高琥珀酸产出细菌的制作方法

专利名称：高琥珀酸产出细菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及被设计在大肠杆菌内并被设计为在有氧和无氧条件下都产出高水平的琥珀酸的杂合琥珀酸生产体系(hybrid succinate producing system)。
背景技术：
昂贵的特种化合品琥珀酸及其衍生物具有广泛的工业应用。琥珀酸作为原材料被用于食品、药物、塑料制品、化妆品和纺织品，并且被用于电镀和废气净化(waste-gas scrubbing)(61)。琥珀酸可以作为一些塑料前体的原料，如1，4-丁二醇(BDO)，四氢呋喃和γ-丁内酯。而且，琥珀酸和BDO可以用作聚酯的单体。如果琥珀酸的成本可以被降低，它将作为用于生产其他散装化学品的中间原料而变得非常有用(47)。除了琥珀酸以外，其他4-碳二羧酸，如苹果酸和延胡索酸也具有原料潜力。
从葡萄糖、木糖、山梨糖醇和其他“绿色”可更新原料(在本案中通过发酵过程)生产琥珀酸、苹果酸和延胡索酸是替代从不可更新资源中提取这些酸类的更高能耗方法的一条途径。琥珀酸是产丙酸细菌厌氧发酵的中间体，但那些过程产生低产量和浓度。很早就已知道大肠杆菌发酵能产生酸类的混合物。可是，对于每摩尔被发酵的葡萄糖而言，只产生1.2摩尔甲酸，0.1-0.2摩尔乳酸和0.3-0.4摩尔琥珀酸。因此，以发酵方法生产羧酸的努力导致相对大量的生长底物，如葡萄糖，不能被转变成所需的产物。
传统上，琥珀酸是通过大肠杆菌在厌氧条件下产出的。人们做了许多尝试对大肠杆菌无氧中心代谢途径进行代谢工程设计，以提高琥珀酸的产量和产出率(7，8，12，14，15，20，24，32，44，48)。基因工程与生产条件优化的结合也显示提高了琥珀酸的产出量。一个实例是一种利用双期(dual phase)发酵生产模式使产出琥珀酸的突变大肠杆菌菌株的生长，该模式包括初始的有氧生长期，随后的无氧生产期或/和利用二氧化碳、氢或两种气体的混合物来改变无氧发酵的顶部空间条件(35，49)。这些方法由于在有氧期没有琥珀酸产出并且对琥珀酸生产的无氧生长期的严格条件而受到限制。
特别地，通过扩增、添加或减少特定途径来操纵酶的水平，可以导致所需产物的高产量。已经描述了用于在无氧条件下生产琥珀酸的各种基因改进，这些改进利用了大肠杆菌混合酸发酵途径。一个实例是从大肠杆菌过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(pepc)(34)。在另一实例中，通过过表达大肠杆菌中天然的延胡索酸还原酶(frd)，延胡索酸到琥珀酸的转化被提高(17，53)。某些酶不是大肠杆菌固有的，但能潜在地促进琥珀酸的生产。通过将丙酮酸羧化酶(pyc)从埃特里根瘤菌(Rhizobium etli)转入到大肠杆菌中，琥珀酸的产出量得到提高(14，15，16)。其他代谢工程策略包括使琥珀酸的竞争性途径失活。当苹果酸酶在具有失活的丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)和乳酸脱氢酶(ldh)基因的宿主中过表达时，琥珀酸成为主要的发酵产物(44，20)。在同一突变株(pfl-和ldh-)内的失活的葡萄糖磷酸转移酶体系(ptsG)也显示在大肠杆菌内产出更高的琥珀酸产出量并促进生长(8)。
代谢工程具有通过操纵代谢途径的通过量来相当大地改善过程产出量的潜力。尤其是，通过扩增、添加或减少特定途径来操纵酶的水平，可以导致所需产物的高产量。杂合琥珀酸生产体系允许在有氧和无氧条件下的琥珀酸产出。琥珀酸的产出与环境的有氧条件脱钩，使得大量的琥珀酸被生产出来。
相关的步骤解释了两个优化的途径设计，这是首先由细菌种类的有氧和无氧中心途径的数学建模来产生的。依照两种条件的优化设计的要求，蛋白质可以被灭活。基于为提高羧酸产出量而不可缺少的蛋白的加入也能被激活或过表达。
发明概述描述了带有设计用来能够在有氧和无氧条件下都起作用的杂合羧酸生产体系的细菌。该细菌具有失活的蛋白，该蛋白在有氧和无氧条件下持续地增加琥珀酸、延胡索酸、苹果酸、草酰乙酸或乙醛酸的产出量。失活的蛋白可以选自ACEB、ACKA、ADHE、ARCA、FUM、ICLR、MDH、LDHA、POXB、PTA、PTSG和SDHAB。在本发明的一个实施方案中，ACKA、ADHE、ICLR、LDHA、POXB、PTA、PTSG和SDHAB被灭活。在本发明的另一个实施方案中，ACEB，ACKA，ADHE，ARCA，FUM，ICLR，MDH，LDHA，POXB，PTA，PTSG和SDHAB的不同组合被失活以设计生产一种选自琥珀酸、延胡索酸、苹果酸、草酰乙酸和乙醛酸的羧酸。这些蛋白的失活可以与ACEA、ACEB、ACEK、ACS、CITZ、FRD、GALP、PEPC和PYC的过表达相结合，以进一步增加琥珀酸的产量。
在本发明的一个实施方案中，制造了破坏菌株(disruption strain)，其中ackA、adhE、arcA、fum、iclR、mdh、ldhA、poxB、pta、ptsG和sdhAB基因被破坏。在本发明的另一实施方案中，ackA、adhE、arcA、fum、iclR、mdh、ldhA、poxB、pta、ptsG和sdhAB的不同组合被破坏。描述了其基因型包括Δ(ackA-pta)-sdhAB-poxB-iclR-ptsG-ldhA-adhE，Δ(ackA-pta)-fum-poxB-iclR-ptsG-ldhA-adhE，Δ(ackA-ptd)-mdh-poxB-iclR-ptsG-ldhA-adhE，Δ(ackA-ptd)-sdhAB-poxB-ptsG-ldhA-adhE，Δ(ackA-pta)-sdhAB-poxB-iclR-ldhA-adhE和Δ(ackA-pta)-sdhAB-poxB-ldhA-adhE的突变菌株。菌株SBS552MG(ΔadhE ldhA poxB sdh iclRΔack-pta∷CmR，KmS)；MBS553MG(ΔadhE ldhA poxB sdh iclR ptsG Δack-pta∷CmR，KmS)和MBS554MG(ΔadhE ldhA poxB sdh iclR ptsG galP Δack-pta∷CmR，Kms)提供了琥珀酸生产菌株的非限制性的例子。还描述了其中ACEA、ACEB、ACEK、FRD、PEPC和PYC被过表达以进一步增加琥珀酸产量的菌株。
而且，还描述了利用突变细菌菌株生产琥珀酸的有氧、无氧和有氧/无氧方法，通过将以上描述的突变细菌菌株接种培养，在有氧条件下培养细菌菌株，在无氧条件下培养细菌，以及从培养基分离羧酸。可以在锥形瓶、生物反应器、恒化式(chemostat)生物反应器、或流加式(fed batch)生物反应器中培养细菌菌株而获得羧酸。在一个实例中，通过在有氧条件下培养细胞来快速地获得高水平的生物量，然后继续在无氧条件下生产琥珀酸以提高琥珀酸产量，羧酸的产量被进一步提高。
描述了细菌菌株和培养方法，其中每摩尔底物产出至少2摩尔羧酸，优选地，每摩尔底物产出至少3摩尔羧酸。
附图简要说明

图1杂合琥珀酸生产体系的设计和构建。
图2大肠杆菌中的杂合琥珀酸生产体系。
发明的描述和实施方案所述的羧酸可以是盐、酸、碱或衍生物，取决于结构、pH和存在的离子。例如，术语“琥珀酸(succinate)”和“琥珀酸(succinic acid)”在这里可交替使用。琥珀酸也叫丁二酸(C4H6O4)。这里所使用的化学品包括甲酸、乙醛酸、乳酸、苹果酸、草酰乙酸(OAA)、磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和丙酮酸。包括Krebs循环(也叫柠檬酸、三羧酸或TCA循环)的细菌代谢途径能在Lehninger“生物化学原理(Principles of Biochemistry)”及其他生物化学教科书中找到。
所用的术语“控制性联系(operably associated)”或“控制形相关(operably linked)”指功能配对的核甘酸序列。
在此所定义的“降低的活性”或“失活”指与适当的对照组菌株相比，蛋白质的活性至少降低75％。优选地，达到活性降低至少80、85、90、95％，在最优选的实施方案中，活性被消除(100％)。可以通过抑制剂、突变、抑制表达或翻译等方法使蛋白失活。
在此所定义的“过表达”或“过表达的”是指与适当的对照组种类相比，至少150％的蛋白质活性。可以通过突变所述的蛋白生成更具活性的形式，或通过清除抑制剂、加入激活剂等方式使蛋白能抵抗抑制的形式可以实现过表达。还可以通过清除阻抑物、向细胞中加入基因的多个拷贝或正向调节内源基因等等也可以实现过表达。
所使用的术语“破坏(disruption)”和“破坏菌株”是指细胞株中天然的基因或启动子被突变、删除、阻断或负向调节，以这样的方式来降低基因的活性。通过基因敲除或除去整个基因组DNA序列，能使基因完全(100％)被破坏(reduced)。利用移码突变、终止密码提前、重要残基点突变、或缺失或插入等方式，通过完全阻止活性蛋白的转录和/或翻译，能够使基因产物完全失活(100％)。
在此所用的“重组体”是指来源于或包含基因工程物质。
基因缩写如下异柠檬酸裂解酶(aceA a.k.a.icl)；苹果酸合酶(aceB)；乙醛酸支路操纵子(aceBAK)；异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸化酶(aceK)；乙酸激酶-磷酸转乙酰基酶(ackA-pta)；乌头酸水解酶1和2(acnA和acnB)；乙酰辅酶A合成酶(acs)；醇脱氢酶(adhE)；对有氧呼吸调控的调节子A和B(arcAB)；过氧化物敏感性(arg-lac)；醇乙酰基转移酶1和2(atf1和atf2)；推定的尸胺/赖氨酸反向转运体(cadR)；柠檬酸合酶(citZ)；脂肪酸降解调节子(fadR)；延胡索酸还原酶(frd)；果糖调节子(fruR)；延胡索酸酶A，B，或C(fumABC)；半乳糖透性酶(galp)；异柠檬酸脱氢酶(icd)；异柠檬酸裂合酶(icl)；aceBAK操纵子阻抑物(iclR)；乳酸脱氢酶(ldhA)；苹果酸脱氢酶(mdh)；磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(pepC)；丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)；丙酮酸氧化酶(poxB)；磷酸转移酶体系基因F和G(ptsF和ptsG)；丙酮酸羧化酶(pyc)；鸟苷3’，5’-二焦磷酸合成酶I(relAl)；核糖体蛋白S12(rpsL)；以及琥珀酸脱氢酶(sdh)。Δlac(arg-lac)205(U169)是染色体arg-lac区缺失，该区携带一个或几个使细胞对H2O2敏感的基因(51)。PYC能从不同的物种获得，乳酸乳球菌pyc被表达作为一个实施例(AF068759)。
缩写氨苄西林(Ap)；苯唑西林(Ox)；羧苄青霉素(Cn)；氯霉素(Cm)；卡那霉素(Km)；链霉素(Sm)；四环素(Tc)；萘啶酮酸(Nal)；红霉素(Em)；氨苄西林耐药性(ApR)；甲砜氯霉素/氯霉素耐药性(ThiR/CmR)；大环内酯，林可酰胺和链阳性菌素A耐药性(MLSR)；链霉素耐药性(SmR)；卡那霉素耐药性(KmR)；革兰氏阴性复制起点(ColEl)；革兰氏阳性复制起点(OriII)。常见的限制酶和限制位点可以在NEB(NEW ENGLAND BIOLABS，www.neb.com)和INVITROGEN(www.invitrogen.com).ATCC，AMERICAN TYPE CULTURECOLLECTIONTM(www.atcc.org)找到。
本发明某些实施方案中所用质粒和菌株在表1和表2中列出。MG1655是在F接合中F-λ-的自发突变缺陷，且如Guyer等人所报道(18)。用P1噬菌体转导和基于λred重组酶的一步失活法来消除途径(10)。使用本文所引用的以及Sambrook(38)与Ausebel(5)描述的标准生物化学技术来构建质粒和突变大肠杆菌菌株。
表1质粒
表2菌株
如果合适，每次实验菌株是刚刚用质粒转染的。单一菌落在含有适当抗生素的平板上被重新划线。单个的菌落被转入250ml摇瓶中，摇瓶中包含具有适当抗生素的LB培养基50ml，并且在37℃、以250rpm摇动有氧生长所述的单个菌落12个小时。用LB培养基清洗细胞两次，以1％的体积比接种所述的细胞于2L摇瓶内，每个摇瓶内包含400ml具有适当抗生素浓度的LB培养基，并且在37℃、以250rpm摇动有氧生长所述的细胞12个小时。通过离心收获适当量的细胞生物质(～1.4 gCDW)，弃上清。细胞被重新悬浮于60ml有氧或厌氧LB培养基中(LB肉汤培养基补充有20g/L的葡萄糖，1g/L的NaHCO3)，并且立即接种于反应器中达到约10 OD600的浓度。向培养基中加入NaHCO3，因为它的pH缓冲能力和提供CO2的能力促进细胞生长和羧酸产出。取决于所述的菌株加入适当的抗生素。
实施例1乳酸、乙酸和乙醇的抑制作用在有氧和无氧条件下生产羧酸的杂合细菌菌株能够克服低生物量的生成对无氧生产过程的限制。在发酵过程开始时，生物量可以在有氧条件下产生。在此期间，通过有氧代谢合成途径生成了大量羧酸，节省时间和成本。一旦获得高的生物量，环境可以被转换或允许转向无氧条件下用于碳源向羧酸以高产量的附加转化。使用重新设计的无氧琥珀酸发酵途径，羧酸的产量预计增加到远远高于每摩尔葡萄糖2或3摩尔的产物。
首先，为增加进入TCA循环用于羧酸产出通量，在有氧代谢中的两条乙酸途经被灭活，即，丙酮酸氧化酶(POXB)和乙酸激酶-磷酸转乙酰酶(ACKA-PTA)(图1)。一旦这两条途径被灭活，乙酸生产实质上地减少，更多的碳通量被驱动至TCA循环。
此外，通过灭活乳酸脱氢酶(LDH)，经过乳酸的碳量也被减少。杂合琥珀酸生产体系的无氧设计部分在由大肠杆菌混合酸发酵途径的多条途径失活所构成。乳酸脱氢酶(LDHA)和醇脱氢酶(ADHE)被灭活以保存NADH和碳原子(图1)。发酵羧酸合成途径是需要NADH的。碳的保存增加朝着发酵羧酸合成途径的碳通量。
然后，葡萄糖磷酸转移酶体系(PTSG)也被灭活，以增加用于琥珀酸合成的磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)库(图1)。PEP是OAA的前体，OAA是琥珀酸合成的一个主要前体。灭活PTSG也增加有氧代谢的碳通过量。经过所有这些遗传修饰，杂合生产体系的有氧设计现在包含两条用于羧酸产出的路径；一条是TCA循环的氧化分支，另一条是乙醛酸循环。
在这点上，羧酸由TCA循环的氧化分支生成。TCA循环蛋白中的任何一个失活都会建立分枝的羧酸合成途径。碳会流经OAA-苹果酸和柠檬酸-乙醛酸或异柠檬酸途径。分枝的羧酸途径，如图2所示琥珀酸，允许通过有氧和无氧代谢持续羧酸产物的产出。
实施例2增加乙醛酸旁路通量如前所示，天然的ACEA和ACEB的存在足以驱动羧酸的产出而不需要附加的表达。可是，天然的表达水平易受反馈抑制作用的影响，并且对环境的有氧或无氧条件敏感。乙醛酸支路的结构性活化对保持羧酸合成的高水平有氧代谢非常重要。通过灭活aceBAK操纵子阻抑物(ICLR)，可以使这一活化有可能。如图1所示，乙醛酸旁路的活化提供一个混合的发酵环境，这个环境实现了高水平的羧酸产出。
实施例3琥珀酸生产琥珀酸脱氢酶(SDHAB)的灭活使琥珀酸在有氧条件下积聚(图1)。琥珀酸在有氧条件下一般不积聚，因为它在TCA循环中被氧化为电子传递链提供电子，且补充草酰乙酸(OAA)。图2所示的分枝代谢途径，提供了有氧、无氧和用于碳通量产生琥珀酸的构建途径。双合成途径的存在减少了对纯有氧或纯无氧培养条件的需求，使工业培养条件处于较低严格的标准。
实施例4羧酸生产琥珀酸生产被描述为羧酸生产的原型代谢途径。通过灭活TCA转化酶中的任何一个酶，可以利用该体系生产其他羧酸。值得注意的是，延胡索酸酶(FUM)的灭活会建立一个分枝的延胡索酸生产菌株。同样，苹果酸脱氢酶(MDH)的灭活将建立一个分枝的苹果酸生产菌株。通过灭活苹果酸合成酶(ACEB)和增加异柠檬酸脱氢酶(ACEK)活性，可以生产乙醛酸。
利用细菌生产体系所进行的不同批量特种化学物质，包括延胡索酸、苹果酸、OAA和乙醛酸的生产，为这些物质提供了一个可更新和低成本的资源。使用在有氧和无氧条件下都生产羧酸的细菌菌株减少了对培养条件的限制，因此，减少大批量化学物生产的成本。
实施例5增加产量对杂合琥珀酸生产体系的有氧和无氧网络设计共包括大肠杆菌内基因破坏的不同组合(ΔsdhAB，ΔackA-pta，ΔpoxB，ΔiclR，ΔptsG，ΔldhA和ΔadhE)。在此之上，丙酮酸羧化酶(pyc)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(pepC)能在单一质粒的体系内共表达(图1)。增强PYC和PEPC活性显著增加用于琥珀酸合成的OAA库。PYC将丙酮酸直接转化成OAA，PEPC将PEP直接转化成OAA。最终，杂合琥珀酸生产体系包含三条琥珀酸合成路径，PYC和PEPC过表达驱动碳通量朝着这些途径(图2)。第一条途径是TCA循环的氧化分支，它在有氧条件下发挥作用。第二条途径是还原发酵琥珀酸合成途径，它在无氧条件下发挥作用。第三条途径是乙醛酸循环，一旦被激活，它在有氧和无氧条件都发挥作用。
对杂合琥珀酸生产体系的进一步改进包括过表达苹果酸酶将丙酮酸引导到琥珀酸合成途径。通过减少任何丙酮酸盐积聚能提高生产率。在乙醛酸循环中的途径也能被过表达来提高循环效率(也即，柠檬酸合成酶、顺乌头酸酶、异柠檬酸裂解酶和苹果酸合成酶)。葡萄糖转运体系的操控也能提高到琥珀酸合成途径的碳通过量。一个实例是半乳糖透性酶(GALP)，它有可能被用于提高葡萄糖摄取而减少乙酸产量。在有外部添加的乙酸的情况下，乙酰辅酶A合成酶(ACS)过表达也是进一步增加琥珀酸产量的潜在的策略。理论上，ACS能以乙酸为代价增加乙酰辅酶A库，而OAA库仅从葡萄糖产生。通过将OAA与乙醛酸循环的乙酰辅酶A底物的需要脱钩，能增加可达到的琥珀酸的最大理论产量。排除其他可能消耗OAA库的途径，也能增强该过程。
实施例6分批发酵作为上述所有策略上的基因操作的结果，建立了大肠杆菌的突变株作为杂合琥珀酸生产体系(图2)。突变的菌株能生产高水平的琥珀酸，而无论气氛的氧压力是多少。某些琥珀酸合成路线总是对生产琥珀酸起作用的，而不依赖环境的氧状态。该因素非常重要，因为它避免了保持高氧培养物的问题，并且在从有氧到无氧生长的转换期间允许细胞高效生产琥珀酸。这保证了在操作更大适应性和培养规约更大的适应性。发酵罐的操作控制参数被大大拓宽。
以前，有氧分批发酵需要增加生物量。在一个1.0升的NEW BRUNSWICK SCIENTIFICBIOFLO 110TM发酵罐内，已用600ml体积的培养基进行过有氧分批发酵。温度维持在37℃，摇动速率恒定在800rpm。所用的入口气流为1.5L/min。利用极谱氧电极(NEW BRUNSWICKSCIENTIFICTM)监测溶解氧，并且在整个实验中维持在80％以上的饱和度。需要注意保持通气和监测溶解氧浓度。这些严格的有氧生长条件使生物量增加而以大摩尔的羧酸产量为代价。杂合羧酸生产体系降低氧气的严格性，并提供增加的生物量和大的产物产量的益处。
实施例7恒化器发酵恒化器实验在有氧条件下以0.1hr-1的稀释率进行。稀释率必须基于细菌菌株的比生长速率来被定制，比生长速率由之前的成批培养研究的对数生长期数据来获得。600ml的分批培养可以被恒化地维持，利用之前描述过的培养条件，并用玻璃电极监测pH值，用1.5 N HNO3和2 N Na2CO3控制pH值在7.0。接种后，在进料泵(feed pump)和废物泵(waste pump)被打开以开始恒化前，培养物可以被允许以分批模式生长12至14小时。5个停留时间后，连续培养达到稳态。在5个和6个停留时间由样本测量光密度和代谢物，然后进行比较确定稳态可以被建立。
利用杂合生产体系，生长条件可以被优化用于羧酸生产而没有严格的充氧作用的边界。培养条件的细微变化不会限制代谢生产，因此在降低成本和提高产出量的优化过程期间，充氧作用变得不太重要。
实施例8流加式发酵在有氧条件下进行的流加式操作同样受充氧需要的限制。起始培养基体积是在如前所述的1.0L发酵罐内的400ml。根据所研究菌株的比生长率，按指数方式加入葡萄糖，比生长率来源于分批实验结果。用于葡萄糖加料的程序是BIOCOMMAND PLUSTMBioProcessing软件来自于NEW BRUNSWICK SCIENTIFICTM。接种后，在打开葡萄糖泵开始流加式操作前，生物反应器内的培养物以分批模式生长达14个小时。
杂合羧酸生产体系具有强的在有氧和无氧条件下生产批量羧酸的能力。该琥珀酸生产体系基本上能够在两种条件下都发挥作用，这使生产过程效率更高，过程控制和优化困难更少。因此，最有效的培养物生长的两个步骤和大量的生物量/生物催化剂生产能在有氧条件下进行，此时效率最高同时琥珀酸被积聚，并且在高细胞密度时氧变为约束时，更多摩尔效率的无氧转变过程成为主导。因为在该转换中，不需要分离或操作性改变培养，容易适应大尺寸反应器。羧酸生产可以被增加到远大于每摩尔葡萄糖1摩尔羧酸的水平，一些模型的预期产量可以高达每摩尔葡萄糖2、3或更多摩尔的产物。
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权利要求
1.一种经修饰的细菌，所述的细菌包括乙酸激酶(ACK)、丙酮酸氧化酶(POXB)和磷酸转乙酰酶(PTA)蛋白的减低的活性，还包括一种或更多种选自由醇脱氢酶(ADH)、有氧呼吸控制调节子(ARC)、脂肪酸降解调节子(FADR)、果糖调节子(FRUR)、延胡索酸酶(FUM)、异柠檬酸脱氢酶(ICD)、异柠檬酸裂解酶(ICL)、aceBAK操纵子阻抑物(ICLR)、乳酸脱氢酶(LDH)、苹果酸脱氢酶(MDH)、丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)、磷酸转移酶体系F(PTSF)、磷酸转移酶体系G(PTSG)和琥珀酸脱氢酶(SDH)组成的组蛋白的减低的活性。
2.如权利要求1所述的经修饰细菌，包括ACK、ADH、POXB、PTA和SDH的减低的活性。
3.如权利要求1所述的经修饰细菌，包括ACK、ADH、ICLR、LDH、POXB、PTA和SDH的减低的活性。
4.如权利要求1所述的经修饰细菌，包括ACK、ADH、ICLR、LDH、POXB、PTA、PTSG和SDH的减低活的性。
5.如权利要求1所述的经修饰细菌，包括ACK、ADH、ICLR、LDH、POXB、PTA、PTSG和SDH的减低的活性，其中所述细菌包括GALP的增加的活性。
6.如权利要求1所述的经修饰细菌，其中所述细菌选自由SBS552MG、MBS553MG和MBS554MG所组成的组。
7.如权利要求1所述的经修饰细菌，包括一种或更多种选自由异柠檬酸裂解酶(ACEA)、苹果酸合成酶(ACEB)、异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸化酶(ACEK)、顺乌头酸酶(ACN)、乙酰辅酶A合成酶(ACS)、柠檬酸合成酶(CITZ)、延胡索酸还原酶(FRD)、半乳糖透性酶(GALP)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)和丙酮酸羧化酶(PYC)所组成的组的蛋白的增加的活性。
8.如权利要求1所述的经修饰细菌，包括一个或多个选自由醇脱氢酶(adh)、乙酸激酶(ack)、有氧呼吸控制调节子(arc)、脂肪酸降解调节子(fadR)、延胡索酸还原酶(frd)、果糖调节子(fruR)、延胡索酸酶(fum)、异柠檬酸脱氢酶(icd)、异柠檬酸裂解酶(icl)、aceBAK操纵子阻抑物(iclR)、乳酸脱氢酶(ldh)、苹果酸脱氢酶(mdh)、丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)、丙酮酸氧化酶(poxB)、磷酸转乙酰酶(pta)、磷酸转移酶体系F(ptsF)、磷酸转移酶体系G(ptsG)和琥珀酸脱氢酶(sdh)所组成的组的基因的破坏。
9.如权利要求1所述的经修饰细菌，包括一个或更多个选自由异柠檬酸裂解酶(aceA)、苹果酸合成酶(aceB)；异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸化酶(aceK)、顺乌头酸酶(acn)、乙酰辅酶A合成酶(acs)、柠檬酸合成酶(citZ)、半乳糖透性酶(galP)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(pepC)和丙酮酸羧化酶(pyc)所组成的组的基因的过表达。
10.一个基因工程细菌细胞，包括乙酸激酶(ack)、丙酮酸氧化酶(poxB)和磷酸转乙酰酶(pta)的破坏，并且还包括一个或更多个选自由醇脱氢酶(adh)、有氧呼吸控制调节子(arc)、脂肪酸降解调节子(fadR)、延胡索酸还原酶(frd)、果糖调节子(fruR)、延胡索酸酶(fum)、半乳糖透性酶(galP)、异柠檬酸脱氢酶(icd)、异柠檬酸裂解酶(icl)、aceBAK操纵子阻抑物(iclR)、乳酸脱氢酶(ldh)、苹果酸脱氢酶(mdh)、丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)、磷酸转移酶体系F(ptsF)、磷酸转移酶体系G(ptsG)和琥珀酸脱氢酶(sdh)所组成的组的基因的破坏。
11.如权利要求10所述的基因工程细菌细胞，包括ack-pta、adh、ldh、poxB和sdh的破坏。
12.如权利要求10所述的基因工程细菌细胞，包括ack、adh、iclR、ldh、poxB、pta和sdh的破坏。
13.如权利要求10所述的基因工程细菌细胞，包括ack、adh、iclR、ldh、poxB、pta、ptsG和sdh的破坏。
14.如权利要求10所述的基因工程细菌细胞，包括ack、adh、iclR、ldh、poxB、pta、ptsG和sdh的破坏，其中所述细菌包括GALP的增加的活性。
15.如权利要求10所述的基因工程细菌细胞，包括选自由异柠檬酸裂解酶(aceA)、苹果酸合成酶(aceB)；异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸化酶(aceK)、顺乌头酸酶(acn)、乙酰辅酶A合成酶(acs)、柠檬酸合成酶(citZ)、半乳糖透性酶(galP)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(pepC)和丙酮酸羧化酶(pyc)所组成的组的基因的过表达。
16.一种在细菌培养中生产羧酸的方法，包括a)在培养物中提供细菌，其中所述的细菌包括ACK、POXB和PTA蛋白的减低的活性，并进一步包括i)一种或更多种选自由ADH、ARC、FADR、FRD、FRUR、FUM、ICD、ICL、ICLR、LDH、MDH、PFL、PTA、PTSF、PTSG和SDH所组成的组的蛋白的减低的活性，ii)一种或更多种选自由ACEA、ACEB、ACEK、ACN、ACS、CITZ、GALP、PEPC和PYC所组成的组的蛋白的增加的活性，或iii)i)和ii)两者；b)为所述细菌提供糖底物；c)使所述细菌在有氧条件下代谢所述的糖到足够的生物量；d)使所述细菌在无氧条件下代谢所述的糖到以羧酸产出量最大化；以及e)从所述的培养物回收所述的羧酸。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述的细菌包括ack、adh、iclR、ldh、poxB、pta、ptsG和sdh的破坏。
18.如权利要求16所述的方法，其中所述的细菌包括ack、adh、iclR、ldh、poxB、pta、ptsG和fum的破坏。
19.如权利要求16所述的方法，其中所述的细菌包括ack、adh、iclR、ldh、poxB、pta、ptsG和mdh的破坏。
20.如权利要求16所述的方法，其中所述的细菌包括选自由异柠檬酸裂解酶(ACEA)、苹果酸合成酶(ACEB)、异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸化酶(ACEK)、顺乌头酸酶(ACN)、乙酰辅酶A合成酶(ACS)、柠檬酸合成酶(CITZ)、延胡索酸还原酶(FRD)、半乳糖透性酶(GALP)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)和丙酮酸羧化酶(PYC)所组成的组的蛋白的增加的活性。
21.如权利要求16所述的方法，其中所述培养物是锥形瓶、分批、流加式或恒化器培养物。
22.如权利要求16所述的方法，其中所述培养物是在有氧条件下的生长物，并且羧酸产出在无氧条件下继续而不交换顶端气体。
23.如权利要求16所述的方法，其中所述羧酸以大于每摩尔葡萄糖2摩尔羧酸被回收。
24.如权利要求16所述的方法，其中所述羧酸以大于每摩尔葡萄糖3摩尔羧酸被回收。
全文摘要
本发明涉及杂合的琥珀酸生产体系，该体系具有在有氧和无氧条件下高的生产琥珀酸的能力。对能在有氧和无氧条件下都发挥功能的杂合细菌琥珀酸生产体系的代谢设计，使生产过程更有效率，过程可控性和优化的困难更少。
文档编号C12N1/20GK101023178SQ200580031232
公开日2007年8月22日 申请日期2005年9月16日 优先权日2004年9月17日
发明者K-Y·单, 乔治·N·贝内特, 亨利·林, 艾伦·桑切斯 申请人:莱斯大学