专利名称：一种用于检测nadh浓度的纳米生物传感器及其检测方法
技术领域：
本发明涉及辅酶的检测，具体涉及一种纳米生物传感器及其NADH浓度的检测方法。
背景技术：
还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)广泛存在于动植物和微生物的活细胞中，是生物代谢过程中的一种重要辅酶。在活体细胞内成百上千个代谢反应中，NADH是电子供体，NAD+是电子受体，具有氧化还原活性，它们在糖酵解、柠檬酸循环和光合作用等过程中，起着电子传递的重要作用。在生物体内，NADH参与了维生素衍生的过程，生物体内极其重要的潜能物质三磷酸腺苷(ATP)的产生过程，并且是已被鉴定出的250多种脱氢酶的辅酶，维持着细胞生长、分化和能量代谢。在近年来备受关注的白腐真菌对污染环境的生物修复过程中，醌类物质是真菌胞外过氧化物酶催化降解木质素合芳香族有机污染物等生成的关键中间产物，NADH作为真菌细胞内醌还原酶的辅酶，在这些醌类物质的深度代谢中起到了重要作用。因此，NADH水平代表了生物体内代谢和微生物降解能力的综合指标，NADH检测方法的研究是一个与重大生命过程和环境污染物降解进程息息相关的热点研究领域。
NADH在紫外区的340nm处有吸收，并且在470nm处产生荧光。这项光学性能常被用作NADH水平检测和以NAD(H)为辅酶的脱氢酶和还原酶的活性测定中。但很多生物分子在紫外区吸收过多能量会引起光损伤，其光损伤程度大于可见区或红外区。而细胞内NADH含量很低，故其吸收光谱和荧光光谱信号很弱。因此，基于直接测量其光学效应的检测方法并不理想。高效液相色谱(HPLC)检测NADH的方法虽然效果好，但是需要昂贵的设备费用和专业的操作人员，且不能进行在线检测。因此研制一种检测效果好、操作简便、成本低、且能进行在线检测的NADH浓度的检测技术是重要的研究课题。
发明内容
本发明的目的是运用在NADH还原作用下金属粒子催化增长的原理和吸收光谱变化规律，提供一种纳米生物传感器，以解决NADH浓度检测中存在的上述问题。
本发明是通过以下技术方案实现上述发明目的的。
用于检测NADH浓度的纳米生物传感器由作为反应培育晶种的基底层和纳米粒子增长的反应增长层构成，基底层为固定在玻片上的Au纳米粒子，反应增长层为在含有NADH的反应液中Ag+在Au纳米粒子表面催化还原形成的Au/Ag核壳型纳米粒子。
基底层的玻片是在预处理后经氨丙基三甲氧基硅烷氨基硅烷化的普通玻片，固定在玻片上的纳米粒子是直径为10nm、浓度为1×10-4M的、滴加量为75μL的Au纳米粒子。
纳米生物传感器检测NADH浓度的方法为将传感器置于含有不同浓度的NADH的3mL反应溶液中培育8～12min，将传感器从反应液中取出，置入检测池中进行光谱扫描，以光谱中纳米粒子在415nm附近的吸收峰值测定反应液中NADH的浓度。
反应溶液的其它组分浓度为磷酸盐缓冲溶液(pH 6.64)1/15M十六烷基三甲基氯化铵(CTAC) 0.003MAgNO30.001M对苯醌 0.0015M吸收峰值(I)与NADH浓度(C，10-4M)之间的线性回归方程为I＝(0.1064±0.0116)+(0.0119±0.0006)×C(1)相关系数r2为0.9806其中，NADH浓度的线性范围为2×10-4～3.2×10-3M，检测下限为1.56×10-5M。
下面结合附图进一步详述本发明
图1本发明的生物传感器制作流程和NADH作用下Au/Ag纳米粒子催化增长过程图；图2不同浓度NADH作用下的传感器光谱图，其中，NADH浓度为(a)0，(b)12.32×10-4M，(c)17.98×10-4M，(d)24.59×10-4M和(e)32.16×10-4M；图3Au/Ag纳米粒子催化增长前后的扫描电镜(SEM)图，其中，(a)增长前，(b)增长后；图4光谱吸收峰值与NADH浓度之间的线性回归图。
纳米粒子具有特殊的光学、电学、化学性质，在生物组分分析领域表现出巨大的应用价值，引起了人们的浓厚研究兴趣。金属纳米粒子具有良好的分散性、较为规则的形貌和稳定的吸收光谱，并且其吸收光谱随粒径和浓度的大小发生规律性变化，常被用作生物传感器中的光学标记，在待测的DNA杂交、抗体/抗体识别等反应中产生可检测的光学信号。最近的研究表明，在生物酶等氧化还原活性物质的催化下，Au纳米粒子(AuNP)可以增大，其粒径和数量发生改变，并通过紫外-可见吸收光谱进行定量分析。
将普通玻璃片(长30mm，宽9mm，厚1mm)的表面经Pirahna溶液和H2O2，NH3和H2O的混合溶液预处理后，用氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)氨基硅烷化，将直径为10nm的Au纳米粒子(1×10-4M)75μL滴涂于玻片表面固定，制成Au纳米粒子修饰的生物传感器。
将传感器置于含有不同浓度的NADH的3mL反应溶液中培育8～12min，反应溶液为1/15M磷酸盐缓冲溶液(pH6.64)，其它组分为0.003M十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)，0.0015MAgNO3和0.0015M对苯醌。
生物传感器制作流程和NADH作用下Au/Ag纳米粒子催化增长过程示意图见图1。NADH将对苯醌还原成对苯二酚，Ag+在对苯二酚的作用下，在Au纳米粒子表面还原生成Ag，从而形成Au/Ag核壳型纳米粒子，反应方程为 本发明采用日本岛津UV-2550紫外-可见分光光度计进行光谱分析，石英比色皿光程为1cm。所有工作均在室温(25℃)下完成。实验用水均为超纯水(美国Millipore超纯水系统)。在紫外-可见分光光度计的参比和待测池中均注入2.5mL超纯水，将表面沉积有Ag的传感器置于检测池中进行光谱扫描。Au纳米粒子在560nm波长附近有吸收峰，而Au/Ag核壳型纳米粒子在415nm波长附近形成新的吸收峰，且峰值随着反应液中NADH浓度的增加而增大。当反应液为磷酸盐缓冲溶液(pH6.64，1/15M)3mL，CTAC(0.003M)，AgNO3(0.0015M)和对苯醌(0.0015M)时，传感器对NADH的响应最好，不同浓度NADH的响应光谱见图2。由图可见，光谱在415nm波长附近的峰值随着反应液中NADH浓度的增加而增大，为Au/Ag纳米粒子的吸收峰。
同时，对固定有Au/Ag纳米粒子的玻片表面用日本电子JEOLJSC-1600自动离子溅射仪进行喷铂处理以增强导电性，喷铂厚度约为10nm。采用荷兰FEI Sirion 200场发射扫描电子显微镜对用反应液培育前后的传感器表面进行扫描电镜分析。图3(a)为培育前的玻片表面Au纳米粒子，(b)为用含有磷酸盐缓冲溶液(pH 6.64，1/15M)3 mL，CTAC(0.003M)，AgNO3(0.0015M)、对苯醌(0.0015M)和NADH(6.49×10-4M)的反应液培育后的玻片表面Au/Ag纳米粒子。由图可见，培育前Au纳米粒子粒径为10nm左右，培育后Au/Ag纳米粒子平均粒径增长为42.93nm，增长现象明显。
在实验中还发现，传感器的灵敏度也与玻片上Au纳米粒子的固定量有关，当玻片上Au纳米粒子的固定量越大时，传感器在560nm波长附近的吸收峰值也越高，对相同浓度的NADH的响应峰值变化量也越大。但是，当Au纳米粒子在560nm波长附近的吸收峰值过大时，容易掩盖住Au/Ag核壳型纳米粒子在415nm波长附近形成的吸收峰，因此，当Au纳米粒子固定量对应的玻片在560nm左右吸收峰值为0.14Abs时，传感器响应最好，此时，在传感器制备中玻片上Au纳米粒子的滴加量为75μL。
此外，对培育时间的研究发现，传感器在培育8min后响应峰值即达到最大，为了获得稳定的响应结果，我们采用8～12min为反应液培育时间。
在上述最佳测定条件下，将传感器的响应光谱的Au/Ag纳米粒子的吸收峰值(I)与对应的NADH浓度值(C，10-4M)作线性回归，见图4。当NADH浓度为2×10-4～3.2×10-3M时，回归方程为I＝(0.1064±0.01 16)+0.01 19±0.0006)×C其中，相关系数r2为0.9806，检测下限为1.56×10-5M。
本发明所制备的NADH光学纳米生物传感器操作简便，成本低，抗干扰能力强，能更好地解决复杂生物系统和环境污染物降解进程中NADH在线快速测定问题，为分析NADH为辅酶的氧化还原酶活性提供了更方便快捷的技术。
具体实施例方式
1.玻片的预处理将普通载玻片加工成长30mm，宽9mm，厚1mm，在Pirahna溶液(H2SO4，98％和H2O2，30％，体积比为4∶1)中于60℃下浸泡20min。水洗后，在H2O2，NH3和H2O的混合溶液(体积比为1∶1∶2)中于70℃下浸泡20min。用大量水、甲醇(色谱纯)冲洗除去物理吸附，在4℃下保存于甲醇中备用。
2.纳米传感器制备配APTMS和甲醇混合溶液(体积比为1∶1.5)，将玻片置于其中浸泡18h，35℃，用甲醇冲洗去弱吸附，然后置于常温下干燥。将直径为10nm、浓度为1×10-4M、滴加量为75μL的AuNP滴涂于玻片一面固定，常温下静置干燥2h，用水冲洗，4℃下保存于水中。
3.NADH浓度测定在参比池和待测池中均注入2.5mL超纯水，将表面未沉积Ag的传感器置于检测池中进行光谱扫描。取3mL磷酸盐缓冲溶液(1/15M)，依次加入0.003MCTAC、0.0015MAgNO3、0.0015M对苯醌和NADH，迅速混合均匀后将传感器浸入其中，常温下避光培育8～12min。将传感器从反应液中取出，置入检测池中进行光谱扫描。
根据最佳条件下光谱中纳米粒子吸收峰值测定反应液中NADH的浓度。
4.测定结果将本发明的生物传感器方法对NADH测定的结果与紫外分光光度法测定结果相比较，选择不同浓度NADH的水溶液作为样品，紫外吸收峰波长为340nm。结果见下表。
由表可知，本发明研制的生物传感器对NADH的测定是准确有效的。
权利要求
1.一种用于检测NADH浓度的纳米生物传感器，其特征在于传感器由作为反应培育晶种的基底层和纳米粒子增长的反应增长层构成，基底层为固定在玻片上的Au纳米粒子，反应增长层为在含有NADH的反应液中Ag+在Au纳米粒子表面催化还原形成的Au/Ag核壳型纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的用于检测NADH浓度的纳米生物传感器，其特征在于基底层的玻片是在预处理后经氨丙基三甲氧基硅烷氨基硅烷化的普通玻片，固定在玻片上的纳米粒子是直径为10nm、浓度为1×10-4M的、滴加量为75μL的Au纳米粒子。
3.一种如权利要求1所述的纳米生物传感器检测NADH浓度的方法，其特征在于将传感器置于含有不同浓度的NADH的3mL反应溶液中培育8～12min，将传感器从反应液中取出，置入检测池中进行光谱扫描，以光谱中纳米粒子在415nm附近的吸收峰值测定反应液中NADH的浓度，反应溶液的其它组分浓度为磷酸盐缓冲溶液(pH6.64) 1/15M十六烷基三甲基氯化铵(CTAC) 0.003MAgNO30.0015M对苯醌 0.0015M吸收峰值(I)与NADH浓度(C，10-4M)之间的线性回归方程为I＝(0.1064±0.0116)+(0.0119±0.0006)×C相关系数r2为0.9806其中，NADH浓度的线性范围为2×10-4～3.2×10-3M，检测下限为1.56×10-5M。
全文摘要
本发明涉及一种纳米生物传感器及其检测NADH浓度的方法。本发明以固定在传感器表面的Au纳米粒子为晶种，运用在NADH还原作用下Au/Ag核壳型纳米粒子催化增长的原理和吸收光谱变化规律，计算光谱中纳米粒子吸收峰值的变化测定NADH浓度。本发明测定NADH浓度的线性范围为2×10
文档编号C12Q1/68GK1821751SQ20061003142
公开日2006年8月23日 申请日期2006年3月30日 优先权日2006年3月30日
发明者汤琳, 曾光明, 沈国励, 牛承岗, 袁兴中 申请人:湖南大学