凋亡特异性elF－5AsiRNA和反义多核苷酸在抑制/阻抑炎症反应中的用途的制作方法

专利名称：凋亡特异性elF－5AsiRNA和反义多核苷酸在抑制/阻抑炎症反应中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及到凋亡特异性真核起始因子(eIF-5A)，或者称为“凋亡特异性eIF-5A”或“eIF-5A1”和腐胺缩赖氨酸(deoxyhypusine)合酶(DHS)。本发明涉及到凋亡特异性eIF-5A和DHS核酸和多肽，以及抑制凋亡特异性eIF-5A和DHS表达的方法。
背景技术：
凋亡是由基因决定的细胞程序性死亡，可通过明确的形态学特征加以鉴定，例如细胞收缩、染色质凝缩、核破碎和膜起泡。(Kerr etal.(1972)Br.J.Cancer，26，239-257；Wyllie et al.(1980)Int.Rev.Cytol.，68，251-306)凋亡在常规组织的发展和内环境稳定(homeostasis)中起重要作用，并且凋亡程序中的缺陷被认为与许多种人体紊乱有关，其范围包括从神经退行性疾病和自身免疫紊乱直到肿瘤。(Thompson(1995)Science，267，1456-1462；Mullauer et al.(2001)Mutat.Res，488，211-231)尽管凋亡细胞的形态学特征已被充分鉴定，但对调节这个过程中的分子途径的阐明还刚刚开始。
有一组蛋白被认为在凋亡过程中起关键作用，即半胱氨酸蛋白酶，术语为胱冬酶，大多数凋亡途径似乎都需要该酶。(Creagh&Martin(2001)Biochem.Soc.Trans，29，696-701；Dales et al.(2001).Leuk.Lymphoma，41，247-253)。通过裂解多种细胞蛋白，胱冬酶在响应凋亡刺激的过程中引发凋亡。裂解多种细胞蛋白引起典型的凋亡表现，包括细胞收缩、膜起泡和DNA破碎。(Chang&Yang(2000)Microbiol.Mol.Biol.Rev.，64，821-846)促凋亡蛋白例如Bax或Bak也在凋亡途径中起重要作用，它们通过释放胱冬酶-活化分子，例如线粒体细胞色素c，从而启动通过凋亡途径的细胞死亡。(Martinou&Green(2001)Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.，2，63-67；Zou et al.(1997)Cell，90，405-413)抗凋亡蛋白例如Bcl-2通过拮抗前凋亡蛋白(Bax或Bak)的活性来启动细胞存活(survival)。(Tsujimoto(1998)Genes Cells，3，697-707；Kroemer(1997)Nature Med.，3，614-620)BaxBcl-2的比值被认为是决定细胞命运的因素之一；过量的Bax启动凋亡而过量的Bcl-2启动细胞存活。(Salomons et al.(1997)Int.J.Cancer，71，959-965；Wallace-Brodeur&Lowe(1999)CellMol.Life Sci.，55，64-75)。
另一参与凋亡的关键蛋白由肿瘤抑制基因p53所编码。这个蛋白是一种调节细胞生长并在受损细胞中引起凋亡的转录因子，其途径推测是增量调节Bax。(Bold et al.(1997)Surgical Oncology，6，133-142；Ronen et al.，1996；Schuler&Green(2001)Biochem.Soc.Trans.，29，684-688；Ryan et al.(2001)Curr.Opin.Cell Biol.，13，332-337；Zrnig et al.(2001)Biochem.Biophys.Acta，1551，F1-F37)。
据信凋亡途径中的变化在多种疾病过程中起重要作用，包括癌症。(Wyllie et al.(1980)Int.Rev.Cytol.，68，251-306；Thompson(1995)Science，267，1456-1462；Sen&D′Incalci(1992)FEBS Letters，307，122-127；McDonnell et al.(1995)Seminars in Cancer and Biology，6，53-60)对癌症发展和演进的研究传统上着眼于细胞增殖。但是最近已经明确了凋亡在肿瘤发生中所起的重要作用。事实上由于在肿瘤细胞中的一些途径中的凋亡控制总是发生变化，目前许多已知的凋亡相关信息正是通过肿瘤模型得到的。(Bold et al.(1997)Surgical Oncology，6，133-142)细胞因子也参与了凋亡途径。生物系统的调节需要细胞间的相互作用，而细胞间的交互作用通常涉及到许多种细胞因子。许多种类的细胞在响应多种刺激时都产生细胞因子，它是介导因子(mediators)。细胞因子是多效性分子，它可对多种不同细胞产生多种不同的作用，尤其在调节免疫反应及造血细胞增殖和分化中起重要作用。根据细胞因子具体种类、相对浓度和其它介导因子的存在与否，细胞因子对靶细胞的作用可以起始细胞存活、增殖、活化、分化或凋亡。
通过抗细胞因子来治疗自身免疫紊乱如牛皮癣、风湿性关节炎和Crohn病的方法正在得到普及。促炎细胞因子IL-1和TNF在这些慢性疾病的病理学中扮演了重要角色。减小这两种细胞因子生物活性的抗细胞因子治疗方法具有临床优势(Dinarello and Abraham，2002)。
白介素-1(IL-1)是一种重要的细胞因子，它介导局部和系统性炎症反应，并且在许多疾病的发病机理中与TNF协同作用，这包括脉管炎、骨质疏松、神经退行性疾病、糖尿病、狼疮肾炎和自身免疫疾病如风湿性关节炎。最近发现，在向IL-1β敲除小鼠体内注射黑素瘤细胞时，小鼠对肿瘤转移和血管形成具有抗性，从而阐明了IL-1β在肿瘤血管形成和入侵过程中的重要性(Voronov et al.，2003)。
最近发现白介素-18(IL-18)是IL-1家族的成员，并且在结构、受体和功能上都与IL-1相关。由于IL-18具有诱导干扰素γIFN-γ、TNF-α和IL-1的功能，所以它是参与炎症和自身免疫疾病的中枢细胞因子。IL-1β和IL-18都可引起TNF-α的生成，而已知TNF-α参与心肌局部缺血过程中的心肌紊乱(Maekawa et al.，2002)。已发现在超融合(suprafused)人心房心肌的缺血/再灌注模型中，通过使用IL-18结合蛋白的中和作用来抑制IL-18可减小缺血引起的心肌功能紊乱(Dinarello，2001)。在胶原质引起的关节炎小鼠模型中，使用鼠IL-18结合蛋白来中和IL-18的功能也可减少IFN-γ、TNF-α、IL-1β的转录，并减小联合损坏(Banda et al.，2003)。在小鼠黑素瘤模型中通过注射IL-18结合蛋白成功抑制了癌症转移，IL-18生成或供应得减少也提供了控制癌症转移的功能(Carrascal et al.，2003)。作为促炎细胞因子IL-18具有更进一步的重要性，测量慢性肝脏疾病患者的血浆IL-18浓度水平，该水平的提高被认为与疾病的严重性相关((Ludwiczek etal.，2002)。与此类似，对糖尿病肾病患者的血清IL-18和TNF-α的浓度水平(Moriwaki et al.，2003)。大脑外伤后的神经炎症也由促炎细胞因子介导，使用IL-18结合蛋白抑制IL-18活性改善了脑外伤小鼠的神经恢复(Yatsiv et al.，2002)。
TNF-α是TNF细胞因子家族的成员，也是一种多效性促炎细胞因子，其功能包括对造血细胞的促有丝分裂作用、引发炎症反应和引起多种细胞死亡等。TNF-α通常由细菌脂多糖、寄生虫、病毒、恶性细胞所诱导，细胞因子通常产生有益作用以保护细胞抵御感染和癌症。但对TNF-α的不当诱导却是机体紊乱的主要参与因素，会引起急性和慢性炎症，例如自身免疫紊乱，也可能参与癌症、AIDS、心脏病和脓血症(Aggarwal和Natarajan进行了综述，1996；Sharma&Anker，2002)。实验性动物疾病模型(即脓毒性休克和风湿性关节炎)和人体疾病(即肠道炎症疾病和急性移植物抗宿主病)都证明了阻遏TNF-α的有益作用(Wallach et al.，1999)。抑制TNF-α也可减轻自身免疫疾病患者(例如Crohn病(van Deventer，1999)和风湿性关节炎(Richard-Miceli and Dougados，2001))的痛苦。也认为TNF-α起始B淋巴细胞的存活和生长的功能在B细胞慢性淋巴白血病(B-CLL)的发病机理中起作用，并且在B-CLL中T细胞表达TNF-α的水平肯定与肿瘤质量(mass)和疾病发展阶段有关(Bojarska-Junak et al.，2002)。已知白介素-1β(IL-1β)是一种诱导TNF-α生成的细胞因子。
因此既然细胞因子和的过量积累会引起对机体有害的结果包括细胞死亡，那么就需要有降低体内细胞因子水平、抑制或减少凋亡的方法。本发明正是为了满足这个需要。
已知腐胺缩赖氨酸合酶(DHS)和包含羟腐胺缩赖氨酸的真核翻译起始因子-5A(eIF-5A)在许多细胞活动中(包括细胞生长和分化)起重要作用。在所有检测过的真核生物和古细菌中都发现有羟腐胺缩赖氨酸的存在，而真细菌中则不存在，eIF-5A也是已知仅有的包含羟腐胺缩赖氨酸的蛋白。(Park(1988)J.Biol.Chem.，263，7447-7449；Schümann&Klink(1989)System.Appl.Microbiol.，11，103-107；Bartiget al.(1990)System.Appl.Microbiol.，13，112-116；Gordon et al.(1987a)J.Biol.Chem.，262，16585-16589)活性eIF-5A形成包括两个翻译前步骤首先腐胺缩赖氨酸合酶的催化下，通过将亚精胺的4-氨基丁基转移到eIF-5A前体上的特定赖氨酸残基上，以形成腐胺缩赖氨酸残基；然后在腐胺缩赖氨酸羟化酶的作用下使4-氨基丁基发生羟基化反应以形成羟腐胺缩赖氨酸。
种间的eIF-5A氨基酸序列是高度保守的，并且羟腐胺缩赖氨酸残基周围的氨基酸序列具有严格保守性，这说明形成羟腐胺缩赖氨酸的修饰对存活来说可能是重要的。(Park et al.(1993)Biofactors，4，95-104)。这一假设倍以下发现所进一步证实，酵母中两种同工eIF-5A的失活或者DHS基因的失活(它催化同工eIF-5A活化步骤的第一步)都会阻遏细胞分裂。(Schnier et al.(1991)Mol.Cell.Biol.，11，3105-3114；Sasaki et al.(1996)FEBS Lett.，384，151-154；Park et al.(1998)J.Biol.Chem.，273，1677-1683)但是在酵母中删除eIF-5A蛋白仅引起总蛋白合成的少量下降，说明eIF-5A可能对翻译特定mRNA亚组来说是必须的，而不是所有蛋白合成都需要。(Kang et al.(1993)，″Effectof initiation factor eIF-5A depletion on cell proliferation and proteinsynthesis，″“删除起始因子eIF-5A对细胞增殖和蛋白合成的影响”inTuite，M.(ed.)，Protein Synthesis and Targeting in Yeast，NATO Series H)最近发现结合eIF-5A的配体也共同具有高度保守的基序，这进一步说明了eIF-5A的重要性。(Xu&Chen(2001)J.Biol.Chem.，276，2555-2561)另外发现，修饰后eIF-5A中的羟腐胺缩赖氨酸残基对序列特异性结合RNA来说是必需的，而这种结合并不产生针对核糖核酸酶的保护作用。
此外删除胞内eIF-5A会引起核内特定mRNA的显著累积，这说明eIF-5A可能负责将特定种类的mRNA从胞核穿梭运输到胞质。(Liu&Tartakoff(1997)Supplement to Molecular Biology of the Cell，8，426a.Abstract No.2476，37th American Society for Cell BiologyAnnual Meeting)eIF-5A在核孔-相连的核内丝体(filaments)上的积累以及它与普通核运出受体间的相互作用都进一步说明eIF-5A是一种胞核-胞质穿梭蛋白，而不是多核糖体的成分。(Rosorius et al.(1999)J.Cell Science，112，2369-2380)。
Smit-McBride等在1989年首次从人体克隆到eIF-5A的cDNA，随后从多种真核生物中克隆出eIF-5A cDNA或基因，包括酵母、大鼠、鸡胚胎、苜蓿和西红柿。(Smit-McBride et al.(1989)J.Biol.Chem.，264，1578-1583；Schnier et al.(1991)(酵母)；Sano，A.(1995)in Imahori，M.et al.(eds)，Polyamines，Basic and Clinical Aspects，VNU SciencePress，The Netherlands，81-88(大鼠)；Rinaudo&Park(1992)FASEB J.，6，A453(鸡胚胎)；Pay et al.(1991)Plant Mol.Biol.，17，927-929(苜蓿)；Wang et al.(2001)J.Biol.Chem.，276，17541-17549(西红柿))已经在多种人体组织和哺乳动物细胞系中研究了eIF-5A mRNA的表达。例如在去掉血清又添加血清后，发现在人纤维原细胞中eIF-5A的表达发生变化。(Pang&Chen(1994)J.Cell Physiol.，160，531-538)在开始衰老的纤维原细胞中也发现羟腐胺缩赖氨酸合酶的活力下降及eIF-5A前体数量的减少都与年龄有关，虽然并没有确定这一发现是否反映了同工体分化的平均变化。(Chen&Chen(1997)J.Cell Physiol.，170，248-254)研究表明eIF-5A可能是病毒蛋白的靶细胞蛋白，例如人免疫缺陷病毒第一类Rev蛋白和人T细胞淋巴病毒1型Rev蛋白。(Ruhl et al.(1993)J.Cell Biol.，123，1309-1320；Katahira et al.(1995)J.Virol.，69，3125-3133)初步研究表明eIF-5A可能通过与其它RNA结合蛋白(如Rev)间的相互作用来靶作用于RNA，这说明这些病毒蛋白可能会募集(recruit)eIF-5A以进行病毒RNA加工。(Liu et al.(1997)Biol.Signals，6，166-174)因此虽然已知eIF-5A和DHS，但仍然需要了解这些蛋白是如何参与凋亡途径和细胞因子活化，以调节凋亡和细胞因子表达的。本发明即满足了这种需求。
发明概述本发明涉及到凋亡特异性真核起始因子(eIF-5A)，或者称为“凋亡特异性eIF-5A”或“eIF-5A1”。本发明也涉及到凋亡特异性eIF-5A的核酸和多肽，以及使用反义核酸或siRNA来抑制或阻抑凋亡特异性eIF-5A的表达，从而抑制或阻抑细胞的凋亡的方法。本发明也涉及到将siRNA体内导入到哺乳动物肺细胞的方法。也涉及到通过抑制或阻抑凋亡特异性eIF-5A的表达来阻抑或抑制促炎细胞因子的方法。此外，本发明也涉及到通过抑制或阻抑凋亡特异性eIF-5A的表达来抑制或阻抑p53基因的表达。本发明也涉及到使用反义核酸或siRNA来抑制或阻抑凋亡因子5A的表达，从而提高Bcl-2表达的方法。本发明也提供了抑制细胞因子生成的方法，尤其是在人上皮细胞内抑制TNF-α的方法。在另一实施方案中，使用靶作用于凋亡特异性eIF-5A的反义寡核苷酸来阻抑凋亡特异性eIF-5A的表达，如此提供了防止青光眼眼的视网膜中心细胞死亡的方法。
附图简述

图1描绘了大鼠凋亡特异性eIF-5A3’末端的核苷酸序列(SEQ IDNO11)和相应氨基酸序列(SEQ ID NO12)。
图2描绘了大鼠凋亡特异性eIF-5A5’末端的核苷酸序列(SEQ IDNO15)和相应氨基酸序列(SEQ ID NO16)。
图3描绘了大鼠黄体的凋亡特异性eIF-5A的全长cDNA核苷酸序列(SEQ ID NO1)和相应氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
图4描绘了大鼠凋亡特异性DHS cDNA的3’末端核苷酸序列(SEQ ID NO6)和相应氨基酸序列(SEQ ID NO7)。
图5描绘了大鼠黄体凋亡特异性eIF-5A cDNA的全长核苷酸序列(SEQ ID NO20)与人eIF-5A核苷酸序列间的比对(SEQ ID NO3)(检索号为BC000751或NM_001970，SEQ ID NO3)。
图6描绘了大鼠黄体凋亡特异性eIF-5A cDNA的全长核苷酸序列(SEQ ID NO20)与人eIF-5A核苷酸序列间的比对(SEQ ID NO4)(检索号为NM-020390，SEQ ID NO4)。
图7描绘了大鼠黄体凋亡特异性eIF-5A cDNA的全长核苷酸序列(SEQ ID NO20)与小鼠eIF-5A核苷酸序列间的比对(SEQ IDNO5)(检索号为BC003889)。
图8描绘了大鼠黄体凋亡特异性eIF-5A全长氨基酸序列(SEQ IDNO2)与人eIF-5A氨基酸序列间的比对(SEQ ID NO21)(检索号为BC000751或NM_001970)。
图9描绘了大鼠黄体凋亡特异性eIF-5A全长氨基酸序列(SEQ IDNO2)与人eIF-5A氨基酸序列间的比对(SEQ ID NO22)(检索号为NM_020390)。
图10描绘了大鼠黄体凋亡特异性eIF-5A全长氨基酸序列(SEQID NO2)与小鼠eIF-5A氨基酸序列间的比对(SEQ ID NO23)(检索号为BC003889)。
图11描绘了大鼠黄体凋亡特异性DHS的部分长度cDNA核苷酸序列(SEQ ID NO6中的1-453位残基)与人DHS核苷酸序列间的比对(SEQ ID NO8)(检索号为BC000333)。
图12描绘了大鼠黄体凋亡特异性eIF-5A cDNA的限制性图谱。
图13描绘了大鼠黄体凋亡特异性DHS部分长度cDNA的限制性图谱。
图14描绘了使用32P-dCTP标记的大鼠黄体凋亡特异性eIF-5AcDNA3’末端序列作为探针，得到的总RNA Northern印迹分析结果(顶端)和溴化乙锭染色凝胶结果(底端)。
图15描绘了使用32P-dCTP标记的大鼠黄体凋亡特异性DHScDNA3’末端序列作为探针，得到的总RNA Northern印迹分析结果(顶端)和溴化乙锭染色凝胶结果(底端)。
图16描绘了DNA成梯试验实验结果，其中在注射PGF-2α后，检测排卵过度的大鼠黄体的凋亡程度。
图17为分离自大鼠黄体的基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图，描绘了用PGF-2α处理大鼠后的DNA成梯试验分析结果。
图18描绘了DNA成梯试验实验结果，其中在先用亚精胺处理再用PGF-2α处理后，检测排卵过度的大鼠黄体分散细胞的凋亡程度。
图19描绘了DNA成梯试验实验结果，其中在用亚精胺和/或PGF-2α处理后，检测排卵过度的大鼠黄体分散细胞的凋亡程度。
图20描绘了使用32P-dCTP标记的大鼠黄体凋亡特异性eIF-5A部分长度cDNA的3’末端序列作为探针，得到的大鼠基因组DNASouthern印迹分析结果。
图21描绘了pHM6载体，一种哺乳动物表位标签表达载体(RocheMolecular Biochemicals)。
图22描绘了通过去血清诱导凋亡后，使用32P-dCTP标记的大鼠黄体凋亡特异性DHS cDNA3’非翻译区域序列作为探针，得到的分离自COS-7细胞的总RNA Northern印迹分析结果(顶端)和溴化乙锭染色凝胶结果(底端)。
图23为瞬时转染COS-7细胞步骤的流程图。
图24为用pHM6瞬时转染COS-7细胞后，细胞表达外源蛋白的Western印迹分析结果。
如图25，用包含正义方向的全长大鼠凋亡特异性eIF-5A的pHM6瞬时转染COS-7细胞后，增强的胱冬酶酶活性反映了凋亡作用的增强。
如图26，用包含正义方向的全长大鼠凋亡特异性eIF-5A的pHM6瞬时转染COS-7细胞后，DNA片段的增多反映了凋亡作用的增强。
如图27，用包含正义方向的全长大鼠凋亡特异性eIF-5A的pHM6瞬时转染COS-7细胞后，通过胞核破碎的增多反映凋亡作用来探测凋亡。
如图28，用包含正义方向的全长大鼠凋亡特异性eIF-5A的pHM6瞬时转染COS-7细胞后，胞核破碎的增多反映了凋亡作用的增强。
如图29，用包含正义方向的全长大鼠凋亡特异性eIF-5A的pHM6瞬时转染COS-7细胞后，通过磷脂酰丝氨酸的显现反映凋亡作用来探测凋亡。
如图30，用包含正义方向的全长大鼠凋亡特异性eIF-5A的pHM6瞬时转染COS-7细胞后，磷脂酰丝氨酸显现的增多反映了凋亡作用的增强。
如图31，用包含正义方向的全长大鼠凋亡特异性eIF-5A的pHM6瞬时转染COS-7细胞后，胞核破碎的增多反映了凋亡作用的增强。
如图32描绘了用包含正义方向的全长大鼠凋亡特异性eIF-5A的pHM6瞬时转染COS-7细胞后，细胞凋亡作用提高。
如图33，用包含正义方向的全长大鼠凋亡特异性eIF-5A的pHM6瞬时转染COS-7细胞后，Bcl-2受到减量调控。顶端照片为蛋白印迹的考马斯蓝染色，底端照片为相应的Western印迹结果。
图34为用包含反义方向的凋亡特异性eIF-5A3’末端序列的pHM6转染COS-7细胞后，得到的蛋白印迹考马斯蓝染色，和使用Bcl-2为探针得到的相应印迹的western印迹。
图35为用包含正义方向的全长凋亡特异性eIF-5A的pHM6瞬时转染COS-7细胞后，得到的蛋白印迹考马斯蓝染色，和使用c-Myc为探针得到的相应印迹的western印迹。
图36为用包含正义方向的全长凋亡特异性eIF-5A的pHM6瞬时转染COS-7细胞后，得到的蛋白印迹考马斯蓝染色，和使用p53为探针得到的相应印迹的western印迹。
图37为分别使用抗-[HA]过氧化物酶和p53为探针时，得到的COS-7细胞中pHM6-全长大鼠凋亡特异性eIF-5A表达的蛋白印迹的考马斯蓝染色，和相应印迹的Western印迹结果。
图38为分离自RKO细胞的人eIF-5A序列(SEQ ID NO24)和人eIF-5A2序列(SEQ ID NO22)(Genbank accession numberXM_113401)间的比对。其中共有序列见SEQ ID NO28。
图39描绘了瞬时转染RKO细胞和RKO-E6细胞后，发生凋亡的百分比。使用pHM6-LacZ或pHM6-凋亡特异性eIF-5A转染这两种细胞。用pHM6-凋亡特异性eIF-5A转染并用放线菌素D处理的RKO细胞相比用pHM6-LacZ转染但未被放线菌素D处理的RKO细胞，凋亡发生提高了240％。用pHM6-凋亡特异性eIF-5A转染并用放线菌素D处理的RKO-E6细胞相比用pHM6-LacZ转染但未被放线菌素D处理的RKO-E6细胞，凋亡发生提高了105％。
图40描绘了瞬时转染RKO细胞后发生凋亡的百分比。使用pHM6-LacZ、pHM6-凋亡特异性eIF-5A、pHM6-eIF5A2或pHM6-部分长度凋亡特异性eIF-5A转染细胞。用pHM6-凋亡特异性eIF-5A转染的细胞相比用pHM6-LacZ转染的细胞，凋亡发生提高了25％。这种提高在用pHM6-eIF5A2或pHM6-部分长度凋亡特异性eIF-5A转染的细胞中不明显。
图41描绘了瞬时转染RKO细胞后发生凋亡的百分比。使用pHM6-LacZ或pHM6-凋亡特异性eIF-5A转染细胞，或者不处理。在校正转染效率后，发现用pHM6-凋亡特异性eIF-5A转染的细胞中有60％发生凋亡。
图42描绘了瞬时转染RKO细胞的流式细胞分析结果。使用pHM6-LacZ、pHM6-凋亡特异性eIF-5A、pHM6-eIF5A2或pHM6-部分长度凋亡特异性eIF-5A转染细胞，或者不处理。表格描述了根据每个窗口(gate)的峰(peak)下区域计算的凋亡细胞所占的百分比。在校正转染效率后，发现用pHM6-凋亡特异性eIF-5A转染的细胞中有80％发生凋亡。使用pHM6-LacZ、pHM6-eIF5A2或pHM6-部分长度凋亡特异性eIF-5A转染的细胞仅发生背景水平的凋亡。
图43为用0.25μg/ml放线菌素D处理RKO细胞0、3、7、24和48h后，所提取蛋白的Western印迹结果。顶端部分为使用抗p53抗体作为一级抗体的Western印迹结果。中间部分为使用抗凋亡特异性eIF-5A抗体作为一级抗体的Western印迹结果。底端部分化学发光探测后使用考马斯蓝染色的膜，它被用于抗凋亡特异性eIF-5A抗体印迹实验，以证明上样的等量性。用放线菌素D处理后p53和凋亡特异性eIF-5A都受到增量调控。
图44为柱状图，说明凋亡特异性eIF-5A和增殖eIF-5A都在心脏组织中有表达。从接受冠状动脉旁路移植术(″CABG″)的病人体内获取心脏组织。将凋亡特异性eIF-5A基因的表达水平(浅灰色柱)和增殖eIF-5A表达水平(深灰色柱)进行了比较。X轴代表病人编号，Y轴代表pg/ng(18S)(mRNA量(单位pg)/18S核糖体RNA量(单位ng))。
图45为柱状图，说明凋亡特异性eIF-5A和增殖eIF-5A都在心脏组织中有表达。从接受瓣膜移植的病人体内获取心脏组织。将凋亡特异性eIF-5A基因的表达水平(浅灰色柱)和增殖eIF-5A表达水平(深灰色柱)进行了比较。X轴代表病人编号，Y轴代表pg/ng(18S)(mRNA量(单位pg)/18S核糖体RNA量(单位ng))。
图46为柱状图，描绘了通过实时荧光定量PCR测量的凋亡特异性eIF-5A(eIF-5a)和增殖eIF-5A(eIF-5b)在缺血/缺血再灌注心脏组织中的表达。从接受冠状动脉旁路移植术(″CABG″)的病人体内获取心脏组织。Y轴代表pg/ng(18S)(mRNA量(单位pg)/18S核糖体RNA量(单位ng))。
图47描绘了在心脏组织上进行的实验。首先向心脏组织导入正常氧气水平并测量凋亡特异性eIF-5A和增殖eIF-5A的表达水平。然后降低导入氧气量，由此引起供氧不足和缺血并最终在心脏组织中模拟心脏病发作，测量此时的凋亡特异性eIF-5A和增殖eIF-5A的表达水平，并与缺血损伤前的表达水平进行对比。
图48为心脏组织在缺血前和缺血后的EKG图。
图49描绘了图47实验中所用的实验台。
图50A-F报道了病人相关数据，其中凋亡特异性eIF-5A的含量水平与IL-1β和IL-18含量水平有关。图50A是来自冠状动脉旁路移植术(CABG)病人的数据表格。图50B是来自瓣膜移植病人的数据表格。图50C描绘了CABG病人的凋亡特异性eIF-5A含量水平与IL-18含量水平间的关系。图50D描绘了CABG病人的增殖eIF-5A含量水平与IL-18含量水平间的关系。图50E描绘了瓣膜移植病人的凋亡特异性eIF-5A含量水平与IL-18含量水平间的关系。图50F描绘了瓣膜移植病人的增殖eIF-5A含量水平与IL-18含量水平间的关系。
图51为从图50A-F中病人得到的数据表格。
图53描绘了对荧光标记反义寡核苷酸的摄取。
图54-58表明了与未用凋亡特异性eIF-5A反义寡核苷酸处理的细胞相比，处理细胞的凋亡百分比下降。
如图59，用TNF-α和/或或喜树碱处理筛板细胞引起凋亡细胞数目的增加。
图60和61表明与未用凋亡特异性eIF-5A反义寡核苷酸处理的细胞相比，处理细胞的凋亡百分比下降。
图62描绘了在存在血清或不存在血清时筛板细胞对被标记siRNA的摄取。
如图63，用凋亡特异性eIF-5A siRNA转染的细胞产生凋亡特异性eIF-5A蛋白量下降并产生更多的Bcl-2蛋白。凋亡特异性eIF-5A表达的下降与Bcl-2表达的提高相关。
图64描绘了用凋亡特异性eIF-5A siRNA转染的细胞产生凋亡因子5A的蛋白量下降。
图65-67显示用凋亡特异性eIF-5A siRNA转染的细胞群相比未作处理的细胞群，在用喜树碱和TNF-α处理后发生凋亡的细胞比例更低。
图68为图67和实施例13实验中用siRNA转染并用喜树碱和TNF-α处理的筛板细胞#506的Hoescht染色照片。凋亡细胞的染色亮度更高，它们的外形更小也不规则，并且由于染色体凝缩它们的胞核更小。
如图69，用凋亡特异性eIF-5A反义寡核苷酸转染的HepG2细胞相比未转染细胞，在被IL-1处理后分泌TNF-α量减少。
图70描绘了人凋亡特异性eIF-5A序列(SEQ ID NO29)和本发明的5种siRNA序列(SEQ ID NO30、31、32、33、34)。
图71描绘了人凋亡特异性eIF-5A序列(SEQ ID NO29)和本发明的三种反义寡核苷酸序列(SEQ ID NO35、37、39，分别按照在文中的出现顺序)。
图72描绘了三种靶作用于人凋亡特异性eIF-5A的反义寡核苷酸(SEQ ID NO25-27，分别按照在文中的出现顺序)的结合位点。全长核苷酸序列见SEQ ID NO19。
图73A和B分别描绘了人凋亡特异性eIF-5A和人增殖eIF-5A的核苷酸序列(SEQ ID NO41和42，分别按照在文中的出现顺序)比对和氨基酸序列(SEQ ID NO43和42，分别按照在文中的出现顺序)比对。
图74A为Western印迹结果，其中针对凋亡特异性eIF-5A的siRNA在转染的HT-29细胞减少了(如果没有抑制)TNF-α的生成。图74B为EILSA结果。
图75为EILSA照片，与对照细胞相比，用针对凋亡特异性eIF-5A的siRNA处理的细胞生成TNF-α量减少。
图76描绘了U-937细胞分化实验的时程，见实施例16。
图77为Western印迹结果，表明凋亡特异性eIF-5A在单核细胞分化和TNF-α分泌过程中受到增量调控。
图78描绘了干细胞分化，和使用针对凋亡特异性eIF-5A的siRNA来抑制细胞因子生成。
图79为柱状图，表明在响应TNF-α和干扰素时都产生IL-8。该图表明针对凋亡特异性eIF-5A的siRNA几乎全部阻抑了响应干扰素时的IL-8生成，并显著阻抑了响应干扰素和TNF联合处理时的IL-8生成。
图80为柱状图，表明在响应TNF-α和干扰素时都产生IL-8。该图表明针对凋亡特异性eIF-5A的siRNA几乎全部阻抑了响应干扰素时的IL-8生成，并显著阻抑了响应干扰素和TNF联合处理时的IL-8生成。
图81为用IFNγ处理HT-29细胞8和24h后的western印迹结果。说明HT-29细胞在响应干扰素γ时，凋亡特异性eIF-5A受到增量调控(在8h时增加了4倍)。
如图82，通过免疫荧光鉴定筛板细胞。从一名83岁男性的视神经乳头分离筛板细胞#506，并通过免疫荧光进行鉴定。所用的一级抗体为a)肌动蛋白；b)纤粘连蛋白；c)层粘连蛋白；d)GFAP。所有图片均为400倍放大率。
图83描绘了筛板细胞系#506在响应喜树碱和TNF-α联合处理时，发生凋亡的百分比。将筛板细胞系#506接种在8孔培养片上，每孔40000个细胞。三天后用10ng/ml TNF-α或者50μM喜树碱处理细胞，或同时使用二者处理细胞。向不处理的对照细胞中加入等体积的DMSO，一种表达载体作为喜树碱的对照。处理后用Hoescht33258染色细胞48h，并在荧光显微镜下用荧光滤光片观察。被明亮染色或发生染色体凝缩或胞核破碎的细胞作为凋亡细胞而记录。
图84描绘了在喜树碱处理或联用喜树碱和TNF-a处理的过程中，凋亡特异性eIF-5A的表达水平。将筛板细胞系#506接种在8孔培养片上，每孔40000个细胞。三天后用10ng/ml TNF-α处理细胞，或同时使用50μM喜树碱和10ng/ml TNF-α处理细胞，并在1、4、8和24h后收集细胞裂解物。向不处理的对照细胞中加入等体积的DMSO作为对照载体，并在1、24h后收集细胞裂解物。取每个样品的5μg总蛋白SDS-PAGE上电泳，并转移到PVDF膜上。使用抗凋亡特异性eIF-5A抗体为一级抗体进行Western印迹。通过化学发光探测固定抗体，并放在X射线感光胶片上曝光。然后将膜剥离，再用抗β-肌动蛋白抗体作为内部上样对照而进行印迹。
图85描绘了在用siRNA砖然后，筛板细胞系#506和#517中凋亡特异性eIF-5A的表达水平。将筛板细胞#506和#517接种在24孔板上，每孔10000个细胞。三天后用GAPDH siRNA或凋亡特异性eIF-5A siRNA#1-4(SEQ ID NO30-33)或对照siRNA#5(SEQ IDNO34)转染细胞。转染3d后收集裂解物蛋白，并取每个样品的5μg总蛋白SDS-PAGE上电泳，并转移到PVDF膜上。使用抗凋亡特异性eIF-5A抗体进行Western印迹。通过化学发光探测固定抗体，并放在X射线感光胶片上曝光。然后将膜剥离，再用抗β-肌动蛋白抗体作为内部上样对照而进行印迹。该图表明用凋亡特异性eIF-5AsiRNA处理的细胞生成更少的凋亡特异性eIF-5A蛋白。
图86描绘了用凋亡特异性eIF-5A siRNA转染并用喜树碱和TNF-α处理的筛板细胞#506发生凋亡的百分比。将筛板细胞系#506接种在8孔培养片上，每孔7500个细胞。三天后用GAPDH siRNA或凋亡特异性eIF-5A siRNA#1-4(SEQ ID NO30-33)或对照siRNA#5(SEQ ID NO34)转染细胞。72h后用1同时使用50μM喜树碱和10ng/ml TNF-α处理转染细胞。24h后用Hoescht 33258染色细胞，并在荧光显微镜下用荧光滤光片观察。被明亮染色或发生染色体凝缩或胞核破碎的细胞作为凋亡细胞而记录。本图描绘了平均n＝4的独立实验，表明在面对喜树碱和TNF处理时，用凋亡特异性eIF-5AsiRNA转染的细胞相比未转染细胞，发生凋亡的百分比更低。
图87描绘了用凋亡特异性eIF-5A siRNA#1转染并用喜树碱和TNF-α处理的筛板细胞#517发生凋亡的百分比。将筛板细胞系#517接种在8孔培养片上，每孔7500个细胞。三天后用GAPDH siRNA或凋亡特异性eIF-5A siRNA#1(SEQ ID NO30)或对照siRNA#5(SEQID NO34)转染细胞。72h后用1同时使用50μM喜树碱和10ng/mlTNF-α处理转染细胞。24h后用Hoescht33258染色细胞，并在荧光显微镜下用荧光滤光片观察。被明亮染色或发生染色体凝缩或胞核破碎的细胞作为凋亡细胞而记录。这里为两个独立实验的结果，表明用siRNA处理的细胞发生凋亡的百分比更低。
图88描绘了用凋亡特异性eIF-5A siRNA#1转染并用喜树碱和TNF-α处理被TUNEL标记的筛板细胞#506。将筛板细胞系#506接种在8孔培养片上，每孔7500个细胞。三天后用GAPDH siRNA或凋亡特异性eIF-5A siRNA#1(SEQ ID NO30)或对照siRNA#5(SEQID NO34)转染细胞。72h后用1同时使用50μM喜树碱和10ng/mlTNF-α处理转染细胞。24h后用Hoescht33258染色细胞，并用末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的dUTP-地高辛配基切口末端标记法(insituterminal terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-digoxigenin nick end labeling(TUNEL))测量DNA破碎程度。A部分为在荧光显微镜下使用荧光滤光片(以使被TUNEL标记的凋亡细胞破碎DNA显形)观察的玻片。B部分为使用UV滤光片(以显现被Hosescht染色的胞核)观察的同一玻片。这里为两个独立实验的结果。所有图片均为400倍放大率。
图89描绘了所设计的针对凋亡特异性eIF-5A的siRNA，它们具有SEQ ID NO45、48、51和56中的序列，全长核苷酸序列在SEQID NO29中列出。
如图90，直接针对凋亡特异性eIF-5A的siRNA在干扰素γ和LPS的存在下，降低NKkB的活化作用。
图91描绘了PBMC实验的时程(见实施例18)。
图92为在一个时间段内从两个捐赠者处收集的PBMC的细胞裂解物的Western印迹结果。使用PMA处理PBMC，然后用LPS刺激以提高凋亡特异性eIF-5A的表达。
如图93，使用PMA处理并用LPS刺激的PBMC具有提高的凋亡特异性eIF-5A表达，这与TNF产量提高一致。
图94描绘了PBMC响应LPS，没有PMA分化。
如图95，用凋亡特异性eIF-5A siRNA转染的PBMC中的凋亡特异性eIF-5A表达被阻抑。
如图96，用凋亡特异性eIF-5A siRNA转染并用LPS刺激的PBMC相比未转染细胞产生TNF量更少。
图97为用干扰素γ处理或未处理HT-29细胞的裂解物western印迹结果。
图98为用凋亡特异性eIF-5A siRNA转染或用对照siRNA转染的HT-29细胞的裂解物western印迹结果。该图表明凋亡特异性eIF-5A siRNA抑制凋亡特异性eIF-5A的表达。
图99描绘了用凋亡特异性eIF-5A siRNA转染的HT-29细胞中TNF产量水平下降。
如图100，用凋亡特异性eIF-5A siRNA转染的HT-29细胞相比对照细胞凋亡发生下降。对照转染和siRNA转染细胞都被干扰素γ处理，并且也被TNF-α处理。
图101描绘了用凋亡特异性eIF-5A siRNA转染的HT-29细胞相比对照细胞，表达更少的TLR4蛋白。
图102描绘了用凋亡特异性eIF-5A siRNA转染的HT-29细胞相比对照细胞，表达更少的TNFR1蛋白。
图103描绘了用凋亡特异性eIF-5A siRNA转染的HT-29细胞相比对照细胞，表达更少的iNOS蛋白。
图104描绘了用凋亡特异性eIF-5A siRNA转染的HT-29细胞相比对照细胞，表达更少的TLR4 mRNA。
图105描绘了U937实验的时程。
如图106，U937细胞中凋亡特异性eIF-5A受到PMA的增量调控。
如图107，U937细胞中凋亡特异性eIF-5A受到LPS的增量调控。
如图108，在用siRNA处理数小时后，凋亡特异性eIF-5A蛋白的表达仍然下降。
如图109，siRNA介导的凋亡特异性eIF-5A的减量调控与TLR4生成量的减少一致。
如图110，siRNA介导的凋亡特异性eIF-5A的减量调控与U937细胞中糖基化形式的干扰素γ受体减少一致。
如图111，siRNA介导的凋亡特异性eIF-5A的减量调控与U937细胞中TNFR1减少一致。
如图112，siRNA介导的凋亡特异性eIF-5A的减量调控与U937细胞中TNF-α生成(由LPS所诱导)减少一致。
如图113，siRNA介导的凋亡特异性eIF-5A的减量调控与U937细胞中IL-1β生成(由LPS所诱导)减少一致。
如图114，siRNA介导的凋亡特异性eIF-5A的减量调控与U937细胞中IL-18生成(由LPS所诱导)减少一致。
如图115，U937细胞中IL-6的生成与siRNA介导的凋亡特异性eIF-5A的减量调控无关。
如图116，通过静脉注射导入直接针对凋亡特异性eIF-5A的siRNA引起血清中TNF-α含量水平的下降。
如图117，通过鼻腔导入直接针对凋亡特异性eIF-5A的siRNA引起肺脏中TNF-α含量水平的下降。
如图118，通过鼻腔导入直接针对凋亡特异性eIF-5A的siRNA引起肺脏中MIP-1含量水平的下降。
如图119，通过鼻腔导入直接针对凋亡特异性eIF-5A的siRNA引起IL-1α含量水平的下降。
如图120，用针对凋亡特异性eIF-5A的siRNA转染HT-29细胞并用IFN-γ和LPS处理，引起NFκB p50活化作用的降低和TNF-α生成的减少。
如图121，针对凋亡特异性eIF-5A的siRNA在HT-29细胞中阻抑了内源性凋亡特异性eIF-5A的表达。
如图122，HT-29细胞中由siRNA介导的凋亡特异性eIF-5A表达阻抑降低了响应IFN-γ时IFN-γα-受体的积累。
如图123，HT-29细胞中由siRNA介导的凋亡特异性eIF-5A表达阻抑降低了响应IFN-γ时Toll受体4(TLR4)的积累。
如图124，HT-29细胞中由siRNA介导的凋亡特异性eIF-5A表达阻抑降低了响应IFN-γ时JAK1和STAT1的磷酸化作用。
发明详述已经分离了若干种同工真核起始因子5A(eIF-5A)，相关数据可在公开数据库中查得。一般认为这些同工体在功能上是冗余的。本发明的发明者们发现在凋亡诱导前一种同工体受到瞬时增量调控，他们称这种eIF-5A为凋亡特异性eIF-5A或eIF-5A1。本发明的主题是凋亡特异性eIF-5A和DHS(它参与eIF-5A的活化)。
因为凋亡特异性eIF-5A的作用表现为下游效应器的转录后调控和参与凋亡途径的转录因子，所以它可能是凋亡所致疾病中的合适干涉靶点。具体来说，凋亡特异性eIF-5A表现为选择性的促进编码下游效应器和凋亡转录因子的mRNA从胞核到胞质(mRNA在这里被翻译)的转运，从而促进翻译。起始凋亡的最终决定依赖于内部/外部的促-和抗-凋亡信号间复杂的相互作用。(Lowe&Lin(2000)Carcinogenesis，21，485-495)凭借其促进下游凋亡效应器和转录因子翻译的能力，凋亡特异性eIF-5A似乎可以推动这些信号间的平衡向凋亡方向移动。
因此，本发明提供了通过分别导入抑制或减少凋亡特异性eIF-5A或DHS表达的物质，来阻抑或减少细胞凋亡的方法。通过减少DHS的表达，可用来活化凋亡特异性eIF-5A的DHS蛋白量就会减少。一种可抑制或减少凋亡特异性eIF-5A或DHS表达的物质是凋亡特异性eIF-5A或DHS的反义寡核苷酸。通过降低凋亡特异性eIF-5A的活化或减少/抑制凋亡特异性eIF-5A的表达，细胞凋亡可以被推迟或被抑制。
反义寡核苷酸已被成功用来在体外和体内进行基因特异性抑制。反义寡核苷酸是与特定靶DNA或RNA互补(或反义)的人工合成短链DNA(或DNA类似物)、RNA(或RNA类似物)，或DNA/RNA杂交分子。设计反义寡核苷酸以通过与靶mRNA结合并在转录、翻译或拼接水平停止表达，来阻遏靶DNA或RNA编码的蛋白表达。通过使用能够抵抗降解的骨架(Blake et al.，1985)，例如用硫代磷酸酯连接来替换寡核苷酸中的磷酸二酯键以抵抗核酸酶的降解(Matzuraand Eckstein，1968)，反义寡核苷酸已在细胞培养物和动物疾病模型中被成功应用(Hogrefe，1999)。本领域技术人员也了解其它修饰反义寡核苷酸以提高其稳定性和抗降解能力的方法。本文所用的反义寡核苷酸包括双链或单链DNA、双链或单链RNA、DNA/RNA杂交分子、DNA/RNA类似物，和碱基、糖基或骨架分子被修饰的寡核苷酸。可使用本领域已知的方法来修饰寡核苷酸，以提高其稳定性，提高其抵抗核酸酶降解的能力或其它类似能力。本领域技术人员了解这些修饰方法，包括(但不仅限于)修饰寡核苷酸的骨架、修饰糖基部分获修饰碱基。
本发明的反义寡核苷酸优选包含凋亡特异性eIF-5A多肽或DHS多肽的部分或全部编码核酸序列。发明者们按下文所述使用编码部分凋亡特异性eIF-5A多肽的反义核酸转染了多种细胞系，并测量了发生凋亡的细胞数目。与未用反义寡核苷酸转染的同种细胞群相比，转染的细胞群中发生凋亡的细胞数目减少了。图54-58表明了与未用反义凋亡特异性eIF-5A寡核苷酸处理的细胞相比，处理细胞发生凋亡数目的百分比减少。
本发明关注许多种合适的编码凋亡特异性eIF-5A多肽或DHS多肽的核酸序列。例如，本发明提供了下列凋亡特异性eIF-5A核苷酸序列(SEQ ID NOS1，3，4，5，11，12，15，16，19，20，21)和DHS序列(SEQ ID NOS6，7，8)的反义寡核苷酸。本发明的寡核苷酸并不需要有这些序列的全长序列，它们只需要有足以结合的长度，以抑制或减少凋亡特异性eIF-5A或DHS的表达。“抑制或减少表达”或“阻抑表达”指靶基因(凋亡特异性eIF-5A或DHS基因)的蛋白产物或mRNA产物不存在或数量发生可探测性减少。
不包含全部编码序列的凋亡特异性eIF-5A反义寡核苷酸例如包含SEQ ID NO35、37和39序列的凋亡特异性eIF-5A反义寡核苷酸。
“凋亡特异性eIF-5A反义寡核苷酸”包括与凋亡特异性eIF-5A具有基本(substantial)序列同一性或基本同源性的寡核苷酸。此外，本发明的凋亡特异性eIF-5A反义寡核苷酸还包括那些与上文列举的序列具有基本序列同一性(即90％的同源性)的寡核苷酸，或者是那些可以在高严紧条件下与上文列举的SEQ ID Nos序列发生杂交的寡核苷酸。这里所用的术语“基本序列同一性”或者“基本同源性”指一个序列的结构或功能表现出与其它序列基本等同的性质。具有基本序列同一性或基本同源性的序列之间，任何结构或功能差异都是极其微小的；也就是说，这些差异不会影响这些序列在所需使用中发挥预定作用的能力。差异可能是由于如不同种间对密码子的使用不同而引起的。如果两个或更多不同序列间具有相当数量的序列重叠或相似，或者不同序列即使长度/结构不同也表现出相似物理特性，那么就认为序列间的结构差异是极其微小的。这种物理特性包括如，在限定条件下发生杂交的能力，或者是蛋白的免疫交互反应能力，相似的酶活力等。技术人员可通过本领域已知方法来方便的确定所有这些特性。
此外如果两个核苷酸序列具有至少70％或更高、更优选80％或更高、更优选90％或更高、最优选95％或更高的序列相似性，那么这两个序列就“基本互补”。如果两个氨基酸序列在活性或相关功能、或多肽部分上具有至少70％、更优选至少80％、更优选至少90％、最优选至少95％的相似性，那么这两根序列就基本同源。
为确定两个序列间的同一性百分比，对它们进行序列比对以达到最优比较(comparison)目的(为得到最优比对(alignment)，可在第一个和第二个氨基酸或核苷酸上单独或同时引入缺口(gap)，为达到比较目的可忽略非同源性序列)。在首选的实施方案中，比对参考序列的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大长度，以达到比较的目的。然后比较在相应氨基酸或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。如果第一个序列中某位置上的氨基酸残基或核苷酸与第二个序列中相应位置相同，那么两个序列在这个位置上就是等同的(这里所用的氨基酸残基或核苷酸“同一性”与氨基酸或核酸“同源性”的意思等同)。两个序列间的同一性百分比是两个序列间等同位置数目的函数，要考虑到缺口数目和并需要将每个缺口的长度引入到两个序列间的最优比对中。
可使用数学算法来比较序列，确定两个序列间同一性和相似性百分比。(Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，OxfordUniversity Press，New York，1988；BiocomputingInformatics andGenome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，Part 1，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis inMolecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；and SequenceAnalysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991)可进一步将本发明的核酸和蛋白序列用作“查询序列(querysequence)”以在序列数据库中进行搜索，来鉴别如其它家族成员或相关序列。可使用NBLAST和XBLAST程序(version 2.0)进行这种搜索(Altschul，et al.(1990)J.Mol Biol.215403-10)。可使用XBLAST程序进行核苷酸BLAST搜索。可使用XBLAST程序进行蛋白BLAST搜索，以得到与发明中蛋白同源的氨基酸序列。为得到带缺口的比对(gapped alignments)以进行比较，可使用Gapped BLAST(Altschul etal.(1997)Nucleic Acids Res.25(17)3389-3402)。当使用BLAST和gapped BLAST程序时，可分别使用程序的默认参数(如XBLAST和NBLAST)。
术语“凋亡特异性eIF-5A”包括它们的功能性衍生物。这里所用的术语“功能性衍生物”指氨基酸或核苷酸序列的同源物或相似物。功能性衍生物保留了给定基因的功能，这使其可在发明中使用。这里所用的凋亡特异性eIF-5A多肽的“功能性衍生物”，或凋亡特异性eIF-5A反义寡核苷酸的功能性衍生物，包括凋亡特异性eIF-5A的片段、变异体、类似物或化学衍生物，它们并且保持了凋亡特异性eIF-5A的活性，或与凋亡特异性eIF-5A的特异抗体进行免疫交互反应的活性。凋亡特异性eIF-5A多肽的片段指该分子的任何亚单位。
功能性变异体也可包含用相似氨基酸进行的替换，这样不引起功能变化或仅引起不显著的功能变化。可通过本领域已知方法鉴别功能必需的氨基酸，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham et al.(1989)Science 2441081-1085)。后一种方法在分子的每个残基损伤引入单个丙氨酸突变。然后对所得突变分子进行生物活性检测，例如激酶活性或实验中的体外增殖活性。可通过结构分析如晶体分析、核磁共振或光亲和标记，来确定结合配体/底物的关键位置(Smith et al.(1992)J.Mol.Biol.224899-904；de Vos et al.(1992)Science 255306-312)。
“变异体”指与整个基因或其片段基本相似的分子，例如替换了一个或多个核苷酸的核苷酸替换变异体，但它必须保持与特定基因杂交的能力，或者它编码的mRNA转录物能与天然DNA进行杂交。“同源物”指来自不同属或种动物的片段或变异序列。“相似物”指与整个分子基本相似或发挥相关功能的非天然分子(也包括其变异体或片段)。
变异肽包括天然变异体，也包括那些通过本领域已知方法操作形成的变异体。可使用分子技术和本文公开的序列信息，方便的鉴别/制备这些变异体。此外可根据它们与本发明eIF-5A或DHS蛋白的序列和/或结构同源性，方便的将这些变异体与其它蛋白分辨开来。同源性/同一性程度主要基于蛋白是否是功能性变异体或非功能性变异体，侧向同源物家族中的趋异数量和直向同源物间的进化距离。
可使用重组技术方便的制备本发明eIF-5A或DHS的多核苷酸、反义寡核苷酸或蛋白的非天然变异体。这些变异体包括(但不仅限于)在核苷酸或氨基酸序列中进行删除、添加和替换所得的产物。例如一种替换是保守性氨基酸替换。这种替换是将蛋白中的给定氨基酸用具有相似性质的其它氨基酸进行替换。可视为保守性替换的典型替换为发生在脂肪组氨基酸(Ala、Val、Leu、Ile)间的一个或多个替换；发生在羟基氨基酸Ser和Thr间的互换；发生在酸性氨基酸Asp和Glu间的互换；发生在具氨基氨基酸Asn和Gln间的替换；发生在碱性氨基酸Lys和Arg间的替换；发生在芳香族氨基酸Phe和Tyr间的替换。关于哪些氨基酸替换可能形成表型沉默(phenotypicallysilent)的阐述，可见文献Bowie et al.，Science 2471306-1310(1990)。
这里所用的术语“杂交”通常指在合适严紧性条件下核酸之间的杂交，本领域技术人员可根据探针序列和靶序列特征方便的确定杂交严紧性。杂交条件和洗涤方法在本领域被熟知，可根据所需严紧性通过改变孵育时间、温度和/或溶液离子强度来方便的调解杂交条件。参见如Sambrook，J.et al.，Molecular CloningA LaboratoryManual，2ndedition，Cold Spring Harbour Press，Cold Spring Harbor，New York，1989。
根据带杂交序列长度(尤其是探针序列长度)，核酸的相对G-C含量和允许的错配数量来确定杂交条件。当需要互补性较低的序列发生部分杂交时，首选用低严紧性条件。当需要完全或几乎完全的互补时，受选用高严紧性条件。高严紧性条件意味着杂交溶液含有6X S.S.C.、0.01M EDTA、1X Denhardt溶液和0.5％SDS。进行克隆DNA片段杂交时，在68℃下进行约3-4h，进行总真核DNA杂交时进行约12-16h。为了降低严紧性，可将温度调节到42℃，低于双链体的熔解温度(Tm)。已知Tm是双链体G-C含量和双链体长度及溶液离子强度的函数。
这里所用的“杂交到(DNA或RNA分子的)相应部分”指杂交分子(如寡核苷酸、多核苷酸或任何核苷酸序列，以正义或反义方向)识别并杂交到其它核酸分子中的一段与其大小近似并具有足够序列相似性的序列上，以影响在合适条件下进行的杂交。例如一个长100个核苷酸的正义分子将识别并杂交到另一核酸分子中一个长约100核苷酸的序列上，只要这两个序列间有约70％或更高的序列相似性。当然“相应部分”的大小将容忍一些杂交错配，所以“相应部分”可以比杂交到其上的分子更短或更长，例如长或短20-30％，长度差异优选不超过12-15％。
另外，多肽的功能性变异体也可含有用相似氨基酸进行的替换，这样就不会引起功能变化或者只引起不显著的功能变化。可使用本领域已知方法，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变来鉴别功能必需的氨基酸(Cunningham et al.，Science2441081-1085(1989))。后者方法在分子的每个残基上引入单独丙氨酸突变。然后检测所得突变分子的生物活性，或者在实验中进行检测(or in assays)。
本发明也提供了其它可抑制或减少凋亡特异性eIF-5A或DHS表达的物质。其中之一是小干涉RNA(siRNA)。SiRNA技术是作为反义寡核苷酸的一个可行改变而出现的，因为可用比寡核苷酸更低浓度的siRNA，来得到与用反义寡核苷酸所得的抑制水平相当或更高的抑制效果(Thompson，2002)。已经使用长双链RNA在多种生物中，例如植物、线虫和果蝇使得特定基因发生沉默。Dicer酶(RNase-III家族成员)将这些长双链RNA消化为长21-23核苷酸的小干涉RNA，然后此小RNA被包含进RNA引起的沉默复合体(RISC)中。siRNA的展开活化RISC并允许单链siRNA通过碱基配对将RISC引导到内生mRNA上。RISC对内生mRNA的识别引起mRNA的裂解，从而使其不能被翻译。向哺乳动物细胞导入长双链RNA引发有力的抗病毒反应，这一效果也可使用siRNA来达到(Elbashir et al.，2001)。SiRNA已在细胞培养物中广泛使用，并都取得了使特定基因表达减少90％或更高的效果。
在动物疾病模型中使用siRNA抑制基因表达已开始普及。最近的一项研究表明在出生后小鼠的多个器官中，针对萤光素酶的siRNA可通过质粒共转染阻遏荧光素酶的表达。(Lewis et al.，2002)将针对Fas(TNF家族的一个受体)的siRNA的水溶液(hydrodynamically)注射进小鼠的尾静脉，此siRNA能够转染80％以上的肝细胞并使得肝脏中Fas的表达降低90％，并在最后一次注射后持续作用达10天之久(Song et al.，2003)。Fas siRNA也能够防止小鼠发生肝纤维化和感染肝炎。用致死剂量脂多糖处理的小鼠的脓血症，可被直接针对TNF-α的siRNA所抑制(Srensen et al.，2003)。由于其在细胞培养物中的长效性，其能够在体内转染细胞的能力以及其在体内血清中对降解作用的抗性(Bertrand et al.，2002)，siRNA可能是一种可在体内有力抑制特定基应表达的药物。
发明者们用凋亡特异性eIF-5A的siRNA转染细胞并研究了此siRNA对凋亡特异性eIF-5A表达的影响。图64显示用凋亡特异性eIF-5A siRNA转染的细胞产生更少的凋亡特异性eIF-5A蛋白。图65-67显示用凋亡特异性eIF-5A siRNA转染的细胞群相比未作处理的细胞群，在用喜树碱(amptothecin)和TNF-α处理后发生凋亡的细胞比例更低。因此，本发明的一个实施方案提供了通过用包含有凋亡特异性eIF-5A siRNA的载体转染细胞，来抑制胞内凋亡特异性eIF-5A的方法。首选的凋亡特异性eIF-5A siRNA包括那些包含SEQID NO31、31、32、33所述序列的序列。此外还包括那些与上文列举序列具有基本序列同一性(即90％的同源性)的序列，或那些所包含的序列能在高严紧性条件下与所列SEQ ID NO进行杂交的序列。基本序列同一性和同源性的含义在上文本发明反义寡核苷酸的相关内容中已经阐明。术语“凋亡特异性eIF-5A siRNA”包括上述的本发明反义寡核苷酸的功能性变异体和衍生物。
本领域技术人员了解导入SiRNA和表达包含SiRNA的构建体/载体的方法。美国专利申请2004/106567和2004/0086884(均通过引用结合到本文)提供了许多导入方法和构建体/载体表达方法，能说出一些的(to name a few)包括病毒载体、非病毒载体、脂质体导入载体、质粒注射系统、人工病毒包膜和多赖氨酸偶联物(poly-lysineconjugates)。
本领域技术人员应了解，在包含反义寡核苷酸或SiRNA的构建体/载体的表达中，可有用的调节序列。例如，调节序列可以是组成型启动子、可诱导启动子、组织特异性启动子，或者将它们联合使用。
许多重要的人体疾病都是由凋亡控制异常所引起的。这种异常可引起细胞数量的病态增加(例如癌症)或者细胞的损伤性死亡(例如退行性(degenerative)疾病)。本发明的方法和组合物可被用来通过降低或抑制凋亡特异性eIF-5A来预防或治疗患有以下(但不仅限于)凋亡相关疾病和失调的对象，神经/神经退行性疾病(如Alzheimer’s病、帕金森病、Huntington’s病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(Lou Gehrig’s病))，自身免疫疾病(如风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化)，杜兴氏肌营养不良症(Duchenne Muscular Dystrophy(DMD))，运动神经元病，缺血，心肌缺血，慢性心力衰竭，中风，婴儿型脊肌萎缩症，心脏停跳，肾衰竭，异位性皮炎，严重感染和脓毒性休克，AIDS，肝炎，青光眼，糖尿病(1型和2型)，哮喘，视网膜色素变性，骨质疏松，异体排斥和烧伤。
由凋亡控制异常所引起的疾病其中之一是青光眼。多种眼组织的凋亡是导致青光眼患者使命的重要因素。青光眼是一系列由视神经损伤引起的眼部状态，这种状态会引起进行性(progressive)失明。而已经证实凋亡是这种视神经损伤的直接诱因。
早期的青光眼领域研究已证实眼压(″IOP″)增大引起筛板细胞(一种穿孔、胶体连接组织)水平上对轴突运输的干扰，随后就发生视网膜神经节细胞的死亡。(Quigley and Anderson(1976)Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.，15，606-16；Minckler，Bunt，and Klock，(1978)Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.，17，33-50；Anderson and Hendrickson，(1974)Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.，13，771-83；Quigley et al.，(1980)Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.，19，505-17)对动物青光眼模型和死亡后人体组织的研究表明视网膜神经节细胞的死亡是经由凋亡途径发生的。(Garcia-Valenzuela et al.，(1995)Exp.Eye Res.，61，33-44；Quigley etal.，(1995)Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.，36，774-786；Monard，(1998)InHaefliger IO，Flammer J(eds)Nitric Oxide and Endothelin in thePathogenesis of Glaucoma，青光眼发病机制中一氧化氮和内皮素的作用，New York，NY，Lippincott-Raven，213-220)IOP提高所引的轴突运输中断可能会通过引起营养因素缺乏而参与视网膜神经节细胞的死亡。(Quigley，(1995)Aust N Z J Ophthalmol，23(2)，85-91))发现在患青光眼眼睛中，头(head)视神经星状胶质细胞也产生更多的某些毒害神经的物质。例如发现在患青光眼眼睛中，视神经乳头星状胶质细胞产生更多的肿瘤坏死因子(TNF-α)(Yan et al.，(2000)Arch.Ophthalmol.，118，666-673)、一氧化氮合酶(引起一氧化氮生产的酶)(Neufeld et al.，(1997)Arch.Ophthalmol.，115，497-503)。此外在大鼠遗传性视网膜疾病模型中观察到，活化的视网膜神经胶质细胞表达可诱导形式的一氧化氮合酶(iNOS)和TNF-α的水平提高。(Cotinet et al.，(1997)Glia，20，59-69；de Kozak et al.，(1997)Ocul.Immunol.Inflamm.，5，85-94；Goureau et al.，(1999)J.Neurochem，72，2506-2515.)已发现在青光眼视神经乳头中，过量的一氧化氮于是神经节细胞轴突的损伤有关。(Arthur and Neufeld，(1999)Surv Ophthalmol，43(Suppl 1)，S129-S135)最后，已发现视网膜神经胶质细胞在响应刺激性缺血或静力压(hydrostatic pressure)提高时产生TNF-α量的提高，会引起共培养视网膜神经节细胞的凋亡。(Tezel and Wax，(2000)J.Neurosci.，20(23)，8693-8700.)正在研究如何保护视网膜神经节细胞不发生凋亡引起的损伤，并将此作为治疗青光眼所致失明的可能新型疗法。已经在动物疾病模型中成功应用了反义寡核苷酸。瞬时视网膜缺血模型中的缺血过程中，主要在胞核内和视网膜神经节细胞层中胱冬酶的表达提高。通过视网膜电流图确定，使用反义寡核苷酸抑制胱冬酶引起显著的组织病理学和功能改善。(Singh et al.，(2001)J.Neurochem.，77(2)，466-75)其它研究发现通过转染视神经，视网膜神经节细胞增量调控前凋亡蛋白Bax生成并发生凋亡。重复注射Bax反义寡核苷酸到大鼠颞上(temporal superior)视网膜中抑制了局部的Bax表达，并在处理视神经后提高了视网膜神经节细胞存活的数量。(Isenmann et al.，(1999)Cell Death Differ.，6(7).673-82)将反义寡核苷酸包埋在脂质体微囊中，然后通过融合用失活的日本血凝性病毒(HVJ；仙台病毒)包膜包被微囊(HVJ脂质体)，如此对反义寡核苷酸的导入方法进行了改进。将反义寡核苷酸用FITC标记然后包埋在HVJ脂质体中，玻璃体腔(Intravitreal)注射后引起44％以下的神经节细胞产生高亮荧光，并且持续3天，而裸FITC标记的反义寡核苷酸产生的荧光在一天后就消失了。(Hangai et al.，(1998)Arch Ophthalmol，116(7)，976)本发明的一种方法是用以预防或减少眼组织和细胞的凋亡，例如(但不仅限于)星细胞、视网膜神经节、视网膜神经胶质细胞和筛板细胞。青光眼视网膜神经节细胞经由凋亡途径发生死亡并引起失明。因此如果一种方法抑制或减少视网膜神经节细胞的凋亡，或者保护视网膜神经节细胞免受凋亡引起的退化，那么这种方法就提供了预防青光眼所致失明的新型疗法。这种方法包括抑制凋亡特异性eIF-5A的表达以减少凋亡。凋亡特异性eIF-5A是一种表现出可有力调节整个凋亡过程的基因。因此通过阻遏凋亡特异性eIF-5A表达来控制视神经乳头中的凋亡是一种治疗青光眼的方法。
通过将人凋亡特异性eIF-5A的反义寡核苷酸或siRNA导入眼部细胞，例如(但不仅限于)筛板细胞、星细胞、视网膜神经节细胞或视网膜神经胶质细胞，来抑制凋亡特异性eIF-5A的表达。反义寡核苷酸或siRNA定义如上文所书，即至少编码部分凋亡特异性eIF-5A多肽的核酸序列。可用于本发明反义寡核苷酸包括如SEQ ID NO26或27，或者是在高严紧性条件下能结合到与SEQ ID NO26或27互补的序列上，并且抑制凋亡特异性eIF-5A表达的寡核苷酸。
本发明的另一实施方案提供了在筛板细胞、星细胞、视网膜神经节细胞或视网膜神经胶质细胞中抑制凋亡特异性eIF-5A表达的方法。将靶作用于人凋亡特异性eIF-5A的反义寡核苷酸或siRNA(如(但不仅限于)SEQ ID NO26或27)导入筛板细胞、星细胞、视网膜神经节细胞或视网膜神经胶质细胞。这些细胞可以来自人体。
发明者们发现在缺血心脏组织中，凋亡特异性eIF-5A的含量水平与两种细胞因子(白细胞介素1-β“IL-1β”和白细胞介素18“IL-18”)含量水平的提高有关，从而进一步证实当凋亡特异性eIF-5A存在于缺血心脏组织中时，也参与细胞死亡。而在非缺血性心脏组织中没有发现这种凋亡特异性eIF-5A/白细胞介素间的相关性。见图50A-F和51。使用PCR测量了多种缺血性心脏组织中(来自冠状动脉旁路移植和瓣膜移植(二尖瓣和房室瓣(atrial valve))病人)凋亡特异性eIF-5A和增生eIF-5A(“eIF-5A2”-另一种异构体)、IL-1β和IL-18的水平。
凋亡特异性eIF-5A与这些有力白细胞介素间的关系进一步证实通过控制凋亡特异性eIF-5A水平可能会控制缺血组织的炎症和凋亡途径。人外周血单个核细胞((PBMC)正常状态下低水平表达eIF-5A，但在T-淋巴特异性刺激下表达eIF-5A的水平急剧提高，这一事实进一步证实凋亡特异性eIF-5A参与免疫反应(Bevec et al.，1994)。这说明了凋亡特异性eIF-5A在T细胞增殖和/或活化中的作用。因为活化的T细胞能够产生许多种细胞因子，所以细胞因子mRNA也可能需要凋亡特异性eIF-5A作为核-质穿梭运输载体。上文参考文献的作者也发现，由于eIF-5A被证实是HIV Rev蛋白的细胞结合因子并且HIV复制需要eIF-5A，所以在HIV-1病人的PBMC中eIF-5A含量水平的提高可能与这些细胞中HIV的有效复制相关(Ruhl et al.，1993)。
新近发现在树突状细胞成熟过程中eIF-5A表达的水平提高(Kruse et al.，2000)。树突状细胞是抗原呈递细胞，它敏感化助T细胞和杀伤T细胞以诱发T细胞介导的免疫活性(Steinman，1991)。不成熟的树突状细胞缺乏刺激T细胞的能力并需要有适合的刺激(即验证细胞因子和/或微生物产物)来成熟为能够活化T细胞的细胞。腐胺缩赖氨酸合酶(凋亡特异性eIF-5A活化必需的酶)的抑制物被发现可通过防止CD83的表面表达来抑制T淋巴细胞经由树突状细胞的活化(Kruse et al.，2000)。因此凋亡特异性eIF-5A作为CD83 mRNA的核-质穿梭运输蛋白，可能会促进树突状细胞的成熟。
有文献报道(Bevec et al.，1994；Kruse et al.，2000)eIF-5A在免疫系统中的作用，但作者并未明确或鉴别出他们研究的是哪一种eIF-5A异构体，也没有作出推断。如上文所述，已知人具有两种eIF-5A异构体，凋亡特异性eIF-5A(eIF-5A1)和增殖eIF-5A(eIF-5A2)，二者分别在不同的染色体上所编码。在本发明以前，人们相信这两种异构体在功能上是重复的。Bevec等人所描述的被用来在刺激后PBMC中探测eIF-5A的寡核苷酸，与人凋亡特异性eIF-5A具有100％的同源性，这项研究还在此前进行(pre-date)了增殖eIF-5A的克隆。与此相似，Kruse等人所述的被用来通过反转录聚合酶链式反应探测树突状细胞成熟过程中eIF-5A的引物，具有与人凋亡特异性eIF-5A100％的同源性。
本发明涉及到通过控制凋亡特异性eIF-5A表达来控制树突状细胞成熟速率和PBMC的活化，并可能以此控制T-细胞介导免疫活性的速率。单核细胞和巨噬细胞在免疫系统中其主要作用，它们能够识别外来物并被活化/刺激，然后产生细胞因子以警告其余的免疫系统。发明者们使用U-937细胞系(因为已知U-937细胞系表达eIF-5AmRNA(Bevec et al.，1994))研究了凋亡特异性eIF-5A在单核细胞分化为粘着巨噬细胞过程中的作用。U-937是一种悬浮生长的人单核细胞系，在PMA的刺激下会变粘着并分化为巨噬细胞。当通过改变培养基除去PMA，细胞变成非活动性，并随后能够产生细胞因子(Barrios-Rodiles et al.，J.Immunol.，163963-969(1999))。已知在响应脂多糖(一种在许多细菌外膜上存在的因子)时诱发了一般炎症反应，巨噬细胞同时产生TNF-α和IL-1β(Barrios-Rodiles et al.，1999)。见图78，显示了干细胞分化和所产生的细胞因子。在LPS刺激后，U-937细胞也产生IL-6和IL-10(Izeboud et al.，J.Receptor&SignalTransduction Research，19(1-4)191-202.(1999))。
使用U-937细胞，发现凋亡特异性eIF-5A在单核细胞分化和TNF-α分泌过程中受到增量调控。见图77。凋亡特异性eIF-5A siRNA抑制了凋亡特异性eIF-5A蛋白的表达。用Western印迹比较用对照siRNA和凋亡特异性eIF-5A siRNA分别处理的细胞表达凋亡特异性eIF-5A、toll-样受体4(TLR4)、肿瘤坏死因子受体(TNF-R1)和干扰素γ受体(IFNγ-Rα)的特性。用ELISA和液相电化学发光法(ECL)对细胞因子、TNF、白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6和IL-8进行定量。
结果表明相比用对照siRNA处理的细胞，用凋亡特异性eIF-5AsiRNA处理的细胞特异性减量调节了凋亡特异性eIF-5A蛋白的表达80％以上。PMA、LPS、、IFN-γ处理会诱导凋亡特异性eIF-5A蛋白的表达。减量表达凋亡特异性eIF-5A的细胞也减量表达TLR4、TNF-R1和IFNγ-Rα。最初的实验也说明，减量表达凋亡特异性eIF-5A的细胞中，LPS诱导的TNF表达在3h减少，LPS诱导的IL-1β和IL-8生成在24h减少。这些研究说明凋亡特异性eIF-5A可能参与了许多重要细胞因子信号分子(包括受体(TLR4、TNF-R1、IFNγ-Rα)和细胞因子(TNFα、IL-1β、IL-8))的转录后调控。
因此一方面本发明提供了抑制或延迟巨噬细胞成熟以抑制或减少细胞因子生成的方法。这种方法包括提供一种能够减少DHS或凋亡特异性eIF-5A表达的物质。通过减少或禁止DHS的表达，凋亡特异性eIF-5A活化将被抑制或禁止。因为在单核细胞分化和TNF-α分泌过程中凋亡特异性eIF-5A受增量调控，所以相信在这些过程中需要有凋亡特异性eIF-5A。因此通过抑制或禁止凋亡特异性eIF-5A活化或直接减少或禁止凋亡特异性eIF-5A表达，可抑制或禁止单核细胞分化和TNF-α分泌。任何能够减少DHS或凋亡特异性eIF-5A表达的物质都可使用，这包括(但不仅限于)本文所述的针对凋亡特异性eIF-5A的反义寡核苷酸(优选)或siRNA。
发明者们使用已知在响应特定刺激时会产生细胞因子的细胞系，在体外研究了人凋亡特异性eIF-5A作为细胞因子mRNA的核-质穿梭运输载体，启动细胞因子翻译的能力。最近的一些研究发现人肝脏细胞系能够响应细胞因子刺激，诱发其它细胞因子的生成。HepG2是一种人肝脏癌细胞系，它被发现对细胞因子敏感。在响应IL-1β时，HepG2以剂量依赖方式，迅速产生TNF-αmRNA和蛋白((Frede et al.，1996；Rowell et al.，1997；Wordemann et al.，1998)。所以HepG2被用作研究TNF-α生成的模型系统。发明者们发现在HepG2细胞中用直接针对凋亡特异性eIF-5A的反义寡核苷酸抑制人凋亡特异性eIF-5A的表达后，细胞产生的TNF-α会减少。
因此，本发明的一个实施方案提供了降低细胞因子水平的方法。该方法包括导入一种能够减少凋亡特异性eIF-5A表达的物质的步骤。凋亡特异性eIF-5A表达的减少也减少了细胞因子的表达，因此引起细胞产生细胞因子数量的下降。这种细胞因子优选是一种促炎细胞因子，包括(但不仅限于)IL-1、IL-18、IL-6、TNF-α。
合适的用于减少凋亡特异性eIF-5A的物质包括上文所述的反义寡核苷酸。人凋亡特异性eIF-5A的反义寡核苷酸包括如以下物质，SEQ ID NO35、37、39序列，或者是能在高严紧性条件下与SEQ IDNO35、37、39序列发生杂交的反义核酸。
其它的合适物质包括上文所述的人凋亡特异性eIF-5A的siRNA。人凋亡特异性eIF-5A的反义寡核苷酸包括如以下物质，SEQID NO30、31、32和33序列，或者是能在高严紧性条件下与SEQ IDNO0、31、32和33序列发生杂交的反义核酸。如图65-67所示，用人凋亡特异性eIF-5A siRNA转染的细胞在与喜树碱(amptothecin)和TNF-α接触后，发生凋亡比例更低。
发明者们也研究了减少p53表达的方法。该方法包括导入能够减少凋亡特异性eIF-5A表达的物质这一步骤，例如上文所述的反义寡核苷酸或siRNA。如图52和实施例10所示，减少凋亡特异性eIF-5A表达也减少了p53的表达。
发明者们也研究了提高Bcl-2表达的方法。该方法包括导入能够减少人凋亡特异性eIF-5A表达的物质这一步骤。优选使用上文所述的反义寡核苷酸或siRNA。如图63和实施例13所示，减少凋亡特异性eIF-5A的表达提高了Bcl-2的表达。如图63，用人凋亡特异性eIF-5A siRNA转染的细胞产生凋亡特异性eIF-5A的量减少，并且产生更多的Bcl-2蛋白。凋亡特异性eIF-5A表达的减少与Bcl-2表达的提高相关。
本发明也提供了在有需要的病人体内降低TNF-α水平的方法，包括向所述病人导入上文所述的凋亡特异性eIF-5A反义寡核苷酸或siRNA这一步骤。如图69和实施例14所示，用本发明的人凋亡特异性eIF-5A反义寡核苷酸转染的细胞相比未转染细胞，在被IFN-γ诱导后产生凋亡特异性eIF-5A的量减少。
此外，本发明提供了治疗特征为IL-1、TNF-α、IL-6或IL-18水平提高的病理状态的方法，包括向处于所述病理状态的哺乳动物导入上文所述物质(反义寡核苷酸和siRNA)，以减少凋亡特异性eIF-5A表达。已知的特征为IL-1、TNF-α、IL-6或IL-18水平提高的病理状态包括(但不仅限于)风湿性关节炎骨关节炎，哮喘，过敏，脉管炎，crohn’s病，肠炎(ibd)，溃疡性结肠炎，冠心病，囊胞性纤维症，糖尿病，狼疮，多发性硬化，Graves病，牙周炎，青光眼&黄斑变性，眼表疾病包括圆锥形角膜疾病，器官(心脏、肾脏)缺血，缺血再灌注损伤，脓毒症，多发性骨髓瘤，器官移植排斥，牛皮癣和湿疹。例如，肠道炎症疾病的特征为(部分由肠道上皮细胞分泌的)促炎细胞因子和趋化因子所引起的组织损伤。
干扰素γ(IFN-γ)由天然杀伤细胞(NK)和T淋巴细胞产生，它在细胞因子途径网中起到中枢作用。IFN-γ在敏感性细胞中引起多种反应，包括抗病毒、抗增殖和免疫调节活性。IFN-γ与其受体(IFN-γR)的结合引起Janus激酶JAK1和JAK2的自磷酸化。相信JAK1在1022和1023两个酪氨酸残基上的磷酸化参与了催化活性(Liu et al.，Curr.Biol.(7)817-826(1997))。IFN-γR至少有两条链组成，名为IFN-γRα和IFN-γRβ。IFN-γR配基与其受体的结合，引起JAK1的自磷酸化从而导致信号转导和转录活化蛋白(STAT)转录因子的募集和酪氨酸磷酸化。STAT转录因子的磷酸化引起STAT的二聚化和核定位，然后STAT与靶启动子的上游元件结合以调节转录。JAK-STAT途径是良好的抗炎症疗法靶点的代表，因为改变JAK-STAT信号可减少细胞因子引起的促炎症反应，而且认为不适当的IFN-γ表达参与了自身免疫紊乱。
肠道上皮细胞在正常生理状态下，对天然肠道菌群产物(包括脂多糖(LPS))是低敏感性的。因为引起细胞因子如IL-8和TNF-α的产生，IFN-γ表现出具有赋予肠道上皮细胞响应LPS能力的性质。IFN-γ可能使肠道上皮细胞恢复对LPS敏感性的一种机制，是通过提高MD-2和Toll受体4(TLR4)(两种LPS识别必需的蛋白)表达来提高对LPS的摄取(Suzuki et al.，Infection and Immunity；(71)3503-3511(2003))。增加的Th1细胞因子例如IFN-γ产生量(引起肠道上皮细胞对共生细菌的微生物产物的响应发生改变)，被认为参与了特征为肠道炎症的慢性炎症。
另一参与炎症的分子是NFκ-β(也称为NKκ-β或NFkB)。NFκ-β是一种主要的炎症细胞信号分子，它的活化引起COX-2的表达，从而导致组织炎症。COX-2编码基因的表达(相信这响应炎症位点的前列腺素大分子产物)，被NFkB在转录水平上所调控。NFkB位于细胞质内，并被其抑制物所限制。NFkB移动到胞核内并活化相应基因以表达COX-2。因此可通过减少NFkβ表达来减轻炎症。
在本发明的一个实验中，用靶作用于凋亡特异性eIF-5A的siRNA处理人上皮细胞(HT-29细胞)。然后添加TNF(干扰素γ)和LPS来使得NFkB诱导炎症1h。此实验的结果表明使用siRNA来抑制凋亡特异性eIF-5A表达降低了NFkB(它被干扰素γ和LPS所活化)的水平。见图90。
发明者们证实HT-29细胞中在响应IFN-γ刺激时，凋亡特异性eIF-5A siRNA阻遏了TLR4和IFN-γRα蛋白的增量调控(见图123)。如图121，也表现了直接针对凋亡特异性eIF-5A的siRNA阻抑了内源性凋亡特异性eIF-5A的表达。图124也表现了由siRNA所介导的凋亡特异性eIF-5A表达的阻抑，引起在IFN响应处理时STAT1α和JAK1磷酸化的降低。用凋亡特异性eIF-5A siRNA处理得到的TLR4增量调控(在IFN-γ刺激)的降低，与以往的数据相符，即证实了凋亡特异性eIF-5A siRNA降低了HT-29细胞中(在响应IFN-γ和LPS时)NF-κB p50的活化和TNF-α的产生。这些数据与凋亡特异性eIF-5A通过JAK-STAT途径调节IFN-γ信号的理论相符。干扰凋亡特异性eIF-5A从而防止IFN-γ刺激的TLR4增量调控(结肠上皮细胞探测LPS所必需)，因此细胞保持对LPS的低敏感性。因此，在响应TLR4结合LPS时NFκB p50不被活化，同时细胞因子(TNF-α和IL-8)生成被抑制。
凋亡特异性eIF-5A siRNA急剧降低了STAT1α和JAK1的磷酸化(两个重要的IFN-γ信号传导步骤)，这一发现进一步支持了凋亡特异性eIF-5A调控IFN-γ信号这一观点。虽然发现在IFN-γ刺激时IFN-γ受体α增量调控被降低，但不管用对照siRNA还是用凋亡特异性eIF-5A siRNA处理，IFN-γ量表现出与IFN-γ处理以前相同。虽然IFN-γRβ链可以受到凋亡特异性eIF-5A siRNA影响，但这些数据说明IFN-γ与其受体的结合可能没有受到凋亡特异性eIF-5A siRNA影响。这说明JAK1的翻译后调节，或调控JAK1表达或磷酸化的蛋白可能需要凋亡特异性eIF-5A。显然JAK-STAT途径的正常功能(至少通过JAK1和STAT1α)需要凋亡特异性eIF-5A，因此IFN-γ信号也同样需要。
值得指出的是，对照siRNA能够在HT-29细胞中引起反应，这可能是通过TLR3的双链RNA探测的结果。具体来说，用对照siRNA处理的HT-29细胞相比未处理细胞，明显产生更多的TNF-α和IL-8。而凋亡特异性eIF-5A siRNA不引起该反应。在用对照siRNA转染而未用IFN-γ(见图124)处理的细胞中，Jak1也被磷酸化。这可能反映了JAK-STAT途径的活化，此作用参与由TLR3识别双链RNA所引起的干扰素反应。这些数据说明在凋亡特异性eIF-5A siRNA处理细胞中，即使在用IFN-γ处理后JAK1也不被磷酸化，而这说明凋亡特异性eIF-5A siRNA可能阻遏了由探测双链RNA所引发的干扰素反应(在Jak-STAT途径中也发生)。
发明者们使用siRNA抑制了HT-29细胞中的凋亡特异性eIF-5A的表达，以检测对干扰素γ(IFN-γ)信号的作用。凋亡特异性eIF-5AsiRNA使得HT-29细胞在响应IFN-γ和LPS时，分泌TNF-α的能力下降了90％以上。凋亡特异性eIF-5A siRNA也抑制了在响应IFN-γ时(但没有抑制响应TNF-α时)IL-8的分泌。同样的，发现凋亡特异性eIF-5A siRNA以IFN-γ特异性方式降低NF-κB p50的活化，也降低了IFN-γ刺激的TLR4和TNR1表达。更让人感兴趣的是，发现用对照siRNA转染的细胞相比假转染对照细胞，在受到IFN-γ刺激时分泌TNF-α显著提高，并且凋亡特异性eIF-5A siRNA能够显著降低此反应。这些结果说明凋亡特异性eIF-5A可能是FN-γ信号途径的翻译后调节物，并且可能参与细胞对双链RNA的反应。siRNA对凋亡特异性eIF-5A的抑制干扰了信号，并削弱了肠道上皮细胞分别经由TLR4和TNFR1响应LPS和TNF-α的能力。因此，对凋亡特异性eIF-5A的抑制表现出具有对肠道上皮细胞的直接免疫调节影响，并可能是肠道炎症疾病的治疗靶点。
因此，本发明第一个实施方案提供了通过抑制或减少内源性凋亡特异性eIF-5A的表达，来抑制或减轻促炎症反应的方法。优选使用本发明的凋亡特异性eIF-5A反义寡核苷酸或siRNA按上文所述来抑制凋亡特异性eIF-5A的表达。发明者们已说明了内源性凋亡特异性eIF-5A表达的减少对细胞结果的多种影响。这些影响包括多种参与炎症级联反应的生物分子(例如p53、促炎细胞因子(见图112、113、114)、活性NFκβ、TLR4(见图109和123)、TNFR-1(见图111)、IFN-γRα(见图122)和iNOS，还包括TNF-α)的减少，还包括降低STAT1α和JAK1的磷酸化。这些炎症级联反应所必需的生物分子水平的减少或活性的降低，导致炎症的减轻。削弱细胞进入炎症级联反应的能力，可能会被证实为可有效治疗慢性炎症相关疾病/症状(例如(但不仅限于)肠道炎症疾病、关节炎、Chron′s病和狼疮)。
因此，本发明也提供了通过使用直接针对凋亡特异性eIF-5A的反义核酸或siRNA来抑制或阻抑凋亡特异性eIF-5A表达，来降低p53水平、降低促炎细胞因子水平(见图112、113、114)、降低活性NFκβ、TLR4、TNFR-1、IFN-γRα、iNOS、TNF-α的水平，和减少STAT1和JAK1磷酸化的方法。
本发明也提供了在体内向哺乳动物肺脏导入siRNA的方法。通过鼻腔将直接针对凋亡特异性eIF-5A的siRNA(与水混合)导入小鼠体内。导入24h后，向小鼠体内导入脂多糖(LPS)。LPS是一种细菌生物大分子细胞表面抗原，它在体内应用时引发炎症反应网络。通过鼻腔导入LPS引起肺脏内嗜中性细胞数量的增加。主要事件之一是单核噬菌细胞经由受体介导途径的活化，这引起许多细胞因子包括TNF-α的释放。然后TNF-α引起的嗜中性细胞对上皮细胞粘着作用的增强，导致肺脏空间内的大量(massive)渗透。
24h后取出右肺，并测量髓过氧化物酶。髓过氧化物酶(MPO)是嗜中性细胞中的溶菌酶。MPO使用氢过氧化物酶将氯化物转化为次氯酸。次氯酸与细菌发生反应并摧毁细菌。当动脉发炎时，也生成MPO。因此，MPO显然与嗜中性细胞和炎症反应相关。与对照siRNA相比，小鼠凋亡特异性eIF-5A siRNA阻抑了近90％的髓过氧化物酶。在研究中，每个小组中有5只小鼠。该研究的结果说明siRNA可被成功在体内导入哺乳动物的肺脏组织，也说明直接针对凋亡特异性eIF-5A的siRNA抑制了凋亡特异性eIF-5A的表达，从而阻抑髓过氧化物酶的生成。
发明者们也证实了用siRNA进行的凋亡特异性eIF-5A减量调控，降低了肺脏组织在接触LPS(它通常引起有髓过氧化物酶参与的炎症反应)后产生髓过氧化物酶的水平，并从而降低或阻抑了炎症反应。因此，本发明的一个实施方案提供了通过导入针对凋亡特异性eIF-5A的siRNA来抑制或减少凋亡特异性eIF-5A siRNA的表达，来降低肺脏组织中MPO水平的方法。凋亡特异性eIF-5A siRNA表达的减少导致MPO的减少。可以通过鼻腔导入凋亡特异性eIF-5AsiRNA。
MPO水平是自身免疫紊乱引起的心脏病发作和细胞因子-炎症的关键预测物。降低或阻抑炎症反应的能力可能会在治疗炎症相关紊乱(例如自身免疫紊乱)的过程中发挥作用。此外，降低MPO水平的能力可能意味着可在局部缺血的事件发生时和心脏病发作时保护病人。
如图116所示，用凋亡特异性eIF-5A siRNA在小鼠体内进行实验，结果说明它能够降低小鼠血清中的TNF-α含量。通过静脉注射将siRNA导入小鼠尾部血管。在导入LPS 90min后和在静脉注射凋亡特异性eIF-5A siRNA转染48h后，测量血清TNFα水平。图117显示了通过鼻腔向小鼠体内导入siRNA(如上文所述)的实验结果。在小鼠血清中测量总TNF-α水平。凋亡特异性eIF-5A siRNA导致TNF-α含量的下降。因此，本发明的一个实施方案提供了通过导入针对凋亡特异性eIF-5A的siRNA来抑制或减少凋亡特异性eIF-5A表达，来减少血清TNF-α含量的方法。凋亡特异性eIF-5A表达的减少导致血清TNF-α含量的减少。
如图118所示，巨噬细胞炎症蛋白1-α(MIP-1α)的水平也降低。MIP-1α是一种低分子量趋化因子，它属于细胞因子的RANTES(活化后可调节的、正常T细胞表达和分泌的(因子)(regulated on activationnormal T cell expressed and secreted))家族，并与受体CCR1、CCR5、CCR9结合。因此，本发明的一个实施方案提供了通过导入针对凋亡特异性eIF-5A的siRNA来抑制或减少凋亡特异性eIF-5A表达，来减少肺脏组织中MIP-1α含量的方法。凋亡特异性eIF-5A表达的减少导致MIP-1α含量的减少。
图119显示了用针对凋亡特异性eIF-5A的siRNA处理小鼠(通过鼻腔/静脉注射导入)的实验结果。结果显示，在用LPS处理90min后和用siRNA处理后48h，与未用siRNA处理的小鼠肺脏相比，用针对凋亡特异性eIF-5A的siRNA处理的小鼠肺脏中Il-1的水平显著下降。因此本发明的一个实施方案提供了通过导入针对凋亡特异性eIF-5A的siRNA来抑制或减少凋亡特异性eIF-5A表达，来减少肺脏组织中Il-1α含量的方法。凋亡特异性eIF-5A表达的减少导致Il-1α含量的减少。
因此发明者们展示了凋亡特异性eIF-5A与免疫反应间的关系，也展示了针对凋亡特异性eIF-5A的siRNA可阻抑髓过氧化物酶(这是免疫反应的一部分)。发明者们也展示了可以简便的通过鼻腔在体内向肺脏组织导入siRNA。此siRNA仅与水混合即可。这代表了在本领域技术人员一直试图优化的siRNA导入方法上的一大突破和发现。
与此相似，在另一实验中用针对凋亡特异性eIF-5A的siRNA处理小鼠。向小鼠体内导入脂多糖(LPS)以诱发炎症和免疫系统反应。在对照条件下，LPS杀死了胸腺细胞，而胸腺细胞是胸腺产生的一种可抵御感染的重要的免疫系统前体分子。但是使用针对凋亡特异性eIF-5A的siRNA使得胸腺细胞在LPS存在时具有约90％的存活率。因为胸腺细胞是T细胞的前体分子，它们被摧毁后机体的天然免疫活力就不能产生T细胞，因此就不能抵御细菌感染之类的攻击。因此可是使用针对凋亡特异性eIF-5A的siRNA来减轻炎症(如实施例1中MPO水平降低)，同时并不摧毁机体的天然免疫防御系统。
本发明的反义核酸和siRNA在用预防或治疗动物疾病时，可以组合物形式导入，其间另外添加制药学上可行的载体。合适的制药学上可行的载体包括如，水、盐、磷酸盐缓冲液、葡萄糖、甘油和乙醇等物质中的一种或多种，或联合使用这些物质。制药学上可行的载体可进一步包含较小量的辅助物(auxiliary substance)，如润湿或乳化剂、防腐剂或缓冲液，这些物质提高了结合蛋白的保存时间或效能。可按本领域技术人员已知的方法来制备注射组合物，以在将组合物导入哺乳动物体内后，有效成分快速、持续或延时释放。
本发明的组合物可以为多种形式，这包括如固体、半固体和液体形式，如片剂、丸剂、粉剂、液体溶液、分散液或悬浮液、脂质体、栓剂、可注射且可输注溶液。优选的制剂形式依赖于目的导入方式和治疗用途。
可用制药学领域熟知方法来制备这种组合物。在组合物制备过程中，活性成分通常与载体混合，稀释于载体中，和/或由载体包被，这些载体能够形成如胶囊、小袋、纸质或其它容器形式。当载体作为稀释剂时，它可以是固体、半固体、或液体物质，同时载体还发挥了活性成分的载体、赋形剂或介质的作用。因此，组合物可以是片剂、含片、小袋(sachets)、胶囊、酏剂、悬浮液、气雾剂(固体形式或存于液体介质中)、药膏(其中包含的有效成分重量含量可高至(如)10％)、柔软和坚硬凝胶胶囊、栓剂、注射液、悬浮液、包装好的无菌粉剂、局部膏药的形式。
现在已在总体上描述了本发明，下面将通过实施例形式来进一步描述本发明，这些实施例以说明的方式给出。这些实施例是用以帮助读者理解本发明，而不是为了对本发明的范围进行任何限定。并且这些实施例没有包括常规方法的详细描述。这些方法被本领域技术人员所熟知，也在许多公开文献中都有描述。常规方法的详细描述，例如载体和质粒的构建，将编码多肽核酸插入到载体和治理，将质粒导入到宿主细胞，表达并确定基因产物等，可以从许多公开文献中查到，这些文献包括Sambrook，J.et al.，(1989)MolecularCloningA Laboratory Manual，2nded.，Cold Spring Harbor LaboratoryPress。所有文献通过引用结合到本文。
实施例实施例1使用DNA成梯试验(laddering)在大鼠黄体中观察凋亡可使用DNA成梯试验确定凋亡程度。使用QIAamp DNA BloodKit(Qiagen)按照使用说明书从分散黄体细胞中或从离体黄体组织中分离基因组DNA。在诱导凋亡(使用PGF-2α处理1h)之前和诱导凋亡之后1h和24h取出黄体组织。取500ng基因组DNA，与0.2μCi[α-32P]dCTP、1mM Tris、0.5mM EDTA、3U Klenow酶，以及dATP、dGTP、dTTP各0.2pM在室温下共孵育30min，从而对分离的DNA进行末端标记。根据Sambrook等人所述，将样品用一根1ml SepadexG-50层析柱进行层析，除去未标记核苷酸。然后对样品进行Tris-醋酸盐-EDTA(1.8％)凝胶电泳。室温下真空干燥凝胶30min，并在-80℃下将凝胶放在X射线感光胶片上曝光24h。
在一个实验中，在注射PGF-2α后的0、1、2或24h，分别检测过度排卵的大鼠黄体的凋亡程度。0h对照不用注射PGF-2α，即取出卵巢。低分子量DNA片段的成梯状条带(反映了与凋亡相关的核酸酶的活性)在对照黄体组织中(PGF-2α处理前即取出)不明显，但是在诱导凋亡后的1h时间内即可辨认，并且在诱导凋亡后的24h后就非常清晰了，如图16所示。此图中，顶端部分是Northern印迹(以用32P-dCTP标记的大鼠黄体凋亡特异性DHS cDNA的3′-非翻译区域作为探针)的放射自显影图，下面是总RNA的EB染色凝胶图，每个泳道含有10μg RNA。数据表明在血清停药后，凋亡特异性eIF-5A的转录受到减量调控。
另一实验中，用盐水代替PGF-2α处理相应的对照动物。用盐水或PGF-2α处理15min后，从动物体内取出黄体。在取出后的3h和6h，分别从黄体组织中分离基因组DNA。在用PGF-2α处理的动物组织取出后6h提取样品中，可明显观察到DNA成梯状且基因组DNA末端标记增强，但在取出后3h提取样品中没有此发现，见图17。PGF-2α处理后15min取出的动物黄体样品中也可明显观察到反应凋亡的DNA成梯现象，并在体外条件下(EBSS(Gibco)中)保持6h之久。从更强的基因组DNA末端标记中也可明显的观察到与凋亡相关的核酸酶活性。
另一实验中通过皮下注射500μg PGF-2α来诱导过度排卵。对照大鼠用等体积的盐溶液处理。15-30min后，取出卵巢并用胶原酶切碎。用PGF-2α处理的大鼠的分散细胞与10mm谷氨酰胺加10mm亚精胺共孵育1h，再与10mm谷氨酰胺(无亚精胺)共孵育5h(泳道2)，或者与10mm谷氨酰胺加10mm亚精胺共孵育1h，再与10mm谷氨酰胺加10mm亚精胺共孵育5h(泳道3)。用盐水处理的对照大鼠细胞用胶原酶分散后，与10mm谷氨酰胺加10mm亚精胺共孵育1h，再与10mm谷氨酰胺(无亚精胺)共孵育5h(泳道1)。分别取来自每个样品的500ng DNA，使用klenow酶进行[α-32P]-dCTP标记，并在1.8％的琼脂糖凝胶上分离，再放在X射线感光胶片上曝光24h。结果见图18。
还有一个实验中，分别在500μg PGF-2α皮下注射处理前的24h、12h和2h向过度排卵的大鼠皮下注射亚精胺，每100g体重共注射1mg，每次注射0.333mg/100g体重。对照大鼠分为3组无注射，3次注射亚精胺但不用PGF-2α处理，以及在PGF-2α处理前同时间点3次注射等体积的盐溶液。在用前列腺素处理后的95min或3h又45min时，取出大鼠卵巢，并用以分离DNA。分别取来自每个样品的500ng DNA，使用klenow酶进行[α-32P]-dCTP标记，并在1.8％的琼脂糖凝胶上分离，再放在X射线感光胶片上曝光24h泳道1，无注射(在与泳道3-5同样的时间点处死动物)；泳道2，注射3次亚精胺(在与泳道3-5同样的时间点处死动物)；泳道3，3次注射盐溶液后注射PGF-2α(动物在PGF-2α处理后95min处死)；泳道4，3次注射亚精胺后注射PGF-2α(动物在PGF-2α处理后95min处死)；泳道5，3次注射亚精胺后注射PGF-2α(动物在PGF-2α处理后95min处死)；泳道6，3次注射亚精胺后注射PGF-2α(动物在PGF-2α处理后3h又45min处死)；泳道7，3次注射亚精胺后注射PGF-2α(动物在PGF-2α处理后3h又45min处死)。结果见图19。
RNA分离在用PGF-2α诱导凋亡后的不同时间点从大鼠体内取出黄体，并分离RNA。将组织(5g)在液氮中快速磨碎，然后将碎粉与30ml胍盐缓冲液(4M异硫氰酸胍、2.5mM NaOAc，pH8.5、0.8％β-巯基乙醇)混合。用四层Miracloth滤膜过滤混合物，并在10000g、4℃下离心30min。取上清液，进行氯化铯密度梯度离心，11200g，20h。用75％乙醇漂洗RNA沉淀，再用600ml DEPC-处理水重悬浮，然后在-70℃用1.5ml 95％乙醇和60ml 3M NaOAc沉淀RNA。
基因组DNA分离和成梯试验按照使用说明书使用QIAamp DNA Blood Kit(Qiagen)从提取的黄体组织或分散黄体细胞中分离基因组DNA。取500ng基因组DNA，与0.2μCi[α-32P]dCTP、1mM Tris、0.5mM EDTA、3U Klenow酶，以及dATP、dGTP、dTTP各0.2pM在室温下共孵育30min，从而对分离的DNA进行末端标记。根据Maniatis等人所述方法，将样品用一根1ml Sepadex G-50层析柱进行层析，除去未标记核苷酸。然后对样品进行Tris-醋酸盐-EDTA(1.8％)凝胶电泳。室温下真空干燥凝胶30min，并在-80℃下将凝胶放在X射线感光胶片上曝光24h。
质粒DNA分离，DNA测序根据上文Sambrook等人所述用碱解法(alkaline lysis)提取质粒DNA。用双脱氧测序法对全长阳性cDNA克隆进行测序(Sanger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，745463-5467)。使用BLAST(GenBank，Bethesda，MD)进行开放阅读框的搜集和分析，并使用BCM SearchLauncher(多序列比对模式-诱导的多重比对方法，Multiple SequenceAlignments Pattern-Induced Multiple Alignment Method，F.Corpet，Nuc.Acids Res.，1610881-10890，(1987))进行序列比对。序列和序列比对见图5-11。
大鼠黄体RNA的Northern印迹在1％的变性甲醛琼脂糖凝胶上分离来自大鼠黄体凋亡不同阶段的20mg总RNA，并固定在尼龙膜上。使用随机引物试剂盒(Boehringer)用32P-dCTP标记全长大鼠凋亡特异性eIF-5A cDNA(SEQID NO1)，并用以探测膜(7×107cpm)。或者使用随机引物试剂盒(Boehringer)用32P-dCTP标记全长大鼠DHS cDNA(SEQ ID NO6)，并用以探测膜(7×107cpm)。然后在室温下用1x SSC、0.1％SDS洗膜一次，再于65℃下用0.2x SSC、0.1％SDS洗膜三次。膜干燥后，在-70℃下放在X射线感光胶片上曝光过夜。
可见凋亡特异性eIF-5A和DHS在凋亡中的黄体组织中均受到增量调控。在用PGF-2α处理诱导凋亡后，凋亡特异性eIF-5A的表达显著提高-在零时较低，在处理后的1h内即显著提高，处理后8h内提高到更高水平，处理后24h内轻微提高(图14)。DHS的表达在零时较低，在处理后的1h内即显著提高，处理后8h内提高到更高水平，处理后24h内也轻微提高(图15)。
使用基于酵母、真菌和人eIF-5A序列的引物，得到凋亡中大鼠黄体的RT-PCR产物使用一对根据酵母、真菌和人凋亡特异性eIF-5A序列设计的寡核苷酸引物，以凋亡中的大鼠黄体RNA为模板进行RT-PCR，得到了部分长度的凋亡特异性eIF-5A序列(SEQ ID NO11)，它相应于基因3’末端。用以分离大鼠凋亡特异性eIF-5A基因3’末端的上游简并引物长20个核苷酸5′TCSAARACHGGNAAGCAYGG 3′(SEQ IDNO9)，其中的S为C或G；R为A或G；H为A、T或C；Y为C或T；N可为任意核苷酸。用以分离大鼠凋亡特异性eIF-5A基因3’末端的下游引物长42个核苷酸5′GCGAAGCTTCCATGGCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT3′(SEQ ID NO10)。进行反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)。简短来说，使用5mg下游引物合成cDNA的第一链。然后用第一链作为RT-PCR的模板，并同时使用上游和下游引物。
将RT-PCR产物用琼脂糖凝胶分离，得到900bp的片段，通过用平末端连接将该片段亚克隆到pBluescriptTM载体中(StratageneCloning Systems，LaJolla，CA)并测序(SEQ ID NO11)。cDNA的3’末端序列是SEQ ID NO11，3’末端氨基酸序列是SEQ ID NO12，见图1-2。
以凋亡中的大鼠黄体RNA为模板进行RT-PCR，得到了部分长度的凋亡特异性eIF-5A序列(SEQ ID NO15)，它相应于基因5’末端并与3’末端重叠。根据人eIF-5A设计5’引物，长24个核苷酸5′CAGGTCTAGAGTTGGAATCGAAGC3′(SEQ ID NO13)。根据人RT-PCR的3’末端设计3’引物，长30个核苷酸5′ATATCTCGAGCCTT GATTGCAACAGCTGCC3′(SEQ ID NO14)。进行反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)。简短来说，使用5mg下游引物合成cDNA的第一链。然后用第一链作为RT-PCR的模板，并同时使用上游和下游引物。
将RT-PCR产物用琼脂糖凝胶分离，得到500bp的片段，通过用分别存在于上游和下游引物中的XbaI和XhoI克隆位点，将该片段(SEQ ID NO11)亚克隆到pBluescriptTM载体中(Stratagene CloningSystems，LaJolla，CA)并测序(SEQ ID NO15)。cDNA的5’末端序列是SEQ ID NO15，5’末端氨基酸序列是SEQ ID NO16，见图2。
大鼠凋亡特异性eIF-5A的3’和5’末端(分别为SEQ ID NO11和SEQ ID NO15)互相重叠并形成全长cDNA(SEQ ID NO1)。将此全长序列与GeneBank中的数据进行比较，见图1-2。该cDNA克隆编码一个长154个氨基酸的分子量计算值为16.8KD的多肽(SEQ IDNO2)。图3中描绘了通过RT-PCR得到的大鼠黄体凋亡特异性eIF-5A基因的全长cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO1)，相应的氨基酸序列为SEQ ID NO9。将该全长eIF-5A氨基酸序列与人和小鼠eIF-5A序列进行比对，见图7-9。
使用基于人DHS序列的引物，得到凋亡中大鼠黄体的RT-PCR产物使用一对根据人DHS序列设计的寡核苷酸引物，以凋亡中的大鼠黄体RNA为模板进行RT-PCR，得到了部分长度的DHS序列(SEQID NO6)，它相应于基因3’末端。5’引物长20个核苷酸5′GTCTGTGTATTATTGGGCCC 3′(SEQ ID NO17)；3’引物长42个核苷酸5′GCGAAGCTTCCATGGCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT3′(SEQ ID NO18)。进行反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)。简短来说，使用5mg下游引物合成cDNA的第一链。然后用第一链作为RT-PCR的模板，并同时使用上游和下游引物。
将RT-PCR产物用琼脂糖凝胶分离，得到606bp的片段，通过用平末端连接将该片段亚克隆到pBluescriptTM载体中(StratageneCloning Systems，LaJolla，CA)并测序(SEQ ID NO6)。图4中描绘了通过RT-PCR得到的部分长度的大鼠黄体凋亡特异性DHS基因序列(SEQ ID NO6)，相应的氨基酸序列为SEQ ID NO7。
基因组DNA的分离和Southern分析从离体的大鼠卵巢分离得到基因组DNA，并进行southern印迹法试验。将约100mg的卵巢组织碎成小块并置于一支15ml试管中。用1ml PBS洗涤组织两次(对组织悬浮液轻轻振荡，然后用吸管除去PBS)。然后用2.06ml DNA缓冲液(0.2M Tris-HCl，pH 8.0，0.1mMEDTA)重悬组织，并添加240μl 10％SDS、100μl蛋白酶K(Boehringer Manheim；10mg/ml)。再将试管置于45℃振摇水浴中过夜。第二天再向试管内组织悬液中加入100μl蛋白酶K(10mg/ml)，然后将组织悬浮液在45℃水浴中孵育4h。随后用等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合液萃取组织悬浮液一次，完成后再用等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)混合液萃取一次。萃取后加入1/10体积的3M醋酸钠(pH 5.2)和两倍体积的乙醇。用本生灯将一根玻璃吸管一端烧熔密封并形成一个钩子，用它从溶液中勾出细线状的DNA并转移到一个干净的微离心管中。用70％乙醇洗涤DNA一次，并风干10min。用500μl 10mM Tris-HCl(pH 8.0)溶解DNA沉淀，再加入10μl RNaseA(10mg/ml)，然后在37℃下孵育1h。用苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合液萃取DNA一次，然后加入1/10体积的3M醋酸钠(pH 5.2)和两倍体积的乙醇沉淀DNA。以13,000xg在4℃下离心10min。再用70％乙醇洗涤DNA沉淀一次，然后重新溶解于200μl 10mMTris-HCl(pH 8.0)中，4℃下旋转过夜。
为进行southern印迹分析，将分离自大鼠卵巢的基因组DNA用多种限制性酶消化，这些酶或者在内源性基因中不切割，或者仅切割一次。为此，将10μg基因组DNA，20μl 10X反应缓冲液和100U限制性酶在总体积为200μl的反应体系里反应5-6h。消化后的DNA在0.7％琼脂糖凝胶上电泳，电压40v进行6h或15v电泳过夜。电泳后将凝胶在0.2N HCl中脱嘌呤(depurinated)10min，随后用变性溶液(0.5M NaOH，1.5M NaCl)洗涤两次，每次15min，再用中和缓冲液(1.5M NaCl，0.5M Tris-HCl，pH7.4)洗涤两次，每次15min。将DNA转移到尼龙膜上，然后将膜置于杂交溶液中(40％甲酰胺，6X SSC，5X Denhart′s溶液(1X Denhart′s溶液含0.02％Ficoll，0.02％PVP和0.02％BSA)，0.5％SDS和1.5mg变性鲑鱼精子DNA)进行预杂交。通过随机引物用[α-32P]-dCTP标记大鼠eIF-5A cDNA的3’UTR的700bp PCR片段，然后将该片段以1×106cpm/ml加到膜上。
类似的，通过随机引物用[α-32P]-dCTP标记大鼠DHScDNA(450bp的编码序列和156bp的3’UTR)，然后以1×106cpm/ml加到另一个相同的膜上。42℃下印迹杂交过夜，然后在42℃下用2XSSC和0.1％SDS洗涤两次，再在同样温度下用1X SSC和0.1％SDS洗涤两次。然后将印迹显影3-10d。
用限制性酶切开大鼠基因组DNA，如图20所示，并用32P-dCTP标记的全长eIF-5A cDNA为探针进行探测。高严紧条件下的杂交实验揭示了全长eIF-5A cDNA探针与每个限制性酶消化DNA样品的若干限制性片段间的杂交，说明了若干eIF-5A异构体的存在。需要特别指出的是，当用EcoRV(它在凋亡特异性eIF-5A开放阅读框内有限制性识别位点)消化基因组DNA时，在southern印迹实验中探测到两个凋亡特异性eIF-5A异构体的限制性片段。在图20中用双箭头标出。在标为EcoR I和BamH I(它们在开放阅读框中没有酶切位点)的泳道中，用单箭头标出相应于凋亡特异性eIF-5A异构体的限制性片段。这些结果说明凋亡特异性eIF-5A在大鼠中是一个单拷贝基因。如图5-13所示，不同种间的eIF-5A基因高度保守，所以可以预测任意种内的异构体之间有相当高的保守性。
如图21，显示了以用32P-dCTP标记的部分大鼠黄体DHS cDNA作为探针得到的大鼠基因组DNA的southern印迹结果。用EcoRV处理基因组DNA，该酶对部分长度的cDNA探针不起作用。可明显辨别出两个限制性片段，这说明该基因有两个拷贝或该基因含有一个具有EcoRV位点的内含子。
实施例2
本实施例阐述了凋亡特异性eIF-5A对凋亡的调节(正义方向的凋亡特异性eIF-5A增强了凋亡作用)。
培养COS-7细胞，RNA分离COS-7细胞是用SV40(编码野生T抗原)的突变体转化的非洲绿猴肾脏成纤维细胞样细胞系，它被用于所有的转染实验。用Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)(含有0.584g/L的L-谷氨酰胺、4.5g/L的葡萄糖和0.37％碳酸氢钠)培养COS-7细胞。在培养基中添加10％胎牛血清(FBS)和100单位的青霉素/链霉素。在37℃、5％CO2和95％空气、加湿环境中培养细胞。每3-4d用0.25％胰蛋白酶和1mM EDTA溶液分离贴壁细胞来进行传代。分离的细胞按1∶10分流比分配到含有新鲜培养基的新培养皿中。
在150mm组织培养皿(Corning)中培养用以分离RNA的COS-7细胞。用胰蛋白酶EDTA溶液分离细胞来收集细胞。用离心管收集分离的细胞，3000rpm转速离心5min。除去上清液，用液氮速冻细胞沉淀。按照使用说明书使用GenElute Mammalian Total RNAMiniprep kit(Sigma)从冷冻细胞中分离RNA。
构建重组质粒并转染COS-细胞使用哺乳动物表位标签表达载体pHM6(Roche MolecularBiochemicals)构建重组质粒，其中携带有正义方向的大鼠凋亡特异性eIF-5A全长编码序列，以及反义方向的大鼠凋亡特异性eIF-5A3’非翻译区域(UTR)，如图21所示。此载体包含以下元件CMV启动子-人巨细胞病毒的立即-早期(immediate-early)启动子/增强子，来自流感病毒血凝素的HA-九肽表位标签，BGH pA-牛生长激素聚腺苷酸化信号，f1 ori-f1复制起点，SV40 ori-SV40早期启动子和复制起点，新霉素抗性基因(G418)，SV40 pA-SV40聚腺苷酸化信号，Col E1-ColE1复制起点，氨苄青霉素抗性基因。从pBluescript载体中的原始大鼠凋亡特异性eIF-5A RT-PCR片段(SEQ ID NO1)出发，PCR扩增得到大鼠凋亡特异性eIF-5A全长编码序列和大鼠凋亡特异性eIF-5A3’UTR。扩增全长eIF-5A的引物为，正向5′GCCAAGCTTAATGGCAGATGATTT GG3′(SEQ ID NO59)(Hind3)，反向5′CTGAATTCCAGT TATTTTGCCATGG 3′(SEQ IDNO60)(EcoR1)。扩增大鼠凋亡特异性eIF-5A 3’UTR的引物为，正向5′AATGAATTCCGCCATGACAGAGGAGGC 3′(SEQ ID NO61)(EcoR1)，反向5′GCGAAGCTTCCATGGCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT3′(SEQ ID NO62)(Hind3)。
大鼠凋亡特异性eIF-5A全长序列PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后长度为430bp，大鼠凋亡特异性eIF-5A 3’UTR PCR产物为697bp。将这两个片段亚克隆到pHM6的Hind3和EcoR1位点间，以构建pHM6-全长凋亡特异性eIF-5A和pHM6-反义3’UTR eIF-5A。将全长大鼠凋亡特异性eIF-5A PCR产物亚克隆与处于多克隆位点的上游的流感病毒血凝素(HA)九肽表位标签置于同一阅读框内，从而使得重组蛋白能够使用抗-[HA]-过氧化物酶抗体来探测。使用人巨细胞病毒的立即-早期启动子/增强子来驱动表达，以确保在哺乳动物细胞系中获得高水平表达。这个质粒也含有新霉素抗性基因(G148)(从而能够选择稳定转化子)和SV40早期启动子和复制起点，这使得在表达SV40大(large)T抗原的细胞(如COS-7)中可进行附加型复制。
转染实验待用的COS-7细胞的培养如下进行，在24孔培养板(Corning)上培养将用于蛋白提取的细胞，在4格培养片上(Falcon)培养将要染色的细胞。在添加有10％FBS(缺少青霉素/链霉素)的DMEM培养基中培养细胞，直至细胞融合达50-70％。将0.32μg质粒DNA稀释在42.5μl无血清DMEM培养基中，并在室温下孵育15min，以制备足以用在24孔板上一个孔或培养片上的转染液。将1.6μl转染试剂LipofectAMINE(Gibco，BRL)稀释在42.5μl无血清DMEM培养基中，并在室温下孵育5min。然后将LipofectAMINE混合物添加到DNA混合物中，并在室温下孵育30-60min。用无血清DMEM培养基洗涤待转染细胞一次，然后用转染液覆盖细胞，再将细胞放回培养4h。
孵育后，向细胞中加入0.17ml DMEM+20％FBS。然后培养细胞40h，再进行凋亡诱导(然后染色)或收集细胞以进行Western印迹分析。进行假转染作为对照，其中在转染液中没有加入质粒DNA。
蛋白提取和Western印迹分析从转染细胞中提取蛋白以进行Western印迹，首先用PBS(8g/LNaCl，0.2g/L KCl，1.44g/L Na2HPO4，0.24g/L KH2PO4)洗涤细胞两次，然后加入150μl热SDS凝胶上样缓冲液(50mM Tris-HCl pH6.8，100mM二硫苏糖醇，2％SDS，0.1％溴酚蓝，和10％甘油)。将细胞溶出物收集在微离心管中，95℃加热10min，然后再13000xg转速离心10min。将上清液转移到新微离心管中并于-20℃下储存待用。
为进行Western印迹，将2.5或5μg的总蛋白在12％SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳。将分开的蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜上。将膜与封阻溶液(5％脱脂奶粉、0.02％叠氮化钠的PBS溶液)孵育1h，然后用PBS-T(PBS+0.05％Tween-20)洗涤三次共15min。将膜保存在PBS-T溶液中，4℃过夜。第二天在膜恢复到室温后，用1μg/ml聚乙烯醇封阻30s。用去离子水漂洗膜5次，然后用5％牛奶PBS溶液封阻30min。将一级抗体在5％牛奶PBS溶液中预孵育30min，然后与膜共孵育。
使用若干一级抗体。使用抗-[HA]过氧化物酶抗体(RocheMolecular Biochemicals，稀释度1∶5000)来探测重组蛋白的表达。因为这个抗体与过氧化酶偶联，所以不需要二级抗体，洗涤印迹并通过化学发光来辨认。使用的另一一级抗体为来自癌基因的单抗，它识别p53(Ab-6)、Bcl-2(Ab-1)、c-Myc(Ab-2)。识别p53的单抗使用稀释度为0.1μg/ml，识别Bcl-2和c-Myc的单抗为0.83μg/ml。与一级抗体孵育60-90min后，用PBS-T溶液洗涤三次共15min。然后将二级抗体稀释在1％牛奶PBS中，并与膜共孵育60-90min。当使用p53(Ab-6)为一级抗体时，使用与碱性磷酸酶偶联的羊抗鼠IgG(Rockland)作为二级抗体，稀释度1∶1000。当使用Bcl-2(Ab-1)和c-Myc(Ab-2)作为一级抗体时，使用与过氧化物酶偶联的兔抗鼠IgG(Sigma)作为二级抗体，稀释度1∶5000。与二级抗体共孵育后，将膜用PBS-T洗涤三次。
使用两种探测方法来显现印迹，比色法和化学发光法。比色法只在p53(Ab-6)作为一级抗体，用偶联有碱性磷酸酶的二级抗体时才能够使用。将印迹在黑暗中与0.33mg/mL硝基四唑蓝、0.165mg/mL5-溴-4-氯-3-吲哚磷脂、100mM NaCl、5mM MgCl2、和100mMTris-HCl溶液(pH9.5)孵育，以显现结合的抗体。将膜与2mM EDTA的PBS溶液共孵育以停止颜色反应。使用其它所有二级抗体时均可使用化学发光探测法，包括抗-[HA]-过氧化物酶、Bcl-2(Ab-1)、c-Myc(Ab-2)。使用ECL Plus Western印迹探测试剂盒(AmershamPharmacia Biotech)来探测过氧化物酶-偶联的固定抗体。简短来说，将膜轻轻吸干，然后在黑暗中与试剂A和B的混合液(40∶1)孵育5min。将膜吸干，夹在醋酸纤维膜之间，然后放在X射线感光胶片上曝光，时间为10s-10min。
在COS-7细胞中诱导凋亡使用两种方法在转染的COS-7细胞中诱导凋亡，即去血清法和链霉菌(streptomyces sp)放线菌素D(Calbiochem)处理法。两种方法中，均在转染后除去培养基并保持40h。在去血清实验中，用无血清无抗体的DMEM代替培养基。在添加有10％FBS的无抗体DMEM中生长的细胞用作对照。在放线菌素D诱导凋亡方法中，用添加了10％FBS和1μg/ml的放线菌素D甲醇溶液的无抗体DMEM代替培养基。对照细胞在添加了10％FBS和等体积甲醇的无抗体DMEM中培养。两种方法中，均使用Hoescht或膜联蛋白V-Cy3染色在48h后确定发生凋亡的细胞百分比。也通过Northern印迹确认凋亡诱导，如图22所示。
Hoescht染色使用Hoescht核染色来标记转染COS-7细胞的胞核，以通过形态学特征鉴别凋亡细胞，如核破碎和凝缩。A固定剂由无水甲醇和冰醋酸的混合液(3∶1)组成，即用即配。将等体积的固定剂加入到培养片上的COS-7细胞培养基中，孵育2min。然后从细胞中移出培养基/固定剂混合物并弃去，再向细胞加入1ml固定剂。5min后弃去固定剂，再加入1ml新鲜固定剂孵育5min。随即弃去固定剂，风干细胞4min，再加入1ml Hoescht染色液(0.5μg/ml Hoescht33258溶于PBS)。在黑暗中孵育10min后弃去染色液，用去离子水洗涤培养片三次共1min。然后向细胞加入1ml McIlvaine′s缓冲液(0.021M柠檬酸、0.058M Na2HPO4.7H2O，pH5.6)，在黑暗中孵育20min。除去缓冲液，在黑暗中风干细胞5min，然后除去培养片上分开孔的隔板。向片上滴几滴Vectashield封片液(Vector Laboratories)，盖上盖玻片。使用UV滤光片在荧光显微镜下观察染色细胞。被明亮染色或具有核破碎片段的细胞作为凋亡细胞而记录。
膜联蛋白V-Cy3染色使用膜联蛋白V-Cy3凋亡探测试剂盒(Sigma)对凋亡细胞上外化的磷脂酰丝氨酸进行荧光标记。对使用说明进行以下修改，其余操作按说明书进行。简短来说，将生长于四格培养片上的COS-7细胞用PBS洗涤两次，用1x结合缓冲液洗涤三次。加入150μl染色溶液(1μg/ml AnnCy3溶于1X结合缓冲液中)，在黑暗中孵育10min。然后除去染色溶液，用1x结合缓冲液洗涤5次。从培养片上除去隔板，在细胞上滴几滴1x结合缓冲液，盖上盖玻片。用荧光显微镜分析荧光，使用绿色滤光片以辨别发红色荧光的阳性染色(凋亡)细胞。在可见光下数出细胞数目以确定整个细胞群。
实施例3
本实施例阐明了凋亡特异性eIF-5A对凋亡的调控。
使用上文实施例中描述的常规步骤和方法，图23是瞬时转染COS-7细胞步骤的流程图，其中生长于无血清培养基中的细胞与lipofect AMINE中的质粒DNA孵育4h，然后加入血清再孵育40h。随后将细胞置于含有血清的正式培养基中继续孵育48h，再进行分析(即无后续处理)，去血清48h以诱导凋亡并进行分析，或者用放线菌素D处理48h以诱导凋亡并进行分析。
图22描绘了用pHM6转染后COS-7细胞中外源蛋白的瞬时表达。用pHM6-LacZ、pHM6-反义3′rF5A(pHM6-反义大鼠凋亡特异性eIF-5A 3’UTR)、pHM6-正义rF5A(pHM6-全长凋亡特异性eIF-5A)，转染细胞或者假转染。48h后，从COS-7细胞中分离蛋白。取每个样品的5μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，然后转移到PVDE膜上，用抗-[HA]-过氧化物酶进行western印迹分析。通过化学发光探测结合的抗体并放在X射线感光胶片上曝光30s。LacZ(泳道2)和正义大鼠凋亡特异性eIF-5A(泳道4)的表达清晰可见。
如上文所述，用pHM6-正义rF5A(pHM6-全长凋亡特异性eIF-5A)转染COS-7或者进行假转染。转染40h后，通过去血清以诱导凋亡。使用荧光同质胱冬酶试验试剂盒(Roche Diagnostics)来测量转染细胞提取物的胱冬酶溶蛋白活性。也使用FragEL DNA FragmentationApoptosis Detection kit试剂盒(Oncogene)测量DNA片段，该试剂盒将DNA片段暴露的3’-OH末端用标记有荧光的脱氧核苷酸进行标记。
另外的COS-7细胞用pHM6-正义rF5A(pHM6-全长凋亡特异性eIF-5A)转染或假转染。40h后，将细胞在含有血清的正常培养基中培养(无进一步处理)，通过去血清诱导凋亡48h，或者通过用0.5μg/ml的放线菌素D处理48h诱导凋亡。用Hoescht33258对细胞染色(它描绘伴随凋亡的胞核破碎)，或者用膜联蛋白V-Cy3染色(它描绘了伴随凋亡的磷脂酰丝氨酸显现)。也通过荧光显微镜使用绿色滤光片来观察染色细胞，并计算确定发生凋亡的细胞百分比。在可见光下计算细胞群总数目。
如图25，用包含正义方向的全长大鼠凋亡特异性eIF-5A的pHM6瞬时转染COS-7细胞后，增强的胱冬酶酶活性反映了凋亡作用的增强。大鼠凋亡特异性eIF-5A的表达使得胱冬酶酶活提高60％。
如图26，用包含正义方向的全长大鼠凋亡特异性eIF-5A的pHM6瞬时转染COS-7细胞后，DNA破碎程度的提高反映了凋亡作用的增强。大鼠凋亡特异性eIF-5A的表达使得DNA破碎程度提高了273％。如图27，用包含正义方向的全长大鼠凋亡特异性eIF-5A的pHM6瞬时转染COS-7细胞后，通过胞核破碎的增多反映凋亡作用来探测凋亡。大鼠凋亡特异性eIF-5A的表达使得胞核破碎比例增大。如图28，用包含正义方向的全长大鼠凋亡特异性eIF-5A的pHM6瞬时转染COS-7细胞后，胞核破碎的增多反映了凋亡作用的增强。大鼠凋亡特异性eIF-5A的表达使得细胞相比非血清饥饿和血清饥饿对照，胞核破碎分别增强了27％和63％。
如图29，用包含正义方向的全长大鼠凋亡特异性eIF-5A的pHM6瞬时转染COS-7细胞后，通过磷脂酰丝氨酸的显现反映凋亡作用来探测凋亡。如图30，用包含正义方向的全长大鼠凋亡特异性eIF-5A的pHM6瞬时转染COS-7细胞后，磷脂酰丝氨酸显现的增多反映了凋亡作用的增强。大鼠凋亡特异性eIF-5A的表达使得细胞相比非血清饥饿和血清饥饿对照，磷脂酰丝氨酸的显现分别增多了140％和198％。
如图31，用包含正义方向的全长大鼠凋亡特异性eIF-5A的pHM6瞬时转染COS-7细胞后，胞核破碎的增多反映了凋亡作用的增强。大鼠凋亡特异性eIF-5A的表达使得细胞相比未处理和处理样品对照，胞核破碎分别增强了115％和62％。图32描绘了用包含正义方向的全长凋亡特异性eIF-5A的pHM6瞬时转染COS-7细胞后，无进一步处理诱导凋亡的细胞和被进一步处理诱导凋亡的细胞中，凋亡作用提高情况之间的比较。
实施例4本实施例说明了导入凋亡特异性eIF-5A后对凋亡活力的调控。
用pHM6-LacZ、pHM6-正义rF5A(pHM6-全长凋亡特异性eIF-5A)，转染细胞或者假转染，孵育40h。从每个样品提取5μg蛋白，进行SDS-PAGE电泳后转移到PVDF膜上，使用识别Bcl-2的单抗进行western印迹分析。使用与过氧化物酶偶联的兔抗鼠IgG作为二级抗体，通过化学发光探测固定抗体，并放在X射线感光胶片上曝光。结果见图33。相比用pHM6-LacZ转染的细胞，在用pHM6-正义rF5A转染的细胞中探测到更少的Bcl-2；因此说明Bcl-2受到pHM6-正义rF5A的减量调控。
另外，用pHM6-反义3′rF5A(pHM6-反义大鼠凋亡特异性eIF-5A3’UTR)、pHM6-正义rF5A(pHM6-全长凋亡特异性eIF-5A)转染COS-7细胞或者进行假转染。转染40h后，通过去血清诱导凋亡48h。从每个样品提取5μg蛋白，进行SDS-PAGE电泳后转移到PVDF膜上，使用识别Bcl-2的单抗进行western印迹分析。使用与过氧化物酶偶联的兔抗鼠IgG作为二级抗体，通过化学发光探测固定抗体，并放在X射线感光胶片上曝光。
此外，用pHM6-LacZ、pHM6-正义rF5A(pHM6-全长凋亡特异性eIF-5A)，转染COS-7细胞或者假转染，孵育40h。从每个样品提取5μg蛋白，进行SDS-PAGE电泳后转移到PVDF膜上，使用识别p53的单抗进行western印迹分析。使用与碱性磷酸酶偶联的羊抗鼠IgG作为二级抗体，通过比色法探测固定抗体。
最后，用pHM6-LacZ、pHM6-正义rF5A(pHM6-全长凋亡特异性eIF-5A)，转染COS-7细胞或者假转染，孵育40h。从每个样品提取5μg蛋白，进行SDS-PAGE电泳后转移到PVDF膜上，使用识别p53的单抗进行western印迹分析。用抗-[HA]-过氧化物酶探测相应的蛋白印迹，以确定大鼠凋亡特异性eIF-5A的表达水平。使用与碱性磷酸酶偶联的羊抗鼠IgG作为二级抗体，通过化学发光探测固定抗体。
如图33，用包含正义方向的全长凋亡特异性eIF-5A的pHM6瞬时转染COS-7细胞后，Bcl-2受到减量调控。上面为蛋白印迹的考马斯蓝染色；下面为相应的western印迹。相比用pHM6-LacZ转染的细胞，在用pHM6-正义rF5A转染的细胞中探测到更少的Bcl-2。
如图34，用包含反义方向的凋亡特异性eIF-5A 3’末端的pHM6转染COS-7细胞后，Bcl-2受到增量调控。上面为蛋白印迹的考马斯蓝染色；下面为相应的western印迹。相比用pHM6-正义rF5A转染的细胞或假转染细胞，用pHM6-反义3’rF5A转染的细胞中探测到更多的Bcl-2。
如图35，用包含正义方向的全长凋亡特异性eIF-5A的pHM6瞬时转染COS-7细胞后，c-Myc受到增量调控。上面为蛋白印迹的考马斯蓝染色；下面为相应的western印迹。相比用pHM6-LacZ转染的细胞或假转染细胞，在用pHM6-正义rF5A转染的细胞中探测到更高水平的c-Myc。
如图36，用包含正义方向的全长凋亡特异性eIF-5A的pHM6瞬时转染COS-7细胞后，p53受到增量调控。上面为蛋白印迹的考马斯蓝染色；下面为相应的western印迹。相比用pHM6-LacZ转染的细胞或假转染细胞，在用pHM6-正义rF5A转染的细胞中探测到更高水平的p53。
如图37，COS-7细胞中p53的增量调控依赖于pHM6-全长大鼠凋亡特异性eIF-5A的表达。在第一种转染方案的细胞中探测到比第二种转染方案的细胞中更多的大鼠凋亡特异性eIF-5A。用抗-p53抗体进行的western印迹实验，一部分为相应的蛋白考马斯蓝染色，一部分为p53的western印迹结果。在第一种转染方案中，相比用pHM6-LacZ转染的细胞或假转染细胞，在用pHM6-正义rF5A转染的细胞中探测到更高水平的p53。在第二种转染方案中(大鼠凋亡特异性eIF-5A表达更低)，用pHM6-LacZ转染的细胞，用pHM6-正义rF5A和假转染细胞中p53水平没有可探测性差异。
实施例5如图47，在心脏组织上进行实验以模拟人心脏跳动和随后的心脏病发作。图49描述了实验台的安装。在心脏瓣膜置换手术过程中取出一片人心脏组织，勾在电极上。在心脏组织下吊一小重量物，以在测量心脏跳动力量时固定组织。电极对心脏组织加以电流刺激以起始跳动。在诱导缺血之前，测量心脏组织中凋亡特异性eIF-5A和增殖eIF-5A的表达水平。见图46。在缺血前的心脏组织中凋亡特异性eIF-5A和增殖eIF-5A的表达水平都较低，并且两者之间保持相对平衡。这时，通过缓冲液向心脏组织输送氧和二氧化碳，浓度分别为92.5％和7.5％。随后减少氧含量并提高氮含量，以诱导组织缺血，最终引起“心脏病发作”。心脏组织停止跳动。氧含量水平随即恢复正常，在电流刺激下心脏组织又开始跳动。在“心脏病发作”之后，再次测量凋亡特异性eIF-5A和增殖eIF-5A的表达水平。这时凋亡特异性eIF-5A的表达水平显著提高，而增殖eIF-5A表达水平的提高程度则明显低于前者。见图46。
“心脏病发作”之后，心脏组织的跳动力度减弱，从附加重物的紧张/运动程度降低即可看出，因此也说明凋亡特异性eIF-5A的存在迅速杀死了心脏细胞。
EKG结果见图8。左侧为正常心脏跳动情况(缺血前心脏组织)。“心脏病发作”(直线)并且重新起始跳动后，由于肌肉细胞死亡EKG活力降低。EKG结果表明了心脏跳动力度的相对减少量。
实施例6本实施例说明了细胞培养条件。
人筛板和星细胞培养从加拿大眼库安大略分部(Eye Bank of Canada，Ontario Division)获得死亡48h内的人双眼。取出视神经乳头(和附着极(pole))并置于添加有抗生素/抗真菌素、谷氨酰胺和10％FBS的DMEM培养基中(Dulbecco改进的Eagle培养基)3h。从每个组织样本中得到视神经盘(ONH)钮(button)，并用手术剪剪切成四小块。用DMEM培养基在12.5cm2塑料培养瓶中培养组织块。一个月内可观察到组织块生长。一旦细胞达到90％融合，就用胰蛋白酶处理并进行差别传代，以产生筛板(LC)和星细胞群。具体来说，用添加有庆大霉素、谷氨酰胺和10％FBS的DMEM培养基和25cm2培养瓶传代培养LC细胞，而用不含FBS的EBM完全培养基(Clonetics)将星细胞扩展在25cm2培养瓶中。传代10d后向星细胞培养瓶中添加FBS。按照上述方案维持和传代培养细胞。
在8孔培养片上使用差别荧光抗体染色来对通过差别传代进行的细胞群的均一性和细胞群纯度进行鉴定。将细胞固定在10％的福尔马林溶液中并用DPBS液(Dulbecco磷酸缓冲盐溶液)洗涤三次。用含2％脱脂牛奶的DPBS液封阻后，将抗体稀释在含1％BSA的DPBS中，并将此用于8孔片上的6个孔中。剩下的两个孔仅用1％牛血清白蛋白(BSA)溶液处理，不添加一级抗体作为对照。室温下将细胞与一级抗体孵育1h，然后用DPBS洗涤三次。将合适的二级抗体稀释在含1％BSA的DPBS中，然后加入到所有孔中并孵育1h。用DPBS洗涤后，从培养片上出去分隔小孔的格子，然后将培养片浸在双蒸水中并随后风干。在所用玻片上均用Fluoromount(VectorLaboratories)处理，并用22×60mm盖玻片覆盖。
用合适的滤光片在荧光显微镜下观察免疫荧光染色结果，并与未用一级抗体处理的对照孔进行比较。除非特别指出所有一级抗体均从Sigma公司获得。所有二级抗体均购买自Molecular Probes公司。用以鉴别LC细胞的一级抗体为抗I型胶原抗体、抗IV型胶原抗体、抗层粘连蛋白抗体、抗纤粘连蛋白抗体。用以鉴别星细胞的一级抗体为抗半乳糖脑苷脂(Chemicon International)抗体、抗A2B5抗体(Chemicon International)、抗NCAM抗体、抗人血管性血友病因子抗体。在两种细胞都使用的抗体包括抗胶质纤维抗体(GFAP)和抗α平滑肌肌动蛋白抗体。如果细胞群发生抗I型胶原抗体、抗IV型胶原抗体、抗层粘连蛋白抗体、抗纤粘连蛋白抗体和抗α平滑肌肌动蛋白抗体阳性染色，并且发生抗胶质纤维抗体(GFAP)阴性染色，那么认为该细胞群由LC细胞组成。如果细胞群发生抗NCAM抗体、抗胶质纤维抗体(GFAP)阳性染色，并且发生抗半乳糖脑苷脂抗体、抗A2B5抗体、抗人血管性血友病因子抗体和抗人α平滑肌肌动蛋白抗体阴性染色，那么认为该细胞群由星细胞组成。
在预备研究中，使用三对人眼以起始培养。从一个83岁男子、一个17岁男子和26岁女子眼睛的视神经乳头建立LC细胞系，命名为#506、#517和#524。所有细胞系都经过充分鉴定并发现其中LC细胞的含量超过90％。
RKO细胞培养RKO细胞(American Type Culture Collection CRL-2577)是一种表达野生型p53的人结肠癌细胞系。用该细胞系来测试反义寡核苷酸阻抑凋亡特异性eIF-5A表达的能力。用Minimum Essential MediumEagle(MEM)培养基(含非必需氨基酸、Earle’s salts和L-谷氨酰胺)培养RKO细胞。培养基添加有10％胎牛血清(FBS)和100单位的青霉素/链霉素。在37℃下的加湿环境(5％CO2和95％空气)中培养细胞。每3-4d用0.25％胰蛋白酶和1mM EDTA溶液分离贴壁细胞来进行传代。分离的细胞按1∶10到1∶12的分流比分配到含有新鲜培养基的新培养皿中。
HepG2细胞培养HepG2细胞是一种人肝癌细胞系，用它来测试直接针对人凋亡特异性eIF-5A的反义寡核苷酸对在响应IL-1β时产生TNF-α的阻遏能力。用添加有庆大霉素、谷氨酰胺和10％FBS的DMEM培养基在37℃下的加湿环境(5％CO2和95％空气)中培养HepG2细胞。
实施例7
凋亡诱导分别使用放线菌素D(RNA聚合酶抑制物)和喜树碱(拓扑异构酶抑制物)诱导RKO和筛板细胞发生凋亡。放线菌素D的使用浓度为0.25μg/ml，喜树碱的使用浓度为20、40、或50μM。也联合使用喜树碱(50μM)和TNF-α(10ng/ml)诱导筛板细胞发生凋亡。发现联合使用喜树碱和TNF-α的凋亡诱导效率高于单独使用喜树碱或TNF-α的诱导效率。
反义寡核苷酸通过Molecula Research Labs设计并购买了一套(共三种)靶作用于人凋亡特异性eIF-5A的反义寡核苷酸。第一种靶作用于人凋亡特异性eIF-5A的反义寡核苷酸(#1)序列为5’CCT GTC TCG AAG TCCAAG TC3’(SEQ ID NO63)，第二种靶作用于人凋亡特异性eIF-5A的反义寡核苷酸(#2)序列为5′GGA CCT TGG CGT GGC CGT GC3′(SEQ ID NO64)，第三种靶作用于人凋亡特异性eIF-5A的反义寡核苷酸(#3)序列为5’CTC GTA CCT CCC CGC TCT CC3’(SEQ ID NO65)。对照寡核苷酸序列为5′CGT ACC GGT ACG GTT CCA GG3′(SEQ ID NO66)。用异硫氰酸荧光素(FITC)标记反义寡核苷酸(5′GGA CCT TGG CGT GGC CGT GCX3′(SEQ ID NO67)，其中X为FITC标记)，用以监测转染效率。所有反义寡核苷酸都全部硫代磷酸酯化。
反义寡核苷酸转染在RKO细胞中测试凋亡特异性eIF-5A反义寡核苷酸阻抑凋亡eIF-5A蛋白表达的能力。使用转染试剂Oligofectamine(Invitrogen)和反义寡核苷酸转染RKO细胞。在24孔板上加入MEM培养基(添加10％FBS但缺少青霉素/链霉素)，在转染前的24h将细胞加到孔中，每孔157000个。24h后细胞总体上达到约50％融合。用100nM或200nM反义寡核苷酸转染细胞或进行假转染。将0、1.25或2.5μl的20μM反义寡核苷酸稀释在无血清MEM中，终体积为42.5μl，制备足以用于24孔板上一个孔的转染液，混合物在室温下孵育15min。将1.5μl Oligofectamine稀释在6μl无血清MEM中，并在室温下孵育7.5min。5min后，将稀释的Oligofectamine混合物添加到DNA混合物中，并在室温下孵育20min。用无血清MEM洗涤细胞一次，然后添加200μl MEM到细胞中，并用50μl转染液覆盖。将细胞转移回生长室中，保持4h。孵育后添加125μl MEM+30％FBS。然后再培养细胞48h，用0.25μg/ml放线菌素D处理24h，然后收集细胞提取物并进行western印迹分析。
也使用转染试剂Oligofectamine和100n或200nM反义寡核苷酸，按上文转染RKO细胞同样的步骤，测试筛板细胞的转染。但是通过添加反义寡核苷酸(用无血清培养基稀释为1μM到10μM)到细胞中，并随后每24h用稀释有反义寡核苷酸的新鲜含血清培养基替换一次，共进行2-5的，来简便的有效转染筛板细胞。
用标记有FITC的反义寡核苷酸(与凋亡特异性eIF-5A反义寡核苷酸#2(SEQ ID NO64)有相同序列，但在3’末端与FITC偶联)进行转染，以最优化和监测反义寡核苷酸转染的效率。用标记有FITC的反义寡核苷酸在8孔培养片上转染RKO细胞和筛板细胞。48h后用PBS洗涤细胞并用含3.7％氯仿的PBS固定10min。除去孔并添加封片液(Vectashield)，然后盖上盖玻片。使用荧光显微镜和荧光滤光片(Green H546，第48915套滤光片)，在UV光线下观察细胞核，确定摄取了寡核苷酸的细胞的亮绿色荧光。
凋亡探测用反义寡核苷酸转染筛板细胞并用喜树碱诱导凋亡后，确定用对照寡核苷酸或凋亡特异性eIF-5A反义寡核苷酸(SEQ ID NO26)转染的细胞发生凋亡的百分比。用两种方法探测筛板细胞的凋亡-Hoescht染色和DeadEndTMFluorometric TUNEL。Hoescht染色是对胞核染色，用它标记筛板细胞以根据形态学特征(实施例如胞核破碎和凝缩)来鉴别凋亡。将等体积的固定剂(无水甲醇和冰醋酸3∶1的混合物，即用即配)添加到培养片上的细胞培养基中并孵育2min。然后除去并弃去培养基/固定剂混合物，再加入1ml固定剂。5min后除去固定剂，再加入1ml新鲜固定剂孵育5min。除去固定剂并风干细胞4min，然后加入1ml Hoescht染色剂(0.5μg/ml Hoescht33258溶于PBS)。黑暗中孵育10min后，除去染色剂，除去培养片上分开孔的隔板，用去离子水洗涤培养片三次每次1min。洗涤后加入几滴McIlvaine’s缓冲液(0.021M柠檬酸，0.058M Na2HPO4.7H2O；pH5.6)，并盖上盖玻片。使用UV滤光片在荧光显微镜下观察染色细胞。被明亮染色或具有胞核碎片的细胞即作为凋亡细胞而记录。每孔中最少记录了200个细胞。
使用DeadEndTMFluorometric TUNEL(Promega)探测DNA片段(这是鉴定凋亡细胞的特征)。进行Hoescht染色后，用双蒸水粗略洗涤培养片，并进一步将玻片浸于PBS(137mM NaCl，2.68mM KCl，1.47mM KH2PO4，8.1mM Na2HPO4)中以进行清洗，两次每次5min，其间用纸巾吸干玻片。将细胞浸透在0.2％Triton X-100的PBS溶液中5min。然后将细胞浸于PBS中两次每次5min，其间用纸巾吸干玻片。每孔中加入25μl平衡缓冲液(200mM二甲砷酸钾(pH6.6)，25mM Tris-HCl(pH6.6)，0.2mM二硫苏糖醇，0.25mg/ml BSA，2.5mM氯化钴)，并孵育5-10min。平衡过程中为每孔制备30μl反应混合液，将平衡缓冲液、核苷酸混合物(50μM荧光素-12-dUTP、100μM dATP、10mM Tris-HCl(pH7.6)、1mM EDTA)和末端脱氧核苷酸转移酶(Tdt，25U/μl)按45∶5∶1的比例混合。在平衡缓冲液中孵育后，每孔中加入30μl反应混合液并盖上盖玻片。在黑暗中37℃下反应1h。然后将玻片浸在2XSSC(0.3M NaCl、30mM柠檬酸钠，pH7.0)中停止反应。再用PBS洗涤玻片三次每次5min。通过用Kim擦轻拍孔周围来除去PBS，并在每孔中加入一滴封片液(Oncogeneresearch project，JA1750-4ML)，盖上盖玻片。使用UV滤光片(UV-G365，第487902套滤光片)在荧光显微镜下观察细胞，对被Hoescht染色的胞核进行计数。被明亮染色或具有胞核碎片的细胞作为凋亡细胞而记录。使用相同观察视场，用荧光滤光片(Green H546，第48915套滤光片)观察细胞，具有明亮荧光的细胞作为凋亡细胞而记录。荧光滤光片下记录的具有明亮绿色的胞核数目除以在UV滤光片下记录的总胞核数目，得到观察视场中凋亡细胞的百分比。每孔中最少记录200个细胞。
图54-57描绘了这些研究的结果。转染了凋亡特异性eIF-5A的细胞发生凋亡的比例远低于用对照寡核苷酸进行转染的细胞。
蛋白提取和western印迹从转染的RKO细胞中提取蛋白以进行western印迹分析，用PBS洗涤细胞，每孔加入40μl裂解缓冲液(0.5％SDS，1mM二硫苏糖醇，50mM Tris-HCl，pH8.0)。将细胞裂解后的提取物转移到微离心管中，-20℃下保存。根据使用说明书使用Bio-Rad Protein Assay(Bio-Rad)试剂盒对蛋白进行定量。
取5μg总蛋白在12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳，然后将分开的蛋白转移到PVDF膜上。将膜与封阻缓冲液(5％的奶粉溶于PBS中)，然后用0.05％Tween-20/PBS洗涤三次每次15min。将膜保存在PBS-T中，4℃下过夜。第二天再恢复到室温后，用1μg/ml聚乙烯乙醇封阻膜30s。用去离子水漂洗膜5次，然后用5％的牛奶0.025％Tween-20/PBS溶液封阻30min。将一级抗体在5％的牛奶0.025％Tween-20/PBS溶液预孵育30min，然后再与膜进行孵育。
使用若干种一级抗体。识别p53(Ab-6)的单抗(Oncogene)，直接针对合成肽(氨基-CRLPEGDLGKEIEQKYD羧基，SEQ ID NO68，它与人凋亡特异性eIF-5A的C末端同源)的多克隆抗体，从小鸡培养获得(Gallus Immunotech)。也使用抗β-肌动蛋白的抗体(Oncogene)来说明蛋白上样的等量。抗p53的单抗使用稀释度为0.05μg/ml，针对凋亡特异性eIF-5A的使用稀释度为1∶20000。膜与一级抗体孵育60-90min后，用0.05％Tween-20/PBS洗涤三次每次15min。然后将二级抗体稀释在1％的牛奶0.025％Tween-20/PBS溶液中，并与膜孵育60-90min。但使用抗p53(Ab-6)的单抗作为一级抗体时，使用与过氧化物酶偶联的兔抗鼠IgG(Sigma)作为二级抗体，稀释度为1∶5000。与抗肌动蛋白抗体联合使用的二级抗体为与过氧化物酶偶联的羊抗鼠IgM(Calbiochem)，稀释度为1∶5000。与二级抗体孵育后，用PBS-T洗涤膜三次。
使用ECL Plus Western印迹探测试剂盒(Amersham PharmaciaBiotech)来探测与过氧化物酶偶联的固定抗体。简短来说，轻轻吸干膜，然后在黑暗中与试剂A和B的混合液(40∶1)孵育5min。将膜吸干，夹在醋酸纤维膜之间，然后放在X射线感光胶片上曝光，时间为10s-10min。将膜浸在剥离缓冲液(100mM 2-巯基乙醇、2％SDS、62.5mM Tris-HCl，pH6.7)中，并在50℃孵育30min以对膜进行剥离。然后用去离子水漂洗膜，并用大量0.05％Tween-20/PBS洗涤两次每次10min。剥离并再印迹膜3次。
实施例8siRNA的构建直接针对人凋亡特异性eIF-5A的小干涉RNA(siRNA)被用来在RKO细胞和筛板细胞中特异性阻抑凋亡特异性eIF-5A的表达。使用SilencerTMsiRNA Construction Kit试剂盒(Ambion Inc.)通过体外转录制得6种siRNA。其中四种针对人凋亡特异性eIF-5A(siRNAs#1-#4)(SEQ ID NO30-33)，另两种用作对照，试剂盒中提供了直接针对GAPDH的siRNA(siRNA#5)(SEQ ID NO34)，还有一种siRNA具有凋亡特异性eIF-5A siRNA#1(SEQ ID NO30)的反转序列，但是其本身并不靶作用于凋亡特异性eIF-5A。所有siRNA都按照使用说明书进行制备。简短来说，使用编码目的siRNA链的DNA寡核苷酸作为模板，使用T7RNA聚合酶合成siRNA的单独链，然后与T7启动子退火，再用Klenow片段补平。正义链和反义链的转录反应都完成后，联合反应并使两个siRNA链退火，用Dnase和Rnase处理，通过层析柱纯化。用来制备siRNA的DNA寡核苷酸序列为(T7启动子的退火位点用下划线标出)siRNA#1反义5’AAAGGAATGACTTCCAGCTGACCTGTCTC3’(SEQ ID NO69)，siRNA#1正义5’AATCAGCTGGAAGTCATTCCTCCTGTCTC3’(SEQ ID NO70)；siRNA#2反义5’AAGATCGTCGAGATGTCTACTCCTGTCTC3’(SEQ ID NO71)，siRNA#2正义5’AAAGTAGACATCTCGACGATCCCTGTCTC3’(SEQ ID NO72)；siRNA#3反义5’AAGGTCCATCTGGTTGGTATTCCTGTCTC3’(SEQ ID NO73)，siRNA#3s正义5’AAAATACCAACCAGATGGACCCCTGTCTC3’(SEQ ID NO74)；siRNA#4反义5’AAGCTGGACTCCTCCTACACACCTGTCTC3’(SEQ ID NO75)，siRNA#4正义5’AATGTGTAGGAGGAGTCCAGCCCTGTCTC3’(SEQ ID NO76)；siRNA#5反义5’AAAGTCGACCTTCAGTAAGGACCTGTCTC3’(SEQ ID NO77)，siRNA#5正义5’AATCCTTACTGAAGGTCGACTCCTGTCTC3’(SEQ ID NO78)。
使用SilencerTMsiRNA Labeling Kit-FAM(Ambion)试剂盒来用FAM标记GAPDH siRNA，以监测RKO细胞和筛板细胞对siRNA的摄取。在8孔培养片上进行转染之后，用PBS洗涤细胞，并在3.7％的甲醛PBS溶液中固定10min。然后除去固定液并加入封片液(Vectashield)，盖上盖玻片。使用荧光滤光片在荧光显微镜的UV光线下显现对FAM-标记siRNA的摄取。根据使用说明书对GAPDHsiRNA进行标记。
SiRNA转染按照相同步骤使用siRNA转染RKO细胞和筛板细胞。在转染前一天，将RKO细胞接种于8孔培养片(密度为每孔46000个细胞)或24孔板(密度为每孔105000个细胞)上。当筛板细胞融合达到40-70％时，在转染前的第三天将细胞接种在8孔培养片上(密度为每孔7500-10000个细胞)。将25.5pmol siRNA稀释在Opti-Mem(Sigma)中，终体积为21.2μl，如此制备足以在一个孔中使用的转染液。将0.425μl Lipofectamine 2000稀释在Opti-Mem中，终体积为21.2μl，并在室温下孵育7-10min。稀释的Lipofectamine2000混合物被加到稀释的siRNA混合物中，并在室温下共孵育20-30min。用无血清培养基洗涤细胞一次，然后向细胞加入135μl无血清培养基，并用42.4μl转染液覆盖。将细胞放回生长室，培养4h。孵育后，向细胞加入65μl无血清培养基+30％FBS。在24孔板上进行的转染步骤和条件与在8孔培养片上的步骤相同，只是溶液体积相应增加2.3倍。
转染后孵育RKO细胞和筛板细胞72h，然后收集细胞提取物以进行Western印迹分析。为确定针对凋亡特异性eIF-5A的siRNA阻遏凋亡的效率，在转染后的48h或72h用50μM喜树碱(Sigma)和10ng/ml TNF-α(Leinco Technologies)处理筛板细胞以诱导凋亡。24h或48h后对细胞进行Hoescht染色以确定凋亡细胞的比例。
实施例9确定HepG2 TNF-α的生成量将HepG2细胞接种在48孔板上，每孔20000个细胞。72h后除去培养基，并加入含有2.5μM对照反义寡核苷酸或2.5μM凋亡特异性eIF-5A反义寡核苷酸#2的新鲜培养基。24h再加入含有反义寡核苷酸的新鲜培养基。与寡核苷酸共孵育48h后，除去旧培养基，加入含有白介素-1β(IL-1β，1000pg/ml，Leinco Technologies)的新鲜培养基，孵育6h。收集培养基并在-20℃下保存，以用于量化TNF-α。将另外平行孵育的未处理细胞(没有用反义寡核苷酸和IL-1β处理)，和仅用IL-1β处理的细胞作为对照。所有实验均进行两次。通过ELISA(Assay Designs Inc.)根据使用说明书测量释放到培养基中的TNF-α量。
实施例10本实施例说明凋亡特异性eIF-5A反义核苷酸能够抑制凋亡特异性eIF-5A和p53的表达。
用200nM凋亡特异性eIF-5A反义寡核苷酸#1、#2、#3(SEQID NO25，26，27)转染RKO细胞，或进行假转染或不转染。也用100nM凋亡特异性eIF-5A反义寡核苷酸#2(SEQ ID NO26)转染RKO细胞。转染48h后用0.25μg/ml放线菌素D处理细胞。24h后，收集细胞提取物，并将每个样品的5μg蛋白在SDS-PAGE胶上电泳，然后转移到PVDF膜上，并使用抗凋亡特异性eIF-5A的抗体进行Western印迹分析。化学发光探测后，剥离一层膜再用抗p53的抗体进行反应。化学发光检测后，剥离一层膜后再用抗肌动蛋白的抗体进行反应。图52描绘了用反义寡核苷酸1、2和3(针对凋亡特异性eIF-5A，分别是SEQ ID NO25、26、27)转染后的RKO细胞产生蛋白的水平。用凋亡特异性eIF-5A反义寡核苷酸转然后，RKO细胞产生更少的凋亡特异性eIF-5A和更少的p53。
实施例11本实施例说明了凋亡特异性eIF-5A核苷酸能够减少凋亡。
在一个实验中，(A)用100nM FITC-标记的反义寡核苷酸和Oligofectamine转染试剂转染筛板细胞#506，(B)用直接稀释在无血清培养基中的10μM裸FITC-标记的反义寡核苷酸转染筛板细胞#506。24h后，将含有10％FBS和稀释到10μM的新鲜反义寡核苷酸的新鲜培养基加入到细胞中。(A)或(B)处理的细胞总计固定48后，使用荧光滤光片在荧光显微镜UV光线下进行显形。图53描绘了对荧光标记反义寡核苷酸的摄取。
另一实验中，用10μM对照反义寡核苷酸或凋亡特异性eIF-5A反义寡核苷酸#2(SEQ ID NO26)转染筛板细胞#506，共4d。反义寡核苷酸处理后的48h，用20μM或40μM喜树碱处理48h。每天用含有反义寡核苷酸和喜树碱的培养基更换一次。通过Hoescht和TUNEL标记细胞来确定凋亡细胞比例。见图54。
另一实验中，用10μM对照反义寡核苷酸或凋亡特异性eIF-5A反义寡核苷酸#2(SEQ ID NO26)转染筛板细胞#506。24h后，更换培养基并加入新鲜反义寡核苷酸。反义寡核苷酸处理后的48h，除去反义寡核苷酸，用20μM喜树碱处理3d。每天用含有喜树碱的培养基更换一次。通过Hoescht和TUNEL标记细胞来确定凋亡细胞比例。见图55。
另一实验中，用1μM对照反义寡核苷酸或凋亡特异性eIF-5A反义寡核苷酸#2(SEQ ID NO26)转染筛板细胞#517，共5d。反义寡核苷酸处理后的48h，用20μM喜树碱处理3或4d。每天用含有反义寡核苷酸和喜树碱的培养基更换一次。通过Hoescht和TUNEL标记细胞来确定凋亡细胞比例。见图56。
另一实验中，用2.5μM对照反义寡核苷酸或凋亡特异性eIF-5A反义寡核苷酸#2(SEQ ID NO26)转染筛板细胞#517，共5d。反义寡核苷酸处理后的48h，用40μM喜树碱处理3d。每天用含有反义寡核苷酸和喜树碱的培养基更换一次。通过Hoescht和TUNEL标记细胞来确定凋亡细胞比例。见图57。
另一实验中，用1μM或2.5μM对照反义寡核苷酸或凋亡特异性eIF-5A反义寡核苷酸#2(SEQ ID NO26)转染筛板细胞#517，共5d。反义寡核苷酸处理后的48h，用40μM喜树碱处理3或4d。每天用含有反义寡核苷酸和喜树碱的培养基更换一次。通过Hoescht和TUNEL标记细胞来确定凋亡细胞比例。见图58。
另一实验中，用10ng/ml TNF-α或50μM喜树碱处理筛板细胞#517，或用二者同时处理细胞，或者不处理。通过Hoescht和TUNEL标记细胞来确定凋亡细胞比例。见图59。
另一实验中，用2.5μM或5μM对照反义寡核苷酸或凋亡特异性eIF-5A反义寡核苷酸#2(SEQ ID NO26)转染筛板细胞#506和#517，共2d。24h后，加入含有反义寡核苷酸的培养基。反义寡核苷酸处理后的48h，用50μM喜树碱和10ng/ml TNF-α处理2d。通过Hoescht和TUNEL标记细胞来确定凋亡细胞比例。见图60。
另一实验中，用2.5μM对照反义寡核苷酸或凋亡特异性eIF-5A反义寡核苷酸#2(SEQ ID NO26)转染筛板细胞#506、#517和#524，共2d。24h后，加入含有反义寡核苷酸的培养基。反义寡核苷酸处理后的48h，用50μM喜树碱和10ng/ml TNF-α处理2d。通过Hoescht和TUNEL标记细胞来确定凋亡细胞比例。见图61。
实施例12本实施例说明用靶作用于凋亡特异性eIF-5A的siRNA转染多细胞表达更少的凋亡特异性eIF-5A，也说明靶作用于凋亡特异性eIF-5A的siRNA能够减少凋亡。
在一个实验中，用100nM FAM-标记的siRNA和Oligofectamine2000转染试剂转染筛板细胞#517，转染过程中使用血清(A)或不使用血清(B)。(A)或(B)处理的细胞总计固定24h后，使用荧光滤光片在荧光显微镜UV光线下进行显形。见图62。
另一实验中，使用两种对照siRNA(siRNA#5(SEQ ID NO34)，另一种靶作用于GAPDH)和四种靶作用于凋亡特异性eIF-5A的siRNA(siRNA#1-#4)(SEQ ID NO30-33)转染RKO细胞，用量为100nM，转染时有血清存在或无血清存在。转染72h后，收集细胞提取物，取每个样品的5μg蛋白在SDS-PAGE胶上电泳，然后转移到PVDF膜上，并使用抗凋亡特异性eIF-5A的抗体进行Western印迹分析。化学发光探测后，剥离一层膜再用抗bcl-2的抗体再次探测。化学发光探测后使用抗肌动蛋白的抗体再次探测。见图63。
再一实验中，用100nM siRNA转染筛板细胞系#506和#517。使用两种对照siRNA(siRNA#5(SEQ ID NO34)，另一种靶作用于GAPDH)和四种靶作用于凋亡特异性eIF-5A的siRNA(siRNA#1-#4)(SEQ ID NO30-33)进行转染。转染72h后，收集细胞提取物，取每个样品的5μg蛋白在SDS-PAGE胶上电泳，然后转移到PVDF膜上，并使用抗凋亡特异性eIF-5A的抗体进行Western印迹分析。化学发光探测后使用抗肌动蛋白的抗体再次探测。见图64。
还一实验中，用100nM siRNA转染筛板细胞系#506。使用两种对照siRNA(siRNA#5(SEQ ID NO34)，另一种靶作用于GAPDH)和四种靶作用于凋亡特异性eIF-5A的siRNA(siRNA#1-#4)(SEQ IDNO30-33)进行转染。转染48h后，用含有50μM喜树碱和10ng/mlTNF-α的培养基替换原有培养基。24h后，通过Hoescht染色细胞来确定凋亡细胞比例。见图65。
另一实验中，用100nM siRNA转染筛板细胞系#506。使用两种对照siRNA(siRNA#5(SEQ ID NO34)，另一种靶作用于GAPDH)和四种靶作用于凋亡特异性eIF-5A的siRNA(siRNA#1-#4)(SEQ IDNO30-33)进行转染。转染72h后，用含有50μM喜树碱和10ng/mlTNF-α的培养基替换原有培养基。24h后，通过Hoescht染色细胞来确定凋亡细胞比例。见图66。
再一实验中，用100nM siRNA转染筛板细胞系#506，或者不转染。使用两种对照siRNA(siRNA#5(SEQ ID NO34)，另一种靶作用于GAPDH)和四种靶作用于凋亡特异性eIF-5A的siRNA(siRNA#1-#4)(SEQ ID NO30-33)进行转染。转染72h后，用含有50μM喜树碱和10ng/ml TNF-α的培养基替换原有培养基。向未转染未处理细胞中加入新鲜培养基。48h后，通过Hoescht染色细胞来确定凋亡细胞比例。见图67。
用siRNA转染并用喜树碱和TNF-α处理的筛板细胞#506的Hoescht染色照片见图67，实施例13相关见图68。
实施例13本实施例说明是用直接针对凋亡特异性eIF-5A的反义寡核苷酸处理人细胞系会导致细胞生成TNF-α量的减少。
用2.5μM对照反义寡核苷酸或凋亡特异性eIF-5A反义寡核苷酸#2处理HepG2细胞，共2d。72h后除去培养基，并加入含有2.5μM对照反义寡核苷酸或2.5μM凋亡特异性eIF-5A反义寡核苷酸#2的新鲜培养基。24h再加入含有反义寡核苷酸的新鲜培养基。另外的细胞不处理放置2d。处理开始48h后，用含有IL-1β(1000pg/ml)的新鲜培养基处理6h。实验最后收集培养基并在-20℃下保存，以用于量化TNF-α。通过ELISA(Assay Designs Inc.)根据使用说明书测量释放到培养基中的TNF-α量。见图69。用凋亡特异性eIF-5A反义寡核苷酸转染的细胞产生更少的TNF-α。
实施例14用针对凋亡特异性eIF-5A的siRNA或具有相反序列的对照siRNA处理HT-29细胞(人结肠癌细胞)。使用如下siRNA690位(3′UTR)％G/C＝485′AAGCUGGACUCCUCCUACACA3′(SEQ ID NO79)；对照siRNA为％G/C＝395′AAACACAUCCUCCUCAGGUCG3′(SEQ ID NO80)48h后，用干扰素-γ(IFN-γ)处理细胞16h。16h后用新鲜培养基洗涤细胞并用脂多糖(LPS)处理8或24h。在每个时间点(8或24h)除去培养基，冷冻并通过ELISA确定培养基中TNF-α的含量。叶收集细胞裂解产物，确定蛋白含量，并用之调节TNF-α值到pg/mg蛋白(以调整不同孔中细胞数目的差异)。Western印迹结果和ELISA结果见图74A和B。图75描绘了除了细胞密度更高外其它相同的实验结果。
实施例15U-937细胞系的组织培养条件U-937细胞(ATCC编号CRL-1593.2，细胞不是直接来自ATCC)是一种悬浮生长的人单核细胞系，它在PMA的刺激下会变为贴壁并分化为巨噬细胞。在RPMI1640培养基(含有2mM L-谷氨酰胺，1.5g/L碳酸氢钠，4.5g/L葡萄糖，10mM HEPES，1.0mM丙酮酸钠，10％胎牛血清)中，37℃下的CO2(5％)孵育器中维持细胞。每周分流细胞两次(分流比1∶4或1∶5)，细胞密度总保持在每毫升105-2×106细胞之间。在组织培养处理的塑料T-25培养瓶中悬浮培养细胞，实验在24孔板上进行。
进行实验的时间实验开始前两天将细胞密度调节到3×105个细胞/ml培养基。在实验开始的当天收集对数期的细胞。将细胞悬液转移到15ml离心管中并在室温下400xg离心10min。吸出上清液，用新鲜培养基洗涤并重悬细胞沉淀。然后再次400xg离心10min，吸出上清然后最终将细胞沉淀重悬于新鲜培养基中。将等体积的细胞悬液和台盼蓝溶液(0.4％的台盼蓝PBS溶液)混合，并使用血球计和显微镜数出活细胞数量。将细胞稀释到4×105个细胞/ml培养基。
在24孔板的每个孔中加入PMA或DMSO(对照载体)来预处理24孔板。向每个孔中加入1ml细胞悬液，使得每个孔中含有400000个细胞，0.1％DMSO+/-162nM PMA。在37℃、CO2(5％)孵育器中维持细胞。在0、24、48、72、96、99、102h的时间点收集分离孔中的细胞。图76总结了实验时间点和额外时间点。
在72h时更换培养基。因为一些细胞贴壁而其它细胞悬浮，必须小心操作以防止破坏贴壁细胞。将每个孔中的细胞小心转移到相应的微离心管中，然后14,000xg离心3min。吸出上清液，然后用新鲜培养基(1ml，(-)DMSO，(-)PMA)重悬细胞沉淀，然后放回原来的相应孔中。在没有PMA的新鲜培养基中细胞进入静止期。96h时加入LPS(100ng/ml)，并在3h(99h)和6h(102h)后收集细胞。
在时间点上，细胞悬液和培养基被从孔中转移到微离心管中。14,000xg离心3min。将培养基(上清液)转移到干净试管中并保存在-20℃下，以用于ELISA/细胞因子分析。剩余在孔中的细胞用PBS(1ml，37℃)洗涤，并且此P B S也用于洗涤相应微离心管中的细胞沉淀。然后再次14,000xg离心3min。用煮沸的裂解缓冲液(50mM Tris pH7.4+2％SDS)裂解细胞。将每个孔中的贴壁细胞和悬浮细胞混合。煮沸样品并在-20℃下保存。
Western印迹使用BCA(bicinchoninic acid)法用BSA(牛血清白蛋白)作为标准蛋白确定每个细胞样品的蛋白浓度。在SDS-PAGE胶上进行蛋白样品(5μg总蛋白)的电泳然后转移到PVDF膜上。用1μg/ml的聚乙烯乙醇封阻膜30s，再用5％的脱脂牛奶PBS-T溶液封阻1h。用鼠源抗人eIF-5A单抗(BD Biosciences cat#611976；1∶20000于5％脱脂牛奶中)对膜进行探测，反应1h。用PBS-T洗涤膜三次每次10min。二级抗体为与辣根过氧化物酶偶联的抗鼠抗体(Sigma，1∶5000于1％脱脂牛奶中)，反应1h。用PBS-T洗涤膜三次每次10min。通过化学发光使蛋白条带显形(使用ECL探测系统，Amersham PharmaciaBiotech)。
为说明起见，将相同量的蛋白上样在每个泳道中，剥离一层膜并用抗肌动蛋白抗体再次探测。膜被剥离(100mM 2-巯基乙醇，2％SDS，62.5mM Tris-HCl，pH6.7；50℃进行30min)，洗涤，然后如上文所述进行封阻。用抗肌动蛋白抗体作为一级抗体(在小鼠体内制的单抗；Oncogene，Ab-1；1∶20000于5％脱脂牛奶中)与膜反应。如上文所述用二级抗体探测、洗涤。
图77描绘了在单核细胞(U-397)分化和随后的TNF-α分泌过程中，凋亡特异性eIF-5A受到增量调控。
实施例16凋亡特异性eIF-5A阻抑响应干扰素γ时的IL-8生成。
使用针对凋亡特异性eIF-5A的siRNA转染HT-29细胞(人结肠腺癌细胞)。转染约48h后更换培养基，使得一些试验样品培养基含有干扰素γ，而一些试验样品培养基不含有干扰素γ。添加干扰素γ16h后，洗涤细胞，并将含有或不含有TNF-α的培养基加到细胞上。18或24h后收集培养基(用于ELISA探测IL-8)和细胞裂解产物。
如图79和80，在响应TNF-α和干扰素时，都产生IL-8。用干扰素γ处理细胞后再用TNF处理所引起的IL-8生成量高于单独用两者处理引起的生成量。这可能是由于已知的在响应干扰素时，TNF受体1受到增量调控，所以用干扰素处理会使细胞含更多的受体从而更好的响应TNF。针对凋亡特异性eIF-5A的siRNA对只响应TNF时的IL-8生成没有作用(先前的实验)，但是此siRNA几乎阻抑了在响应干扰素时的IL-8的全部生成，也相当程度上阻抑了在响应干扰素和TNF联合处理时的IL-8生成。这些结果说明，通过使用针对凋亡特异性eIF-5A的siRNA，发明者们掌握了通向IL-8的干扰素途径，而不是TNF途径。如图81，western印迹分析结果说明HT-29细胞中在响应干扰素γ时，凋亡特异性eIF-5A受到增量调控(在8h时增加了4倍)。
实施例17人筛板细胞培养从加拿大眼库安大略分部(Eye Bank of Canada，Ontario Division)获得死亡48h内的人双眼。取出视神经乳头(和附着极(pole))并置于添加有抗生素/抗真菌素、谷氨酰胺和10％FBS的DMEM培养基中(Dulbecco改进的Eagle培养基)3h。从每个组织样本中得到视神经盘(ONH)钮(button)，并用手术剪剪切成四小块。用DMEM培养基在12.5cm2塑料培养瓶中培养组织块。一个月内可观察到组织块生长。一旦细胞达到90％融合，就用胰蛋白酶处理并进行差别传代，以产生筛板(LC)和星细胞群。用添加有庆大霉素、谷氨酰胺和10％FBS的DMEM培养基和25cm2培养瓶传代培养LC细胞。按照上述方案维持和传代培养细胞。
在8孔培养片上使用差别荧光抗体染色来对通过差别传代进行的细胞群的均一性和细胞群纯度进行鉴定。将细胞固定在10％的福尔马林溶液中并用DPBS液(Dulbecco磷酸缓冲盐溶液)洗涤三次。用含2％脱脂牛奶的DPBS液封阻后，将抗体稀释在含1％BSA的DPBS中，并将此用于8孔片上的6个孔中。剩下的两个孔仅用1％牛血清白蛋白(BSA)溶液和二级抗体处理，不添加一级抗体作为对照。室温下将细胞与一级抗体孵育1h，然后用DPBS洗涤三次。将合适的二级抗体稀释在含1％BSA的DPBS中，然后加入到所有孔中并孵育1h。用DPBS洗涤后，洗涤培养片并随后风干，用Fluoromount封片液(Vector Laboratories)覆盖。用合适的滤光片在荧光显微镜下观察免疫荧光染色结果，并与未用一级抗体处理的对照孔进行比较。除非特别指出所有一级抗体均从Sigma公司获得。所有二级抗体均购买自Molecular Probes公司。用以鉴别LC细胞的一级抗体为抗I型胶原抗体、抗IV型胶原抗体、抗层粘连蛋白抗体、抗细胞纤粘连蛋白抗体、抗胶质纤维抗体(GFAP)、抗α平滑肌肌动蛋白抗体。如果细胞群发生抗I型胶原抗体、抗IV型胶原抗体、抗层粘连蛋白抗体、抗纤粘连蛋白抗体和抗α平滑肌肌动蛋白抗体阳性染色，并且发生抗胶质纤维抗体(GFAP)阴性染色，那么认为该细胞群由LC细胞组成。在这项研究中，使用两对人眼以起始培养。从一个83岁男子和一个17岁男子眼睛的视神经乳头建立LC细胞系，命名为#506、#517。所有细胞系都经过充分鉴定并发现其中LC细胞的含量超过90％。
对LC细胞的处理联合使用50μM喜树碱(Sigma)和10ng/ml TNF-α(LeincoTechnologies)处理人筛板细胞来诱导凋亡。发现与单独使用两者处理相比，联合使用喜树碱和TNF-α能更有效的诱导凋亡构建siRNA并用之转染使用直接针对人凋亡特异性eIF-5A的小干涉RNA(siRNA)来特异性阻抑筛板细胞中凋亡特异性eIF-5A的表达。使用SilencerTMsiRNA构建试剂盒(Ambion Inc.)通过体外转录制得6种siRNA。其中四种针对人凋亡特异性eIF-5A(siRNA#1-#4)，另两种用作对照(一种是试剂盒中提供的针对GAPDH的siRNA，和siRNA#5，它具有凋亡特异性eIF-5A特异siRNA#1的相反序列但本身并与靶作用于凋亡特异性eIF-5A。根据使用说明书制得siRNA。凋亡特异性eIF-5A和对照siRNA靶具有以下序列siRNA#15’AAAGGAATGACTTCCAGCTGA3’(SEQ ID NO81)；siRNA#25’AAGATCGTCGAGATGTCTACT3’(SEQ IDNO82)；siRNA#35’AAGGTCCATCTGGTTGGTATT3’(SEQ ID NO83)；siRNA#45’AAGCTGGACTCCTCCTACACA3’(SEQ ID NO84)；siRNA#5’AAAGTCGACCTTCAGTAAGGA3’(SEQ ID NO85)。使用LipofectAMINE 2000和siRNA转染筛板细胞。
当筛板细胞融合达到40-70％时，在转染前的第三天将细胞接种在8孔培养片上(密度为每孔7500个细胞)。将25.5pmol siRNA稀释在Opti-Mem(Sigma)中，终体积为21.2μl，如此制备足以在一个孔中使用的转染液。将0.425μl Lipofectamine2000稀释在Opti-Mem中，终体积为21.2μl，并在室温下孵育7-10min。稀释的Lipofectamine2000混合物被加到稀释的siRNA混合物中，并在室温下共孵育20-30min。用无血清培养基洗涤细胞一次，然后向细胞加入135μl无血清培养基，并用42.4μl转染液覆盖。将细胞放回生长室，培养4h。孵育后，向细胞加入65μl无血清培养基+30％FBS。在24孔板上进行的转染步骤(待用于Western印迹分析)和条件与在8孔培养片上的步骤相同，只是溶液体积相应增加2.3倍。转染后孵育筛板细胞72h，然后用50μM喜树碱(Sigma)和10ng/ml TNF-α(LeincoTechnologies)处理义诱导凋亡。然后收集细胞裂解物以进行Western印迹分析，或检测细胞以确定凋亡情况。
凋亡细胞探测转染细胞经TNF-α和喜树碱处理24h后，使用Hoescht3358进行染色以确定发生凋亡细胞的百分比。简短来说，用无水甲醇和冰醋酸的混合物(3∶1)固定细胞，然后与Hoescht染色液(0.5μg/mlHoescht33258溶于PBS)在黑暗中孵育。10min后除去染色液，然后除去培养片上分开孔的隔板，用去离子水洗涤培养片三次每次1min。然后向细胞加入几滴1ml McIlvaine′s缓冲液(0.021M柠檬酸、0.058M Na2HPO4.7H2O，pH5.6)，盖上盖玻片。使用UV滤光片在荧光显微镜下观察染色细胞。被明亮染色或具有核破碎片段的细胞作为凋亡细胞而记录。也使用DeadEndTMFluorometric TUNEL(Promega)探测DNA片段(这是鉴定凋亡细胞的特征)。进行Hoescht染色后，用双蒸水粗略洗涤培养片，并进一步将玻片浸于PBS(137mMNaCl，2.68mM KCl，1.47mM KH2PO4，8.1mM Na2HPO4)中以进行清洗，两次每次5min，其间用纸巾吸干玻片。将细胞浸透在0.2％TritonX-100的PBS溶液中5min。然后将细胞浸于PBS中两次每次5min，其间用纸巾吸干玻片。每孔中加入25μl平衡缓冲液(200mM二甲砷酸钾(pH 6.6)，25mM Tris-HCl(pH6.6)，0.2mM二硫苏糖醇，0.25mg/ml BSA，2.5mM氯化钴)，并孵育5-10min。平衡过程中为每孔制备30μl反应混合液，将平衡缓冲液、核苷酸混合物(50μM荧光素-12-dUTP、100μM dATP、10mM Tris-HCl(pH7.6)、1mM EDTA)和末端脱氧核苷酸转移酶(Tdt，25U/μl)按45∶5∶1的比例混合。在平衡缓冲液中孵育后，每孔中加入30μl反应混合液并盖上盖玻片。在黑暗中37℃下反应1h。然后将玻片浸在2X SSC(0.3M NaCl、30mM柠檬酸钠，pH 7.0)中孵育15min停止反应。再用PBS浸没玻片三次每次5min。通过用Kim擦轻拍孔周围来除去PBS，并在每孔中加入一滴封片液(Oncogene research project，JA1750-4ML)，盖上盖玻片。使用UV滤光片(UV-G365，第487902套滤光片)在荧光显微镜下观察细胞，对被Hoescht染色的胞核进行计数。被明亮染色或具有胞核碎片的细胞作为凋亡细胞而记录。使用相同观察视场，用荧光滤光片(Green H546，第48915套滤光片)观察细胞，具有明亮荧光的细胞作为凋亡细胞而记录。荧光滤光片下记录的具有明亮绿色的胞核数目除以在UV滤光片下记录的总胞核数目，得到观察视场中凋亡细胞的百分比。每孔中最少记录200个细胞。
蛋白提取和Western印迹分析从生长于24孔板上的筛板细胞中提取蛋白以进行Western印迹，首先用PBS(8g/L NaCl，0.2g/L KCl，1.44g/L Na2HPO4，0.24g/LKH2PO4)洗涤细胞两次，然后加入50μl裂解缓冲液(2％SDS，50mM Tris-HCl，pH 7.4)。将细胞溶出物收集在微离心管中，煮沸5min，然后在-20℃下储存。使用Bicinchoninic Acid Kit(BCA；Sigma)试剂盒确定蛋白浓度。为进行Western印迹，将5μg的总蛋白在12％SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳。将分开的蛋白转移到PVDF膜上。将膜与封阻溶液(5％去脂奶粉、0.02％叠氮化钠的PBS溶液)孵育1h，然后用PBS-T(PBS+0.05％Tween-20)洗涤三次共15min。将膜保存在PBS-T溶液中，4℃过夜。第二天在膜恢复到室温后，用1μg/ml聚乙烯乙醇封阻30s。用去离子水漂洗膜5次，然后用5％牛奶PBS溶液封阻30min。将一级抗体在5％的牛奶PBS溶液中预孵育30min，然后与膜共孵育。使用的一级抗体为抗eIF-5A抗体(BD TransductionLaboratories，稀释度1∶120000)和抗β-肌动蛋白抗体(Oncogene)。用PBS-T溶液洗涤三次共15min。然后将合适的偶联有HRP的二级抗体稀释在1％牛奶PBS溶液中，并与膜共孵育1h。洗涤印迹，并用ECL Plus Western印迹探测试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech)来探测与过氧化物酶偶联的固定抗体。
实验结果从男性捐赠人(年级为83岁和17岁)的视神经乳头建立两个筛板细胞系(LC)(分别为#506和#507)。从人筛板分离的细胞与其它研究中发现的突出的胞核具有相同的大小(broad)和扁平(flat)的形态特征(Lambert et al.，2001)。与其它研究分组一样，LC细胞表现出对α平滑肌肌动蛋白具有免疫反应活性(图82a)，也对许多种胞外基质蛋白(包括细胞纤粘连蛋白(图82b)、层粘连蛋白(图82c)、胶原蛋白I、胶原蛋白IV)具有免疫反应活性(数据未列出)(Clark et al.，1995；Hernandez et al.，1998；Hernandez and Yang，2000；Lambert et al.；2001)。LC细胞对胶质纤维酸性蛋白(GFAP)具有阴性免疫反应活性，这一发现与以往发现一致(图82d)(Lambert et al.，2001)。这些发现证明可将这些分离细胞鉴别为LC细胞，而不是视神经乳头星细胞。
因为相信TNF-α在青光眼发病中起重要作用，所以检测LC细胞对TNF-α的细胞毒素效果的敏感性。用喜树碱、TNF-α处理融合的LC细胞，或联合使用喜树碱和TNF-α进行处理(均为48h，图83d)。通过Hoescht染色发现单独用TNF-α处理对LC细胞不产生细胞毒性。用喜树碱处理大约引起30％的LC细胞死亡。但是发现联合使用喜树碱和TNF-α处理LC细胞会有互相促进的效果，48h内有45％的LC细胞死亡。这些结果说明但首先用喜树碱引起凋亡后，LC细胞能够响应TNF-α的细胞毒素作用。
已知eIF-5A是一种核-质穿梭蛋白，为细胞分裂所必需，最近也发现它参与凋亡过程。通过喜树碱处理或者连用喜树碱和TNF-α处理诱导LC细胞发生凋亡，这些细胞表达凋亡特异性eIF-5A蛋白。再用喜树碱处理细胞时，凋亡特异性eIF-5A的表达没有明显变化，也许会稍微降低(图84A)。但是当用喜树碱和TNF-α联合处理8h或24h后，凋亡特异性eIF-5A蛋白的表达受到明显的增量调控(图84B)。这些结果说明凋亡特异性eIF-5A的表达被TNF-α所特异性诱导，并且与凋亡诱导相关。这指出，凋亡特异性eIF-5A在凋亡途径下游中扮演了TNF-α结合受体的角色。
为了检测凋亡特异性eIF-5A表达在TNF-α诱导的LC细胞凋亡过程中的重要性，设计并通过体外转录合成了一系列靶作用于凋亡特异性eIF-5A的siRNA(siRNAs#1-#4)(SEQ ID NO81-84)。为确定这些siRNA在阻抑凋亡特异性eIF-5A蛋白表达上的效率，用每种siRNA转染LC细胞系#506和#517，并在72h后检测了细胞裂解物中的凋亡特异性eIF-5A蛋白表达量(图85)。为进行比较，也用针对GAPDH的siRNA和/或对照siRNA(siRNA#5)(SEQ ID NO85)(它与siRNA#1具有相同化学成分但不识别凋亡特异性eIF-5A)转染细胞。所有直接针对凋亡特异性eIF-5A的siRNA都能够在两个LC细胞系中显著阻抑凋亡特异性eIF-5A的表达(图85)。因为GAPDHsiRNA不像siRNA#5那样只是具有相反序列而并没有细胞作用靶，它是一种活性siRNA并能够阻抑其靶蛋白的表达(GAPDH，数据未列出)。所有4种针对凋亡特异性eIF-5A的siRNA也都能够保护转染的LC细胞(#506)，在联合使用TNF-α和喜树碱处理24h时，不发生它们所引起的凋亡(图86)。通过Hoescht染色发现，前4种siRNA降低凋亡发生的程度为，59％(siRNA#1)(SEQ ID81)，35％(siRNA#2)(SEQ ID NO82)，50％(siRNA#3)(SEQ ID NO83)，69％(siRNA#4)(SEQ ID NO.84)。有趣的是针对GAPDH的siRNA也将LC细胞的凋亡发生降低了42％(图86)。已知GAPDH在其糖酵解酶的角色之外，还有其它细胞功能，包括推断的在小脑神经元凋亡过程的作用(Ishitani and Chuang，1996；Ishitani et al.，1996a；Ishitani et al.，1996b)。在相似的实验中，我们也发现siRNA#1(SEQ ID NO81)能够将LC细胞系#517在响应TNF-α和喜树碱时的凋亡发生降低53％。这说明凋亡特异性eIF-5A siRNA对分离自不同视神经乳头的LC细胞具有保护作用(图87)。这些结果说明凋亡特异性eIF-5A在凋亡过程中确实发挥作用，并且可能是LC细胞中通向TNF-α-诱导凋亡的途径中的重要调节物。
使用末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端原位标记法(TUNEL)，确认被喜树碱和TNF-α处理的LC细胞确实是通过凋亡途径死亡。用凋亡特异性eIF-5A siRNA(siRNA#1)(SEQ IDNO81)或对照siRNA(siRNA#5)(SEQ ID NO85)转染LC细胞系(#506)，3d后再用喜树碱和TNF-α处理处理24h。也对这些细胞进行Hoescht染色以促进胞核显形。用对照siRNA转染的LC细胞中有46％为TUNEL染色阳性，而用凋亡特异性eIF-5A siRNA#1(SEQID NO81)转染的细胞仅有8％为阳性标记，这说明凋亡特异性eIF-5AsiRNA提供的针对凋亡的保护作用比对照高80％(图88)。凋亡特异性eIF-5A siRNA#4所的结果与此相似，提供的针对凋亡的保护作用比对照高80％(数据未列出)。
实施例18收集血液并制备PBMC使用含有柠檬酸钠(作为抗凝血剂)的采血管通过静脉穿刺(venapuncture)从每个健康捐赠者处各收集约10ml血液，在收集后的24h内进行处理。
向15ml圆锥试管中加入60％SIP溶液(Percoll和1.5M NaCl按体积比9∶1混合制成)沉在底部，然后加入血液使血液层覆盖在Percoll层之上，确保只有最低程度的混合发生。然后1000xg离心30min，在起始和最后的5min内要缓慢加速/减速。除去最上层的纯血清，收集下方的白色PBMC层(1-2ml)。然后逐滴加入10m温热RPMI+15％FBS溶液，PBCM沉淀下来并对其进行计数。
在一个时间段内刺激PBMC以诱导细胞因子生成分离PBCM并接种在培养板上，密度为每孔2×105to5×105个细胞。用佛波酯(佛波醇12-豆蔻酸酯13-乙酸酯)(PMA，每孔100ng)处理细胞。此后的第72h用不含任何刺激因子的培养基替换原有培养基。然后在第96h向板上加入脂多糖(LPS，每孔100ng，来自大肠杆菌，血清型0111)。在加入脂多糖(第96h)之前收集样品，同时在不同阶段中每次加入试剂后也收集样品，如图91所示。贴壁细胞(可能是单核细胞或巨噬细胞)和悬浮细胞(可能是淋巴细胞)都被收集。为分析样品的细胞因子分泌，将每个样品的培养基转移到干净的微离心管中，13000xg离心3min，使得上清液无任何残渣存在。收集沉淀并与贴壁细胞混合。将培养基分装为200-250μl一份，然后保存在-20℃下。用37℃的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞，并用煮沸的裂解缓冲液(50mM Tris pH7，2％SDS，每孔加100μl)裂解细胞。煮沸细胞裂解物并保存在-20℃下。Western印迹分析结果见图92，相应ELISA结果见图93。
进行PBMC刺激以诱导凋亡特异性eIF-5A表达收集PBCM并接种在培养板上，密度为每孔2×105to5×105个细胞。为确定那种刺激诱导凋亡特异性eIF-5A，也为了确定它们是否有协同作用，用植物凝集素(PHA，100ng/ml)、佛波酯(佛波醇12-豆蔻酸酯13-乙酸酯)(PMA，100ng/ml)、脂多糖(LPS，100ng/ml)处理细胞，或同时用三者处理细胞(均为100ng/ml)。刺激12或36h后收集样品并分析凋亡特异性eIF-5A表达(图94)。
PBMC转染在制备PBMC的当天即对其进行转染。接种细胞，密度为每孔2×105-5×105个细胞(24孔板上，每孔150μl以进行转染)。在板上进行单独转染(77、78和79号捐赠者，图95和96)或者在接种到板上之前在锥形管中同时转染(80和84号捐赠者，图96)。将15pmol siRNA稀释在50μl Opti-MEM(Sigma)中。将1μl Lipofectamine 2000(Invitrogen)稀释在49μl Opti-MEM中，孵育7-10min，然后加到稀释的siRNA溶液中孵育25min，即制得一个孔用量的转染液。将转染液覆盖在细胞上，并置于37℃生长室中4h。终转染液含有9％的血清。孵育后，向细胞加入50μl无血清RPMI+21％FBS溶液，以使终血清浓度达到15％。
转染后刺激PBMC以诱导细胞因子生成如上文所述转染72h后，含有脂多糖(LPS，每孔100ng，来自大肠杆菌，血清型0111)的500μl培养基被加到细胞上。刺激后的第24h收集样品。用LPS处理孔中和仅进行转染孔(即无刺激)中的细胞均被收集。为收集用于细胞因子分泌分析的样品，将每个样品的培养基转移到干净的微离心管中，13000xg离心3min，使得上清液无任何残渣存在。收集沉淀并与贴壁细胞混合。将培养基分装为200-250μl一份，然后保存在-20℃下。用1ml 37℃的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞，并用煮沸的裂解缓冲液(50mM Tris pH7，2％SDS，每孔加100μl)裂解细胞。煮沸细胞裂解物并保存在-20℃下，以进行BCA蛋白定量。
实施例19细胞培养在含有10％胎牛血清(FBS)的RPMI培养基中维持HT-29细胞系，一种人结肠腺癌细胞系。用同样培养基悬浮培养U937细胞系，一种人组织细胞性淋巴瘤细胞系。两种细胞系均在37℃、5％CO2加湿环境中维持。在U937细胞实验中，在实验开始前的两天将细胞密度调节为3×105个细胞/ml。在实验到第一天收集细胞并400xg离心10min，然后用含有10％胎牛血清(FBS)的RPMI培养基重悬细胞，再次离心，然后用不含FBS的RPMI培养基重悬细胞。对细胞进行计数，并调节到2×106个细胞/ml。
siRNA根据人凋亡特异性eIF-5A设计siRNA序列并在Dharmacon RNATechnologies处合成。凋亡特异性eIF-5A siRNA(h5A1)靶序列为5’NNGCUGGACUCCUCCUACACA3’(SEQ ID NO_)，相应的双链siRNA序列为5’GCUGGACUCCUCCUACACAdTdT3’，(SEQ ID NO_)3’dTdTCGACCUGAGGAGGAUGUGU5’(SEQ ID NO_)。
对照siRNA(hcontrol)序列为5’NNACACAUCCUCCUCAGGUCG3’(SEQ ID NO_)。
相应的双链siRNA序列为5’ACACAUCCUCCUCAGGUCGdTdT3’(SEQ ID NO_)3’dTdTUGUGUAGGAGGAGUCCAGC5’(SEQ IDNO_)。
HT-29细胞转染转染前一天在24孔板上接种细胞，密度为每孔105000个细胞。将25.5pmol siRNA稀释在50μl Opti-MEM(Sigma)中。将1μlLipofectamine 2000(Invitrogen)稀释在49μl Opti-MEM中，孵育7-10min，然后加到稀释的siRNA溶液中孵育25min，即制得一个孔用量的转染液。用无血清RPMI洗涤细胞一次，然后向细胞加入300μl无血清RPMI，并覆盖上100μ转染液。再置于37℃生长室中4h。孵育后，向细胞加入300μl无血清RPMI+30％FBS溶液。
U937细胞电穿孔将凋亡特异性eIF-5A siRNA和对照siRNA稀释在Opti-Mem培养基(Sigma)中。将400μl细胞(800000个细胞)和100pmol siRNA混合在0.4mm电穿孔杯中。使用ECM830 Electrosquare porator(BTX，San Diego，CA)，300V、10mSec、一次脉冲进行电穿孔。随后轻轻混合细胞并加到含有RPMI和浓缩FBS的孔中，以使得FBS终浓度达到10％。
处理HT-29细胞根据Suzuki等人发展的方法(Suzuki et al.2003)在HT-29细胞中诱导TNF-α生成。转染48h后用200U/ml的干扰素γ(Roche Diagnostics)处理HT-29细胞。16h后用培养基洗涤细胞并加入脂多糖(LPS，100ng/ml，来自大肠杆菌，血清型0111Sigma)使得浓度为100μg/ml。LPS刺激8或24h后，将每个孔的培养基转移到微离心管中，在进行TNFα的ELISA试验前保存在-20℃下。用1ml 37℃的磷酸盐缓冲液洗涤细胞，并在煮沸的裂解缓冲液(50mM Tris pH7，2％SDS)中进行裂解。煮沸细胞裂解物并保存在-20℃下。用bicinchoninic acid方法(BCA)并使用牛血清白蛋白作为标准蛋白确定细胞裂解物中的蛋白浓度。
通过用IFNγ处理HT-29细胞来诱导IL-8的生成。转染48h后用200U/ml的干扰素γ处理HT-29细胞。24h后将每个孔的培养基转移到微离心管中，在进行IL-8的液相电化学发光(ECL)试验前保存在-20℃下。用1ml 37℃的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞，并在煮沸的裂解缓冲液(50mM Tris pH7，2％SDS)中进行裂解。煮沸细胞裂解物并保存在-20℃下。用二辛可宁酸(bicinchoninic acid)法(BCA)并使用牛血清白蛋白作为标准蛋白确定细胞裂解物中的蛋白浓度。
U937细胞分化的诱导电穿孔16h后收集U937细胞并计数，然后接种到24孔板上(密度为每孔接入1ml，含有200000个细胞)。通过加入佛波酯(佛波醇12-豆蔻酸酯13-乙酸酯)(PMA；100ng/ml)来刺激巨噬细胞分化。48h后，超过80％的单核细胞已从悬浮(单核细胞)变化成贴壁状态(巨噬细胞)。在第48h除去培养基和任何非贴壁细胞，并加入新鲜含10％FBS的RPMI培养基(每孔1ml)。然后静置新鲜培养基中的细胞24h，以使其进入静止期。
刺激U937细胞产生细胞因子向U937细胞加入PMA72h后，向孔中加入脂多糖(LPS，每孔100ng，来自大肠杆菌，血清型0111)或加入干扰素γ(IFNγ；100U/ml)，或同时加入两者。在加入刺激之前(72h)收集样品，同时在不同阶段中每次加入试剂后也收集样品，如图108所示。为分析样品的细胞因子分泌，将每个样品的培养基转移到干净的微离心管中，13000xg离心3min，使得上清液无任何残渣存在。收集沉淀并与贴壁细胞混合。将培养基分装为200-250μl一份，然后保存在-20℃下。用37℃的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞，并用煮沸的裂解缓冲液(50mM Tris pH7，2％SDS，每孔加75μl)裂解细胞。来自相似孔的裂解物被合并，煮沸细胞裂解物并保存在-20℃下。
定量细胞因子所有样品保存在-20℃下。使用Assay Designs的ELISA试剂盒并使用其中附带的0-250pg/ml TNFα作为标准蛋白按照使用说明书定量TNFα。为进行U937的TNFα实验，将样品培养基用RPMI+10％FBS溶液稀释20倍(0h，3h LPS)或80倍(6h，24h，30h LPS)。使用液相电化学发光(ECL)法定量IL-1β、IL-8和IL-6。而HT-29实验中的培养基不被稀释。根据每孔细胞蛋白总量(mg)校正所有细胞因子测量结果。
使用液相电化学发光(ECL)法定量IL-1β、IL-8和IL-6。简短来说，用生物素(Igen，Inc.，Gaithersburg，MD)标记纯化的鼠抗-鼠抗-人IL-8、IL-6或IL-1β(R&D Systems)单克隆抗体。另外按照使用说明书用钌(Igen)标记羊抗-人IL-8、IL-6或IL-1β抗体(R&D)。用PBS(含有0.25％BSA、0.5％Tween-20、0.01％叠氮化物、pH7.4，(ECL buffer))稀释生物素标记的抗体，终浓度达到1mg/ml。在每个实验试管中，将25ml生物素酰化的抗体与25ml 1mg/ml的用链霉抗生物素包被的磁性小珠(Dynal Corp.，Lake Success，NY)溶液通过强烈搅拌在室温下共孵育30min。向试管中加入已在RPMI中稀释的待测样品(25mL)或标准品，然后加入25ml用钌标记的抗体(终浓度1mg/mL，稀释在ECL缓冲液中)。然后振荡试管2h。通过向每只试管加入200ml PBS来停止反应，并使用Origen Analyzer(Igen)确定化学发光量。
SDS-PAGE和Western印迹使用BCA法和牛血清白蛋白作为标准蛋白来确定细胞裂解物中的蛋白浓度。取5μg细胞总蛋白在10％或14％SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)上电泳。用10％的凝胶分析分子量大于50kDa的蛋白(TLR4、IFNγ、TNF-R1、iNOS)，而14％的凝胶用于分析凋亡特异性eIF-5A蛋白(17kDa)。使用半干转移单位将凝胶上的蛋白转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上(转移缓冲液48mMTris、39mM甘氨酸、1.3mM SDS，pH9.2；15V进行18min)。用5％的脱脂牛奶PBS-T(含0.1％Tween20)溶液封阻1h。在封阻溶液中稀释一级抗体，并在室温下与所有印迹通过摇动进行孵育。使用的一级抗体为抗凋亡特异性eIF-5A抗体(BD Biosciences；稀释度1∶20000；孵育1h。它识别凋亡特异性eIF-5A和eIF5-A2)，TLR4抗体(Santa Cruz Biotechnology Inc；TLR4(H-80)sc-10741；稀释度1∶1000；孵育2h)，IFN-γRα抗体(Santa Cruz Biotechnology Inc；IFN-γRα(C-20)sc-700；稀释度1∶1000；孵育1h)，TNF-R1抗体(SantaCruz Biotechnology Inc；TNF-R1(H-5)sc-8436；1∶200；incubate3hours)，iNOS(BD Transduction Laboratories610431；稀释度1∶10000；孵育1h)和抗β-肌动蛋白抗体(Oncogene；actin(Ab-1)；稀释度1∶20,000；孵育1h)。加入一级抗体并孵育后，用PBS-T洗涤印迹三次每次5-10min。将辣根过氧化物酶(HRP)二级抗体稀释在1％脱脂牛奶中，与膜孵育反应1h。所用的二级抗体为抗鼠IgG-HRP(Sigma；稀释度1∶5000；识别凋亡特异性eIF-5A和TNF-R1)，抗兔IgG-HRP(Amersham Pharmacia Biotech；稀释度1∶2500；识别TLR4和IFNγ-Rα)，抗鼠IgM-HRP(Calbiochem；稀释度1∶5000；识别肌动蛋白)。与二级抗体孵育后用PBS-T洗涤印迹四次每次5-10min。按照使用说明书使用增强的化学发光探测试剂(ECL；Amersham PharmaciaBiotech)促进印迹，并放在X射线感光胶片上曝光(Fuji)。
RT-PCR根据文献(Medvedev et al.2002)所述进行RT-PCR，以观察转染的HT-29细胞在响应IFNγ时TLR4 mRNA表达的变化。使用GAPDH表达作为对照，以表明在样品中使用了同等量的cDNA。增加PCR循环次数以确定最优的循环数目，从而在非饱和条件下得到可探测扩增产物。通过溴化乙锭染色和琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。从用siRNA转染的HT-29细胞(用IFNγ处理6h或未处理)中分离总mRNA并进行RT-PCR，以探测TLR4和GAPDH转录。按上文所述用siRNA转染HT-29细胞。转染48h后，用200U/ml的IFNγ处理细胞，对照细胞不进行处理，仅更换培养基。使用GenElute MammalianRNA miniprep kit(Sigma)试剂盒按照使用说明书从贴壁细胞中分离总mRNA。除去培养基并用温热PBS洗涤两次。向细胞中加入裂解缓冲液，将细胞裂解物转移到微离心管中，然后按照使用说明书分离总mRNA。
扩增TLR4(NM_003266)所用引物为正向5’CGGATGGCAACATTTAGAATTAGT3’(SEQ ID NO_)反向5’TGATTGAGACTGTAATCAAGAACC3’(SEQ IDNO_)。预计扩增片段长674bp。
扩增GAPDH(BC023632)所用引物为正向5’CTGATGCCCCCATGTTCGTCAT3’(SEQ ID NO_)反向5’CCACCACCCTGTTGCTGTAG3’(SEQ ID NO_)预计扩增片段长599bp。
RT-PCR反应条件如下混合以下物质，RNA2.5μgPoly(T)引物6.25μl添加Depc水到总体积为 13.75μl70℃加热5min，然后在冰上冷却5min。
向上述混合物中加入，5X AMV缓冲液 5.0μldNTPs(10mM)2.5μlRnase抑制物1.25μlAMV RT 2.5μl42℃加热60min，70℃加热10min。
单次PCR反应体系条件为10X Tsg缓冲液 2.0μldNTP(10mM) 0.4μl正向引物(25pmol/μl) 0.4μl反向引物(25pmol/μl) 0.4μl
MgCl2(15mM)2.0μlcDNA 0.8μlH2O13.88μlTsg聚合酶 0.12μlTLR4的PCR条件为加热到95℃ 5min，20、25、30或35个循环95℃ 1min55℃ 1min72℃ 2min最后72℃延伸10min，冷却到4℃。
GAPDH的PCR条件为加热到95℃ 5min，20、25、30或35个循环95℃ 1min57℃ 1min72℃ 2min最后72℃延伸10min，冷却到4℃。
实施例20NFκB分析的材料与方法本实验的结果说明用针对凋亡特异性eIF-5A的siRNA转染HT-29细胞，并用IFN-γ和LPS处理后，NFκB p50的活化作用降低并且TNF-α生成减少。见图120。
培养使用RPMI加10％FBS在37℃、5％CO2加湿环境中维持HT-29细胞系(一种人结肠腺癌细胞系)。
转染在转染前一天将HT-29细胞接种在6孔板上，每孔500000个细胞。将155pmol siRNA稀释在240μl Opti-Mem(Sigma)中，即为用于一个孔的转染量。将4.8μl Lipofectamine 2000(Invitrogen)稀释在240μl Opti-Mem中并孵育7-10min，然后将此溶液添加到稀释的siRNA中并孵育25min。用无血清RPMI洗涤待转染细胞一次，然后向细胞中加入1400μl无血清RPMI并用480μl转染液覆盖。将细胞置回生长室4h。孵育后向细胞加入720μl无血清RPMI加30％FBS。转染24h后向细胞中加入新鲜培养基。
细胞处理转染48h后用200U/ml的干扰素γ(Roche Diagnostics)处理HT-29细胞。并更换所有剩余孔中的培养基。加入干扰素γ16h后用TNF-α(20ng/ml；Leinco Technologies Inc.，St.Louis，MO)或脂多糖(LPS，100ng/ml，来自大肠杆菌，血清型0111；Sigma)处理细胞，或者用培养基假处理以作为对照。准备仅用干扰素γ处理的细胞在用干扰素γ处理过夜，并在16h后添加含有新鲜干扰素γ的培养基。
核提取和NFκB转录因子分析在用不同刺激处理1h后，从细胞中提取并收集核蛋白以用于测量NFκB活性。使用TransAM Nuclear Extract Kit(Active Motif，Carlsbad，CA)试剂盒按照使用说明书提取胞核。取20μg核提取物，使用TransAM NFκB Family Transcription Factor Assay Kit(ActiveMotif，Carlsbad，CA)试剂盒按照使用说明书测量NFκB p50亚基的DNA结合能力。
序列表<110>SENESCO TECHNOLOGIES，INC.
<120>凋亡特异性eIF-5A siRNA和反义多核苷酸在抑制/阻抑炎症反应中的用途<130>10799.173<140>PCT/US2005/025766<141>2005-07-20<150>60/589，073<151>2004-07-20<160>85<170>PatentIn Ver.3.2<210>1<211>1139<212>DNA<213>人鼠种(Rattus sp.)<220>
<221>CDS<222>(33)..(494)<400>1caggtctaga gttggaatcg aagcctctta aa atg gca gat gat ttg gac ttc53Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe1 5gag aca gga gat gca ggg gcc tca gcc acc ttc cca atg cag tgc tca101Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala Thr Phe Pro Met Gln Cys Ser10 15 20gca tta cgt aag aat ggt ttt gtg gtg ctc aag ggc cgg cca tgt aag149Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys25 30 35atc gtc gag atg tct act tcg aag act ggc aag cat ggc cat gcc aag197Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys40 45 50 55gtc cat ctg gtt ggt att gat att ttt act ggg aag aaa tat gaa gat245Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp60 65 70atc tgc ccg tcg act cat aac atg gat gtc ccc aac atc aaa agg aat293
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<213>人(Homo sapiens)<400>4atggcagacg aaattgattt cactactgga gatgccgggg cttccagcac ttaccctatg60cagtgctcgg ccttgcgcaa aaacggcttc gtggtgctca aaggacgacc atgcaaaata120gtggagatgt caacttccaa aactggaaag catggtcatg ccaaggttca ccttgttgga180attgatattt tcacgggcaa aaaatatgaa gatatttgtc cttctactca caacatggat240gttccaaata ttaagagaaa tgattatcaa ctgatatgca ttcaagatgg ttacctttcc300ctgctgacag aaactggtga agttcgtgag gatcttaaac tgccagaagg tgaactaggc360aaagaaatag agggaaaata caatgcaggt gaagatgtac aggtgtctgt catgtgtgca420atgagtgaag aatatgctgt agccataaaa ccctgcaaat 460<210>5<211>462<212>DNA<213>大鼠种(Rattus sp.)<400>5atggcagatg atttggactt cgagacagga gatgcagggg cctcagccac cttcccaatg60cagtgctcag cattacgtaa gaatggtttt gtggtgctca aaggccggcc atgtaagatc120gtcgagatgt ctacttcgaa gactggcaag catggccatg ccaaggtcca tctggttggc180attgacattt ttactgggaa gaaatatgaa gatatctgcc cgtcgactca taatatggat240gtccccaaca tcaaacggaa tgacttccag ctgattggca tccaggatgg gtacctatcc300ctgctccagg acagtgggga ggtacgagag gaccttcgtc tgcctgaagg agaccttggc360aaggagattg agcagaagta tgactgtgga gaagagatcc tgatcacagt gctgtctgcc420atgacagagg aggcagctgt tgcaatcaag gccatggcaa aa 462<210>6<211>606<212>DNA<213>大鼠种(Rattus sp.)<220>
<221>CDS<222>(1)..(453)<400>6gct gtg tat tat tgg gcc cat aag aac cac ata cct gtg ctg agt cct 48Ala Val Tyr Tyr Trp Ala His Lys Asn His Ile Pro Val Leu Ser Pro1 5 10 15gca ctc aca gac ggc tca ctg ggt gac atg atc ttt ttc cat tcc tat 96Ala Leu Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Ile Phe Phe His Ser Tyr20 25 30aaa aac cca ggc ttg gtc ctg gac atc gtt gaa gac ctg cgg ctc atc 144Lys Asn Pro Gly Leu Val Leu Asp Ile Val Glu Asp Leu Arg Leu Ile35 40 45
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50 55 60Gly Gly Val Val Lys His His Ile Ala Asn Ala Asn Leu Met Arg Asn65 70 75 80Gly Ala Asp Tyr Ala Val Tyr Ile Asn Thr Ala Gln Glu Phe Asp Gly85 90 95Ser Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys Ile100 105 110Arg Met Asp Ala Gln Pro Val Lys Val Tyr Ala Asp Ala Ser Leu Val115 120 125Phe Pro Leu Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala Gln Lys Ala Asp Ala Phe130 135 140Arg Ala Glu Lys Asn Glu Asp145 150<210>8<211>453<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>8tccgtgtatt actgggccca gaagaaccac atccctgtgt ttagtcccgc acttacagac60ggctcgctgg gcgacatgat cttcttccat tcctacaaga acccgggcct ggtcctggac120atcgttgagg acctgaggct catcaacaca caggccatct ttgccaagtg cactgggatg180atcattctgg gcgggggcgt ggtcaagcac cacattgcca atgccaacct catgcggaac240ggggccgact acgctgttta catcaacaca gcccaggagt ttgatggctc tgactcaggt300gcccgaccag acgaggctgt ctcctggggc aagatccggg tggatgcaca gcccgtcaag360gtctatgctg acgcctccct ggtcttcccc ctgcttgtgg ctgaaacctt tgcccagaag420atggatgcct tcatgcatga gaagaacgag gac 453<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成引物<220>
<221>经修饰的核苷酸(modified_base)<222>(12)<223>a、t、c或g
<400>9tcsaarachg gnaagcaygg 20<210>10<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成引物<400>10gcgaagcttc catggctcga gttttttttt tttttttttt tt 42<210>11<211>972<212>DNA<213>大鼠种(Rattus sp.)<220>
<221>CDS<222>(1)..(327)<400>11tcg aag acc ggt aag cac ggc cat gcc aag gtc cat ctg gtt ggt att48Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile1 5 10 15gat att ttt act ggg aag aaa tat gaa gat atc tgc ccg tcg act cat96Asp Ile Phe Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His20 25 30aac atg gat gtc ccc aac atc aaa agg aat gat ttc cag ctg att ggc144Asn Met Asp Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Phe Gln Leu Ile Gly35 40 45atc cag gat ggg tac cta tcc ctg ctc cag gac agt ggg gag gta cga192Ile Gln Asp Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln Asp Ser Gly Glu Val Arg50 55 60gag gac ctt cgt ctg cct gag gga gac ctt ggc aag gag att gag cag240Glu Asp Leu Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gln65 70 75 80aag tat gac tgt gga gaa gag atc ctg atc aca gtg ctg tcc gcc atg288Lys Tyr Asp Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile Thr Val Leu Ser Ala Met85 90 95aca gag gag gca gct gtt gca atc aag gcc atg gca aaa taactggctt 337
Thr Glu Glu Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala Met Ala Lys100 105ccagggtggc ggtggtggca gcagtgatcc atgagcctac agaggcccct cccccagctc397tggctgggcc cttggctgga ctcctatcca atttatttga cgttttattt tggttttcct457caccccttca aactgtcggg gagaccctgc ccttcaccta gctcccttgg ccaggcatga517gggagccatg gccttggtga agctacctgc ctcttctctc gcagccctga tgggggaaag577ggagtgggta ctgcctgtgg tttaggttcc cctctccctt tttcttttta attcaatttg637gaatcagaaa gctgtggatt ctggcaaatg gtcttgtgtc ctttatccca ctcaaaccca697tctggtcccc tgttctccat agtccttcac ccccaagcac cactgacaga ctggggacca757gcccccttcc ctgcctgtgt ctcttcccaa acccctctat aggggtgaca agaagaggag817ggggggaggg gacacgatcc ctcctcaggc atctgggaag gccttgcccc catgggcttt877accctttcct gtgggctttc tccctgacac atttgttaaa aatcaaacct gaataaaact937acaagtttaa tatgaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 972<210>12<211>109<212>PRT<213>大鼠种(Rattus sp.)<400>12Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile1 5 10 15Asp Ile Phe Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His20 25 30Asn Met Asp Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Phe Gln Leu Ile Gly35 40 45Ile Gln Asp Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln Asp Ser Gly Glu Val Arg50 55 60Glu Asp Leu Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gln65 70 75 80Lys Tyr Asp Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile Thr Val Leu Ser Ala Met85 90 95Thr Glu Glu Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala Met Ala Lys
100 105<210>13<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成引物<400>13caggtctaga gttggaatcg aagc 24<210>14<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成引物<400>14atatctcgag ccttgattgc aacagctgcc 30<210>15<211>489<212>DNA<213>大鼠种(Rattus sp.)<220>
<221>CDS<222>(33)..(485)<400>15caggtctaga gttggaatcg aagcctctta aa atg gca gat gat ttg gac ttc53Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe1 5gag aca gga gat gca ggg gcc tca gcc acc ttc cca atg cag tgc tca101GluThr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala Thr Phe Pro Met Gln Cys Ser10 15 20gca tta cgt aag aat ggt ttt gtg gtg ctc aag ggc cgg cca tgt aag149Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys25 30 35atc gtc gag atg tct act tcg aag act ggc aag cat ggc cat gcc aag197
Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys40 45 50 55gtc cat ctg gtt ggt att gat att ttt act ggg aag aaa tat gaa gat245Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp60 65 70atc tgc ccg tcg act cat aac atg gat gtc ccc aac atc aaa agg aat293Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn75 80 85gat ttc cag ctg att ggc atc cag gat ggg tac cta tcc ctg ctc cag341Asp Phe Gln Leu Ile Gly Ile Gln Asp Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln90 95 100gac agt ggg gag gta cga gag gac ctt cgt ctg cct gag gga gac ctt389Asp Ser Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu105 110 115ggc aag gag att gag cag aag tat gac tgt gga gaa gag atc ctg atc437Gly Lys Glu Ile Glu Gln Lys Tyr Asp Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile120 125 130 135aca gtg ctg tcc gcc atg aca gag gag gca gct gtt gca atc aag gct485Thr Val Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala140 145 150cgag 489<210>16<211>151<212>PRT<213>大鼠种(Rattus sp.)<400>16Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala1 5 10 15Thr Phe Pro Met Gln Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val20 25 30Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr35 40 45Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe50 55 60Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp65 70 75 80
Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Phe Gln Leu Ile Gly Ile Gln Asp85 90 95Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln Asp Ser Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu100 105 110Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gln Lys Tyr Asp115 120 125Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile Thr Val Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu130 135 140Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala145 150<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成引物<400>17gtctgtgtat tattgggccc20<210>18<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成引物<400>18gcgaagcttc catggctcga gttttttttt tttttttttt tt 42<210>19<211>1299<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>19ggcacgaggg cggcggcggc ggtagaggcg gcggcggcgg cggcagcggg ctcggaggca60gcggttgggc tcgcggcgag cggacggggt cgagtcagtg cgttcgcgcg agttggaatc120gaagcctctt aaaatggcag atgacttgga cttcgagaca ggagatgcag gggcctcagc180caccttccca atgcagtgct cagcattacg taagaatggc tttgtggtgc tcaaaggccg240
gccatgtaag atcgtcgaga tgtctacttc gaagactggc aagcacggcc acgccaaggt300ccatctggtt ggtattgaca tctttactgg gaagaaatat gaagatatct gcccgtcaac360tcataatatg gatgtcccca acatcaaaag gaatgacttc cagctgattg gcatccagga420tgggtaccta tcactgctcc aggacagcgg ggaggtacga gaggaccttc gtctccctga480gggagacctt ggcaaggaga ttgagcagaa gtacgactgt ggagaagaga tcctgatcac540ggtgctgtct gccatgacag aggaggcagc tgttgcaatc aaggccatgg caaaataact600ggctcccagg atggcggtgg tggcagcagt gatcctctga acctgcagag gccccctccc660cgagcctggc ctggctctgg cccggtccta agctggactc ctcctacaca atttatttga720cgttttattt tggttttccc caccccctca atctgtcggg gagcccctgc ccttcaccta780gctcccttgg ccaggagcga gcgaagctgt ggccttggtg aagctgccct cctcttctcc840cctcacacta cagccctggt gggggagaag ggggtgggtg ctgcttgtgg tttagtcttt900tttttttttt tttttttttt tttaaattca atctggaatc agaaagcggt ggattctggc960aaatggtcct tgtgccctcc ccactcatcc ctggtctggt cccctgttgc ccatagccct1020ttaccctgag caccacccca acagactggg gaccagcccc ctcgcctgcc tgtgtctctc1080cccaaacccc tttagatggg gagggaagag gaggagaggg gaggggacct gccccctcct1140caggcatctg ggagggccct gcccccatgg gctttaccct tccctgcggg ctctctcccc1200gacacatttg ttaaaatcaa acctgaataa aactacaagt ttaatatgaa aaaaaaaaaa1260aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1299<210>20<211>462<212>DNA<213>大鼠种(Rattus sp.)<400>20atggcagatg atttggactt cgagacagga gatgcagggg cctcagccac cttcccaatg60cagtgctcag cattacgtaa gaatggtttt gtggtgctca agggccggcc atgtaagatc120gtcgagatgt ctacttcgaa gactggcaag catggccatg ccaaggtcca tctggttggt180attgatattt ttactgggaa gaaatatgaa gatatctgcc cgtcgactca taacatggat240gtccccaaca tcaaaaggaa tgatttccag ctgattggca tccaggatgg gtacctatcc300ctgctccagg acagtgggga ggtacgagag gaccttcgtc tgcctgaggg agaccttggc360aaggagattg agcagaagta tgactgtgga gaagagatcc tgatcacagt gctgtccgcc420atgacagagg aggcagctgt tgcaatcaag gccatggcaa aa 462<210>21<211>154<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>21Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala1 5 10 15Thr Phe Pro Met Gln Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val20 25 30Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr35 40 45
Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe50 55 60Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp65 70 75 80Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Phe Gln Leu Ile Gly Ile Gln Asp85 90 95Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln Asp Ser Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu100 105 110Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gln Lys Tyr Asp115 120 125Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile Thr Val Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu130 135 140Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala Met Ala Lys145 150<210>22<211>153<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>22Met Ala Asp Glu Ile Asp Phe Thr Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ser1 5 10 15Thr Tyr Pro Met Gln Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val20 25 30Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr35 40 45Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe50 55 60Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp65 70 75 80Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Tyr Gln Leu Ile Cys Ile Gln Asp85 90 95Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Thr Glu Thr Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu100 105 110Lys Leu Pro Glu Gly Glu Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gly Lys Tyr Asn115 120 125
Ala Gly Glu Asp Val Gln Val Ser Val Met Cys Ala Met Ser Glu Glu130 135 140Tyr Ala Val Ala Ile Lys Pro Cys Lys145 150<210>23<211>154<212>PRT<213>小鼠(Mus musculus)<400>23Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala1 5 10 15Thr Phe Pro Met Gln Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val20 25 30Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr35 40 45Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe50 55 60Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp65 70 75 80Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Phe Gln Leu Ile Gly Ile Gln Asp85 90 95Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln Asp Ser Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu100 105 110Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gln Lys Tyr Asp115 120 125Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile Thr Val Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu130 135 140Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala Met Ala Lys145 150<210>24<211>153<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>24
Met Ala Asp Glu Ile Asp Phe Thr Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ser1 5 10 15Thr Tyr Pro Met Gln Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val20 25 30Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr35 40 45Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe50 55 60Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp65 70 75 80Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Tyr Gln Leu Ile Cys Ile Gln Asp85 90 95Gly Cys Leu Ser Leu Leu Thr Glu Thr Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu100 105 110Lys Leu Pro Glu Gly Glu Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gly Lys Tyr Asn115 120 125Ala Gly Glu Asp Val Gln Val Ser Val Met Cys Ala Met Ser Glu Glu130 135 140Tyr Ala Val Ala Ile Lys Pro Cys Lys145 150<210>25<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成寡核苷酸<400>25gacttggact tcgagacagg 20<210>26<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成寡核苷酸
<400>26gcacggccac gccaaggtc19<210>27<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成寡核苷酸<400>27ggacagcggg gaggtacgag 20<210>28<211>153<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明说明性共有序列<400>28Met Ala Asp Glu Ile Asp Phe Thr Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ser1 5 10 15Thr Tyr Pro Met Gln Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val20 25 30Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr35 40 45Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe50 55 60Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp65 70 75 80Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Tyr Gln Leu Ile Cys Ile Gln Asp85 90 95Gly Cys Leu Ser Leu Leu Thr Glu Thr Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu100 105 110Lys Leu Pro Glu Gly Glu Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gly Lys Tyr Asn115 120 125Ala Gly Glu Asp Val Gln Val Ser Val Met Cys Ala Met Ser Glu Glu130 135 140
Tyr Ala Val Ala Ile Lys Pro Cys Lys145 150<210>29<211>1309<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>29ggcacgaggg tagaggcggc ggcggcggcg gcagcgggct cggaggcagc ggttgggctc60gcggcgagcg gacggggtcg agtcagtgcg ttcgcgcgag ttggaatcga agcctcttaa120aatggcagat gacttggact tcgagacagg agatgcaggg gcctcagcca ccttcccaat180gcagtgctca gcattacgta agaatggctt tgtggtgctc aaaggccggc catgtaagat240cgtcgagatg tctacttcga agactggcaa gcacggccac gccaaggtcc atctggttgg300tattgacatc tttactggga agaaatatga agatatctgc ccgtcaactc ataatatgga360tgtccccaac atcaaaagga atgacttcca gctgattggc atccaggatg ggtacctatc420actgctccag gacagcgggg aggtacgaga ggaccttcgt ctccctgagg gagaccttgg480caaggagatt gagcagaagt acgactgtgg agaagagatc ctgatcacgg tgctgtctgc540catgacagag gaggcagctg ttgcaatcaa ggccatggca aaataactgg ctcccaggat600ggcggtggtg gcagcagtga tcctctgaac ctgcagaggc cccctccccg agcctggcct660ggctctggcc cggtcctaag ctggactcct cctacacaat ttatttgacg ttttattttg720gttttcccca ccccctcaat ctgtcgggga gcccctgccc ttcacctagc tcccttggcc780aggagcgagc gaagctgtgg ccttggtgaa gctgccctcc tcttctcccc tcacactaca840gccctggtgg gggagaaggg ggtgggtgct gcttgtggtt tagtcttttt tttttttttt900tttttttttt aaattcaatc tggaatcaga aagcggtgga ttctggcaaa tggtccttgt960gccctcccca ctcatccctg gtctggtccc ctgttgccca tagcccttta ccctgagcac1020caccccaaca gactggggac cagccccctc gcctgcctgt gtctctcccc aaaccccttt1080agatggggag ggaagaggag gagaggggag gggacctgcc ccctcctcag gcatctggga1140gggccctgcc cccatgggct ttacccttcc ctgcgggctc tctccccgac acatttgtta1200aaatcaaacc tgaataaaac tacaagttta atatgaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa1260aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa1309<210>30<211>23<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>30aaaggaatga cttccagctg att23<210>31<211>23<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>31aagatcgtcg agatgtctac ttc23
<210>32<211>23<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>32aaggtccatc tggttggtat tga 23<210>33<211>23<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>33aagctggact cctcctacac aat 23<210>34<211>23<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>34aaagtcgacc ttcagtaagg att 23<210>35<211>20<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>35cctgtctcga agtccaagtc 20<210>36<211>20<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>36gacttggact tcgagacagg 20<210>37<211>20<212>DNA<213>人(Homo sapiens)
<400>37ggaccttggc gtggccgtgc20<210>38<211>20<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>38gcacggccac gccaaggtcc20<210>39<211>20<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>39ctcgtacctc cccgctctcc20<210>40<211>19<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>40ggacagcggg gaggtacga 19<210>41<211>465<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>41atggcagatg acttggactt cgagacagga gatgcagggg cctcagccac cttcccaatg60cagtgctcag cattacgtaa gaatggcttt gtggtgctca aaggccggcc atgtaagatc120gtcgagatgt ctacttcgaa gactggcaag cacggccacg ccaaggtcca tctggttggt180attgacatct ttactgggaa gaaatatgaa gatatctgcc cgtcaactca taatatggat240gtccccaaca tcaaaaggaa tgacttccag ctgattggca tccaggatgg gtacctatca300ctgctccagg acagcgggga ggtacgagag gaccttcgtc tccctgaggg agaccttggc360aaggagattg agcagaagta cgactgtgga gaagagatcc tgatcacggt gctgtctgcc420atgacagagg aggcagctgt tgcaatcaag gccatggcaa aataa465<210>42<211>462<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)<400>42atggcagacg aaattgattt cactactgga gatgccgggg cttccagcac ttaccctatg60cagtgctcgg ccttgcgcaa aaacggcttc gtggtgctca aaggacgacc atgcaaaata120gtggagatgt caacttccaa aactggaaag catggtcatg ccaaggttca ccttgttgga180attgatattt tcacgggcaa aaaatatgaa gatatttgtc cttctactca caacatggat240gttccaaata ttaagagaaa tgattatcaa ctgatatgca ttcaagatgg ttacctttcc300ctgctgacag aaactggtga agttcgtgag gatcttaaac tgccagaagg tgaactaggc360aaagaaatag agggaaaata caatgcaggt gaagatgtac aggtgtctgt catgtgtgca420atgagtgaag aatatgctgt agccataaaa ccctgcaaat aa 462<210>43<211>154<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>43Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala1 5 10 15Thr Phe Pro Met Gln Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val20 25 30Leu Lys Gly Trp Pro Cys Lys Ile Val Glu Met Ser Ala Ser Lys Thr35 40 45Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe50 55 60Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp65 70 75 80Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Phe Gln Leu Ile Gly Ile Gln Asp85 90 95Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln Asp Ser Gly Glu Val Pro Glu Asp Leu100 105 110Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gln Lys Tyr Asp115 120 125Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile Thr Leu Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu130 135 140Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala Met Ala Lys145 150<210>44
<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成寡核苷酸<400>44aaaggaatga cttccagctg a 21<210>45<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA/RNA结合分子的说明合成寡核苷酸<220>
<223>人工序列说明合成寡核苷酸<400>45aaaggaauga cuuccagcug att23<210>46<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA/RNA结合分子的说明合成寡核苷酸<220>
<223>人工序列说明合成寡核苷酸<400>46ucagcuggaa gucauuccuu utt23<210>47<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成寡核苷酸<400>47aagatcgtcg agatgtctac t 21
<210>48<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA/RNA结合分子的说明合成寡核苷酸<220>
<223>人工序列说明合成寡核苷酸<400>48aagaucgucg agaugucuac utt23<210>49<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA/RNA结合分子的说明合成寡核苷酸<220>
<223>人工序列说明合成寡核苷酸<400>49aguagacauc ucgacgaucu utt23<210>50<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成寡核苷酸<400>50aaggtccatc tggttggtat t 21<210>51<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA/RNA结合分子的说明合成寡核苷酸
<220>
<223>人工序列说明合成寡核苷酸<400>51aagguccauc ugguugguau utt23<210>52<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA/RNA结合分子的说明合成寡核苷酸<220>
<223>人工序列说明合成寡核苷酸<400>52aauaccaacc agauggaccu utt23<210>53<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成寡核苷酸<400>53aagctggact cctcctacac a 21<210>54<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA/RNA结合分子的说明合成寡核苷酸<220>
<223>人工序列说明合成寡核苷酸<400>54aagcuggacu ccuccuacac att23<210>55
<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA/RNA结合分子的说明合成寡核苷酸<220>
<223>人工序列说明合成寡核苷酸<400>55uguguaggag gaguccagcu utt23<210>56<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成寡核苷酸<400>56aaagtcgacc ttcagtaagg a 21<210>57<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA/RNA结合分子的说明合成寡核苷酸<220>
<223>人工序列说明合成寡核苷酸<400>57aaagucgacc uucaguaagg att23<210>58<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>DNA/RNA结合分子的说明合成寡核苷酸<220>
<223>人工序列说明合成寡核苷酸
<400>58uccuuacuga aggucgacuu utt23<210>59<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成引物<400>59gccaagctta atggcagatg atttgg 26<210>60<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成引物<400>60ctgaattcca gttattttgc catgg 25<210>61<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成引物<400>61aatgaattcc gccatgacag aggaggc27<210>62<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成引物<400>62gcgaagcttc catggctcga gttttttttt tttttttttt tt 42
<210>63<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成寡核苷酸<400>63cctgtctcga agtccaagtc20<210>64<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成寡核苷酸<400>64ggaccttggc gtggccgtgc20<210>65<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成寡核苷酸<400>65ctcgtacctc cccgctctcc20<210>66<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成寡核苷酸<400>66cgtaccggta cggttccagg20<210>67
<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成寡核苷酸<400>67ggaccttggc gtggccgtgc20<210>68<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成肽<400>68Cys Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gln Lys Tyr1 5 10 15Asp<210>69<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成寡核苷酸<400>69aaaggaatga cttccagctg acctgtctc 29<210>70<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成寡核苷酸<400>70aatcagctgg aagtcattcc tcctgtctc 29
<210>71<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成寡核苷酸<400>71aagatcgtcg agatgtctac tcctgtctc 29<210>72<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成寡核苷酸<400>72aaagtagaca tctcgacgat ccctgtctc 29<210>73<211> 29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成寡核苷酸<400>73aaggtccatc tggttggtat tcctgtctc 29<210>74<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成寡核苷酸<400>74aaaataccaa ccagatggac ccctgtctc 29<210>75<211>29<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成寡核苷酸<400>75aagctggact cctcctacac acctgtctc 29<210>76<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成寡核苷酸<400>76aatgtgtagg aggagtccag ccctgtctc 29<210>77<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成寡核苷酸<400>77aaagtcgacc ttcagtaagg acctgtctc 29<210>78<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成寡核苷酸<400>78aatccttact gaaggtcgac tcctgtctc 29<210>79<211>20<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成寡核苷酸<400>79aagcuggacu ccuccuacac20<210>80<211>21<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成寡核苷酸<400>80aaacacaucc uccucagguc g 21<210>81<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成寡核苷酸<400>81aaaggaatga cttccagctg a 21<210>82<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成寡核苷酸<400>82aagatcgtcg agatgtctac t 21<210>83<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成寡核苷酸<400>83
aaggtccatc tggttggtat t 21<210>84<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成寡核苷酸<400>84aagctggact cctcctacac a 21<210>85<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成寡核苷酸<400>85aaagtcgacc ttcagtaagg a 2权利要求
1.一种凋亡特异性eIF-5A反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸阻抑细胞中凋亡特异性eIF-5A的内源性表达。
2.权利要求1的反义寡核苷酸，其中的凋亡特异性eIF-5A由SEQ ID NO20的核苷酸序列所编码。
3.权利要求1的反义寡核苷酸，其中的凋亡特异性eIF-5A由SEQ ID NO41的核苷酸序列所编码。
4.权利要求1的反义寡核苷酸，其中的反义寡核苷酸具有SEQID NO35中列出的序列。
5.权利要求1的反义寡核苷酸，其中的反义寡核苷酸具有SEQID NO37中列出的序列。
6.权利要求1的反义寡核苷酸，其中的反义寡核苷酸具有SEQID NO39中列出的序列。
7.一种用以转染哺乳动物细胞的表达载体，其中包含权利要求1的反义寡核苷酸和操作性连接于该反义寡核苷酸上的调控序列，以使得该反义寡核苷酸可在所述细胞中进行转录。
8.一种用以转染哺乳动物细胞的表达载体，其中包含权利要求4的反义寡核苷酸和操作性连接于该反义寡核苷酸上的调控序列，以使得该反义寡核苷酸可在所述细胞中进行转录。
9.一种用以转染哺乳动物细胞的表达载体，其中包含权利要求5的反义寡核苷酸和操作性连接于该反义寡核苷酸上的调控序列，以使得该反义寡核苷酸可在所述细胞中进行转录。
10.一种用以转染哺乳动物细胞的表达载体，其中包含权利要求6的反义寡核苷酸和操作性连接于该反义寡核苷酸上的调控序列，以使得该反义寡核苷酸可在所述细胞中进行转录。
11.一种抑制细胞中凋亡特异性eIF-5A表达的方法，所述方法包括向所述细胞中导入权利要求7的表达载体，从而使所述的凋亡特异性eIF-5A反义寡核苷酸抑制所述细胞中内源性凋亡特异性eIF-5A的表达。
12.一种抑制细胞中凋亡特异性eIF-5A表达的方法，所述方法包括向所述细胞中导入权利要求8、9或10的表达载体，从而使所述的凋亡特异性eIF-5A反义寡核苷酸抑制所述细胞中内源性凋亡特异性eIF-5A的表达。
13.权利要求11的方法，其中对所述细胞中内源性凋亡特异性eIF-5A表达的抑制对该细胞具有选自以下的作用阻抑所述细胞发生凋亡、减少所述细胞中p53的表达、降低所述细胞中产生的细胞因子的水平、降低所述细胞中产生的细胞因子的水平、提高所述细胞中Bcl-2的表达、降低所述细胞中产生的髓过氧化物酶的水平、降低所述细胞中活性NFk β的水平、降低所述细胞中TLR4的水平、降低所述细胞中TNFR-1的水平和降低所述细胞中iNOS的水平的作用。
14.权利要求12的方法，其中对所述细胞中内源性凋亡特异性eIF-5A表达的抑制对该细胞具有选自以下的作用阻抑所述细胞发生凋亡、减少所述细胞中p53的表达、降低所述细胞中产生的细胞因子的水平、降低所述细胞中产生的细胞因子的水平、提高所述细胞中Bcl-2的表达、降低所述细胞中产生的髓过氧化物酶的水平、降低所述细胞中活性NFk β的水平、降低所述细胞中TLR4的水平、降低所述细胞中TNFR-1的水平和降低所述细胞中iNOS的水平的作用。
15.一种向哺乳动物体内肺脏细胞导入siRNA的方法，包括将所述siRNA与水混合并通过鼻腔导入哺乳动物细胞。
16.一种凋亡特异性eIF-5A siRNA，其中siRNA阻抑细胞中内源性凋亡特异性eIF-5A的表达。
17.权利要求16的siRNA，其中的凋亡特异性eIF-5A由SEQ IDNO20的核苷酸序列所编码。
18.权利要求16的siRNA，其中的凋亡特异性eIF-5A由SEQ IDNO41的核苷酸序列所编码。
19.权利要求16的siRNA，其中siRNA具有SEQ ID NO30中列出的序列。
20.权利要求16的siRNA，其中siRNA具有SEQ ID NO31中列出的序列。
21.权利要求16的siRNA，其中siRNA具有SEQ ID NO32中列出的序列。
22.权利要求16的siRNA，其中siRNA具有SEQ ID NO33中列出的序列。
23.一种抑制细胞中凋亡特异性eIF-5A表达的方法，所述方法包括向所述细胞中导入权利要求16的siRNA，从而使所述的凋亡特异性eIF-5A siRNA抑制所述细胞中内源性凋亡特异性eIF-5A的表达。
24.一种抑制细胞中凋亡特异性eIF-5A表达的方法，所述方法包括向所述细胞中导入权利要求19、20、21或22的siRNA，从而使所述的凋亡特异性eIF-5A siRNA抑制所述细胞中内源性凋亡特异性eIF-5A的表达。
25.一种抑制细胞中凋亡特异性eIF-5A表达的方法，所述方法包括向所述细胞中导入权利要求16的siRNA，从而使所述的凋亡特异性eIF-5A siRNA抑制所述细胞中内源性凋亡特异性eIF-5A的表达。
26.一种抑制细胞中凋亡特异性eIF-5A表达的方法，所述方法包括向所述细胞中导入权利要求19、20、21或22的siRNA，从而使所述的凋亡特异性eIF-5A siRNA抑制所述细胞中内源性凋亡特异性eIF-5A的表达。
27.权利要求25的方法，其中对所述细胞中内源性凋亡特异性eIF-5A表达的抑制对该细胞具有选自以下的作用阻抑所述细胞发生凋亡、减少所述细胞中p53的表达、降低所述细胞中产生的细胞因子的水平、降低所述细胞中产生的细胞因子的水平、提高所述细胞中Bcl-2的表达、降低所述细胞中产生的髓过氧化物酶的水平、降低所述细胞中活性NFkβ的水平、降低所述细胞中TLR4的水平、降低所述细胞中TNFR-1的水平和降低所述细胞中iNOS的水平的作用。
28.权利要求26的方法，其中对所述细胞中内源性凋亡特异性eIF-5A表达的抑制对该细胞具有选自以下的作用阻抑所述细胞发生凋亡、减少所述细胞中p53的表达、降低所述细胞中产生的细胞因子的水平、降低所述细胞中产生的细胞因子的水平、提高所述细胞中Bcl-2的表达、降低所述细胞中产生的髓过氧化物酶的水平、降低所述细胞中活性NFk β的水平、降低所述细胞中TLR4的水平、降低所述细胞中TNFR-1的水平和降低所述细胞中iNOS的水平的作用。
全文摘要
本发明涉及凋亡特异性真核起始因子5A(eIF－5A)，称为“凋亡特异性eIF－5A”或“eIF－5A1”，包括相关核酸和多肽。也涉及到使用反义核苷酸或者siRNA抑制凋亡特异性eIF－5A表达从而抑制或阻抑细胞凋亡的方法。本发明也涉及通过抑制凋亡特异性eIF－5A表达，来阻抑或抑制促炎细胞因子表达，或抑制NFkB活化作用的方法。
文档编号C12N15/113GK101027393SQ200580031487
公开日2007年8月29日 申请日期2005年7月20日 优先权日2004年7月20日
发明者J·E·汤普森, B·C·加尔顿, C·泰勒, C·迪纳雷洛, L·列兹尼科夫, A·布恩, M·霍普金斯 申请人:森尼斯科技术公司