免使用它们。参见以全文纳入本文作参考并用于所有目的《使用AlphaScreenTM的实践指南》(A Practical Guide to Working withAlphaScreenTM)，第22页，PerkinElmer，Inc.(2003)。然而，本发明意外发现，用三价金属离子替代上述现有的放大发光邻近均相使用技术中所用的磷酸化特异性抗体提供了增强的试验。
图1说明适合按照本发明进行三价金属介导的均相发光邻近激酶试验的组合物100的组成。邻近试验利用偶联供体102和受体104颗粒之间的生物分子相互作用进行工作。在优选实施方式中，颗粒是聚合物珠，如Ullman，E.F.等，“发光氧沟流免疫试验通过化学发光测定颗粒结合动力学”(Luminescent oxygen channelingimmunoassaymeasurement of particle binding kinetics by chemiluminescence).ProcNatl Acad Sci USA 91，5426-30(1994)和美国专利号6,703,248所述，将它们全文纳入本文作参考并用于所有目的。按照这些公开，珠是市售的AlphaScreenTM珠，购自Perkin Elmer Life and Analytical Sciences(马萨诸塞州波士顿)。聚合物珠可由一种或多种聚合物组成，如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚氯乙烯、聚乙烯基萘和聚甲基丙烯酸酯。合适的珠可以是胶乳颗粒形式。而且，聚合物珠包括增塑剂，如高级烷基芳族化合物、高级烷氧基芳族化合物和碳氟化合物，例如其含量约为0.1-25重量％。珠的直径可约为20nm-100μm，如直径约175nm-275nm。用于生物试验(如激酶试验)时，将珠分散于水性介质110，如合适缓冲液中。
供体珠102掺入了光敏剂，由光源如激光激发(活化)后，光敏剂将环境氧(ambientoxygen)转变为单线态氧。合适光敏剂的例子包括内过氧化物或酞菁。供体珠也具有表面包衣103，以有利于生物分子106结合。通常，表面包衣与生物分子106上的键合基108互补。例如，供体珠表面包衣103是抗生物素蛋白，如链霉抗生物素蛋白，那么生物分子106上的互补键合基108是生物素。其它合适的键合基包括谷胱甘肽-S-转移酶、蛋白A、蛋白G和螯合的Ni2+(用于6x组氨酸标记分子)。合适的供体珠是AlphaScreen供体珠，购自Perkin Elmer Life and Analytical Sciences(马萨诸塞州波士顿)。
在激酶试验中，生物分子106，如蛋白质、脂质或核酸(或其组成部分，如蛋白质的组成部分肽)能够被激酶磷酸化，以调节其生物活性。它通过供体珠表面包衣103和键合基108结合于供体珠表面。根据具体试验中感兴趣的激酶选择生物分子106。例如，如果试验目的是鉴定蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶PDK1的抑制剂，那么生物分子106是能够被PDK1磷酸化的蛋白(或组成部分)，如本领域所知。本发明试验适用的激酶的一些例子如下该激酶可以是蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶，包括Akt激酶家族、Aurora激酶家族、PDK1、MAPKAP K2、Erk激酶家族、CAMK激酶家族、细胞周期蛋白依赖性激酶(如CDK1、CDK2、CDK4、CDK6)、RAF激酶家族、酪蛋白激酶家族、PKC家族、PKA家族、PKB家族、PKG家族、GSK3β、ROCK、SGK、Rsk家族和Nek家族；蛋白酪氨酸激酶，包括受体酪氨酸激酶，如FGFR、EGFR、PDGFR、c-Kit、IGFR、胰岛素受体、TrkA、TrkB、TrIcC、c-Met或c-Ret，以及胞质酪氨酸激酶，如Src、Lck、Lyn、Fyn、Yes、Syk、Hck、Ab1和Eph家族；或脂质激酶，如PI3激酶、PI4激酶或PI5激酶。
受体珠104掺入了在单线态氧存在下产生化学发光信号的化学发光化合物。因此，当活化供体102和受体104珠接近时，即当珠之间的距离不大于单线态氧在其寿命中在水溶液中穿过的距离，如不大于约200nm时，产生化学发光信号。在一个实施方式中，化学发光化合物是二甲基噻吩衍生物，发射的发光信号读出为520-620nm的发射光。
受体颗粒104通常具有表面包衣112，以防止非特异性结合，如右旋糖苷(dextran)或多肽水凝胶的包衣。它也具有(如)通过键合基115络合于珠104表面的三价金属离子114，键合基115共价结合于受体颗粒104的表面包衣112。三价金属离子114可以是Ga3+、Fe3+、Al3+、In3+、Ru3+、Sc3+和Y3+中的至少一种。
已证明，可能通过用三价金属代替二价Ni2+络合的三乙酸腈(NTA；也称为羧甲基-赖氨酸)或亚氨基二乙酸(IDA)树脂(一般用于纯化含6×His的蛋白质)将三价金属离子络合于色谱基材。Porath，J.基于IMAC-固定的金属离子亲和力的色谱.TrendsAnal.Chem.7，254-259(1988)，全文纳入本文作参考并用于所有目的。已发现，通过在该技术中采用二价Ni2+络合的三乙酸腈(NTA)AlphaScreenTM受体珠，可将三价金属离子络合于适合用作本发明受体珠的聚合物珠。此外，如以下实施例进一步所述，三价金属离子可直接偶联于适合用作受体珠的树脂，如AlphaScreenTM未偶联“原始”受体珠。AlphaScreenTM珠可购自Perkin Elmer Life and Analytical Sciences(马萨诸塞州波士顿)。
三价金属离子也可通过键合基115络合于适合用作本发明受体珠的聚合物珠，键合基115是合适取代的含N杂环，如叠氮杂环，如叠氮环壬烷并壬烷。化合物1-乙酸基-4-苄基-叠氮环壬烷已被描述为蛋白质纯化和其它应用中Ni/NTA的替代物(D.L.Johnson和LX.Martin，J.Am.Chem.Soc.2005，127，2018-2019(和相关的支持信息)，将全文纳入本文作参考并用于所有目的)。合适的取代将提供能将叠氮杂环连接于受体珠104表面的官能团，如上所述，受体珠104通常具有表面包衣112以防止非特异性结合，如右旋糖苷或多肽水凝胶的包衣。合适的取代包括羧酸基团和游离胺。这种合适键合基115的一个具体例子是1-丙基氨基-4-乙酸基-1，4，7-三氮杂环壬烷 其制备如以下实施例所述。
虽然不想受限于理论，但应相信，叠氮杂环键合基115可更强地络合三价金属离子，从而抵抗用作试验反应终止物的金属例子螯合剂(如EDTA)从受体珠上剥下离子。而且，据信，此种类型键合基的刚性也可定向使络合的金属离子离开受体珠表面并向供体珠移动，从而提高该试验的信号。
如上所述，活化的供体珠和受体珠接近时产生化学发光信号。这可以在珠上的表面结合基团之间发生生物相互作用时实现。如果生物分子已被激酶磷酸化，受体珠104上的三价金属离子114将结合于生物分子106的磷酸基团116，以使珠保持接近。然而，如果候选化合物是激酶抑制性化合物，它将抑制生物分子的磷酸化，并从而抑制化学发光信号的产生，相对于缺少抑制性候选化合物的对照组合物发出的化学光，试验组合物发出的化学光减少或消失到激酶被抑制的程度。这提供了激酶抑制的指标或测定方法，或二者。
因此，可按照本发明进行试验来检测激酶抑制性化合物。该方法包括提供一种组合物，其包含供体颗粒以及受体颗粒，该供体颗粒含光敏剂和表面结合的、能被激酶磷酸化的未磷酸化生物分子，该受体颗粒具有络合于其表面的三价金属离子以及化学发光化合物。化学发光化合物的特征是在光敏剂被活化且供体和受体颗粒接近时它产生发光信号。将激酶和激酶抑制性候选化合物引入组合物，以使在没有候选化合物的情况下不发生磷酸化。有许多方式来完成此过程。在磷酸化反应开始时，必须存在三种组分激酶、激酶底物(如待磷酸化的生物分子，如蛋白质(或组成部分))和ATP。将这三种组分中的任意两种组合并混合，或加入含有该化合物的孔中。必须在发生磷酸化的所有必需组分混合之前加入候选抑制剂，然后加入第三种组分。
然后，可通过检测抑制性候选化合物对激酶的抑制确定该候选化合物是否为激酶抑制剂，激酶抑制的观察结果为相对于缺少抑制性候选化合物的对照组合物发出的化学光，化学发光减少或消失。
应注意，在发光邻近试验，如用AlphaScreenTM技术进行的试验之前，推荐的终止缓冲液包含常用和方便的金属螯合剂EDTA。按照本发明的三价金属离子-介导的发光邻近试验可以或可以不采用包含EDTA的终止缓冲液，这取决于EDTA对三价金属离子的相对亲和力和用于将三价金属离子络合于受体珠的键合基。EDTA的亲和力大于键合基时，为了避免加入反应终止缓冲液时从珠上剥离三价金属离子的风险，可将另一种反应终止缓冲液用于该试验。例如，非-EDTA缓冲液，如不含EDTA的IMAPTM结合缓冲液可用于这种情况，以避免金属离子剥离。在这种情况下低pH溶液也可提供可接受的终止缓冲液。当键合基的亲和力大于EDTA时，可采用EDTA。
因此，本发明的一些实施方式，如采用NTA三价金属离子键合基的实施方式不采用含EDTA的反应终止缓冲液，因为EDTA是足够强的金属螯合剂，它可能从受体珠上剥离NTA络合的金属离子。另一方面，含EDTA的反应终止缓冲液可用于采用叠氮杂环键合基，如1-丙基氨基-4-乙酸基-1，4，7-三氮杂环壬烷的本发明实施方式，因为大家相信这种键合基络合三价金属离子的亲和力大于EDTA，从而防止EDTA从该珠上剥离金属离子。
本发明实施方式本发明可具体实施为组合物、试剂盒或方法，例如一种组合物，其包含含光敏剂的供体颗粒；含有化学发光化合物的受体颗粒，该化合物的特征是在光敏剂被活化且供体和受体颗粒接近时它产生发光信号；和络合于供体或受体颗粒之一的表面的三价金属离子。
一种组合物，其包含聚合物颗粒，该聚合物颗粒包含络合于该颗粒表面的三价金属离子并含有光敏剂和化学发光化合物中的一种。该颗粒的特征可以是，当含有光敏剂和化学发光化合物中另外一种的第二种颗粒与其接近且光敏剂被活化时产生发光信号。
一种用于试验的试剂盒，该试剂盒在包装组合中包括进行试验的试剂，该试剂包含含光敏剂的供体颗粒；含化学发光化合物的受体颗粒，该化合物的特征是在光敏剂被活化且供体和受体颗粒接近时它产生发光信号；和络合于供体或受体颗粒之一的表面的三价金属离子。该试剂盒也可包含进行三价金属介导的均相发光邻近试验的说明书，如按照下述本发明方面检测激酶抑制性化合物的方法。
一种检测激酶抑制性化合物的方法，该方法包括提供一种组合物，其包含含光敏剂和能被激酶磷酸化的表面结合的未磷酸化生物分子的供体颗粒，以及包含络合于颗粒表面的三价金属离子和化学发光化合物的受体颗粒，该化合物的特征是在光敏剂被活化且供体和受体颗粒接近时它产生发光信号；将激酶抑制性候选化合物引入该组合物；将激酶引入该组合物；和通过检测抑制性候选化合物对激酶的抑制确定该激酶抑制性候选化合物是激酶性化合物，激酶抑制的观察结果为相对于缺少抑制性候选化合物的对照组合物发出的化学光，化学发光减少。
一种检测磷酸酶或磷酸二酯酶抑制性化合物的方法，该方法包括提供一种组合物，其包含含光敏剂和能被磷酸酶或磷酸二酯酶去磷酸化的、表面结合的、磷酸化生物分子的供体颗粒，以及包含络合于颗粒表面的三价金属离子和化学发光化合物的受体颗粒，该化合物的特征是在光敏剂被活化且供体和受体颗粒接近时它产生发光信号；将磷酸酶或磷酸二酯酶引入该组合物；将磷酸酶或磷酸二酯酶抑制性候选化合物引入该组合物；和通过检测抑制性候选化合物对磷酸酶或磷酸二酯酶的抑制确定该磷酸酶或磷酸二酯酶抑制性候选化合物是磷酸酶或磷酸二酯酶抑制性化合物，酶抑制的观察结果为相对于缺少抑制性候选化合物的对照组合物发出的化学光，化学发光增加。
对于本发明的任何组合物、试剂盒或方法被光源激发后，活化的光敏剂可将环境氧转变为单线态氧。光源可以是激光。光敏剂可以是内过氧化物。化学发光化合物可以是二甲基噻吩衍生物。受体和供体颗粒可分散于水性介质中。接近距离不大于单线态氧在其寿命中在水溶液中穿过的距离，如不大于200nm。颗粒可以是聚合物珠。聚合物珠可包含选自下组的聚合物聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚氯乙烯、聚乙烯基萘和聚甲基丙烯酸酯。聚合物珠可包含约0.1-25重量％的增塑剂，增塑剂选自高级烷基芳族化合物、高级烷氧基芳族化合物和碳氟化合物。在一些情况下，聚合物珠的直径可以约为20nm-100μm。在其它情况下，聚合物珠的直径可以175nm-275nm。另外，该珠可包含胶乳颗粒。在一些情况下，可将三价金属离子络合于受体颗粒表面；在其它情况下，络合于供体珠表面。可通过含N键合基将三价金属离子络合于供体或受体颗粒之一的表面上，含氮键合基例如羧甲基-赖氨酸或1-丙基氨基-4-乙酸基-1，4，7-三氮杂环壬烷键合基之一，如1-丙基氨基-4-乙酸基-1，4，7-三氮杂环壬烷键合基。供体颗粒还可包含表面包衣，以有利于能够被激酶磷酸化的生物分子的结合。包衣可包含互补结合对之一。供体珠还可包含表面结合的生物分子，选自蛋白质、脂质、核酸和其组成部分，生物分子能够被激酶磷酸化以调节其生物活性。激酶可选自蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶、蛋白酪氨酸激酶和脂质激酶。例如，激酶可以是蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶，选自Akt激酶家族、Aurora激酶家族、PDK1、MAPKAP K2、Erk激酶家族、CAMK激酶家族、细胞周期蛋白依赖性激酶、RAF激酶家族、酪蛋白激酶家族、PKC家族、PKA家族、PKB家族、PKG家族、GSK3β、ROCK、SGK、Rsk家族或Nek家族；或者，激酶可以是蛋白酪氨酸激酶，选自受体酪氨酸激酶或胞质酪氨酸激酶；或者，激酶可以是受体酪氨酸激酶，选自FGFR、EGFR、PDGFR、c-Kit、IGFR、胰岛素受体、TrkA、TrkB、TrkC、c-Met或c-Ret；或者，激酶可以是胞质酪氨酸激酶，选自Src、Lck、Lyn、Fyn、Yes、Syk、Hck、Ab1或Eph家族；或者，激酶可以是脂质激酶，选自PI3激酶、PI4激酶或PI5激酶。该生物分子还可包含与供体珠上表面包衣互补的键合基。供体珠包衣可包含抗生物素蛋白，如链霉抗生物素蛋白，生物分子上的互补键合基可包含生物素。受体珠上的三价金属离子与供体珠上磷酸化生物分子的磷酸基团之间的生物学相互作用可以维持珠相互接近。三价金属离子可选自Ga3+、Fe3+、A13+、In3+、Ru3+、Sc3+或Y3+。在本发明方法中，可在引入激酶之前或同时引入激酶抑制性候选化合物，还可将ATP引入该组合物。
实施例提供以下实施例是为了说明本发明的某些方面和组成材料及其制备。这些实施例将用于进一步说明本发明，但不旨在以任何方式限制本发明范围。
实施例1材料和方法AlphaScreenTM链霉抗生物素蛋白供体珠、AlphaScreenTMNi2+-螯合受体珠和AlphaScreenTM未偶联″原始″受体珠购自Perkin Elmer Life and Analytical Sciences(马萨诸塞州波士顿)。IMAPTM结合缓冲液获自Molecular Devices(加利福亚州桑尼维尔)，为5x浓缩液。三价金属离子盐购自Sigma Aldrich，密苏里州圣路易斯(FeCl3)和Alfa Aesar，马萨诸塞州Ward Hill(GaCl3和AlCl3)。Akt3激酶和生物素化Crosstide底物购自Upstate，弗吉尼亚州夏洛茨维尔。氰基硼氢钠和羧甲基-L-赖氨酸购自SigmaAldrich。由获自VWR International，宾夕法尼亚州西切斯特的研究级材料制备本文所述其它溶液。起初，开发了将三价金属离子络合于AlphaScreenTM受体珠的两种方法，如下所述。
方法1用三价金属离子取代Ni2+-螯合AlphaScreenTM珠子上的Ni2+1)通过离心(13,000×g 20分钟，4℃)获得250μg(50μl，5mg/ml)Ni2+-螯合受体珠沉淀。
2)将沉淀珠重悬于1mL剥离缓冲液(500mM NaCl，100mM EDTA，50mMTrisHCl，pH8)。涡旋，超声处理，在37℃避光孵育1小时。
3)在0.1M TrisHCl，pH8中洗涤3×(13,000×g 20分钟，4℃)。
4)重悬于1mL 100mM的M3+溶液(如FeCl3、GaCl3或GaNO3)。涡旋，超声处理，在37℃避光孵育1小时。
5)用1mL储存缓冲液(25mM HEPES/100mM NaCl，pH7.4)洗涤2×。
6)将最终洗出物重悬于100μl储存缓冲液。
方法2通过NTA(羧甲基-赖氨酸)将三价金属离子直接偶联于AlphaScreenTM受体珠1)在1.5ml小离心管中混合以下物质400μg原始AlphaScreenTM醛受体珠(40μl，20mg/ml)10μl 1％吐温-208μl NaCNBH4(氰基硼氢钠)溶液(25mg/ml)400μg羧甲基-赖氨酸(40μl，20mg/ml的0.1M MOPS溶液，pH8)62μl 0.1M MOP，pH82)37℃避光振荡孵育反应48-60小时。
3)加入10μl 1M Tris-HCl，pH7.5以阻断反应。37℃避光孵育1小时。
4)离心珠，倾析上清，涡旋重悬于200μl 0.1M Tris-HCl，pH8。
5)重复步骤4两次。
6)将珠重悬于在1.5mM NaOH中制备的100mM M3+溶液(如FeCl3、GaCl3或GaNO3)。37℃避光孵育1小时。
7)通过13,000×g 4℃离心20分钟和重悬于200μl 0.1M Tris-HCl，pH8进行洗涤。
8)重复步骤7两次。
9)最终洗涤后，将沉淀重悬于受体珠储存缓冲液(25mM HEPES/100mM NaCl，pH7.4)。
结果方法1方案.用完全反应缓冲液(CRB10mM TrisHCl，10mM MgCl2，0.01％BSA，lmM DTT，pH7.2)将生物素化Crosstide肽(552μM母液)和ATP(10mM母液)分别稀释至1μM和20μM，制得2×浓缩底物/ATP溶液。用CRB将Akt3激酶(Upstate，约2μM的母液)稀释至20nM，制得2×浓缩激酶溶液。将10μl 2×底物/ATP溶液与单独的10μl CRB或10μl 2×Akt3激酶溶液(最终试验浓度10nM Akt3，10μM ATP，500nM Crosstide)混合，室温孵育2小时。作为对照，将一些反应与5μM强效泛激酶(pan-kinase)抑制剂星孢素一起预孵育15分钟。加入30μl AlphaScreenTM链霉抗生物素蛋白供体(10μg/ml)和三价金属离子络合受体(20μg/ml)珠混合物的3×浓缩IMAPTM结合缓冲液终止反应。用Packard Fusion Alpha读出各条件的发光计数，见图1和2(图1和2所示值为4次重复试验的平均值)。
方法2方案.用完全反应缓冲液(CRB10mM TrisHCl，10mM MgCl2，0.01％BSA，1mM DTT，pH7.2)将生物素化Crosstide肽(552μM母液)和ATP(10mM母液)分别稀释至1μM，制得2×浓缩底物/ATP溶液。然后连续1∶1稀释此溶液，以产生肽浓度固定(1μM)、但ATP浓度不同(20、10、5和2.5μM)的溶液。用CRB连续稀释Akt3激酶(Upstate，约2μM的母液)，以制备2×浓缩激酶溶液(20、10、5和2.5nM)。
将10μl各2×底物/ATP溶液与单独的10μl CRB或10μl各2×Akt3激酶溶液(最终试验浓度1.25-10nM Akt3，1.25-10μM ATP，500nM Crosstide)混合，室温孵育1和2小时。作为对照，将一些反应与5μM星孢素一起预孵育15分钟。最后孵育2小时后，通过首先加入15μl AlphaScreenTM链霉抗生物素蛋白供体(0.1μg/μl)，然后加入15μl Fe3+络合受体(0.2μg/μl)珠的3×浓缩IMAPTM结合缓冲液终止反应。用Packard FusionAlpha读出各条件的发光计数，见图3-6。
讨论结果明确表明，三价金属离子(M3+)取代的AlphaScreenTM受体珠可以是快速优化和评价激酶试验的有力而简单的方法。M3+取代的珠不难制备，在预实验中成功检测了Crosstide磷酸化，S/B比约为20。
实施例2通过1-丙基氨基-4-乙酸基-1，4，7-三氮杂环壬烷将三价金属离子直接偶联于AlphaScreenTM受体珠三价金属离子可通过1-丙基氨基-4-乙酸基-1，4，7-三氮杂环壬烷或另一种含N杂环偶联于AlphaScreenTM受体珠，其偶联方式与上述方法2通过NTA偶联中所述的方式相同。简要说，原始AlphaScreenTM醛受体珠可与1-丙基氨基-4-乙酸基-1，4，7-三氮杂环壬烷、吐温-20和NaCNBH4(氰基硼氢钠)缓冲液溶液混合。37℃避光振荡孵育该反应48-60小时，然后加入1M Tris-HCl，pH7.5以阻断反应，然后再37℃避光孵育1小时。然后离心珠，倾析上清，将沉淀的珠重悬于0.1M Tris-HCl，pH8。将此离心和重悬过程重复两次，然后将珠重悬于在1.5mM NaOH中制备的100mM M3+溶液(如FeCl3、GaCl3或GaNO3)，37℃避光孵育1小时。然后通过离心和重悬于0.1M Tris-HCl，pH8数次洗涤珠，最后重悬于受体珠储存缓冲液(25mM HEPES/100mMNaCl，pH7.4)。
实施例31-丙基氨基-4-乙酸基-1，4，7-三氮杂环壬烷的合成可通过任何合适技术获得或制备1-丙基氨基-4-乙酸基-1，4，7-三氮杂环壬烷，并已(例如)按照全文纳入本文作为参考并用于所有目的的A.Warden，B.Graham，M.T.W.Heam，L.Spiccia Org.Letters，2001，3，2855-2858(和相关支持信息)所述方法的以下修改而合成。将1，4，7-三氮杂环壬烷三(tris)HCl(2.0g)溶解于水(12mL)。用30分钟逐份加入氢氧化钠(1.3g)，在室温下搅拌得到的溶液1小时。将混合物真空浓缩为白色糊状物，通过数次甲苯浓缩进一步干燥。将甲苯加入得到的残留物中，超声处理得到的悬液数分钟，然后倾析去除白色固体。将二甲基甲酰胺乙酸二甲酯加入甲苯溶液中，将该混合物加热回流4小时。将该反应混合物冷却至室温，浓缩产生淡黄色油状物。将此油状物溶解于乙腈(5mL)，加入N-(3-溴丙基)邻苯二甲酰亚胺(2.1g)，产生深黄色溶液。搅拌该溶液过夜，产生白色沉淀，过滤收集该沉淀并用乙腈和醚(ether)洗涤(从滤出物中回收其它固体)，产生2.2g(理论值67％)1-(N-(3-丙基)苯二甲酰亚氨基)-1，4，7-三氮杂环壬烷正脒(orthoamidinium)溴。LC/MS Rt＝1.4分钟，m/z＝327。将1-(N-(3-丙基)苯二甲酰亚氨基)-1，4，7-三氮杂环壬烷正脒溴(870mg)溶解于水(10mL)，加热回流过夜，然后真空浓缩。通过与甲苯共蒸发去除残留水，得到粘性黄色油状物，立即将其溶解于乙腈。超声处理5分钟后，加入碳酸钠(2g)和溴乙酸乙酯(0.29mL)，将得到的混合物加热回流2天。冷却至室温后，过滤去除固体，真空浓缩滤出液，得到黄色油状物。将该油状物溶于水并萃取到氯仿中。用硫酸镁干燥合并的有机相，过滤并浓缩产生499mg淡黄色油状物。将此油状物溶解于5MHCl(11mL)，加热到93℃ 20小时。将该溶液冷却至室温，然后放入冰箱过夜，形成白色沉淀。过滤去除固体，浓缩滤出液，产生油状残留物，将其溶解于氢溴酸(4mL)和乙酸(4mL)中。加入醚(ether)直到观察到两层，将该混合物储存于冰箱3天。在氮气复盖层下过滤收集得到的白色固体，用水洗涤。在真空中进一步干燥该固体，得到300mg标题化合物。LC/MS Rt＝0.3分钟m/z＝245。NMR(1H，300MHz)与公开数据相同。
其它实施方式如上所述，虽然本文主要参照蛋白激酶试验描述了本发明，但它可广泛应用于任何磷酸化或去磷酸化反应酶。本发明的组合物和方法也可用于其他类型酶，包括脂质激酶、磷酸酶和磷酸二酯酶的试验。
对脂质激酶而言，比如PI3K，生理反应是PI-4，5-P2至PI-3，4，5-P。PI(磷脂酰肌醇)本身也可用作底物。一旦PI或PIP2被磷酸化，由于加入磷酸基团使该珠的信号增加。
对于磷酸酶和磷酸二酯酶而言，该试验以与激酶试验相反的方式进行，因为磷酸酶和磷酸二酯酶能去除磷酸基团，例如，磷酸酶或磷酸二酯酶抑制剂会产生比对照高的化学发光信号。
结论虽然根据几个优选实施方式描述了本发明，但是本发明不应仅限于上述特定情况。可采用上述优选实施方式的许多变化形式。因此，应参照所附权利要求书广义解释本发明。
将本文引用的所有参考文献全文纳入本文作参考并用于所有目的。
权利要求
1.一种组合物，其包含含光敏剂的供体颗粒；含有化学发光化合物的受体颗粒，所述化合物的特征是在光敏剂被活化且供体和受体颗粒接近时它产生发光信号；和络合于供体或受体颗粒之一的表面的三价金属离子。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，在被光源激发后，活化的光敏剂能将环境氧转变为单线态氧。
3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述光源是激光。
4.如权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述光敏剂是内过氧化物。
5.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述化学发光化合物是二甲基噻吩衍生物。
6.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述颗粒分散于水性介质中。
7.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述接近距离不大于单线态氧在其寿命中在水溶液中穿过的距离。
8.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述距离不大于200nm。
9.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述颗粒是聚合物珠。
10.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述三价金属离子络合于所述受体颗粒表面。
11.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述三价金属离子络合于所述供体颗粒表面。
12.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述三价金属离子通过含N键合基络合于所述供体或受体颗粒之一的表面。
13.如权利要求12所述的组合物，其特征在于，所述三价金属离子通过羧甲基-赖氨酸和1-丙基氨基-4-乙酸基-1，4，7-三氮杂环壬烷键合基之一络合于所述供体或受体颗粒之一的表面。
14.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述三价金属离子选自Ga3+、Fe3+、Al3+、In3+、Ru3+、Sc3+或Y3+。
15.一种组合物，其包含含光敏剂的供体颗粒；含有化学发光化合物的受体颗粒，所述化合物的特征是在光敏剂被活化且供体和受体颗粒接近时它产生发光信号；和通过1-丙基氨基-4-乙酸基-1，4，7-三氮杂环壬烷键合基络合于所述受体颗粒表面的三价金属离子。
16.一种用于试验的试剂盒，所述试剂盒在包装组合中包括进行试验的试剂，所述试剂包含，含光敏剂的供体颗粒；含化学发光化合物的受体颗粒，所述化合物的特征是在光敏剂被活化且供体和受体颗粒接近时它产生发光信号；和络合于供体或受体颗粒之一的表面的三价金属离子。
17.如权利要求16所述的试剂盒，其特征在于，所述三价金属离子通过含N键合基络合于所述供体或受体颗粒之一的表面。
18.如权利要求17所述的试剂盒，其特征在于，所述三价金属离子通过羧甲基-赖氨酸和1-丙基氨基-4-乙酸基-1，4，7-三氮杂环壬烷键合基之一络合于所述供体或受体颗粒之一的表面。
19.如权利要求18所述的试剂盒，其特征在于，所述三价金属离子通过1-丙基氨基-4-乙酸基-1，4，7-三氮杂环壬烷键合基络合于受体颗粒表面。
20.如权利要求16所述的试剂盒，还包括进行三价金属介导的均相发光邻近试验的说明书。
21.一种检测激酶抑制性化合物的方法，所述方法包括提供一种组合物，其包含，含光敏剂和能被激酶磷酸化的、表面结合的未磷酸化生物分子的供体颗粒，和含络合于其颗粒表面的三价金属离子和化学发光化合物的受体颗粒，所述化合物的特征是在光敏剂被活化且供体和受体颗粒接近时它产生发光信号；将激酶抑制性候选化合物引入所述组合物；将激酶引入所述组合物；和通过检测抑制性候选化合物对激酶的抑制，确定该激酶抑制性候选化合物是激酶性化合物，激酶抑制的观察结果为，相对于缺少抑制性候选化合物的对照组合物发出的化学光，化学发光减少。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述三价金属离子通过含N键合基络合于所述供体或受体颗粒之一的表面。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述三价金属离子通过羧甲基-赖氨酸和1-丙基氨基-4-乙酸基-1，4，7-三氮杂环壬烷键合基之一络合于所述受体颗粒的表面。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述三价金属离子通过1-丙基氨基-4-乙酸基-1，4，7-三氮杂环壬烷键合基络合于受体颗粒表面。
25.如权利要求21所述的方法，其特征在于，在引入所述激酶前引入所述激酶抑制性候选化合物。
26.如权利要求21所述的方法，其特征在于，同时引入所述激酶抑制性候选化合物和所述激酶。
27.一种检测磷酸酶或磷酸二酯酶抑制性化合物的方法，所述方法包括提供一种组合物，其包含，含光敏剂和能被磷酸酶或磷酸二酯酶去磷酸化的、表面结合的磷酸化生物分子的供体颗粒，和包含络合于颗粒表面的三价金属离子和化学发光化合物的受体颗粒，所述化合物的特征是在光敏剂被活化且供体和受体颗粒接近时它产生发光信号；将磷酸酶或磷酸二酯酶引入所述组合物；将磷酸酶或磷酸二酯酶抑制性候选化合物引入所述组合物；和通过检测抑制性候选化合物对磷酸酶或磷酸二酯酶的抑制，确定该磷酸酶或磷酸二酯酶抑制性候选化合物是磷酸酶或磷酸二酯酶抑制性化合物，酶抑制的观察结果为，相对于缺少抑制性候选化合物的对照组合物发出的化学光，化学发光增加。
全文摘要
一种体外蛋白激酶试验技术，它的特征为(1)试验信噪比(S/B)和范围(S－B)高；(2)均相；(3)非放射性；和(4)不需要磷酸化特异性抗体。所述试验包括(例如)通过合适键合基将三价金属离子(如Ga
文档编号C12Q1/42GK101023183SQ200580031496
公开日2007年8月22日 申请日期2005年9月19日 优先权日2004年9月17日
发明者R·C·郭, T·D·道斯, T·D·马查朱斯基 申请人:希龙公司