专利名称：：具iii-v族氮化物细胞贴附层的生物感测芯片的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种生物感测芯片，尤其涉及一种具有lli-v族氮化物细胞贴附层的生物感测心片o
背景技术：
：近年来，对于结合电子及生物系统，刺激神经元细胞或搜集神经元所发出的讯号的神经元芯片，已引起广泛的注意。主要是由于神经元芯片在医药及生医等领域的潜在应用，如该神经元芯片可发展为一用来提供制药工业作为一种先进的药物筛检方式，以便能快速找出有研究前景的药物；或是将细胞与硅电路结合，创造出精密的神经元义肢，以治疗神经元的异常；亦或是发展出有机计算机等。由神经元芯片发展的技术观点来看，提供细胞紧密贴附于合适芯片表面，是开发神经元芯片的一首要条件。目前用于神经元系统的芯片，大多数系使用以硅基材为主的装置。然而，硅对于神经元的生物兼容性很低，为促进细胞贴附、生长及维持细胞的残存率，常会于硅芯片的表面涂布生物活性分子，如聚离胺酸、胶原蛋白、纤维黏连蛋白(fibronectin)、层黏连蛋白(laminin)等。但是，此类的生物活性分子一般是以物理性吸附方式涂布于硅基材的表面，涂布的生物活性分子在芯片的清洗步骤中极易脱落，即其并非为一永久性的修饰。一般硅芯片表面最常涂布的生物活性分子为聚离胺酸，随着时间的增长，以物理性吸附于硅芯片表面的聚离胺酸可能会逐渐产生脱附或是断炼的现象。部分研究报告中指出，当聚离胺酸的游离部分浓度过高时，会造成细胞毒性的现象产生。为了解决上述问题，有必要提供一种具有新的细胞培养基材的生物感测芯片，该细胞培养基材无需涂布聚离胺酸即能促进细胞的贴附生长，以改进聚离胺酸游离时对细胞所产生的毒性问题。
发明内容为解决现有技术中的缺陷和不足，本发明的目的在于提供一种生物感测芯片，其所检测的细胞与该芯片上的细胞贴附层间具有良好的附着效果，可促使细胞生长、分化，及降低细胞死亡率，可适用于长时间的检测分析上。为达到上述目的，本发明的生物感测芯片包含有一细胞贴附层以及一检测分析系统，该细胞贴附层为一III-V族氮化物，用于提供所要检测的细胞贴附与生长的场所。本发明的传感器可为新药筛检芯片、生医感测组件或类神经网络芯片。其中该新药筛检芯片，用以测试活体细胞对新药物的反应，可更准确筛选及预测新药的功能，并大幅縮短药物开发的时程；该生医感测组件，利用神经细胞于某些刺激特别敏感的特性，可用来侦测环境中状况的改变，如二氧化碳浓度的改变、酵素检测等；该类神经网络的应用，由该细胞贴附层提供细胞可生长的环境，并提供针对神经讯号的非侵入性研究的感测数组，建立与活体细胞的直接信息联系，以研究大脑功能与神经讯号的传播。其中，该类神经网络芯片包含一基板；一电路层，设于该基板的表面；以及一III-V族氮化物的细胞贴附层，形成于该电路层的表面，用以提供细胞贴附及生长的场所。进一步地，该电路层各边及该细胞贴附层下方分别设有复数个电极及与该电极电性相连接的复数条导线，用以量测细胞表面电位的变化情形。该电极为选自金、银、铼、钌、铑、钯、银、锇及铱等贵金属所组成的群组之一。该复数条导线可为导电性的铟锡氧化物、锡氧化物、掺杂锌氧化物的铟氧化物、镉锡氧化物、锑、铬、银、铜等金属或金属合金。根据本发明的一实施例，将细胞培养于具III-V族氮化物薄膜细胞贴附层的细胞培养芯片表面，与其它培养基材相较下，无须涂布聚离胺酸等生物活性分子即能加强所欲培养细胞与该细胞贴附层间良好的附着效果，并可促进细胞的生长与分化，降低细胞死亡率。该细胞培养芯片可应用于神经细胞、神经干细胞、类神经细胞、肌肉细胞及心肌细胞等细胞的培养上。此外，根据本发明的另一实施例，结合该具m-v族氮化物细胞贴附层的类神经网络芯片，利用该类神经网络芯片上层的m-v族氮化物细胞贴附层提供细胞贴附及生长的环境，并藉由输入电流至细胞中，刺激细胞活动，藉以观察细胞间的信号变化。图1A为本发明的细胞培养芯片示意图1B为本发明的细胞培养芯片另一示意图2为神经元于不同细胞贴附层基材的细胞培养芯片下培养6天后的生长情形；图2(A)为神经元于U型氮化镓细胞贴附层基材的细胞培养芯片下培养6天后的生长情形；图2(B)为神经元于N型氮化镓细胞贴附层基材的细胞培养芯片下培养6天后的生长情形；图2(C)为神经元于P型氮化镓细胞贴附层基材的细胞培养芯片下培养6天后的生长情形；图2(D)为神经元于硅细胞贴附层基材的细胞培养芯片下培养6天后的生长情形；图2(E)为神经元于TCPS(即未置入任何芯片的组织培养聚乙烯盘，作为控制组)细胞贴附层基材的细胞培养芯片下培养6天后的生长情形；图3为神经元的相对残存率；图4为神经元于不同细胞贴附层基材的细胞培养芯片下培养35天后的生长情形；图4(A)为神经元于氮化镓细胞贴附层基材的细胞培养芯片下培养35天后的生长情形；图4(B)为神经元于聚离氨酸细胞贴附层基材的细胞培养芯片下培养35天后的生长情形；图4(C)为神经元于TCPS(即未置入任何基材的组织培养聚乙烯盘，作为控制组)细胞贴附层基材的细胞培养芯片下培养35天后的生长情形；图5为神经干细胞于氮化镓芯片培养30天后的生长情形；图6A为培养于不同细胞贴附层基材的PC12细胞的Akt的磷酸化程度；图6B为培养于不同细胞贴附层基材的PC12细胞的ERK的磷酸化程度；图7A为本发明的类神经网络芯片的结构立体图7B为本发明的类神经网络芯片的结构俯视图。具体实施例方式下面结合附图及具体实施方式对本发明做进一步的详细说明。实施例一细胞于m-v族氮化物细胞贴附层上的培养评估在本实施例中，是将神经元培养于一具有ni-v族氮化物细胞贴附层的细胞培养芯片上，以评估in-v族氮化物细胞贴附层对于细胞贴附、生长及分化的影响。(i)细胞培养芯片的制备如图i所示，其为本发明的细胞培养芯片(i)，包含一基板(ii);以及一具in-v族氮化物薄膜的细胞贴附层(12)，形成于该基板的一表面，以提供细胞贴附及生长的场所。其中，该基板(11)为选自于蓝宝石(sapphire,A1203)、碳化硅、尖晶石(spinel，MgAl204)及砷化镓所组成的群组之一；该III-V族氮化物薄膜(12)系选自于氮化铝、氮化镓及氮化铟所组成的群组之一，以有机金属化学气相沈积法(metalorganicchemicalvapordeposition,MOCVD)、分子束磊晶法(molecularbeamepitaxy,MBE),或氢化物气相磊晶法(hydridev叩orphaseepitaxy,HVPE)成长于该基板(11)的一表面。此外，该细胞培养芯片(1)更可包含一缓冲层(13)，设于该基板(11)与该细胞贴附层(12)之间，以改善该III-V族氮化物薄膜细胞贴附层(12)与该基板(11)间晶格不匹配及热膨胀系数差异等问题；其中，该缓冲层(13)可为氮化铝或氮化镓。举例说明，但不限于，本发明的一较佳实施例的细胞培养芯片(1)，利用有机金属化学气相层积法将氮化镓薄膜(12)成长于一蓝宝石基板(11)上。于磊晶前，该蓝宝石基板(11)需事先进行表面清洗过程，以去除该基板(11)表面的油脂以及氧化层。于本实施例中，利用一分流水平反应器(separate-flowhorizontalreactor)制备该氮化镓细胞培养芯片(1)(详见，KuwanN，TsukamotoK，TakiW，HoribuchiK.GradualtiltingofcrystallographicorientationandconfigurationofdislocationsinGaNselectivelygrownbyvapourphaseepitaxymethods.JElectronMicrosc(Tokyo).2000;49:331-8.)。其主要反应物源系以石英板分离，分别导入流量为60mmol/min三甲基镓(trimethylgallium，TMGa)及5000cc/min氨气至上下流，以作为镓及氮的来源。首先，将蓝宝石基板(11)温度设于525'C下，成长一厚度为01000A的氮化镓缓冲层，该氮化镓缓冲层系为一成核层；接着，将该基板(11)温度提高至100(TC后，成长一氮化镓磊晶层于该氮化镓缓冲层上，制得一具U型氮化镓细胞贴附层(12)的细胞培养芯片(1)(以下简称U型氮化镓细胞培养芯片)。而具N型氮化镓细胞贴附层(12)的细胞培养芯片(1)(以下简称N型氮化镓细胞培养芯片)的制备，则是于制得该U型氮化镓细胞培养芯片(1)后，将温度提升至113(TC，于该U型氮化镓细胞培养芯片(1)的氮化镓薄膜(12)上通入硅甲烷(SiH4)气体，反应生成硅而掺杂入氮化镓薄膜表层(12)，其中该硅甲烷气体的硅莫耳流速介于0.43~0.65nM/min的间；至于具P型氮化镓细胞贴附层(12)的细胞培养芯片(1)(以下简称P型氮化镓细胞培养芯片)，系于该U型氮化镓细胞培养芯片(1)表面通入二茂镁((C5H5)2Mg，Cp2Mg)气体，反应生成镁而掺杂入该氮化镓薄膜层(12)表面。本发明的细胞培养芯片(1)，举例说明，但不限于，可适用于神经细胞、肌肉细胞、心肌细胞及神经干细胞等细胞的培养。(2)细胞培养芯片的前处理于培养细胞前，该培养细胞芯片(1)须先进行前处理首先，将该待测试的芯片裁剪成lci^的大小，以70%酒精清洗;接着以高压蒸气锅进行灭菌，再以大量的磷酸缓冲溶液(PBS)进行润洗。将灭菌完成的该细胞培养芯片(1)置入24孔洞的组织培养聚乙烯盘(TCPSplate，购自corning,美国纽约)中备用。(3)神经细胞的培养该神经细胞系取自7天大的韦斯大鼠(Wistarrat)小脑皮层的小脑颗粒状神经元(cerebellumgranuleneurons)。于胰蛋白酶及脱氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease，DNase)溶液存在下，藉由机械式破碎方式将神经元自小脑中分离；接着将该神经元接种于一已置入待测的细胞培养芯片的24孔洞培养盘上进行细胞培养，该培养盘中接种的细胞密度为1X106细胞/孔，且添加一补充10%胎牛血清、25mMKCl、青霉素G及链霉素的BME培养基(BasalMediumEagle)，并培养于37'C,95%空气/5%C02的大气湿度下。在接种完后一天，于该培养盘中加入IOuM的胞嘧啶阿拉伯醣(cytosinearabinoside)，以避免非神经元细胞的复制。相关的处理步骤参见LeviGetal.Autoradiographiclocalizationanddepolarization-inducedreleaseofacidicaminoacidsindifferentiatingcerebellargranuleneuronsJ.BiomedMaterRes2000;52:748-53.(4)神经元于细胞培养初期的生长情形的评估于本实施例中，将该神经元接种于一已分别置入具有不同细胞贴附层基材的细胞培养芯片(1)的24孔洞培养盘中进行培养，其中于该24孔洞培养盘中所置入的细胞培养芯片(1)，该细胞贴附层(12)的基材分别为U-型氮化镓、P-型氮化镓、N-型氮化镓、U-型硅及TCPS(未置入芯片的TCPS培养孔洞，作为控制组)。在观察细胞型态前，先以PBS冲洗附着于芯片上的细胞，接着于4。C环境下，以2.5%戊二醛(glutaraldehyde,GTA)的PBS固定样本l小时，再以PBS冲洗样本，并以分析级乙醇干燥后，利用金相显微镜(OlympusBX51M,日本)分析。表1为该小脑颗粒神经元于培养盘中培养第3、6、12天后的贴附密度及轴突与树突生长情形；其显示，培养于该氮化镓细胞培养芯片(1)表面3天后的小脑颗粒神经元呈现良好的贴附情形，并可见到神经元的轴突及树突的生长；当细胞培养于该硅芯片表面或直接培养于该TCPS时，神经元出现聚集现象，并无产生如该氮化镓芯片表面所呈现的密集神经网。当小脑神经元培养6天后(请配合图2所示)，培养于该氮化镓细胞培养芯片(1)表面的小脑颗粒神经元贴附数目无明显改变，但轴突及树突的数目有明显增加的趋势；而培养于该硅芯片表面的小脑颗粒神经元数目及轴突与树突的数目皆大幅减少。在小脑神经元培养12天后，培养于该氮化镓细胞培养芯片(1)表面的小脑颗粒神经元贴附数目无明显改变，而略呈现聚集的现象，且轴突及树突的数目有减少趋势，此现象可能系由于随着培养天数的增加，培养基里面所含的营养因子已显不足，细胞倾向互相聚集来达到存活的目的；而培养于该硅芯片表面或直接培养于该TCPS的小脑细胞已所剩无几。表1神经细胞在不同天数的贴附密度及轴突与树突的生长情形<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(5)神经元于细胞培养初期的残存评估由于乳酸去氢酶(LDH)系一稳定的细胞质酵素且存在于中央神经元，因此，神经元细胞的残存可藉由测量自活细胞释放至细胞外的LDH进行评估。于本实施例中，系将培养于不同细胞贴附层(12)基材的细胞培养芯片(1)中的活细胞暴露于一含0.2毫升TritonX-100的新培养孔洞中30分钟，以破坏细胞膜。接着，藉由测量自神经元释放至培养基的LDH进行定量测定，以作为神经元残存的指标。图3显示一相对神经元的残存情形，系测定自培养于不同细胞贴附层(12)基材的细胞培养芯片(1)对培养于TCPS的神经元所释放的LDH比值。由图中可知，培养在该硅芯片表面的神经元相对于单纯培养在该TCPS中的神经元，于3及6天后的相对残存率分别仅有74.5±15.5%及33.1±0.76%;而培养于该氮化镓细胞培养芯片(1)上的神经元与在TCPS的神经元相较下，其值皆超过或接近200%。由结果显示，与该硅芯片相较下，本发明所揭的该氮化镓细胞培养芯片(1)可明显改善神经元残存率，降低神经元死亡率。(6)神经元长天期培养评估图4显示为该小脑颗粒神经元于不同细胞贴附层基材的细胞培养芯片下培养35天后的生长情形，(a)氮化镓、(b)聚离氨酸(即于该TCPS表面涂布聚离氨酸)，及(c)TCPS(即未置入任何基材的组织培养聚乙烯盘，作为控制组)；其中，该小脑颗粒神经元的培养条件如前所述。图中显示，神经元培养于该氮化镓细胞贴附层的细胞数及轴突、树突的分化情形远高于培养于聚离氨酸及TCPS细胞贴附层的神经元。由其结果可知，本发明所揭的细胞培养芯片(1)有助于长天期细胞培养的细胞存活、生长及分化。(7)神经干细胞长天期培养的生长情形本实施例中的神经干细胞系取自怀孕母鼠，将取得的神经干细胞置于该氮化镓细胞培养芯片(l)进行培养，该神经元干细胞的培养条件类似前述的小脑颗粒神经元。图5显示为该神经干细胞于氮化镓细胞培养芯片(1)培养30天后的培养情形，如图中所显示，该神经干细胞于该氮化镓细胞培养芯片(1)上经过30天的培养后，具有良好的贴附，且该神经元干细胞并生长出明显的神经网。由结果显示，该氮化镓细胞培养芯片(1)可诱导神经干细胞的贴附及生长。(8)嗜铬细胞瘤(PC12)细胞的培养评估PC12细胞样本系分离自大鼠肾上腺髓质细胞瘤(adrenalpheochromocytoma)。其中，该PC12细胞系参考NeurotoxicologyandTeratology26(2004)397-406所述的培养条件。首先，将PC12细胞培养于含7.5。/。热灭活胎牛血清(heat-inactivatedfetalbovineserum)、7.5%马血清、2mMHEPES缓冲溶液以及44mM碳酸氢钠的DMEM培养基的组织培养瓶中，培养环境维持于37。C，95%空气/5%(:02的大气湿度下。待培养3天后，将PC12细胞移至一24孔洞的TCPS培养盘，培养于一DMEM/F12的培养基中；经过2小时的培养后，该培养基以添加50ng/mlNGF(神经生长因子)及0.25%BSA(牛血清蛋白)的无血清DMEM/F12取代。于培养1天后，利用西方墨点法分析PC12细胞的丝氨酸-苏氨酸激酶(serine-threoninekinase,Akt)、细胞外信息调节激酶(extracellularsignal-regulatedkinase,ERK)的磷酸化程度。图6为培养于不同细胞贴附层基材的PC12细胞的Akt与ERK的磷酸化程度;其中，于TCPS培养孔洞中所置放的培养基材分别为C:TCPS(未置入芯片的TCPS培养孔洞，作为控制组)、A:培养孔洞表面涂布聚离氨酸、N:U-型氮化镓、P:P-型氮化镓。于PC12细胞中，当磷酸化的Akt(P-Akt)表现量高时，可促进细胞的存活、抑制细胞凋亡；而当磷酸化的ERK(P-ERK)表现量高时，可促使细胞分裂或分化。如图显示，培养于氮化镓细胞培养层上的Akt与ERK磷酸化程度皆远大于培养于TCPS及聚离氨酸的细胞培养层；由此得知，本发明所揭的细胞贴附层(12)于神经生长因子(NGF)诱导PC12细胞分化时，有助于PC12细胞的存活及分化为外观似交感神经元的细胞。实施例二类神经网络芯片参见图7(A)和图7(B)所示，其显示为本发明的另一实施态样的类神经网络芯片(2)的结构示意图。其包含一基板(21);—电路层(22)，系设于该基板(21)的表面；以及一III-V族氮化物的细胞贴附层(23)，系形成于该电路层(22)的表面，用以提供细胞贴附及生长的场所。其中，该电路层(22)各边及该细胞贴附层(23)下方分别设有复数个电极(221)，以及与该电极(221)电性相连接的复数条导线(222)，用以量测细胞表面电位的变化情形。该类神经网络芯片(2)可另包含一细胞培养槽(24)，置于该电路层(22)表面，且竖立于该细胞贴附层(23)的周围。于本发明的类神经网芯片(2)，其中，该基板(21)可为玻璃基板或硅基板；该电极(221)选自金、银、铼、钌、铑、钯、银、锇及铱等贵金属所组成的群组之一；该复数条导线可为导电性的铟锡氧化物、锡氧化物、掺杂锌氧化物的铟氧化物、镉锡氧化物、锑、铬、银、铜等金属或金属合金；该III-V族氮化物薄膜(23)系选自氮化铝、氮化镓及氮化铟所组成的群组之一。综上所述，将细胞培养于本发明所揭示的III-V族氮化物细胞贴附层表面时，与其它贴附基材相较下，无须涂布聚离胺酸等生物活性分子即能提供该细胞良好的贴附效果，并可促进细胞的生长与分化，降低细胞死亡率，可用于神经细胞、神经千细胞、类神经细胞、肌肉细胞、及心肌细胞等细胞的培养上，于长天期的细胞培养亦能使细胞具有一高存活率、生长及分化。本发明的该细胞贴附层可应用于神经移植用的生物芯片将表面已培养神经细胞的III-V族氮化物细胞贴附层，移植到中央神经系统(CNS)，以重建因疾病或受伤所造成的神经缺损。本发明的该细胞培养层进一步可结合其它检测分析系统，作为a)生物感测芯片利用神经细胞于某些刺激特别敏感的特性，可用来侦测环境中状况的改变，如二氧化碳浓度的改变、酵素检测等；b)类神经网络的应用由该细胞贴附层提供细胞可生长的环境，并提供针对神经讯号的非侵入性研究的感测数组，建立与活体细胞的直接信息联系，以研究大脑功能与神经讯号的传播；C)新药筛检芯片用以测试活体细胞对新药物的反应，可更准确筛选及预测新药的功能，并大幅縮短药物开发的时程。权利要求1、一种生物感测芯片，包含有一细胞贴附层以及一检测分析系统，其特征在于该细胞贴附层为一III-V族氮化物，用于提供所要检测的细胞贴附与生长的场所。2、根据权利要求l所述的生物感测芯片，其特征在于该生物感测芯片可为新药筛检芯片、生医感测组件或类神经网络芯片。3、根据权利要求2所述的生物感测芯片，其特征在于该类神经网络芯片包含一基板；一电路层，设于该基板的表面；以及一ni-v族氮化物的细胞贴附层，形成于该电路层的表面，用以提供细胞贴附及生长的场所。4、根据权利要求3所述的生物感测芯片，其特征在于该电路层各边及该细胞贴附层下方分别设有复数个电极，以及与该电极电性相连接的复数条导线。5、根据权利要求i或3所述的生物感测芯片，其特征在于该in-v族氮化物为氮化铝、氮化镓或氮化铟。6、根据权利要求1或3所述的生物感测芯片，其特征在于该细胞可为神经细胞、神经干细胞、类神经细胞、肌肉细胞及心肌细胞。7、根据权利要求1或3所述的生物感测芯片，其特征在于该芯片还包含一细胞培养装置，且位于该芯片上的细胞培养层是设置在该细胞培养装置内。8、根据权利要求l所述的生物感测芯片，其特征在于该感测分析系统是用于检测细胞敏感性刺激物。全文摘要本发明公开了一种具III-V族氮化物细胞贴附层的生物感测芯片，为解决现有技术中细胞于芯片上贴附不佳的问题。其包括有细胞贴附层以及连结于细胞贴附层的感测分析系统，所述的细胞贴附层为III-V族氮化物，用于提供所欲感测细胞贴附与生长的场所。根据本发明的生物感测芯片，可加强细胞与细胞贴附层间的附着效果，促使该细胞的生长、分化，及降低细胞的死亡率，可应用于长时间的检测分析。文档编号C12Q1/02GK101182566SQ200610138729公开日2008年5月21日申请日期2006年11月14日优先权日2006年11月14日发明者陈启瑞申请人:颜宗贤