一种吸收甲醛的青蒿培育方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及利用基因工程培育植物领域，具体是一种利用转基因技术培育可以吸 收甲醛的青蒿的方法。
【背景技术】
[0002] 甲醛室温下无色，挥发性较强，氧化力强，是一种结构简单的高活性醛，已被广泛 地应用于工业生产，它是制造粘合剂，涂料，树脂，人造家具板材的原材料。新房装修以及新 家具均产生大量甲醛，已经成为最有代表性的室内空气污染物。室内甲醛污染，可引起呼吸 系统疾病。甲醛的污染具有毒性大来源广，污染持续长，高水平的污染等特点。世界卫生组 织将甲醛列为人类致癌物的一种室内空气污染物，甲醛与蛋白质、核酸和脂类产生非特异 性反应的活泼化合物，对生物具有很高的毒性。流行病学调查发现甲醛污染与白血病的发 生有相关性，建筑工人中枢神经系统病变所表现的症状与室内甲醛的污染浓度相关。儿童 哮喘的夜间症状增加与甲醛相关。甲醛对人体健康危害主要体现在遗传毒性，归纳为四类 机制：基因突变、染色体改变、细胞毒性如炎症以及对DNA的作用，如DNA链断裂，DNA交联 和DNA蛋白质交联。
[0003] 生物体对甲醛危害有修复机制，微生物甲醛氧化途径的关键酶甲醛脱氢酶 (formaldehydedehydrogenase，FADH，EC1. 2. 1. 1)属于中等锌链醇脱氢酶家族。微生物 中甲醛脱氢酶对甲醛的解毒作用大致过程：甲醛转化靠甲醛氧化途径中的酶促系统，大部 分FADH通常需要NAD+和谷胱甘肽（GSH)参与甲醛的氧化，FADH对甲醛解毒的过程为4步： (1)甲醛从胞外进入胞内，与GSH自发缩合形成S-羟甲基谷胱甘肽；（2)S-羟甲基谷胱甘肽 在甲醛脱氢酶FADH的作用下氧化成S-甲酰谷胱甘肽；(3)s-甲酰谷胱甘肽在S-甲酰谷胱 甘肽水解酶（FGH)的作用下重新GSH并形成甲酸；(4)甲酸在甲酸脱氢酶的作用下转化为 C02。甲醛脱氢酶的结构：FADH存在有二聚体和四聚体两种情况，亚基分子量大小约在40kD 左右，微生物在长期进化过程中，形成了许多代谢甲醛和应对甲醛毒害的机制，如恶臭假单 胞菌（Pseudomonasputida)中的甲醛脱氢酶（PFADH)不需要GSH参与即可氧化甲醛，恶臭 假单胞菌亚基分子为四聚体蛋白，而大肠杆菌以及球形红细菌中的甲醛脱氢酶为二聚体形 式。甲醛脱氢酶调控在转录水平进行，转录中的甲醛脱氢酶（Fadh)基因，可以被甲醛代谢 过程中产生的还原力信号分子和中间物激活，表明甲醛脱氢酶是能通过诱导而产生的。甲 醛含量的检测方有高效液相层析，分光光度法，极谱法和气相层析等，也可以进行甲醛酶法 检测，即利用甲醛脱氢酶的特性来进行甲醛检测，酶法检测甲醛不仅操作简便而且耗资少， 适合于日常使用。
[0004] 甲醛易溶于水，通过气孔和皮孔扩散到植物组织中，进入植物细胞内，与细胞质和 细胞器内的相关酶发生反应，可以将甲醛转化成其它物质，或者以二氧化碳的形式被释放 出来。青蒿中化学成分分为4类：倍半萜、香豆素、黄酮和挥发油。青蒿中的药用成分可分为 挥发性和非挥发性2个部分。非挥发性成分主要是青蒿素。挥发性成分主要为挥发油，包括 篙酮、异篙酮、左旋樟脑、龙脑、按油精、旅烯、丁香烯、倍半褚醇、石竹烯氧化物等成分.其 中丁香烯、篙酮、异篙酮、樟脑、龙脑等含量较高。青蒿植株高大，气味芳香，放置于新修小区 或者新装修的房子内，可以压制或者清除异味，青蒿挥发成分如烯、酮、醇类等化学物质弥 漫在空气中，能消耗掉空气中部分甲醛，达到清除甲醛的目的。
【发明内容】
[0005] 针对现有家居装修中高甲醛释放，人们对清除空气中甲醛污染的家居植物需求， 而培育的甲醛脱氢酶转基因青蒿。本发明所要解决的技术问题是在青蒿基因组中导入能增 加甲醛脱氢酶合成的基因，并增强其原有基因的表达，获得转基因青蒿新品系，以提高其甲 醛脱氢酶合成能力，使其叶片中能超量蓄积甲醛脱氢酶而达到超量转化吸入叶片细胞内甲 醛的目的，使这种转基因青蒿品系成为清除家居装修中释放的甲醛的清除植物。
[0006] 由于甲醛脱氢酶是生物体内清除甲醛的关键性酶，增强Fadh基因活性，可以提高 青蒿植株甲醛脱氢酶的含量，本发明将恶臭假单胞菌甲醛脱氢酶基因Fadh基因克隆转化 导入青蒿，提高青蒿中的甲醛脱氢酶合成，获得高甲醛脱氢酶含量的基因工程青蒿品种，为 培育甲醛脱氢酶高含量的青蒿提供一种新的方法。本发明旨在构建Fadh基因的植物表达 载体，并获得重组工程青蒿植株，利用转基因技术培育高甲醛脱氢酶含量的青蒿奠定基 础。
[0007] 为了实现上述目的本发明才有的技术方案为，一种吸收甲醛的青蒿培育方法，包 括如下步骤：
[0008] 1)克隆恶臭假单胞菌甲醛脱氢酶的基因片段，记为Fadh基因片段，并将Fadh基因 片段构建成重组质粒pCB-Fadh;Fadh基因的DNA序列为SEQIDNO. 1，该Fadh基因由PCR 扩增获得，其中PCR扩增用引物为：上游引物DNA序列为SEQIDNO. 2,下游引物DNA序列 为SEQIDNO. 3。
[0009] 2)利用转基因技术将重组质粒pCB-Fadh导入青蒿，获得包含Fadh基因的青蒿植 株。
[0010] 为了更好地实施本发明，所述步骤2)中采用电击法将pCB-Fadh导入农杆菌感受 态细胞LBA4404,然后采用农杆菌介导法将所述农杆菌感受态细胞LBA4404导入青蒿，构成 包含Fadh基因的青蒿植株。
[0011] 通过对青蒿基因组进行的上述改造，可大幅度提高青蒿叶片甲醛脱氢酶的含量， 使之成为清除家居装修中释放的甲醛的植物。
[0012] 本发明用于作为Fadh基因受体亲本的青蒿是同一品种。在青蒿中导入Fadh基 因可以提高甲醛脱氢酶的含量，在普通植株青蒿甲醛脱氢酶含量为6. 30mg/g时，本发明 得到的转基因青篙植株中甲醛脱氢酶含量最高19. 80mg/g，其含量是非转化对照青篙含量 的2. 98倍。同时在密闭甲醛熏蒸室内，普通植株甲醛吸收为0. 12mg/m2.h时，本发明得到 的转基因青篙植株甲醛吸收最高〇. 27mg/m2.h，其甲醛吸收是非转化对照青篙含量的2. 25 倍。本发明的方法对于清除家居装修中释放的甲醛具有重要意义（如图5、6)。
【附图说明】
[0013] 图1为用pET28a_Fadh转化大肠杆菌Rosetta感受态细胞，重组子单菌落培养后， 不同IPTG浓度（异丙基-D-硫代半乳糖苷）刺激重组蛋白进行诱导表达的电泳图；
[0014] 图中M标示Marker, 1、2、3、4、5、6为不同IPTG浓度（其浓度分别为0.01mmol/L， 0. 05mmol/L,lmmol/L, 1. 5mmol/L, 2.Ommol/L, 2. 5mmol/L)诱导表达的蛋白质SDS-PAGE。
[0015] 图2植物表达载体结构图；
[0016] 图中为pCAMBIA2301-Fadh载体构建示意图。
[0017]图3为候选转基因植株的PCR特异性扩增结果示意图；
[0018] 图中M标示Marker,V为仅转染Vector，l、2、3、4、5、6、7、8、9、10泳道为不同候选 阳性植株，即转染Fadh基因的阳性植株。
[0019] 图4为候选转基因植株的实时定量PCR检测结果；
[0020] 其中，纵坐标表示转录水平Vector表示对照植株，Fadh表示候选转基因植株， "Fadh-"后的阿拉伯数字表示不同转基因植株编号。
[0021] 图5为阳性转基因植株与对照植株叶片就甲醛脱氢酶含量的数据统计数据图；
[0022] 图中，Vector表示对照，Fadh表示候选转基因植株，"Fadh-"后的阿拉伯数字表示 不同转基因植株编号。
[0023] 图6为阳性转基因植株与对照植株叶片对高浓度甲醛的吸收能力的数据统计数 据图，图中，Vector表示对照，Fadh表示候选转基因植株。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，但不应该理解为本发明上述主题 范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明上述技术思想的情况下，根据本领域普通技术知 识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的保护范围内。
[0025] 材料：采用常规野生青蒿，2008年来源于重庆秀山县，在重庆医药高等专科学校 以常规种植了 5代。
[0026] 菌株：恶臭假单胞菌（Pseudomonasputida)，大肠杆菌Rosetta，农杆菌LBA4404
[0027] 质粒：pMD18-T载体购于TaKaRa生物技术公司，原核表达载体pET_28a(+)， PMD19-T，质粒载体pCAMBIA2301。
[0028]酶和主要试剂：各种限制性内切酶如EcoRI和BamHI、Ndel和Xhol、TaqDNA 聚合酶、IPTG、dNTP等购自TaKaRa生物技术公司，引物合成、DNA测序由上海生工技术公司。 PCR引物由Sangon生物技术公司合成，随机引物标记试剂盒购自华美生物技工程公司。
[0029] 分子生物学技术
[0030]下列实施例中未作特别说明的均按照常规实验条件进行，如分子克隆采取SAMBR00K.T等编著的实验手册（NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPreSS, 1989) 中描述条件，或采取制造厂商提供的试剂盒要求之条件进行。
[0031] 实施例1
[0032] 1.lFadh基因PCR扩增及原核表达载体的构建和FADH酶蛋白表达
[0033]PCR引物：
[0034] 上游引物，DNA序列为SEQIDNO. 2:
【主权项】
1. 一种吸收甲醛的青蒿培育方法，其特征在于：包括如下步骤： 1) 克隆恶臭假单胞菌甲醛脱氢酶的基因片段，记为Fadh基因片段，并将Fadh基因片段 构建成重组质粒pCB-Fadh ; 2) 利用转基因技术将重组质粒pCB-Fadh导入青蒿，获得包含Fadh基因的青蒿植株。
2. 根据权利要求1所述一种吸收甲醛的青蒿培育方法，其特征在于：所述步骤2)中采 用电击法将pCB-Fadh导入农杆菌感受态细胞LBA4404,然后采用农杆菌介导法将所述农杆 菌感受态细胞LBA4404导入青蒿，构成包含Fadh基因的青蒿植株。
3. 根据权利要求1或2 -种吸收甲醛的青蒿培育方法，其特征在于：所述Fadh基因的 DNA 序列为 SEQ ID NO. 1。
4. 根据权利要求3 -种吸收甲醛的青蒿培育方法，其特征在于：所述Fadh基因由PCR 扩增获得，其中PCR扩增用引物为：上游引物DNA序列为SEQ ID NO. 2,下游引物DNA序列 为 SEQ ID NO. 3。
【专利摘要】本发明公开了一种吸收甲醛的青蒿培育方法,该方法是将Fadh基因通过植物表达载体导入青蒿中,筛选得到高甲醛吸收的青蒿，具体步骤：从恶臭假单胞菌中克隆Fadh基因,构建含Fadh基因的植物表达载体,用农杆菌介导,将Fadh基因转入青篙并培育筛选再生植株，获高甲醛吸收的转基因青篙植株。在普通植株青蒿甲醛脱氢酶含量为6.30mg/g时,本发明得到的转基因青篙植株中甲醛脱氢酶含量最高19.80mg/g,其含量是非转化对照青篙含量的2.98倍。同时在密闭甲醛熏蒸室内，普通植株甲醛吸收为0.12mg/m2.h时,本发明得到的转基因青篙植株甲醛吸收最高0.27mg/m2.h,其甲醛吸收是非转化对照青篙含量的2.25倍。本发明的方法对于清除家居装修中释放的甲醛具有重要意义。
【IPC分类】A01H5-00, C12N15-84
【公开号】CN104531758
【申请号】CN201410762601
【发明人】陈俊意, 朱照静, 杨治国, 杨延音, 谭丽, 田数高, 管琴, 张宝勇, 彭坤, 曾祥琼
【申请人】重庆医药高等专科学校
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月12日