专利名称：绳状青霉菌的abfB-1基因的制作方法
绳状青霉菌的abffi-l基因本发明涉及自绳状青霉菌(Penicillium funiculosum)分离的abffi-l 基因及由该基因编码的具有oc-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性的ABFB-1多肽。绳状青霉菌为踝节菌属(Talaromyces ),属于Aspergilleae科。该微 生物从许多易受空气或水污染的有机基质中分离，表明该真菌具有含量 丰富的水解酶。这种酶混合物在动物饲料中的使用有助于解聚天然有机 物，且可能改善其可消化性。因此W099/57325描述了称为IMI378536 的产生酶混合物的绳状青霉菌林，这些酶特别适用作动物飼料。然而， 绳状青霉菌产生的酶混合物尚未作重要的生化定性。的确，对获得的发 酵液通常仅测得有限量的酶活性，如木聚糖酶和P-葡聚糖酶。这些活性 仅反映了混合物中的 一部分酶类。农业上的半分解纤维素化合物构成了继植物组织纤维素之后的第二 大多糖储备物。该类特征是具有多种多样的杂多糖，主要代表有木聚糖、 阿拉伯聚糖、半乳聚糖、葡聚糖和甘露聚糖。糠醛形式的阿拉伯糖广泛 存在于杂多糖，如阿拉伯聚糖和阿拉伯木聚糖中。阿拉伯聚糖为聚合物， 以a-l-5 4定与阿拉伯呋喃糖残基相连接，可在0-2或0-3位被1或2个 阿拉伯糖残基取代。至于阿拉伯木聚糖，a-L-阿拉伯呋喃糖残基通过a-l-3 和a-l-2键与主要的(3-l-4-吡喃木糖链连接。在这些侧链上阿拉伯糖残基 的存在可限制许多工业应用(如增强动物饲料可消化性)中的半分解纤 维素化合物的酶水解作用。裂解a-L-阿拉伯呋喃糖苷4囊的酶可与木聚糖 酶协作，以允许阿拉伯木聚糖和阿拉伯聚糖的水解。因此，阿拉伯糖酶活性(内切，外切阿拉伯糖酶以及,主要是a-L-阿拉 伯呋喃糖酶活性)可积极协同木聚糖酶有助于半分解纤维素化合物的解 聚。半分解纤维素化合物和果胶化合物可代表植物中高达50%的总糖， 它们构成动物的主要能源。这些化合物可消化性的增强与半分解纤维素 化合物中阿拉伯糖残基取代程度的降低有关(Brice, R.E., Morrison, I.M. 1982, Carbohydr. Res. 101: 93-100)。
水解L-阿拉伯糖残基之间键的酶已自微生物如细菌或丝状真菌中分离。阿拉伯糖苷酶主要由a-L-阿拉伯呋喃糖酶(EC3.2.1.55)组成，该酶能 水解来自L-阿拉伯木聚糖或(如阿拉伯聚糖和阿拉伯半乳聚糖的)化合 物的非还原性的a-L-阿拉伯呋喃糖残基。根据它们的蛋白质序列相似性，已将a-L-阿拉伯呋喃糖酶 (EC3.2.1.55)分为两个糖苦水解酶的家族(GH51和GH 54)。这两个家族 因其对包含于多糖中底物的特异性而不同。第 一族(GH 51)包含A型阿拉 伯呋喃糖酶，该酶仅对a-l-5连接的小线性结构阿拉伯呋喃低聚糖起作 用。第二族由B型阿拉伯呋喃糖酶(GH54)组成，该酶催化阿拉伯呋喃低 聚糖化合物侧链的a-l,5、 a-l,3和a-l,2 4建的水解。已自许多细菌及丝状真菌中将B型阿拉伯呋喃糖酶(ABFB)分离。 曲霉属(Aspergillus )最具代表性，但也已将它们自木霉属(Trichoderma ), 青霉菌属(Penicillium)和镰孢菌属(Fusarium)中分离。WO 96/29416、 WO 96/06935、 WO 2004/018662和US 5,989,887描述 黑曲霉阿拉伯呋喃糖酶基因。蛋白质序列对比显示黑曲霉abffi蛋白与绳 状青霉素(P. funiculosum) ABFB-1蛋白的同一性为72.4%。这些申请 没有描述任何 一 种多肽在动物营养中应用所必需的特征。Clinche et al. (J. Agric. Food Chem., 45, 2379-2383， 1997)已描述三种 来自土曲霉(Aspergillus terreus ) 的可能用于酿酒的a-L-阿拉伯呋喃糖 酶。Gielkens et al.(Microbiology, 145, 735-741, 1999)已描述了构巢曲 (Aspergillus nidulans ) abdb基因。白曲霉(Aspergillus kawachii)禾口泡盛曲霉(Aspergillus awamori) 的abffi基因已#皮Koseki et al.描述(J. of Bioscience禾口 Bioengineering, Vol. 96， No. 3, 232-241， 2003)。这些酶在日本酒shochu的发酵中具有应 用。来自丝状真菌里氏木霉(Trichoderma reesei) 的abffi基因已被 Margolles-Clark et al.描述(Applied and Environmental Microbiology, 3840-3846， 1996)。Panagiotou et al.也已描述了两种来自尖3包镰刀菌(Fusarium oxysporum)的细胞外o;-L-阿拉伯呋喃糖酶(Can J Microbiol. 2003: 49(10): 639-4)。Carvallo et al. (Mycol. Res" 107 (4)， 388-394, 2003)已描述了来自产 紫青霉菌(Penicillium purpurogenum)的B型ot-L-阿拉伯呋喃糖酶。蛋 白质序列比对显示产紫青霉菌abf-1蛋白与绳状青霉菌ABFB-1蛋白的 同一性为85.6%。此文没有描述任何一种多肽在动物营养应用中所必需的 特征。然而，Sakamoto et al. (FEBS Letters 560, 199-204, 2004)已描述了产 黄青霉菌(Penicillium chrysogenum) abnx基因，其仍编码与ABFB活性 不同的阿拉伯糖酶活性。然而，这些ABFB酶不具备应用于动物飼料所需的最适特性。的确，为了可用于动物饲料，ABFB必须具有与处理相容的特性，可 预期用于该饲料的饲料接受所述处理。特别是，所用酶的活性在处理温 度和pH条件下必须稳定，而且，如果可能，其在制备这些饲料的过程中 以及在消化这些伺料的动物消化系统中的条件下是最佳的。此外，这些酶必须对杂多糖(阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半 乳聚糖)具有广i普作用(去除分支)，以有效增强动物对饲料的可消化性。 增强饲料可消化性可能提高它们的营养价值。因此，对天然底物阿拉伯 木聚糖和阿拉伯聚糖具有增强的的特异性(立体特异性、对映选择性)、活 性或亲和力的酶对于动物饲料非常重要。本发明描述了 一种适用于动物营养的绳状青霉菌L-阿拉伯呋喃糖酶B(ABFB-1)，及编码该酶的基因。本发明还涉及保留相同催化特性的ABFB-1的同系物、变异体和片段。有利的是，根据本发明的ABFB酶具高最适温度。 本发明的另一优点在于绳状青霉菌AFBF-1的表达在该真菌中在用于诱导纤维素水解酶和半纤维素水解酶的条件(用于生产纤维素水解酶和半纤维素水解酶的工业型培养基)下被天然高诱导。根据本发明的酶也具有其它工业或工农业用途。特别值得一提的是 通过发酵处理果汁、造纸、将半分解纤维素生物质转变为燃料或化学制 品、造酒。序列描述SEO ID No. 1:绳状青霉菌abfB-l基因的基因组序列。 SEO ID No. 2:具有B型a-L-阿拉伯呋喃糖酶活性的绳状青霉菌 ABFB-1多肽的序列。SEO ID No. 3: Xbal-abffi引物。 SEO ID No. 4: HindIII-abfB引物。发明描述本发明涉及一种适用于动物营养的多肽，其包括一种选自以下多肽 的多肽画SEQ ID No. 2的多肽，画序列介于SEQ ID No. 2的位置28和位置507之间的多肽，-SEQ ID No. 2的多肽片段，其具有a-L-阿拉伯吹喃糖酶B活性，-一种多肽，其具有a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性且显示与SEQ IDNo. 2的多肽具有至少90%的同一性。本发明还涉及多核苷酸，其编码a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性，选自以下多核苷酸-序列在SEQ ID No. 1的位置845与位置2368之间的多核苷酸， -序列包括在SEQ ID No. 1的位置927与位置2368之间的多核苷酸， -编码上述多肽的多核苷酸。本发明的另一个对象为一种多核苷酸，其具有SEQ ID No. 1代表的 序列或与SEQ ID No. 1互补的序列。本发明还涉及表达盒，其在转录方向上包含 -在宿主生物中有功能的启动子；
-根据本发明的多核苦酸；以及 -在相同宿主生物中有功能的终止序列。本发明另 一个对象为载体，其包含根据本发明的多核苷酸和/或根据 本发明的表达盒。本发明还涉及宿主生物，该生物被根据本发明的多核苷酸、根据本 发明的表达盒和/或根据本发明的载体转化。在在本发明的一个实施方案中，宿主生物选自酵母和丝状真菌。 优选地，宿主生物为绳状青霉菌^^。本发明还涉及动物的营养添加物，包括根据本发明的多肽、根据本 发明的宿主生物或根据本发明的宿主生物的发酵液。 优选地，该营养添加物为液体形式或4分末形式。本发明的另 一 方面为饲料，其包含根据本发明的动物营养基质和动 物营养添加物。本发明还涉及根据本发明的ABFB多肽或根据本发明的宿主生物用 于制备动物营养添加物或饲料营养添加物的用途。本发明的另一个对象是根据本发明的ABFB多肽或根据本发明的宿 主生物用于水解阿拉伯呋喃低聚糖化合物的a - L -阿拉伯呋喃糖4囊的用途。多肽本发明因此涉及具有a-L-阿拉伯吹喃糖酶B活性的ABFB多肽。 优选地，将这些多肽分离自绳状青霉菌。表述"a-L-阿^立伯呋喃糖酶B"应,皮理解为a-L-阿拉伯呋喃并唐酶 (EC 3.2丄55)B型(GH 54)，其催化包含于阿拉伯呋喃低聚糖化合物侧链的 a-l，5、 a-l,3和a-l,2 4建的水解。绳状青霉菌抹IMI378536的a-L-阿拉伯呋喃糖酶B由SEQ ID No.2 表示。表述"适用于动物营养的多肽"应被理解为其特征使得其适于动物营养的多肽。用于动物营养必需的特;f正特别为pH及温度，在此pH及温度
下酶具有活性。的确，动物消化系统的pH为酸性，因此酶在此pH时必 须保持活性，这是为了在L-阿拉伯糖残基的水解中保持其活性。此外， 控制营养添加物或动物饲料中的酶的条件包括处理及高于室温的温度。 所用的酶活性因此必须在处理条件下，特别是在所述温度条件下稳定。根据本发明的一个实施方案，多肽在酸性pH时，例如低于5,优 选低于4时显示a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性。而且，根据本发明的一个 实施方案,多肽在pH 2与pH 3.5之间时显示最佳的a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性。根据本发明优选的实施方案，多肽在高于室温的温度时显示a-L-阿 拉伯呋喃糖酶B活性。优选地，本发明的多肽在40°C与70。C之间，更 优选50°C与65°C之间的温度下具有最佳的a-L-阿拉伯^^喃糖酶B活性。在优选的实施方案中，将根据本发明的多肽糖基化。特别是，SEQID No. 2的多肽在氨基酸92和氨基酸376处具有N-糖基化位点。在优选的 实施方案中，将SEQ ID No. 2多肽的位置92和376处的天冬酰胺残基糖 基化。绳状青霉菌的a-L-阿拉伯呋喃糖酶B是由真菌分泌到其细胞外环境 的酶。SEQIDNo. 2的多肽因此包括27个氨基酸的信号肽。本发明的对 象还为裂解信号肽后获得的成熟多肽。特别是，本发明涉及序列介于SEQ ID No. 2的位置28与位置507之间的多肽。在另 一个实施方案中，SEQ ID No. 2多肽的信号肽可被异源信号肽取代，用于由异源宿主生物表达和分 泌SEQ ID No. 2的多肽。本发明还涉及具有a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性的SEQ ID No. 2的 多肽的片段。术语多肽的"片段"指下述多肽，所述多肽包括其所来源的多肽的一 部分而不是全部。因此，本发明涉及一种多肽，其包括SEQ ID No. 2多 肽的至少100、 200、 300、 400或500个氨基酸的片段。SEQ ID No. 2的多肽的这一片段保持其a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性。 本发明因此涉及SEQIDNo.2的多肽的生物学活性片段。术语"生物学 活性片段"指保持其所来源的多肽的功能的多肽片段。SEQ ID No. 2的 多肽的生物学活性片段因此保持绳状青霉菌ABFB-1多肽的功能。这些 生物学活性片段具有a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性。制备多肽片段的方法 和测定a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性的技术为本领域技术人员所熟知。本发明的对象还为多肽，其具有L-阿拉伯呋喃糖酶B活性且显示 与SEQIDNo. 2的多肽至少90%的同一性。优选地，这些多肽具有与SEQ IDNo. 2的多肽相同的特性，特别是相同的催化特性。优选地，这些多肽 分离自绳状青霉菌的其它抹或其它丝状真菌。或者，这些多肽可通过例 如定点诱变技术获得。本发明的对象为具有与SEQ ID No. 2的多肽至少90%, 95%, 98% 以及优选至少99%相同的氨基酸的多肽。将表述相同的氨基酸理解为两条序列之间不变的或无变化的氨基 酸。这些多肽与SEQ IDNo. 2的多肽相比可显示至少一个氨基酸的缺失、 增加或取代。本发明的对象还为多肽，其显示与SEQIDNo. 2的多肽的相似性为 至少90%、 95%、 98%,以及优选至少99%。将表述相似性理解为蛋白质或核酸序列之间相似性的测量。这些多 肽与SEQ ID No. 2的多肽相比可显示出至少一个氨基酸的缺失、增加或 取代。以分数定量的两条序列之间的相似程度基于序列同一性和/或序列 保守取代的百分比。员所知。可使用例如载体NTi 9.1.0，比对程序AlignX(聚类w算法(Clustal W algorithm) ) (Invitrogen INFORM AX, http:〃www. invitrogen.com)。优选 地，使用默认参数。将根据本发明的多肽自其自然环境分离或纯化。多肽可通过各种方 法制备。特别是，这些方法是从自然来源(如天然表达这些多肽的细胞) 中纯化、通过合适的宿主细胞生产重组的多肽及其随后的纯化、通过化 学合成的生产或，最后，这些不同途径的组合。这些不同生产方法为本 领域技术人员所熟知。因此，可将本发明的ABFB多肽自绳状青霉菌分 离。在另一个实施方案中，本发明的ABFB多肽自表达根据本发明的 ABFB多肽的重组宿主生物中分离。
本发明的对象还为融合蛋白、重组蛋白或嵌合蛋白，包括根据本发 明的多肽。术语"多肽"也指被修饰的蛋白质和多肽。根据本发明的多肽具有ABFB活性并优选地保留绳状青霉菌 ABFB-1酶的催化特性。特别是，这些多肽在60。C和pH 3.4时具有最佳 活性。多核香酸本发明还涉及编码a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性的多核苷酸。优选 地，这些多核香酸编码绳状青霉菌a-L-阿拉伯呋喃糖酶B。根据本发明，表述"多核苷酸"理解为单链核苷酸链或其互补链，其可 以是DNA或RNA型或可为互补或基因组DNA型的双链核香酸链。优 选地，本发明的多核芬酸为DNA型，特别是双链DNA。术语"多核苷 酸"也指被修饰的多核苷酸。可将本发明的多核苷酸自其自然环境分离或纯化。优选地，本发明 的多核苷酸可通过Sambrook et al描述的常规分子生物学技术(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989)或通过化学合成制备。在第一个实施方案中，本发明涉及多核苷酸，其序列介于SEQ ID No. 1的位置845与位置2368之间。该多核苷酸编码SEQ ID No. 2的绳 状青霉菌ABFB-1酶。在第二个实施方案中，本发明涉及多核苷酸，其序列介于SEQ ID No. 1的位置927与位置2368之间。该多核苷酸编码绳状青霉菌信号肽 裂解后的成熟的ABFB-多肽。本发明还涉及多核苷酸，其与序列介于SEQ ID No. 1的位置845与 位置2368之间的多核香酸和/或与序列介于SEQ ID No. 1的位置927与 位置2368之间的多核香酸具有至少70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%、 98%,优选地至少99%的同一性。这些多核香酸编码oc-L-阿^立伯呋喃糖酶 B活性。优选地，这些多核香酸编码绳状青霉菌a-L-阿拉伯呋喃糖酶B。表述相同的核普酸理解为表示两个核苷酸序列不变或无变化。这些 多核苷酸与对照多核苷酸相比显示出至少一个核香酸的缺失、增加或取 代。
本发明还涉及多核苷酸，其与序列介于SEQ ID No. 1的位置845与 位置2368之间的多核苷酸和/或与序列介于SEQ ID No. 1的位置927与 位置2368之间的多核苷酸具有至少70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%、 98%，优选至少99%的相似性。这些多核苷酸编码ot-L-阿拉伯呋喃糖酶B 活性。优选地，这些多核苷酸编码绳状青霉菌oc-L-阿拉伯呋喃糖酶B。表述相似性理解为蛋白质或核酸序列之间相同之处的测量。这些多 核苦酸与对照多核香酸相比可显示出至少一个核苷酸的缺失、增加或取 代。以分数定量的两条序列之间的相似程度基于序列同一性和/或序列保 守取代的百分比。测量和鉴定核酸序列之间的相同程度和相似程度的方法为本领域技 术人员所熟知。可使用例如载体NTi载体NTi 9.1.0，比对程序AlignX (聚 类w算法)(Invitrogen INFORMAX, http:〃www.invitrogen. com)。优选地, 使用默认参数。优选地，与对照多核苦酸具有相似程度的多核苷酸保持对照序列的 功能。在本文情况下，多核苷酸编码a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性。本发明还涉及多核苷酸，其能与序列介于SEQ ID No. 1的位置845 与位置2368之间的多核苷酸和/或与序列介于SEQ ID No. 1的位置927 与位2368之间的多核苦酸选择性杂交。优选地，将选择性杂交在一般严 格性条件下完成，优选在高严格性条件下完成。这些多核苷酸编码a-L-阿拉伯吹喃糖酶B活性。优选地，这些多核苷酸编码绳状青霉菌a-L-阿拉伯呋喃糖酶B。表述"能选择性杂交的序列"被理解为，根据本发明，在明显高于背 景噪音的水平上与对照序列杂交的序列。由能选择性杂交的序列与对照 序列之间的相互作用产生的信号水平比产生背景噪音的其它DNA序列 的相互作用的信号水平强，通常强10倍，优选强100倍。允许选择性杂 交的严格杂交条件为本领域技术人员所熟知。通常，在给定pH和给定离 子强度下，杂交和洗涤温度比对照序列的Tm至少低5°C。通常，用于 15至50个核普酸的多核苷酸的杂交温度至少为30。C，用于多于50个核 香酸的多核苦酸的杂交温度至少为60。C。举例说明，将杂交在以下緩冲 液中完成6x SSC、 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)、 1 mM EDTA、 0.02% PVP、
0.02%Ficoll、 0.02% BSA、 500吗/ml变性鲑鱼精子DNA。例如在低严格 性的2x SSC、 0.1% SDS緩冲液中，一^殳严格性的0.5x SSC、 0.1% SDS 緩沖液中以及高严才各性的O.lx SSC、0.1% SDS緩沖液中成功地完成洗涤。 当然，可将杂交根据本领域技术人员所熟知的其它常用方法完成(特别 参见Sambrook et al.， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989 )。优 选地，与对照多核苦酸选择性杂交的多核苷酸保持对照序列的功能。在 本文情况下，多核苷酸编码ot-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性，其与序列介于 SEQ ID No. 1的位置845与位置2368之间的多核香酸和/或与序列介于 SEQ ID No. 1的位置927与位置2368之间的多核香酸选择性杂交。本发明通常涉及编码根据本发明的多肽的多核苷酸。由于遗传密码 的筒并，不同多核苷酸可编码相同的多肽。本发明的另一对象为序列如SEQ ID No. 1所示的多核苷酸。SEQ ID No. 1的多核香酸包括位于绳状青霉菌abffi-1基因开放读码框(ORF)侧 翼的序列。特别是，它们是abffi-1基因的启动子和终止序列。可将abfB 基因从其同源调控序列表达，特别是在绳状青霉菌中或其它丝状真菌中 过表达。在另一个实施方案中，例如可将abffi基因在各种宿主生物如细菌、 酵母和真菌中表达。在本发明的SEQ ID No. 1的启动子控制下或在异源 启动子的控制下，可将abffi基因在宿主生物中表达。表达盒根据本发明的 一个实施方案，使用本领域技术人员所熟知的克隆技 术，将编码根据本发明的多肽的多核苷酸插入表达盒。该表达盒包括转 录和翻译编码根据本发明的多肽的序列所必需的元件。有利的是，该表达盒既包括可能引起宿主细胞产生多肽的元件，也 包括调节该表达所必需的元件。这些表达盒在转录方向上包含-在宿主生物中有功能的启动子；-根据本发明的多核苷酸；-在相同宿主生物中有功能的终止序列。
启动子的选择将依赖于被选择用于表达目的基因的宿主生物。 一些启动 子允许组成型表达，而其它启动子则相反为诱导型。在真菌中有功能的启动子中，可特别提到构巢曲霉(Aspergillus nidulans )甘油醛-3-磷酸脱 氢酶的启动子(Roberts et al., Current基因t. 15: 177-180, 1989)。在细菌 中有功能的启动子中，可特别提到T7噬菌体RNA聚合酶的启动子 (Studier et al.， Methods in enzymology 185: 60-89, 1990)。在酵母中有功能 的启动子中，可提到GAL1基因(Elledge et al., Proc Natl Acad Sciences, USA. 88: 1731-1735， 1991)或酿酒酵母(S. cerevisiae ) GAL4的启动子以 及ADH启动子。所有这些启动子已有文献描述，且为本领域技术人员 所熟^p。将选择表达盒用于绳状青霉菌中的表达，所述表达盒例如包括组蛋 白H4.B启动子、天冬氨酸蛋白酶启动子或csl13启动子(WO 00/68401)。根据本发明的表达盒可额外包括多肽或多核苷酸表达所必需的任何 其它序列，例如允许分泌宿主生物产生的多肽的调控元件或信号序列。 特别是，可能使用任何调控序列，所述调控序列可能提高插入到表达盒 中的编码序列的表达水平。特别地，根据本发明，可与调控启动子序列 组合使用其它调控序列，这些调控序列位于启动子与编码序列如转录激 活子("增强子")之间。可将各种各样的终止序列用于根据本发明的表达盒中，这些序列可终止转录及mRNA的多腺苷酸化。可使用在所选宿主生物中有功能的任 何终止序列。将选择表达盒用于在绳状青霉菌中的表达，所述表达盒例如包括组 蛋白H4.B终止子、天冬氨酸蛋白酶终止子或csl13终止子的 (WO 00/68401)。本发明的对象还为包含根据本发明的表达盒的多核苷酸，有利的是 将根据本发明的表达盒插入载体。载体
本发明因此还涉及复制或表达载体，所述载体用于转化包含至少一 个多核香酸或一个根据本发明的表达盒的宿主生物。特别是，该载体可 对应为已插入根据本发明的多核苷酸或表达盒的质粒、粘粒、噬茵体或 病毒。构建这些载体和将本发明多核苷酸插入这些载体的技术为本领域 技术人员所熟知。通常，可能使用在宿主细胞中能保持自身、自主复制 或增殖的任何载体，以特别诱导多核苦酸或多肽的表达。本领域技术人 员将根据待转化的宿主生物和根据所用的转化技术选择合适的载体。特别是，将本发明的载体用于转化宿主生物，用于在宿主生物中复 制载体和/或表达根据本发明的多肽。本发明还涉及制备根据本发明的多肽的方法，该方法包括以下步骤-使用包含根据本发明的表达盒的表达载体和/或根据本发明的多 核苷酸转化宿主生物，-分离宿主生物产生的多肽。宿主生物本发明的对象还为转化宿主生物的方法，所述方法通过将至少 一个 根据本发明的多核苷酸或表达盒或载体整合入所述宿主生物来完成。可 将多核苷酸整合入宿主生物的基因组，或多核苷酸能在宿主生物中稳定地复制。转化宿主生物的方法为本领域:技术人员所熟知，且在文献中被 4艮好地描述。本发明还涉及一种宿主生物，其可被根据本发明的多核苷酸、表达 盒或载体转化。特别是，根据本发明，表述宿主生物理解为选自细菌、 酵母和真菌的任何单或多细胞、低等或高等的生物。表述宿主生物理解为非人生物。有利的是，酵母选自毕赤酵母(Pichiapastoris)、酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisae ) 、 Yarrowia lipolytica 和 Schwanniomyces occidentalis。真菌选自曲霉(Aspergillus)和青霉菌(Penicillium)，优选 选自绳状青霉菌、Trichoderma reesei、 黑曲霉(Aspergillus niger )、 泡盛 曲霉(Aspergillus awamori )、白曲霉(Aspergillus kawachii)禾口 Trichoderma koningii。在优选的实施方案中，宿主生物为绳状青霉菌抹，其中根据
本发明的ABFB多肽,皮表达或过表达。在这些生物中，用于构建载体、转化宿主生物和表达异源蛋白质的:技术一皮广泛描述于文献中(Ausubel F.M. et al.， "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes 1和2, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, 1989; T. Maniatis, E.F. Fritsch， J. Sambrook, Molecular Cloning A laboratory Handbook, 1982)。食品添加剂和饲料-本发明因此涉及提供a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性的食品添加剂。摄 入这种类型酶活性可能增强食品的可消化性并提高其营养价值。表述营养添加物理解为有意地、通常以小量添加至食品以改善其营 养特性或可消化性的物质。用于动物的营养添加物可包含例如维生素、 无机盐、氨基酸和酶。通常，用于动物的营养添加物包括根据本发明的多肽,根据本发明的 宿主生物或根据本发明的宿主生物的发酵液。因此，可将具有根据本发 明的a-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性的多肽自绳状青霉菌株或自用于制备 动物营养添加物的重组宿主生物中纯化或分离。或者，可将绳状青霉菌 抹或产生AbfB多肽的宿主生物直接用于制备动物用营养添加物。在本 发明的优选实施方案中，将绳状青霉菌抹或根据本发明的宿主生物的培 养上清液或发酵液用于制备动物用营养添加物。当将ABFB多肽通过绳 状青霉菌株或宿主生物分泌时，该实施方案特别有利。通常，将该培养 上清液浓缩或冻干以制备营养添加物。因此，本发明还涉及制备ABFB酶的方法，该方法包括以下步骤a) 在用于诱导ABFB表达的条件下培养绳状青霉菌株或根据本发 明的纟皮转化的宿主生物，b) 分离包括ABFB酶的培养上清液。 然后可将该培养上清液或发酵液浓缩或冻干以形成食品添加剂或飼料。如果宿主生物在培养基中不分泌ABFB酶，增加打开细胞并纯化细 胞提取物的步骤可能是必需的。 本发明的营养添加物包含(X-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性，但可能还包 含其它营养物质如维生素、氨基酸或无机盐。根据本发明的添加剂增加饲料的可消化性，因此特别有助于更好地 增强基于谷类(小麦、大麦、玉米、燕麦、黑麦等)和基于油渣饼(大 豆、向日葵、油菜籽等)的食物的营养价值。本发明还涉及包含根据本发明的营养基质和营养添加物的饲料。通 常将这些饲料以膳食或颗粒形式提供，其中加入根据本发明的添加剂。表述饲料理解为可作为食物提供给动物的任何事物。饲料包含根据本发明的多肽、根据本发明的宿主生物或根据本发明 的宿主生物的发酵液。用于密集的动物育种，这些饲料通常包含营养基质和营养添加物。表述营养基质理解为构成动物飼料配给的主要部分的物质，例如由谷 类、蛋白和动物和/或植物来源的脂肪的混合物组成。动物用营养基质适合用作这些动物的食物，并为本领域技术人员所熟知。通常，这些营养基质包含例如玉米、小麦、豌豆和大豆。这些营养基质适于它们所指定的各种动物的需要。这些营养基质可能已经包含 营养添加物如维生素、无机盐和氨基酸。在优选的实施方案中，本发明涉及用于单胃动物，特别是用于家禽和猪的祠料。家禽特别包括蛋鸡、broilers、火鸡和鸭子。猪特别包括成 猪和小猪。
附图1:在40。C下，存在5 mM PNPAF时测定ABFB-1酶在Mcllvaine 緩冲系列(pH 2.2至8)中的最佳pH。附图2:在5 mM PNPAF存在下，测定在最佳pH时ABFB-1酶的最佳温度。附图3:当PNPAF为0.5 mM至5 mM的范围时，在pH 3.4和60°C 时，测定ABFB-1的动力学常数Km和Vm(l/Vi = f(l/S)。附图4:根据绳状青霉菌生长情况评价abffi-l和abffi-2基因的相对
定量差异表达。 实施例L-阿拉伯呋喃糖酶B活性测定的发展在包含0.15% provasoy和0.3%纤维素的混合添加剂的M2培养基上 将绳状青霉菌培养40小时后，测定L-阿拉伯呋喃糖酶活性。在培养48 小时和72小时时收集样品。培养在200ml锥形瓶中完成，使用了50ml 体积。通过在50 mM pH 5的乙酸钠緩冲液中水解5 mM对硝基苯基-(L-阿拉伯呋喃糖苷(PNPAF)测定活性。将50 |ul培养上清液与在50。C预热 的250 iil底物將育15分钟。加入500 |id 0.5 MNaOH停止反应。在405 nm 处测定对硝基苯基(PNP)的释放，使用的摩尔消光系数为 17 000M-l.cm-l。将酶单位定义为在上,述条件下每分钟水解1 )umol PNPAF的酶的量。对于绳状青霉菌培养物，在培养48 h后我们获得 20mU.ml-l,在培养72 h后获得112 mU.ml-l 。这些结果与文献一致，的 确对于黑曲霉，根据培养中使用的诱导物，观察到100至600mU.ml-l 等级的活性。将绳状青霉菌abffi ORF克隆进酿酒酵母从绳状青霉菌的基因组 DNA开始，借助引物 (HindlII-abfB/Xbal-abffi)通过PCR扩增abffi基因，应用以下条件(94。C 30 sec; 62°C 30 sec;在72。C 1 min 30 sec)进行30个循环。将PCR产物 克隆入商品化载体pGEM-T(tm)easy中。PCR引物对的序列XbaI陽abfB-l: >5，-TCTAGAATGTTTCCAAGAATAAAACCAG-3，<HindIII-abffi-1: >5，-AAGCTTTCATGCAAAGGCAGTCT-3，<将1534 bp的HindlII/Xbal片段自载体 pGEM-T切除，在 HindlII/Xbal位点亚克隆入穿梭载体pJL52(placl95-PGK/CYCl)。对于异 源表达，abffi基因因此受编码磷酸甘油酸酯激酶(酿酒酵母)的基因的
组成性PGK启动子和编码细胞色素C氧化酶活性的基因的CYC1终止 子(酿酒酵母)的控制。将新的表达盒称为pOT-Ol。酉良酒酵母林JF弁1194(CEN.PK113-5D)是来源于带有ura 3-52营养缺 陷型的CEN.PK 122抹的克隆，以表达载体pOT-02转化(乙酸锂/热激法)。 在无尿嘧啶的选择性平板(URA3标记)上，以表型互补选择转化株。选捧6个转化抹以测试培养上清液中阿拉伯呋喃糖酶B活性的存 在。在50ml无尿嘧啶的YNB培养基(除野生型对照株外)中，将转化 才朱培养24小时。以上文描述的方法测定培养上清液中的阿拉伯呋喃糖酶 活性。最佳pH的确定将来源于绳状青霉菌的编码阿拉伯呋喃糖酶B活性的abffi-l基因 克隆入酿酒酵母中。在几个转化4朱中4企查阿拉伯呋喃糖酶B活性的存在 后，选择一种转化抹并在生长24h后测定培养上清液中的ABFB活性。 在200 ml锥形瓶(工作体积50 ml)中完成培养。在Mcllvaine緩沖系列(pH 2.2至8.0)中存在5 mM p-硝基苯基 -ot-L-阿拉伯呋喃糖苷(PNPAF)时测定活性。将80(il培养上清液与在 40。C预热的320 |al底物孵育10 min。加入1 ml 1M Na2C03停止反应。在 405 nm"处测定p-硝基苯基的释放。将一个酶单位定义为上述条件下每 分钟水解1 iumol PNPAF的酶量。活性曲线如图1所示。在pH 3.4时 ABFB-1具有最佳活性，并且在pH 5时保持65%的活性。最佳温度的测定使用相同的流程，我们确定了 ABFB-1活性的最佳温度。在pH3.4 的各个温度下将酶在Mcllvaine缓冲液中孵育10min。活性曲线如图2 所示。绳状青霉菌ABFB-1在60。C时具有最佳活性。因此ABFB-1具有 高于所述ABFB的最适温度。如果选择酶ABFB-1的最适pH和温度(pH3.4 和60。C),则观察到ABFB-1的活性为在pH 5和40°C的乙酸盐緩沖液中测定的活性的4倍(424 mU vs 102 mU)。 K^和V!的测定在上面确定的最佳条件下，通过测量PNPAF随着时间的水解测定 ABFB-1的动力学常数(Km和Vm)。在pH 3.4緩沖液中，建立0.5与5 mM范围的底物(PNPAF)浓度。 在60°C监控水解的动力学10分钟。将结果根据双反推法(double inverse method ) (Lineweark和Burk)处理，如图3所示。ABFB-1的Km值为1 mM。通过比较，文献中这类酶的Km值根据 所研究的属和真菌的种类在0.05至1.2 mM范围变化。在上述条件下 ABFB-1具有521 mol PNPAF/mo1酶/min的最大水解速度(Vm)。测定ABFB-1酶的分子量为确定ABFB-1酶的分子量，将源于基本培养基的生长突变体(酿 酒酵母)的培养上清液浓缩200倍，在100°C煮沸5分钟变性，然后储 存于SDS-聚丙烯酰胺凝胶中。在野生型菌抹中观察到细胞外蛋白质的量极低。对于突变体， ABFB-1酶被分泌在培养上清液中。主要是与酿酒酵母细胞外蛋白的基本 水平有关。分子量的确定借助于尺寸标记物SeeBlue (Invitrogen)完成。结果表示 于表1中。子贞测的MW在凝胶上评价的MWABFB-15365表1:以Kda计的ABFB-1分子量我们比较通过算法载体NTi预测的分子量与变性SDS-PAGE凝胶电
我们比较通过算法载体NTi预测的分子量与变性SDS-PAGE凝胶电 泳迁移获得的分子量。我们观察到SDS-PAGE对酶分子量预测过高。凝 胶上显示的发散的电泳谱带的确表明了酶的高度糖基化(O和N糖基化)。 糖基化发生在正在表达的生物中的蛋白质加工过程中。绳状青霉菌中abffi-l基因的表达情况分析绳状青霉菌具有两种编码B型a-L-阿拉伯呋喃糖酶的基因abffi-l 和abffi-2基因。比较了这些基因在各种绳状青霉菌培养条件下的表达情 况。在诱导纤维素分解的和半纤维素分解酶(M2型工业生长培养基)的 条件下和非生产条件下(基本的葡萄糖培养基MO)培养绳状青霉菌。在生 长40h后，停止培养，回收菌丝，然后提取总RNA。通过测定260nm 和280nm处的吸光度(260/280比率〉1.8),评价RNA的数量和质量。 在两种各自的条件下(MO和M2),通过实时定量PCR定量编码B型阿拉 伯呋喃糖酶(ABFB-1和ABFB-2)活性的转录物水平。在两种条件下以编码绳状青霉菌微管蛋白(tub-l)的基因作为对照。该 基因编码对细胞完整性必需的结构蛋白。通常将这个基因用作对照基因 是因为不管应用何种培养条件(普遍存在的)，其表达水平不变。为每种基因(abffi-l、 abffi-2和tub-l)设计用于定量PCR的特异引物。 在两种生长条件(MO和M2)下，逆转录2|iig总RNA。为了确定用于扩 增目的基因的最佳条件(定量PCR法的限制以及这些引物对的效率)，连 续稀释来自逆转录的互补DNA。标准化的结果如表2和图4所示。
<formula>formula see original document page 22</formula>表2: abfB-1和abffi-2基因的差异表达值为绳状青霉菌生长条件的函数编码分解纤维素的和半分解纤维素活性的基因的转录调控已有描 述。这些基因的表达易受培养微生物的碳和氮源的性质和/或复杂性的影 响。已报道在葡萄糖存在时这些基因的转录受到高度抑制。此调控通过 分解代谢阻遏蛋白CreA完成，所述CreA特异地与这些基因的启动子结 合并阻断其转录。在我们通过PCR定量abffi-1和abffi-2信使的试验中， 这两种基因在葡萄糖(MO)条件下的表达水平非常低。这与文献一致，因纤维素的底物)i有基础表达水平。在mo、条件下:得的結果与:献'一致:就abffi-1基因的表达而言，观察到比MO条件下获得的基底水平高107 倍的诱导因子，而abfb-2基因并未过表达。
权利要求
1.适用于动物营养的多肽，特征在于其包括一种选自以下多肽的多肽-SEQ ID No.2的多肽，-序列介于SEQ ID No.2的位置28和位置507之间的多肽，-SEQ ID No.2的多肽片段，具有α-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性，-一种多肽，其具有α-L-阿拉伯呋喃糖酶B活性，且显示与SEQ IDNo.2的多肽至少90％的同一性。
2. 编码a-L-阿拉伯吹喃糖酶B活性的多核香酸，其特征在于其选 自以下多核苦酸-序列包括在SEQ ID No. 1的位置845与位置2368之间的多核苷酸，-序列包括在SEQ ID No. 1的位置927与位置2368之间的多核苷酸，-编码根据权利要求1的多肽的多核苷酸。
3. 多核苷酸，特4正在于其具有SEQ ID No. 1的序列或与SEQ ID No. 1互补的序列。
4. 表达盒，特征在于在转录方向上包括 -在宿主生物中有功能的启动子； -根据权利要求2的多核苷酸；以及 -相同宿主生物中的终止序列。
5. 包括根据权利要求2-3中任一项的多核苷酸和/或根据权利要求4 的表达盒的载体。
6. 用根据权利要求2-3中任一项的多核苷酸、根据权利要求4的表 达盒和/或根据权利要求5的载体转化的宿主生物。
7. 根据权利要求6的宿主生物，特征在于宿主生物选自酵母和丝状真菌。
8. 根据权利要求7的宿主生物，特征在于其为绳状青霉菌株。
9. 动物用营养添加物，特征在于其包含根据权利要求l的多肽。
10. 动物用营养添加物，特征在于其包含根据权利要求6-8中任一 项的宿主生物和/或根据权利要求6-8中任一项的宿主生物的发酵液。
11. 根据权利要求9-10中任一项的动物营养添加物，特征在于其为 液体形式或粉末形式。
12. 饲料，特征在于其包含动物用营养基质和根据权利要求9-11 中任一项的动物用营养添加物。
13. 根据权利要求1的多肽或根据权利要求6-8中任一项的宿主生 物用于制备动物用营养添加物或饲料的用途。
14. 根据权利要求1的多肽或根据权利要求6-8中任一项的宿主生 物用于水解阿拉伯呋喃J氐聚糖化合物的ot-L-阿拉伯呋喃糖4囊的用途。
全文摘要
本发明涉及编码B型α-L-阿拉伯呋喃糖酶的绳状青霉菌abfB-1基因。该α-L-阿拉伯呋喃糖酶可以掺入用于动物的营养添加物或食品中，因为其促进可消化性并从而促进营养价值。
文档编号C12N15/56GK101171336SQ200680015044
公开日2008年4月30日 申请日期2006年5月3日 优先权日2005年5月4日
发明者奥里佛·图拉斯, 奥里佛·诺尔, 让-玛丽·弗朗索瓦, 让-路克·帕罗 申请人:安迪苏法国联合股份有限公司