氮源高效利用的单子叶植物的制作方法

专利名称：氮源高效利用的单子叶植物的制作方法
技术领域：
本发明涉及到具有提高氮利用效率(NUE)的单子叶植物，在单子叶植物中提高NUE的方法，以及在氮源限制的条件下生长的单子叶植物增加生物量和种子量的方法。本发明还涉及到单子叶植物遗蛋白启动子。

背景技术：
在许多生态系统中，包括天然的和农业的生态系统中，植物的生产能力被三个主要的营养素所限制氮，磷，钾。这三个限制性的营养素中最重要的通常是氮。氮源通常是肥料的主要成分(Hageman and Lambert，I.Corn and Corn Improvement，3rd ed.，Sprague & Dudley，AmericanSociety of Agronomy，pp.431-461，1988)。因为氮源在植物生长中通常是限制速率的元素，所以大多数农作物都具有对无机含氮肥料的依赖性。植物中的氮源通常是硝酸氨，硝酸钾或尿素。
每年，约有85～90MMt含氮肥料加入到全世界范围内的土壤中。这个数量一直在上涨，1930年为1.3MMt，1960年为10.2MMt。到2050年，预计会增加到240MMt(Tilman et al.，1999，Proc.Nat.Acad.Sci.USA.965995-6000)。估计约有被利用的氮的50％到70％从植物的土壤中流失。因为NO3-是可溶的，而且不能在土壤基质中保留，过剩的NO3-经水浸出后可由微生物利用。实际上，大多数被利用的氮迅速的被土壤中的微生物，浸出和其它因素所耗尽，而不是由植物本身吸收。
植物提高氮利用效率具有许多有益的影响。例如，氮高效利用的植物在缺乏氮源的土壤中比起常规的植物更容易生长。应用氮高效利用的植物可以减少向农作物中添加氮肥料的需求量。因为肥料的利用占农作物产量成本的一个显著地百分比，所以肥料利用的减少直接节省了成本。
肥料利用的减少也相应减少了大量氮源肥料利用给环境带来的损害。氮源肥料利用对环境的有害影响，主要包括增加的富营养化作用，酸雨，土壤算话温室效应。
单子叶植物在世界上37亿英亩耕种土地上生长的农作物中占有的很大一个百分比。仅在美国，2004年种植了8000万英亩的玉米，5900万英亩的小麦，400万英亩的大麦和300万英亩的水稻。
根据世界范围内对于单子叶植物的需求以及现存土地中逐渐减少的肥料，所以产生能在最适氮源条件下生长的单子叶植物是我们所希望的。达到这个目的的一个方法就是产生一种能更加高效利用氮源的单子叶植物。这种单子叶植物的优势就是能在缺乏氮源的土壤中生长，也就是说能更加高效的利用氮源。此外，这种单子叶植物可以证明能提高正常氮水平下土壤的生产力。
水稻通常被用来作为在其它单子叶农作物包括玉米，小麦，甘蔗，大麦，高粱，黑麦和草在内的单子叶农作物遗传和生理学研究上的模式植物。因为它具有作为模式植物的重要性，因为水稻是第一个被测序的农作物。国际水稻基因组定序计划在2004年12月对水稻基因组进行了完整测序。水稻具有一个小的二倍体的基因组，是很保守的结合杂交的单子叶植物。水稻很容易被转化，所以可在水稻中进行转基因研究来研究许多表现型性状包括开花，非生物胁迫应答，抗疾病，干旱耐受力和形态发育。
因为氮在植物生长中具有关键的重要性，所以之前的研究曾尝试通过不同方法来增加氮利用的效率。这些方法包括定向培育具有高效利用氮源的植物的传统育种计划。还采用了重组DNA和转基因植物方法来尝试产生氮源高效利用的植物。
在双子叶植物中过度表达了许多种不同基因来增加氮利用效率，得到不同的结果。(参见Good et al.，Trends Plant Sci 9597-605，2004)。然而，单子叶植物和双子叶植物在包括形态上，发育上，代谢上，表型上和遗传学上的许多方面彼此间是不相同的。因为这些不同，所以不能预言在双子叶植物中能增加氮利用率的方法是否能成功应用在单子叶植物中。
在双子叶芸苔中，丙氨酸氨基转移酶(AlaAT)在芸苔细胞组织膨胀基因—26(也叫做遗蛋白)启动子的命令下过度表达，提高了AlaAT水平并增加了NUE(美国专利号6,084,153)。然而，AlaAT的过度表达是否可以在单子叶植物中增加NUE未见报道。
在单子叶植物中增加NUE在技术中是期望得到的。


发明内容
本发明说明了在氮源缺乏的条件下具有能提高生长特性和氮利用效率的单子叶植物的必要性，通过提供的这种植物和方法来产生转基因单子叶植物并获得高水平AlaAT。
一方面，本发明提供了含有一个编码AlaAT的重组DNA序列的转基因单子叶植物。这个转基因单子叶植物可以是大麦，水稻，甘蔗，玉米，高粱，黑麦，小麦和草。草包括草坪，草坪草，牧草和其它类似的草。AlaAT最好操作连接一个启动子，这个启动子最好是一个单子叶植物遗蛋白启动子。本发明还提供了来自于转基因单子叶植物的种子。
在其它的实施例中，转基因水稻，玉米，小麦，高粱，大麦和甘蔗含有一个编码AlaAT的重组DNA序列和其种子。
本发明的其它方面，提供了一个产生转基因单子叶植物的方法，步骤如下(1)选择一个编码丙氨酸转氨酶的核苷酸，(2)选择一个在单子叶植物中可操作的启动子，(3)将选择的核苷酸和选择的启动子结合起来形成一个遗传构造，(4)由遗传构造转化一个单子叶植物细胞形成一个转化细胞，(5)从转化的细胞生长成一个转基因单子叶植物。在这个实施例中，当植物在适度氮源的条件下生长，对比不表达该构造的单子叶植物的生物量或种子量，在转基因植物中表达，AlaAT的过度表达引起了至少增加了5％～7.5％，7.5～10％，10～15％或15～20％或更多的在植物生物量或种子量。
在本发明的其它实施例中，提供了产生转基因水稻，玉米，小麦和高粱植物的相似方法。
本发明的另一方面，此处描述的转基因单子叶植物表达一个重组AlaAT，对比缺乏重组AlaAT植物的生物量或种子量，转基因单子叶植物至少提高了5％的生物量或种子量。本发明还描述了产生自转基因单子叶植物的种子。这个单子叶植物包括但不仅仅局限于此，玉米，小麦，水稻，大麦和黑麦。
描述了一个通过与植物接触和向其引入一个可操作连接到单子叶植物遗蛋白启动子的AlaAT编码区来增加单子叶植物生物量的方法。还提供了增加植物种子量的相似方法。
用于本发明遗传构造的编码AlaAT的核苷酸可来自任何生物体，可以是植物，最好是单子叶植物，包括，但不仅仅局限于此，大麦，水稻，甘蔗，黑麦，小麦，玉米或草。
另一方面，本发明提供了一个离体单子叶植物遗蛋白启动子序列。这个单子叶植物启动子序列可来自于大麦，水稻，甘蔗，黑麦，小麦，玉米或草。在一个实施例中，它是一个含有SEQ ID NO9或它的活性片段的高粱启动子。在另一个实施例中，它是一个含有SEQ ID NO10或它的活性片段的玉米启动子。
本发明还提供了通过与植物接触和向其引入一个可操作连接一个单子叶植物遗蛋白启动子的靶基因来进行靶基因的定向表达的方法。
本发明还描述了遗传构造，转化植物和植物种子，其中含有可操作连接到靶基因的单子叶植物遗蛋白启动子。这个靶基因编码一个氮利用蛋白，例如高亲和力的硝酸盐运载体，低亲和力硝酸盐运载体，铵运载体，氨水运载体，氨基酸运载体，丙氨酸脱氢酶，谷氨酰胺合成酶，天冬酰胺合成酶，谷氨酸合成酶，谷氨酸2酮戊二酸氨基转移酶，门冬酰胺酶，谷氨酸脱氢酶，硝酸盐还原酶，天冬氨酸转氨酶和AlaAT。
本发明描述了具有提高NUE的单子叶植物和在单子叶植物中提高NUE的方法和在限制性氮源条件下生长的单子叶植物中提高生物量和种子量的方法。限制性的氮源条件就是在这个条件下植物由于氮水平的降低，生物量或种子量也减少。在这样的条件下，通过肥料和其它方法增加可用氮源的量来提高植物生物量或种子量。限制性条件也被称作最适度以下条件。
植物的氮素同化作用和代谢作用通过许多种在底物上作用的酶的协调作用来发生的(图1)。氮素同化作用主要通过谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸合成酶(GOGAT)的活性来产生。GS-GOGAT的循环中，谷氨酸作为氮源为其它代谢反应来供给氮。氮的代谢过程主要通过谷氨酸氨基团被转移到其它碳骨架的转氨基反应来介导。氨基团从谷氨酸到其它碳骨架的转移使得氮处于一种易利用的形式，如其它氨基酸像天冬氨酸和丙氨酸。这种酶的例子有氨基转移酶，。图1所示的是由酶AlaAT催化的反应催化了氨基团从谷氨酸到丙酮酸的转移，因此产生了丙氨酸。
当不限定本发明于特定机制，过度AlaAT的表达可通过耗尽由储存如谷氨酸等氨基酸获得的可用氮源来增加氮效率，接下来使得在植物中增加吸收和同化作用。通过氨基团从谷氨酸到丙酮酸的转移，AlaAT耗尽了氮源储藏混合物的谷氨酸池。此外，α酮戊二酸池被重新补足。为了补充谷氨酸的消耗，植物增加了氮源的吸收和同化作用来恢复平衡。增加的吸收和同化作用活性使得植物能高效利用土壤中存在的低水平(最适度以下的)氮源。
此处还描述了单子叶植物遗蛋白启动子，如水稻，高粱和玉米，它们用来作为目的编码区的类型。
本发明中名词的定义 “转基因植物”指的是一种含有一个外源性核苷酸的单子叶植物，其中外源性核苷酸可来自于同一单子叶植物种，异源的植物种或非植物种。
“启动子”指的是一个可调节的核苷酸序列，代表性的位于一个基因或编码序列蛋白质的上游(5’)，与不同细胞蛋白连接的，它对基因和蛋白编码序列的表达进行调节。其中的启动子可以是全长启动子或它的片段。”活性片段”指的是它最少是参考启动子活性的0.1％，10％更好，最好为25％，其中的启动子活性的测定是经技术中技工熟知的检测启动子活性的方法测试的，例如GUS报道基因水平的测定。DNA序列必须是有活性的，可通过合成不同片段和测试其表达或在某一区域引入点突变或测试活性损失的方法来鉴定DNA的活性。
启动子的异源片段或其它启动子序列可以结合起来，以介导启动子序列的活性。例如，CaMV 35S启动子或其它已知启动子序列可和此处描述的启动子结合起来，以介导目的编码区的表达。
“目的编码区”或“靶基因”指的是在一个或多个植物组织种期望被表达的任何基因。同样，“靶蛋白”指的是在一个或多个植物组织种期望被表达的任何蛋白。例如，结合此处描述的方法有效利用的目的编码区包括编码一个或多个有关氮的同化作用，氮的利用，氮的吸收或它的一个组合的蛋白的核酸序列。
目的蛋白的术语“提高水平”此处指的是转基因单子叶植物中的蛋白水平，意思是蛋白的水平高于对比相应的缺乏如编码AlaAT的过度表达的核苷酸分子的转基因单子叶植物的蛋白水平。
此处描述的基因构造可包含所必须的翻译或转录的增强子。这些增强子区域对于技术中的技工是熟知的，它含有ATG起始密码子和毗邻顺序。这个起始密码子与编码序列的读码框是同相的，以确保整个序列的翻译。翻译控制信号和起始密码子可来自于许多种天然和合成的来源。翻译起始区域可由转录起始区域和结构基因提供。序列可来自于选择表达基因的启动子，可通过特别的修饰来增强信使RNA(mRNA)的翻译。
此处描述的基因构造可进一步包括含有能够影响mRNA加工或基因表达的多腺苷酸化信号和其它调节信号的3’不可译区或终止区。适合的3’区域的非限制性的例子是3’转录非翻译区，它含有农杆菌肿瘤诱导质粒(Ti)基因，如胭脂碱合成酶(Nos基因)，植物基因如大豆储存蛋白基因，和核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO)基因的小亚基的多腺苷酸化信号。
“可操作连接”指的是目的序列的相互作用，直接或间接的执行预期的功能，如基因表达的间介作用和调节作用。可操作连接的序列的交互作用可以被介导的，如通过蛋白质的可操作连接序列的交互作用。
此处核苷酸分子的参考文献中使用的术语“外源”指的是来自于植物体外的核苷酸分子。一个外源核苷酸分子可为天然或非天然产生核苷酸序列。技术中熟练的技工认为一个外源核苷酸分子可为来自于除引入核苷酸分子的植物外的同一植物种或不同植物种的一个异源核苷酸分子。此外，它还可以是来自于非植物如真菌，酵母，细菌或其它非植物生物体的核苷酸分子。
下面描述的是优选实施例。
丙氨酸氨基转移酶(AlaATs)概述 作为酶的一般种类，氨基转换酶是催化叫做氨基转移反应的磷酸吡哆醛依赖性酶。由氨基转换酶催化的氨基转移反应包括α氨基团从一个氨基酸到α酮酸的α酮位置的转移。在这个过程中，氨基酸便成了α酮酸，同时α酮酸接受体变成了α氨基酸。专一的氨基转换酶，AlaAT，利用作为氨基团供体的谷氨酸和作为氨基酸受体的丙酮酸。丙酮酸的氨基转移形成的丙氨酸事实上存在于所有的组织中。相应的，带有AlaAT活性的酶也存在于所有组织中。AlaATs族本发明AlaATs分离和选择的基础。
AlaATs的鉴定 因为许多有机体含有AlaAT活性和酶，所以可采用许多方法鉴定和分离来自不同种类的序列。给出了结构和功能的相互关系，可采用AlaAT族已知成员的序列的知识来收集附加的族成员，其可作为AlaATs候选用于本发明。
数据库搜索用于本发明产生AlaAT序列团的方法就是数据库搜索。因为许多有机体的基因组都已经被测序了，基于氨基酸或核苷酸同源性的以计算机为基础的数据库搜索将显示用作查询序列的已知AlaAT的同源序列。这种计算机数据库搜索的一般工具是用于NCBI的BLAST程序。NCBI序列局部对比查询(Altschul et al.，J.Mol.Biol.215(3)403-410，1990)对于一些来源是可用的，包括国家生物工程信息中心(NCBI，Bethesda，MD)和网络中，用于连接序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx。可以在NCBI主页上访问。在NCBI主页上详细说明了怎样通过这个程序测定序列同一性。例如，采用BLAST程序鉴别AlaAT族成员见实施例7所述。计算机程序如Softberry和PSORT的应用可用来测定这些酶的亚细胞定位，除了靶向少量最适位点的酶，如靶向过氧化物酶体。
技术中已熟知的序列比对的方法是下列描述的程序和比对算法Smith and Waterman，J.Mol.Biol.147(1)195-197，1981；Needlemanand Wunsch，J.Mol.Biol.48(3)443-453，1970；Pearson and Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85(8)2444-2448，1988；Higginsand Sharp，Gene 73(1)237-244，1988；Higgins and Sharp，Comput.Appl.Biosci.5(2)151-3.(1989)；Corpet，Nucleic Acids Res.16(22)10881-90，1988；Huang et al.，Comput.Appl.Biosci.8(2)155-65，1992；and Pearson et al.，Methods Mol.Biol.25365-389，1994.Altschul et al.(Nature Genet.6(2)119-129，1994)，这些文献对序列比对方法和同源性计算进行了详细描述。
根据同源性，同源序列区域的范围和位置，采用以计算机为基础的方法如上面所描述的方法，来鉴别同源性，可合理的猜测编码的AlaAT。这个序列是否能编码AlaAT可由许多方法测定。采用GenBank入口的注释作为第一指示。许多序列已被研究者鉴别和测定了，相应的也显示了AlaAT活性和GenBank入口的注释。
作为优选，由搜索鉴别的序列可做试验性的测定来测定它是否能编码AlaAT活性。关于已被鉴别的核苷酸序列，它可采用许多种技术中已知的方法来分离用于测试。例如，目的序列可采用5’和3’为互补DNA(cDNA)的引物，由聚合酶链反应(PCR)进行扩增。PCR方法在技术中是熟知的，实验室手册PCR实验设计描述了PCR放入来源A Guide to Methods andApplications by M.Innes，et al.，Academic Press，1989。作为优选，所期望的序列可通过常规杂化作用筛选，采用符合已知核苷酸序列的寡核苷酸来筛选互补DNA文库。筛选方法基于技术中熟知的杂化作用，在Sambrook，Fritsch and Maniatis，MOLECULAR CLONINGA LABORATORYMANUAL，2nd edition，1989；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel et al.，eds.，1987)中有所描述。
一旦获得了一个编码候选AlaAT的DNA序列，就可以采用常规的分子生物学方法将其克隆到许多种表达载体中来证实AlaAT是分离的。
AlaAT编码区可由任何适合的方法来修饰。例如，他可被修饰在植物系统中转录和翻译；例如，编码AlaAT蛋白的核苷酸序列可被修饰，这样它就含有所有必须的多腺苷酸化序列，起始位点和终止位点，这使得编码序列在单子叶植物中被转录为mRNA，随后mRNA被翻译。此外，编码区可被修饰使得它的密码子选择与单子叶植物的天然基因非常相似，例如，采用植物优化了的序列。其中的核苷酸序列许是和方法对于技术中熟练的技工是熟知的。
在大肠杆菌，酵母哺乳动物细胞或植物中，蛋白表达的许多载体是商业上可用的。在适合宿主细胞中含有AlaAT构造的表达，如大肠杆菌，采用如来自Novagen(www.Novagen.com)的pET载体的质粒，如果质粒编码一个AlaAT活性，将产生表达。测定AlaAT活性测定的方法在技术中是熟知的。美国专利号6,084,153描述了这个方法，这篇专利因为整体上引用而被合并于此。在此方法中，叶组织被称重，然后放在带有研棒的研钵中，以沙覆盖，其中含有0.1M Tris-HCl(pH 8.5)，10mM二硫苏糖醇，15％甘油和10％(w/v)PVPP提取缓冲液。提取液经6000rpm离心后澄清，浮在表面的经测定是酶活性。如所描述的，加入丙氨酸开始反应。参见Goodand Crosby，Plant Physiol.901305-1309，1989。该测定法经简单的替代细菌或酵母提取可被用于其它有机体，如细菌和酵母，用于叶组织提取。
杂化作用和PCR方法可采用其它方法来分离可用于本发明的AlaATs。作为优选，高、中、低严格杂交方法可用于分离可用于本发明实践的已知AlaATs的直系同源物或同系物。杂化条件根据采用的实验参数依靠序列改变。一般来说，对于在确定的离子强度和pH下的特定序列，严格杂交条件选择在低于热力学熔点(Tm)的约5oC到20oC。Tm是50％的靶序列杂交完全配对的探针的温度。核酸杂交条件和严格性的计算参见Sambrook et al.(1989)and Tijssen(Hybridization with Nucleic Acid Probes，PartII，pp.415.Elsevier，Amsterdam，Netherlands，1993)。核酸杂交的影响因素包括温度，盐条件杂交混合物中有机溶剂的存在，杂交序列的长度和碱基组成，碱基错误匹配的程度。使探针杂交到filter-boundDNA的高度严格性条件是5X SSC，2％十二烷基硫酸钠(SDS)，55-65℃过夜的100ug/ml单链DNA，在0.1X SSC和0.1％ SDS，60-65℃条件下洗涤两次，时间为20min。
简化的严格条件可用于分离有关的但含有错误配对的核酸序列。这样的条件包括降低的杂交和洗涤温度或提高洗涤溶液的盐浓度。这种方法和低严格性杂交方法的实验设计在一般用于分子生物学指南如前面提到的Sambrook，et al.and Ausubel，et al.references中有所描述。
适用于本发明分离直系同源物或同系物其它方法包括PCR克隆。特异或兼并引物可经设计来编码AlaAT核苷酸或氨基酸序列的保守区域。其中的保守区域可通过校对已知的以上描述的用于校对的AlaATs序列来鉴定。设计的PCR引物可用于PCR反应来产生一部分来自可用于通过常规基因库筛选方法或附加PCR方法如cDNA末端迅速扩增方法(RACE)分离全长cDNA的目的物种的AlaAT序列。PCR方法在技术中已熟知，在如PCR实验设计的资料中有所描述A Guide to Methods and Applications by M.Innes，et al.，Academic Press，1989。
用于本发明鉴定AlaATs的一个选择性方法使得基于酶活性的特定来源的AlaATs必须进行生化净化。因为酶测定AlaAT活性在技术中是熟知的，所以熟练的技工能够分离一个特定的细胞或组织，采用常规生物化学法如色谱法纯化AlaAT。其中的生物化学方法在蛋白质纯化的资料中是可用的Principles and Practice by Robert K.Scopes，Springer Advanced Textsin Chemistry，3rd edition，1994；Guide to Protein Purification(Methods in Enzymology Series，Vol.182，1990)by Abelson et al.，Protein Purification TechniquesA Practical Approach(PracticalApproach Series，2001)by Simon Roe(Editor)。AlaAT一但纯化后，可用于得到氨基酸序列，这个序列来自可通过常规分子生物学方法如如上所述的基因库筛选或PCR设计来克隆相应cDNA的寡核苷酸。
图2、图3和表1，表2显示的是许多种物种包括含有许多植物种的从大肠杆菌到人类AlaAT的比对。当每个AlaAT序列与表1所示其它AlaAT作比较时，同源性的百分比范围在超过90％到低于25％。存在于所有AlaAT序列的许多高度保守的氨基酸序列在图2和图3中黑色加亮显示。这个进化的保守氨基酸序列显示了AlaATs特性具有的共有序列或序列基元。一般的，这种序列形成了蛋白质活性位点或功能性重要区域。
表1


表2

单子叶植物中AlaATs的过表达一旦AlaAT被鉴别，目的单子叶植物中AlaAT过表达的构造就可通过技术中已知的方法来产生。其中可采用许多种质粒，如下所述。许多种启动子可用于表达，如构造启动子，不同的诱导型启动子，或组织特异性启动子。
启动子 适用于本发明构造的启动子可在单子叶植物和宿主有机体中发挥机能，用于表达所描述的构造。许多植物启动子是已知的，一些例子如下描述。包括构造启动子，诱导型启动子，组织细胞专一启动子和调节启动子。适合用于本发明时间的启动子的选择方法如下所述。
启动子可通过植物分子生物学技术中已知的操作来分离。可参照但不局限于此，可用于本发明实践的启动子包括水稻遗蛋白(OsAnt1)启动子，如下实施例1所示，还包括其它遗蛋白启动子如下实施例5所示的；水稻肌动蛋白1(Act-1)启动子，如美国专利号5,641,876所描述的玉米泛素-1(Ubi-1)启动子，如美国专利号5,510,474，6,054,574和6,977,325所描述的；玉米乙醇脱氢酶—1(Adh1)启动子。如Kyozuka et al.，Mol.Gen.Genet.228(1-2)40-48，1991所描述的；CaMV 35S和19S启动子，如美国专利号5,352,605所描述的。其它用于单子叶植物的启动子见cambia.org。
特定用于植物中靶基因如AlaAT表达的一种类型的启动子是单子叶植物遗蛋白启动子。水稻遗蛋白启动子如实施例1所描述。其它遗蛋白启动子如实施例5所描述。了解了在这些例子中的单子叶遗蛋白启动子，技工就容易采用类似于实施例1描述的采用btg 26基因进行的水稻遗蛋白启动子的鉴别的方法来鉴别其它单子叶植物遗蛋白启动子。例如，序列应符合启动子预测软件的分析，如TSSP植物启动子预测软件http://softberry.com，这种软件用来鉴别可能的TATA盒子序列和其它启动子序列和进一步采用信号扫描软件(Prestridge，1991；在bimas.dcrt.nih.gov/molbio/signal可用)分析可能是转录因子的识别位点的启动子基序。
可能编码启动子的序列可被确认通过采用任何对于技术中技工熟知的用于测量启动子活性的测定系统，来合成不同片段和测试表达或在某区域引入点突变和测试活性损失，如在启动子序列控制下的报道基因的表达。报道基因可以是任何多聚核苷酸，在启动子序列的控制下转录的和接下来的翻译或转录和翻译可由熟练的技工轻易的探测出来。报道基因不能编码全长蛋白质。在一些实例中，报道基因是寡核苷酸。一般来说，报道基因编码带有可探测活性的蛋白质。一般的报道基因包括GUS，荧光素酶，GFP，β-半乳糖苷酶，CAT，碱性磷酸酶等等。优选实施例的报道基因是GUS。
报道基因的表达可采用技术中技工熟知的任何方法在mRNA或蛋白质水平上来测定。例如，mRNA水平可采用无细胞转录测定法来测定。可选择的是，蛋白质水平可通过采用蛋白质的抗体转移性或转录—翻译测定法来测定酶活性，其中的方法也可用于mRNA水平和蛋白质或多肽水平的测定。
植物中类似于遗蛋白基因调节的基因启动子可在本发明中找到应用。这些基因可以是在植物根部表达的细胞组织膨胀敏感基因，且可以通过ABA或在严格条件下如干旱和盐条件下被诱导。
转化方法 适合的构造构建之后，目的转基因植物采用技术中已知的转化方法来产生，如下例子中有所描述。采用许多种转化方法将外源核苷酸分子引入单子叶植物异位表达，包括农杆菌-介导转化方法，直接基因转移技术如电穿孔技术和微粒—介导转化方法(参见Wang et al.(eds)，Transformationof Plants and Soil根癌农杆菌Microorganisms，Cambridge，UKUniversity Press，1995，由于引用此文献而被合并于此)。基于土壤细菌，根癌农杆菌的转化方法用于将一个外源核苷酸分子引入种子植物中。野生型农杆菌含有使得根癌在宿主植物产生的Ti(肿瘤诱导)质粒。Ti质粒肿瘤诱导的T-DNA区域转移到植物基因组需要Ti质粒编码的致病基因和T-DNA边界，这是一套进行描述区域转移的正向DNA重复片段。基于农杆菌的载体是Ti质粒的修饰形式，其中肿瘤诱导功能由目的核苷酸序列引入到植物宿主中来替代。
农杆菌—介导的转化一般需要共整合载体或二元载体系统，其中Ti质粒的组成在一个辅助载体中被分开，且其永久存在于农杆菌宿主中携带治病基因，此外还需要一个含有T-DNA序列结合的目的基因的穿梭载体。许多种二元载体在技术中是熟知的且在商业上是可用的，例如，来自于Clontech(Palo Alto，CA)的载体。培养植物细胞或创伤组织，如根的外植体，下胚轴，茎片段或根茎的农杆菌的共培养方法，例如，也是技术中熟知的(Glick and Thompson，Methods in Plant Molecular Biology andBiotechnology.CRC Press，Boca Raton，FL，pp 179-20519，1993)。当在适宜条件下培养时，植物组织的创伤细胞被农杆菌感染重新发育成器官；结果产生的转基因芽最后生成异位表达编码AlaAT蛋白的核苷酸分子转基因植物。农杆菌也可用于如下文献描述的整个种子的转化Bechtold etal.，C.R.Acad.Sci.Paris.Life Sci.3161194-1199，1993，(由于引用此文献而被合并于此)。农杆菌—介导的转化在产生许多种转基因种子植物中也是可用的(Wang et al.，supra，1995). 微粒—介导的转化可用于产生异位表达AlaAT的转基因植物。其中的方法首先在如下文献中有所描述Klein et al.(Nature 32770-73，1987，由于引用此文献而被合并于此)，依靠如金，钨等微粒通过氯化钙，亚精胺，PEG沉淀作用涂渍在目的核苷酸分子上来进行。微粒通过如BIOLISTICPD-1000(Biorad，Hercules，CA)的装置以高速度进入植物组织中。
微粒—介导产生或“粒子轰击”对于采用其它方法难转化或再生转化植物特别有用。微粒—介导转化被用来，例如，产生许多种转基因植物种，包括棉花，烟草，玉米，杂交白杨和木瓜(参见Glick and Thompson，supra，1993)，还包括谷类植物如小麦，燕麦，大麦，高粱和水稻(Duan et al.，Nature Biotech.14494-498，1996；Shimamoto，Curr.Opin.Biotech.5158-162，1994；由于引用这些文献而被合并于此)。考虑到上述内容，熟练的技工认为此处所述的农杆菌—介导或微粒—介导转化方法，或其它技术中已知的方法可用来产生本发明的转基因种子植物。
用于本发明可选择的基因转移和转化方法包括，但不仅仅局限于此，脂质体技术，电穿孔术或游离DNA的化学介导吸收，磷酸钙共沉淀技术，微量或大量注射技术，DNA直接转化技术，还包括Ti质粒，Ri质粒或植物病毒载体。这些转化方法在技术中已经被证明。
生长和NUE测定 测试结果产生的目的转基因植物AlaAT转基因的表达和测试表达AlaAT转基因的那些植物系在植物生长或氮源利用中表达的转基因的影响。适合单子叶植物生长的测试包括许多种测定方法，如测量植物高度、茎的直径、植物叶子数量、植物生物量，如测量根、叶子、枝、芽、和花的鲜重或干重。NUE的测试包括转基因植物在不同最适度以下的氮源条件下的生长。测试可以是田间试验，温室或生长室测试或在体外测试。植物可在PerliteTM和其它商业上可用的生长材料，土壤或在基于琼脂的介质中经水培养生长。
单子叶植物遗蛋白启动子命令其它编码区域表达的应用 单子叶植物遗蛋白启动子可用于命令除AlaAT外的编码区域的表达。
可操作连接到单子叶植物遗蛋白启动子的目的编码区或靶基因可以是在植物中期望表达的任何核苷酸序列。本发明的方法和构造中采用的编码区的一般种类包括编码以下蛋白的核苷酸序列编码结构蛋白的核苷酸序列；有关氮运输的蛋白；有关氮吸收的蛋白；有关氮运输和吸收的蛋白；有关氮利用的酶和蛋白；植物中杀虫剂和除草剂抗性的有关蛋白；植物线虫、病毒、昆虫或细菌抗性的有关蛋白；植物应激抗性的有关蛋白，例如渗透性、温度、pH、或氧气应激性，但不仅仅局限于此；植物生长刺激和连续的有关蛋白；植物修复的有关蛋白；具有药特性或产生具有药特性化合物的编码酶的有关蛋白。
例如，目的编码区可编码一个氮利用蛋白，特别的是编码一种酶，这种酶能使得氨水同化为氨基酸或在生物合成反应中采用形成的氨基酸。这个蛋白质可选择自，但不仅仅局限于此，硝酸盐运载体(高或低的亲和力)，铵盐运载体，氨基酸运载体，丙氨酸脱氢酶，谷氨酰胺合成酶(GS)，天冬酰胺合成酶(AS)，谷氨酸合成酶(也叫作谷氨酸2酮戊二酸氨基转移酶GOGAT)，门冬酰胺酶(ANS)，谷氨酸脱氢酶(GDH)，硝酸盐还原酶，天冬氨酸转氨酶(AspAT)，丙氨酸氨基转移酶(AlaAT)和其它已知的氨基转换酶。这些蛋白在专利申请号为2005/0044585的美国专利中有所描述，这个专利因为整体上引用而被合并于此。
靶基因或目的编码区可在植物中天然表达或者它是植物的异源体。这个基因可来自于任何来源，包括病毒、细菌、植物或动物来源。较好的是，目的编码区对于单子叶植物遗蛋白启动子序列是异源的，其中单子叶植物遗蛋白启动子序列是可操作连接的，因为它不是来自于这个基因，单子叶植物遗蛋白启动子序列是天然可连接的。
编码区可通过任何适合的途径被修饰来构建一个具有期望特性的基因。编码区可被修饰，并在植物系统中转录的和翻译；例如，编码目的蛋白的核苷酸序列可被修饰，这样它含有所有必须的多腺苷酸化序列，起始位点和终止位点，这些位点使得编码序列被转录为mRNA(信使RNA)，mRNA再在植物中被翻译。此外，编码区可经修饰使得它的密码子选择与植物天然基因更加相似，例如，可采用优化序列的植物。这个核苷酸序列修饰和方法对于技术中熟练的技工是熟知的。
此处描述的方法和构造使得植物和种子的产生能具有植物中一个或多个目的基因的表达。此处描述的植物具有广泛的应用，包括，但不仅仅局限于，具有增加应激耐受力植物的产生，改进氮的吸收，改进氮的利用，改进营养含量，改进目的混合物的营养量和植物修复性质。特定的应用下面进一步描述。
下面的例子进一步表明了本发明一些优选实施例。例子说明了本发明，但不限制本发明。



图1显示的是植物细胞中氮利用主要步骤的图示。硝酸盐(NO3-)被运送到植物细胞中，由硝酸盐还原酶(NR)转化成亚硝酸盐(NO2-)。亚硝酸盐从细胞质中易位到叶绿体中，由亚硝酸盐还原酶(NiR)还原为铵(NH4+)。谷氨酰胺合成酶(GS)具有同化某物质和循环利用铵(NH4+)的机能。一个酶偶联，谷氨酰胺合成酶(GS)/谷氨酸合成酶(GOGAT)，催化了谷氨酰胺(Gln)到谷氨酸(Glu)的基因转变。谷氨酸是许多氨基酸的标准部件。此外，丙氨酸在可逆反应中由来自于丙酮酸和谷氨酸的丙氨酸氨基转移酶(AlaAT)合成。
图2所示的是来自不同生物体的AlaAT的氨基酸序列比对(SEQ ID NOs29～45)。由图指出用于比对的一些序列是含有小于引用AlaAT全序列的截断序列。采用大麦AlaAT序列的甲硫氨酸作为参考的第一残基进行比对。
图3所示的是来自不同生物体的AlaAT的氨基酸序列比对(SEQ ID NOs29～40)。由图指出用于比对的一些序列是含有小于引用AlaAT全序列的截断序列。采用大麦AlaAT序列的甲硫氨酸作为参考的第一残基进行比对。
图4所示的是本发明OSAnt1启动子的核苷酸序列(SEQ ID NO1)。序列由NCBI数据库的blastn工具，采用芸苔btg26基因的核苷酸序列(366-3175bp)来鉴定同源水稻核苷酸序列(登录号AF323586)。这个序列接下来用在比对TIGR水稻序列的测定(见tigr.org/tdb/e2k1/osa1/)，如例1所示。假定的TATA盒子由粗体显示，水稻基因组PCR扩增序列采用的引物有下划线显示。
图5所示的是产生遗传构造OsAnt1pro-Gus步骤的图示，采用报道基因β葡萄糖苷酸酶(GUS)与例1中描述的方法一致。
图6所示的是产生遗传构造OsAnt1pro-AlaAT步骤的图示，采用报道基因β葡萄糖苷酸酶(GUS)与例1中描述的方法一致。
图7所示的是由本发明OsAnt1启动子命令GUS报道基因的表达。表达发生在由图5所示的遗传构造OsAnt1pro-Gus转化的水稻植物的正在生长根的根尖的细胞膨胀区域(图A)；根毛部分(图B)和侧根部分(图C)，与例1中所描述的方法一致。黑色区域表明了GUS报道基因的表达。
图8显示的是图6所示的由遗传构造OsAnt1pro-AlaAT转化的水稻的平均生物量干重值，对比例1给出的在同样的生长条件下的野生型水稻植物的平均生物量干重值。
图9显示的是图6所示的由遗传构造OsAnt1pro-AlaAT转化的水稻的平均种子重量(克)，对比例1给出的在同样的生长条件下的野生型水稻植物的平均种子重量。
图10所示的是每个转基因植物的生物量干重(克)和总种子重量(克)的关系。
图11所示的是本发明的高粱遗蛋白启动子的核苷酸序列(SEQ ID NO9)。这个序列来自于例5所述的登陆号为CW033386的序列，包含有高粱遗蛋白基因的ATG起始密码子序列下游的443个核苷酸。
图12所示的是部分的玉米遗蛋白启动子(SEQ ID NO10)核苷酸序列。这个序列来自于例5所述的登陆号为BH215004的序列，含有玉米遗蛋白基因的ATG起始密码子序列上游的204-bp。

具体实施例方式 下面通过实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步具体的说明； 实施例1表达大麦AlaAT的水稻中NUE的实证 水稻遗蛋白启动子(OsAnt1)的鉴定和特征 btg26基因(Stroeher et al.，1995，Plant Mol.Biol.27541-551；登录号S77096)的核苷酸序列(bp366-3175)用于采用blastn在NCBI中搜索核苷酸数据库。水稻序列(登陆号为AF323586)被鉴定，它的核苷酸顺序用于搜索TIGR水稻序列的测定(tigr.org/tdb/e2kl/osa1/)。btg26的水稻同系物水稻遗蛋白(OsAnt1)在水稻染色体9被鉴别(登陆号为AP005570；98524-101189碱基对)。OsAnt1的起译密码子的973-bp(核苷酸101189-100216 of AP005570)序列上游由图4显示(SEQ ID NO1)。
OsAntl基因的ATG起译密码子的403bps上游(5’)序列被选择用来进一步分析。为了测定这序列是否可能具有作为一个启动子的功能，采用http://softberry.com/建立的TSSP植物启动子预测软件来分析。分析预测了该序列是一个植物启动子序列。还测定了TATA盒子(图4粗体)和其它启动子序列要素最有可能存在的区域。
因为设计的OsAnt1启动子序列根据softberry分析被预测含有启动子元素，所以序列采用信号扫描软件(Prestridge，1991；http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/signal)分析了启动子基序，启动子基序可以是转录因子的识别位点。OsAnt1启动子中预测了五个不同的信号序列，包含ADR1，DBF-A，GAL4，HSTF和RAF转录因子结合位点。
采用BCM Search Launcher主页(search launcher.bcm.tmc.edu/)和BOXSHADE服务器(ch.embnet.org/software/BOX_form.html)的ClustalW 1.8多序列比对软件比较btg26启动子序列的核酸序列和油菜和拟南芥的核酸序列。保守核苷酸序列的检验显示了油菜和拟南芥细胞组织膨胀基因—26启动子序列与OsAnt1序列彼此非常相似。所有三个启动子序列(水稻，芸苔，拟南芥)的同一个特征是核苷酸序列中存在嘧啶束(CT)。这些嘧啶束范围在20-22个碱基，存在于所有三个启动子序列中可能存在的TATA盒子的上游。此外，OsAnt1序列在ATG起始密码子里存在第二个嘧啶束。
水稻遗蛋白启动子的克隆 水稻基因组DNA从cv.Kitaake中分离出来。选择下列符合OsAnt1启动子区域的PCR引物(位于图4下划线处) 引物1AGGAAGTGATTTTTAGCGTAGCTG(SEQ ID NO2)； 引物2ATGGCAGAAGAGAGAGAGAGAGAGG(SEQ ID NO3). 采用水稻基因组DNA和以上引物引导降落PCR。产生一个975-bp片段。扩增的PCR片段连接

II-TOPO载体转化为十大细胞大肠杆菌。最后的质粒命名为pT-riceOsAntlpro。
序列分析显示出975-bp PCR片段编码一个命名为OsAnt1的启动子序列的启动子序列。比较了来自cv.Kitaake和cv.Nipponbare(由数据库获得)的OsAnt1启动子，显示出它们有99.9％相似度。假定的TATA盒子的起始密码子上游存在145—bps。
OsAnt1pro-GUS构造的产生 通过图5所示的步骤产生了由OsAnt1驱动的β葡萄糖苷酸酶(GUS)报道基因。水稻OsAnt1pro-GUS构造通过采用以下引物，pT-RiceOsAnt1pro为模板来扩增产生 引物3EcoRI-OsAnt1启动子序列GGAATTCAGGAAGTGATTTTT(SEQ IDNO4) 引物4NcoI-OsAntl启动子序列CATGCCATGGATGGCAGAAGA(SEQ ID NO5) 将最终的PCR片段引入到植物二元载体pCAMBIA1305.1中，被EcoR1和Nco1降解成一个pCAMBIA1305.1-riceOsAnt1pro-GUS构造。引物3和引物4的末端序列EcoRI和NcoI序列，使得PCR片段插入pCAMBIA1305.1载体，用带有OsAnt1的启动子序列替代存在的CaMV35s启动子。NcoI(CCATGG)序列含有一个Met密码子，ATG，这个构成了GUS报道基因和使得GUS报道基因通过OsAnt1启动子序列表达。
OsAnt1pro-AlaAT构造的产生 通过图6所示的步骤产生了由OsAnt1驱动的大麦AlaAT基因。水稻OsAnt1pro-AlaAT构造通过采用以下引物，pT-RiceOsAnt1pro为模板来扩增产生 引物3EcoRI-OsAnt1启动子序列GGAATTCAGGAAGTGATTTTT(SEQ IDNO4) 引物5PstI-OsAnt1启动子序列AACTGCAGATGGCAGAAGA(SEQ ID NO6) 最终的PCR片段被EcoR1和Pst1降解，被引入到植物二元载体pCAMBIA1300，产生了pCAMBIA1300-riceOsAnt1pro。
AlaAT DNA片段采用pAG001作为模板进行PCR扩增。pAG001在美国专利No.6,084,153有所描述，其中它被鉴定为pbtg26/AlaAT/nos。它含有连接大麦AlaAT基因和胆脂碱合成酶终止子的btg26启动子。大麦AlaAT/nos基因终止子序列采用以下引物，pAG001为模板进行扩增 引物6PstIAlaAT序列AACTGCAGAIGGCTGCCACCG(SEQ ID NO7) 引物7HindIII-NOS终止序列CCCAAGCTTCCCGATCTAGTA(SEQ ID NO8) 最终的AlaAT/nos片段被Pst和HindIII降解引入到pCAMBIA1300-riceOsAnt1pro，产生了pCAMBIA1300-riceOsAnt1pro-AlaAT构造。
水稻的转化 水稻转化方法在技术中是熟知的(Sridevi et al.，Current Sci.88128-132，2005；Saharan et al.，African J.Biotech 3(11)572-575，2004；Khanna et al.，Aust.J.Plant Physiol.26311-324，1999；Zhang et al.，Molecular Biotechnology 8(3)223-231，1988；Rashidet al.，Plant Cell Rep.15727-730，1996；Aldemita and Hodges，Planta 199612-617，1996；Hiei et al.，Plant J.6271-282，1997；Li et al.，Plant Cell Rpt 12250-255，1993；Christou et al.，Biotechnology 9957-962，1991)。水稻农杆菌—介导的转化在U.SpatentNo.5,591,616中被修饰。
pCAMBIA1305.1-riceOsAnt1pro-GUS和pCAMBIA1300-riceOsAnt1pro-AlaAT通过电穿孔技术(Sambrook et al.，supra，1989)被转移到农杆菌菌株EHA105(Hood et al.，Transgenic Res.2208-218，1993)。农杆菌细胞在含有mg/l卡那徽素的AB培养基(Chiltonet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 713672-3676，1974)中划平板，在28℃条件下培养3天。由扁平小刀收集细菌，先于水稻组织转化之前，在液态共培养基(R2-CL，表3)中采用温和的漩涡式再悬浮培养。
在转化试验中采用成熟的水稻种子(Oryza sativa L.cv.Nipponbare)。种子去皮后，在50％加入0.1％吐温20的漂白剂中灭菌10min，再浸渍在70％(v/v)的乙醇中1min，然后用无菌蒸馏水清洗5次。灭菌后，种子在愈伤组织诱导培养基(NB，表1)中28℃避光培养3周。
表3.用于愈伤组织诱导、嫁接、共培养、静息、选择、再生和生根的培养基


含有1.25mg/l CUSO4aNB培养基 b可选择的 3周后，将3-5mm长从子叶衍生愈伤组织中释放到培养基中的胚性结状片段浸渍到直径为100mm的含有25ml含有密度为3-5×109细胞/ml(OD600＝1)农杆菌细胞的液态共培养基(R2-CL，表1)的培养皿中培养10-15min。胚性片段由已灭菌的滤纸吸干，转移到固态共培养基(R2-CS，表3)中，25℃避光培养3天。共培养的胚性愈伤组织再被转移到静息培养基(R2-AS，表1)中，28℃避光培养1周。
1周后，将未污染的胚性片段分别转移到含有均霉素的选择培养基(R2S，表3)中来选择转化了的组织，28℃避光培养。接下来的3周在R2S培养基中选择培养，变为褐色且愈伤组织表面带有褐色隆起物的胚性片段被转移到NBS选择培养基中(表3)。共培养5周后，小隆起物发展成褐色球状组织，然后将它从愈伤组织中轻轻的挑起，在密封的培养皿中培养2周。2周后，这些球状组织便成了圆形的，紧密的淡黄色的愈伤组织。
将假定的转基因植物，抗均霉素愈伤组织轻轻的挑选出来，转移到再生培养基(PRN，表3)中再培养1周。所有的来自于单一共培养胚性结状片段的抗性愈伤组织被一起放入PRN皿中。带有光滑干燥表面奶白色分裂的愈伤组织被转移到再生培养基(RN，表3)中，避光培养2天，然后在光强度55μmol/m/sec的12/12-h(白天/黑夜)光周期条件下培养3周。在被转移到生长室的盆中之前，将从抗性愈伤组织中再生的绿芽分割开在含有生根培养基(R，表3)的试管中再培养1-2周来促进根和分蘖的生长。转基因植物在含有无污染盆栽混合物(Metromix 220)的直径为16cm的盆中生长为成熟期的植物。将植物在28℃和14/10h白天/黑夜光周期的条件下的生长室中培养。种植在盆中2周后，开始施肥，一周两次。混合肥料包括225g 20/20/20肥料，50g植物微量营养素，6.1g CuSO4.5H2O，140gFeEDTA，13.8g ZnSO4.7H2O，260g MgSO4.7H2O，3.7g H3BO3，共重712.4g。将2g的混合肥料溶解在8L的水中，一周向24株植物施肥两次。
由OsAnt1启动子序列命令表达的分析 由OsAnt1启动子序列命令表达的诱导作用采用由OsAnt1pro-GUS构造转化的水稻植物来检测。植物在盐基品红瓶中无菌条件下发芽水培。第2周龄的植物经过体内GUS活性染色，是通过在生根培养基注射含有0.2mMX—gluc(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-glucuronic acid)的5mls50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.5)并在该培养基中培养1-24h来进行的。在生物解剖显微镜下观察根组织并拍摄照片，如图7所示。
图7黑色区域显示的是GUS报道基因的表达。这个表达不是由根尖(特别是分裂细胞)OsAnt1启动子驱动的GUS报道基因表达的；而是在根尖后面的细胞扩张区域开始快速表达的。OsAnt1启动子序列命令GUS报道基因也在根毛处表达。离根尖很远处的许多成熟根部中，主根没有表达，但是侧根着色很重，说明了OsAnt1在这些侧根中命令表达了。
含有AlaAT构造的转化植物的分析 产生了58株OsAnt1/AlaAT/NOS转基因植物，测定它们成熟期的开花，分蘖数，种子量和生物量，记录为TO代植物。
测定成熟期的OsAnt1/AlaAT植物和对照植物的生物量干重，数据由图8表示。转基因OsAnt1/AlaAT植物的平均生物量高于对照植物的平均生物量。
收集来自于成熟阶段的OsAnt1/AlaAT植物和对照植物的种子，并测定种子总量。结果由图9表示，表明来自OsAnt1/AlaAT植物的高于对照植物的种子量。
图10所示的是每个转基因植物的生物量干重和种子总量的关系。显示出了本质上的线性相关性，表明了在OsAnt1/AlaAT植物中增加生物量能相应的增加了种子量。
这些结果表明OsAnt1/AlaAT转基因植物能够优化可用的营养素的利用，因此增加了植物的生物量，种子量或均增加。
实施例2采用OsAnt1/大麦AlaAT的玉米中NUE的说明 OsAnt1-pro-AlaAT构造可合并到适合的植物二元载体中用于玉米的农杆菌—介导转化。采用许多种可选标记进行玉米未成熟胚转化的方法是技术中熟知的(Ishida et al.，Nature Biotech.14745-750，1996；Lupotto，Maydica 44211-218，1999；Zhao et al.，Molec.Breeding8323-333，2001；Frame et al.，Plant Physiol.12913-22，2002and Miller et al.，Transgenic Res.11381-396，2002，U.S.PatentNo.5,591,616)。转基因玉米植物通过如Plant Transformation Facility，Iowa State University，Ames，Iowa的设备也是可产生的。
可选择的，OsAnt1pro-AlaAT序列可同样用于玉米基因枪转化方法中(Wright et al.，Plant Cell Reports 20(5)429-436，2001；Brettschneider et al.，Theoret.Appl.Genet.94737-748，1997；Gordon-Kamm et al.，Plant Cell 2(7)603-618，1990；Fromm et al.，Biotechnology(N Y).8(9)833-9.1990)。
通过测量在不同氮肥料包括限制性氮源的条件下生长的玉米植物的生物量和种子量来测定玉米植物的NUE。植物生物量可以是鲜重或干重，总植物重量，叶子重量或根的重量。最适度以下的氮源条件是氮源浓度限制植物生长的条件。在这样的条件下，附加氮的添加如肥料将增进植物生长。对于每一个测试，生物量和种子量可在生长室，温室或田间进行试验。
实施例3采用OsAnt1/大麦AlaAT的小麦中NUE的说明 与玉米相似，OsAnt1-pro-AlaAT构造可用于小麦基因枪轰击转化方法(Pastori et al.，J.Exp.Bot.52(357)857-863，2001；Becker etal.，Plant J.5299-307，1994)或合并到适合植物二元载体重用去小麦中农杆菌—介导的转化(Cheng et al.，Plant Physiol.115971-980，1997；美国专利申请US2003/0024014A1)。小麦转化的其它方法也在技术中建立了。
通过测量在不同氮肥料包括限制性氮源的条件下生长的小麦植物的生物量和种子量来测定小麦植物的NUE。植物生物量可以是鲜重或干重，总植物重量，叶子重量或根的重量。最适度以下的氮源条件是氮源浓度限制植物生长的条件。在这样的条件下，附加氮的添加如肥料将增进植物生长。对于每一个测试，生物量和种子量可在生长室，温室或田间进行试验。
实施例4采用OsAnt1/大麦AlaAT的高粱中NUE的说明 根据技术中建立的方法，可获得带有含有OsAnt启动子/AlaAT构造的二元载体的未成熟胚的农杆菌—介导的高粱转化。(Zhao et al.，PlantMol.Biol.44(6)789-98，2000；Gao et al.，Genome 48(2)321-33，2005；Zhao，Z.Y.，Methods Mol.Biol.343233-44，2006；Howeet al.，Plant Cell Rep.25(8)784-91，2006). 通过测量在不同氮肥料包括限制性氮源的条件下生长的高粱植物的生物量和种子量来测定高粱植物的NUE。植物生物量可以是鲜重或干重，总植物重量，叶子重量或根的重量。最适度以下的氮源条件是氮源浓度限制植物生长的条件。在这样的条件下，附加氮的添加如肥料将增进植物生长。对于每一个测试，生物量和种子量可在生长室，温室或田间进行试验。
实施例5用于NUE构造的交替(遗蛋白)启动子序列的鉴定 用于单子叶植物的其它遗蛋白启动子序列可由序列数据库鉴定。例1描述了水稻启动子的分离，btg26基因(Stroeher et al.，Plant Mol.Biol.27，541-551，1995；accessio number S77096)的核苷酸序列可用于采用blastn搜索工具在NCBI中搜索核苷酸数据库。除了被鉴定的水稻序列外，其它单子叶遗蛋白序列也在含有高粱(登录号U87982)，玉米(登录号AY103614 and BT017791)，可可(Theobroma cacao登录号DQ448866；和Curculigo latifolia，登录号X64110)的nr数据库中被鉴定。小麦，甘蔗和柳枝稷的ESTs通过采用不同的搜索算法和已鉴定的水稻遗蛋白核苷酸或氨基酸序列来鉴定。
与OsAnt1启动子的鉴定相似，高粱启动子序列通过采用NCBIGenomeSequence Survey(gss)Database中高粱序列BLAST搜索的遗蛋白克隆(登录号AF323586)的水稻核苷酸序列来鉴定。克隆CW033386被鉴定含有高粱遗蛋白基因ATG起始密码子上游序列的443个核苷酸(SEQ ID NO9，图11)。这个序列可用作单独的启动子序列或方法中克隆且序列大的基因组片段可用于鉴定远离上游的序列。这些片段可以是BAC序列的一部分或来自算法中进一步序列测定的基因组。技术中的技工可采用如反向PCR和基因组步行法来进行基因组步移。
玉米遗蛋白基因上游序列在NCBI Genome Survey Sequences Database中采用水稻遗蛋白克隆序列对比Zea mays序列的BLAST搜索来鉴定。登录号BH215004被鉴定含有玉米遗蛋白基因(SEQ ID NO10，图12)上游序列204—bp。这个序列可用作单独的启动子序列或方法中克隆且序列大的基因组片段可用于鉴定这个特定遗蛋白基因上游1.5kb的序列。包括长启动子的序列可用于设计如下所述的启动子/AlaAT基因构造。
实施例6NUE构造交替表达盒子的构造 不同基因表达的启动子盒子由目的启动子，nos终止子和在启动子和终止子之间限制性酶切位点构成进行基因克隆。其它限制性酶切位点攻击启动子和终止子的侧面来帮助盒子移动到二元载体中进行植物转化。
含有nos终止子的基本载体由PCR扩增nos区域来构成，其中nos包含在美国专利号6,084,153所述的二元载体中，引物为NOSupper25’-CCTAGGccatggttcaaacatttggcaataaagttt-3’(SEQ ID NO11)andNOSlower5’-TTAATTAACGATCTAGTAACATAGATGACA-3’(SEQ ID NO12)。NOSupper2在nos终止子的5’-末端提供了AvrII和NcoI限制性酶切位点和扩增片段3’-末端的Pac1位点。PCR采用BDAdvantageTM 2 PCR kit根据说明书来进行。结果产生的263片段采用TOPO TA

Kit(Invitrogen)和One

E.coli cells根据说明书克隆到

载体中。质粒为Nos/PCR2.1。
Nos/pCR2.1主链中卡那霉素抗性基因的Nco1位点采用

XLSite-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)根据说明书进行移动。用于引入一个沉默核苷酸变化的引物是NcoIpCR2.1 Lower 5’-GCAGGCATCGCCATGAGTCACGACGAGATC-3’(SEQ ID NO13)和NcoIpCR2.1Upper 5’-GATCTCGTCGTGACTCATGGCGATGCCTGC-3’(SEQ ID NO14)。Nco1位点的缺失通过限制性分析和大肠杆菌在卡那霉素存在下生长来验证。结果产生的质粒是Nos/pCR2.1mut。
来自OsAnt1启动子的表达基因的交替的表达盒子由接下来的方法制造。OsAnt1启动子由水稻变种克隆。Nipponbare基因组DNA(通过制造者的推荐而制作的，Sigma Extract-n-AMPTM)采用PCR进行扩增。用于略长于SEQ ID NO1所示的OsAntl启动子的引物是正向引物5’-attaaacctaggttaattaagtttaaacGACCTATAAAGTCAAATGCAAAT-3’(SEQ IDNO15)和反向引物5-tttaattcatgagacgtctttgcgatcgcgcagaagagagagagagagaggtag-3’(SEQ ID NO16)。
正向引物合并了Avr II，PacI和PmeI限制性酶切位点和正向引物合并了BspHI，Aat II和AsiSI限制性酶切位点以帮助进一步的克隆步骤。结果产生的1.1kb片段采用TOPO TA

Kit(Invitrogen)和OneShot E.coli cells根据说明书。结果产生的质粒由限制性内切酶Avr II和BspH1降解，被克隆到由限制性内切酶Avr II和Ncol降解Nos/pCR2.1mut中。结果产生的构造具有带有在唯一AsiSI和AatII位点的OsAnt1启动子和nos3’-区域进行克隆目的基因。表达盒子由5’-末端的Avr II，Pac I和Pme I限制性酶切位点和3’-末端PacI限制性酶切位点攻击侧面，来帮助其移动到一个植物二元表达载体中。
利用高粱Ant启动子的表达盒子由相似的方法设计。正向引物5’-attaaacctaggttaattaagtttaaacGATTCGACAATATTTATCAAAT-3’(SEQID NO17)和反向引物5-tttaattcatgagacgtctttgcgatcgcggcgccggcggcgttggcaggt-3’(SEQID NO18)可被用来扩增如上所述的OsAnt1启动子和水稻DNA来自高粱基因组DNA的443-bp Ant启动子(SEQ ID NO9)。克隆的启动子片段由5’-末端的AvrII，Pac 1和Pme 1限制性酶切位点和3’-末端的BspHI，AatII和Asi SI位点攻击其侧面。启动子片段由限制性内切酶Avr II和BspH1降解，被克隆到由Avr II和Ncol降解的Nos/pCR2.1mut中。结果产生的构造具有高粱的Ant启动子和带有唯一AsiSI和Aat II位点的nos3’-区域克隆目的基因。表达盒子由5’-末端的Avr II，Pac I和Pme I限制性酶切位点和3’-末端Pac I限制性酶切位点攻击侧面，来帮助其移动到一个植物二元表达载体中。
利用玉米Ant启动子(见实施例5)的表达盒子也由相似的方法被设计用于所描述饿水稻和高粱。来自其它遗蛋白基因的启动子区域也可用作由基因组序列测定项目和其它技术的鉴别。
实施例7用于NUE构造的交替丙氨酸氨基转移酶(AlaAT)基因的鉴定和克隆 氨基转换酶是催化氨基团从氨基酸到酮酸可逆转移的酶。它们被分成4个具有相互结构关联的亚基团(Mehta et al.，Eur.J.Biochem.214(2)549-561，1993)。AlaAT酶催化丙氨酸和2-酮戊二酸到丙酮酸和谷氨酸的可逆互变，它属于亚基团1。除了大麦丙氨酸氨基转移酶之外，其它丙氨酸氨基转移酶可用于对比单子叶植物中NUE。
为了鉴定同源AlaAT基因，大麦AlaAT蛋白序列(NCBI accessionnumber CAA81231)作为一个查询采用BLAST算法来搜索NCBI蛋白序列数据库。与大麦AlaAT序列具有高度同源性的基因存在所有的种类的真核生物。相关的序列也存在于细菌中。在NCBI EST数据库的Blastn搜索中显示出AlaAT同系物广泛分布于植物中，但是因为大多数序列不是全长序列，所以它们不能进行进一步分析。因为单子叶植物附加的基因组序列变成可用的序列，所以附加同系物可采用这些方法来鉴定。
全长序列在BLAST搜索中被鉴定，再进一步采用AlignX程序(部分载体NTI程序组，Invitrogen)进行分析。采用来自有机体范围内的序列的代表序列和相应的同源性表由图2和表1显示。大多数同源序列是植物序列。代表性的植物序列和相应的同源性表由图3和表2显示。用于比对的一些序列被截断使得他们含有小于所引用的全序列。采用大麦AlaAT序列的甲硫氨酸(M)作为参考的第一残基进行序列比对。
mRNA的分离和cDNA的合成 用于RNA分离的组织在下面的方法中从玉米(A188)和水稻(Nipponbare)制得。种子在密封袋中24℃条件下的发芽纸H2O中发芽(玉米、水稻)。7天后，收集根组织储存在

(Ambion)中来进行RNA的分离。胡椒幼苗经灭菌后，在一半浓度的MS培养基中培养，其中采用的是整个幼苗。采用来自在土壤中生长的拟南芥植物(Columbia 0)的叶子。
RNA采用RNAqueousTM-4PCR kit(Ambion)由植物组织中制得。cDNA采用Superscript III

2-step q-RT-PCR kit(Invitrogen)作为说明的纯化的RNA合成。
AlaAT的PCR扩增 AlaAT基因可由cDNA经PCR扩增，其中的cDNA的来源包括玉米(Zeamays)，水稻(Oryza sativa)，拟南芥(thaliana)，或胡椒(Capsicumannuum)。大麦(Hordeum vulgareL.cv Himalaya)AlaAT的模板是质粒pAG001(由Allen Good获得，University of Alberta)，其中含有Muenchand Good，1994，GenBank accession CAA8123

.所述的大麦AlaAT编码序列。PCR引物在5’-末端含有AsiS I限制性酶切位点和在3’-末端含有AatII限制性酶切位点来帮助克隆到表达盒子中。单个基因的引物如下 大麦Fw5’-ATTAAAGCGATCGCACCATGGCTGCCACCGTCGCCGTGGA-3’(SEQ ID NO19) 大麦Rv5’-TAGTGAGACGTCTTAGTCACGATACTCTGACA-3’(SEQ ID NO20) 玉米Fw5’-ATTAAAGCGATCGCACCatggccgccagcgtcaccgtgga-3’(SEQ ID NO21) 玉米Rv5-TAGTGAGACGTCTTAGTCGCGGTACTCGGCCAA-3’(SEQ ID NO22) 水稻Fw5’-ATTAAAGCGATCGCACCATGGCTGCTCCCAGCGTCGCCGT-3’(SEQ ID NO23) 水稻Rv5’-TAGTGAGACGTCTCAGTCGCGGTACGCTGCCATGAA-3’(SEQ IDNO24) 拟南芥At1g17290Fw 5’-ATTAAAGCGATCGCACCATGCGGAGATTCGTGATTGGCCAA-3’(SEQ ID NO25) 拟南芥At1g17290Rv 5’-TAGTGAGACGTCTTAGTCGCGGAACTCGTCCATGAA-3’(SEQ ID NO26) 胡椒Fw5’-ATTAAAGCGATCGCACCATGGATTCCATCACTATTGAT-3’(SEQID NO27) 胡椒Rv5’-TAGTGAGACGTCTTAGCCGCAGAATTCATCCAT-3’(SEQ ID NO28) AlaAT基因可采用BD AdvantageTM 2 PCR kit根据说明书来进行扩增(Clontech，Mountain View，CA)。结果产生的PCR产物可采用QIAquickTMPurification Kit(

Hilden，Germany)纯化，再经AsiSI和Aat II限制性酶进行降解。产物可连接到OsAnt1和如上所述的由AsiSI和Aat II限制性酶降解的高粱Ant或玉米Ant表达盒子中。
在每一个表达构造中的AlaAT基因经序列验证来保证PCR的保真度和ATG起始密码子的完整性。
实施例8二元载体构造和植物转化 Ant启动子/AlaAT基因/nos3’表达盒子被克隆到二元载体通过Pme1和Pac1降解和经同种酶降解的pARC110的连接来进行植物转化。pARC110是一种基于pZP100(Hajdukiewicz et al.，Plant Mol.Biol.25，989-994，1994)农杆菌二元载体。pARC110利用由CaMV 35S启动子和nos终止子驱动的Basta选择标记。选择标记位于左边界，将唯一的限制性酶切位点Xba I，Avr II，Pac 1和Pst I设计为接近RB以便基因克隆。pZP100主链中的氯霉素细菌选择标记由来自pCAMBIA 1304载体(可在cambia.org.au上找到)卡那霉素抗性基因(nptIII)替代。
将根癌农杆菌菌株引入启动子/AlaAT/nos 3’基因二元载体进行单子叶植物农杆菌—介导转化或载体DNA用作植物转化的基因枪轰击方法。
实施例9采用bialophos选择的水稻转化中交替遗蛋白/AlaAT构造的应用 由OsAnt1/AlaAT构造或任何交替Ant/AlaAT construct构造进行的农杆菌-介导水稻转化是通过采用基于U.S.Patent No.7,060,876和European Patent No.672752B1描述的转化方法获得的。细节如下描述。
质粒通过电穿孔技术(Sambrook et al.in Molecular Cloning，ALaboratory Manual Cold Spring Harbor，N.Y.Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)转移的到农杆菌菌株EHA105(Hood et al.，Transgenic Res.2208-218，1993)中。农杆菌细胞在含有50mg/l卡那徽素的固体AB培养基中划平板，28℃条件下培养3天。由扁平小刀收集细菌，先于水稻组织转化之前，在液态共培养基(R2-CL，表4)中采用温和的漩涡式再悬浮培养。
在转化试验中采用成熟的水稻种子(Oryza sativa L.cv.Nipponbare)。种子去皮后，在50％加入0.1％吐温20的漂白剂中灭菌10min，再浸渍在70％(v/v)的乙醇中1min，然后用无菌蒸馏水清洗5次。灭菌后，种子在愈伤组织诱导培养基(N6C，表4)中26℃避光培养3周。
表4.用于愈伤组织诱导、嫁接、共培养、静息、选择、再生和生根的培养基

3周后，将3-5mm长从外植体/培养基表面的子叶衍生愈伤组织中释放到培养基中的胚性结状片段浸渍到直径为100mm的含有25ml含有密度为3-5×109细胞/ml(OD600＝0.3)农杆菌细胞的液态共培养基(R2-CL，表4)的培养皿中培养10-15min。胚性片段由已灭菌的滤纸吸干，转移到固态共培养基(R2-CS，表4)中，25℃避光培养3天。共培养的胚性愈伤组织再被转移到含有400mg/l特美汀N6液体培养基中来消毒，在定轨振荡器(100rpm)中，26℃避光培养4h。在无菌滤纸上干浸渍后，愈伤组织放置在N6选择培养基(N6S，表4)中，保持在26℃避光条件下。
培养4周后，未污染的胚性片段发育成大的淡黄色球状组织，这种球状组织在被转移到新鲜N6S培养基中26℃避光条件下再培养4～5周。
球状组织便成了圆形的，紧密的淡黄色的愈伤组织。将假定的转基因植物，抗双丙磷愈伤组织轻轻的挑选出来，转移到再生培养基(RN，表4)中再避光培养1周，然后在14/10h以70μmol/m/s强度白天/黑夜光周期的条件下维持4～5周。在抗性愈伤组织中再生的绿芽被切开，在被转移到装满Sunshine Mix #3的2—英寸的盆中之前，在含有生根培养基(R，表4)的培养瓶中增殖培养2周来促进根和分蘖的生长。转基因植物通过将它们维持在生长室温26℃，14/10h白天/黑夜光周期和高湿度条件下来使它们适应新环境。在盆中种植2周后开始施肥一周3次。肥料混合物是加有硝酸钙的Simmons溶液(San Joaquin Sulphur Co.，Lodi，CA)。16g Simmons和60g硝酸钙混合形成40加仑肥料。
氮源高效利用的单子叶植物包括但不仅仅局限于此玉米、高粱、大麦、小麦、黑麦和草，它们可采用由上例所述的方法进行培育。
本发明描述了有关的一个或多个实施例。然而，许多变异和修饰不能脱离权力要求定义的本发明的范围，这对于技术中熟练的技工是显而易见的。因为这个应用是个暂时的应用.所以是可以修改的。如果需要修改，根据权力要求说明书，这些修改不能影响由整个应用产生的本发明相应的范围。
此处列出的所有文献通过整体上的引用而被合并于此。
序列表
<110>戈德，艾伦G.
迪堡，玛丽
施瓦特，阿莎克K.
<120>氮源高效利用的单子叶植物及其产生方法
<130>FP-1812/US
<140>PCT/US2006/049241
<141>2006-12-21
<150>60/753,818
<151>2005-12-23
<160>45
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>973
<212>DNA
<213>水稻
<400>1
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>2
<210>3
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>3
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>4
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>5
<210>6
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>6
<210>7
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>7
<210>8
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>8
<210>9
<211>443
<212>DNA
<213>高粱
<400>9
<210>10
<211>204
<212>DNA
<213>玉米
<400>10
<210>11
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>11
<210>12
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>12
<210>13
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>13
<210>14
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>14
<210>15
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>15
<210>16
<211>54
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>16
<210>17
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>17
<210>18
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>18
<210>19
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>19
<210>20
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>20
<210>21
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>21
<210>22
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>22
<210>23
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>23
<210>24
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>24
<210>25
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>25
<210>26
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>26
<210>27
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>27
<210>28
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>28
<210>29
<211>482
<212>PRT
<213>大麦
<400>29
<210>30
<211>482
<212>PRT
<213>黍
<400>30
<210>31
<211>482
<212>PRT
<213>水稻
<400>31
<210>32
<211>480
<212>PRT
<213>水稻
<400>32
<210>33
<211>475
<212>PRT
<213>水稻
<400>33
<210>34
<211>482
<212>PRT
<213>水稻
<400>34
<210>35
<211>482
<212>PRT
<213>玉米
<400>35
<210>36
<211>482
<212>PRT
<213>拟南芥
<400>36
<210>37
<211>482
<212>PRT
<213>拟南芥
<400>37
<210>38
<211>473
<212>PRT
<213>拟南芥
<400>38
<210>39
<211>473
<212>PRT
<213>拟南芥
<400>39
<210>40
<211>481
<212>PRT
<213>辣椒
<400>40
<210>41
<211>472
<212>PRT
<213>衣藻
<400>41
<210>42
<211>480
<212>PRT
<213>智人
<400>42
<210>43
<211>486
<212>PRT
<213>酿酒酵母
<400>43
<210>44
<211>404
<212>PRT
<213>大肠埃希氏菌
<400>44
<210>45
<211>397
<212>PRT
<213>高温球菌属
<400>4权利要求
1.一种转基因单子叶植物，其包含有一个编码丙氨酸转氨酶的重组DNA序列。
2.权利要求1所述的转基因单子叶植物，其特征在于，其中所说的单子叶植物选自大麦、水稻、甘蔗、玉米、高粱、黑麦、小麦和草。
3.权利要求1所述的转基因单子叶植物，其特征在于，还包括一个可操作连接到所说的重组DNA序列的启动子。
4.权利要求3所述的转基因单子叶植物，其特征在于，其所述的启动子是一个遗蛋白启动子。
5.权利要求1所述的转基因单子叶植物，其特征在于，其所述的丙氨酸转氨酶是一个植物的丙氨酸转氨酶。
6.权利要求5所述的转基因单子叶植物，其特征在于，其所述的丙氨酸转氨酶是一个单子叶植物的丙氨酸转氨酶。
7.权利要求6所述的转基因单子叶植物，其特征在于，其所述的单子叶植物丙氨酸转氨酶选自大麦、水稻、甘蔗、玉米、高粱、黑麦、小麦和草的丙氨酸转氨酶。
8.一种来自于权利要求1所述的植物的种子。
9.一种转基因水稻植物，其包含有一个编码单子叶丙氨酸转氨酶的重组DNA序列。
10.权利要求9所述的转基因水稻植物，其特征在于，其所述的单子叶丙氨酸转氨酶选自大麦、水稻、甘蔗、玉米、高粱、黑麦、小麦和草的丙氨酸转氨酶。
11.一种来自权利要求9所述的水稻植物的种子。
12.一种转基因玉米植物，其包含有一个编码单子叶丙氨酸转氨酶的重组DNA序列。
13.权利要求12所述的转基因玉米植物，其特征在于，其所述的单子叶丙氨酸转氨酶选自大麦、水稻、甘蔗、玉米、高粱、黑麦、小麦和草的丙氨酸转氨酶。
14.一种来自权利要求12所述的玉米植物的种子。
15.一种转基因小麦植物，其包含有一个编码单子叶丙氨酸转氨酶的重组DNA序列。
16.权利要求15所述的转基因小麦植物，其特征在于，其所述的单子叶丙氨酸转氨酶选自大麦、水稻、甘蔗、玉米、高粱、黑麦、小麦和草的丙氨酸转氨酶。
17.一种来自权利要求15所述的小麦植物的种子。
18.一种转基因高粱植物，其包含有一个编码单子叶丙氨酸转氨酶的重组DNA序列。
19.权利要求18所述的转基因高粱植物，其特征在于，其所述的单子叶丙氨酸转氨酶选自大麦、水稻、甘蔗、玉米、高粱、黑麦、小麦和草的丙氨酸转氨酶。
20.一种来自权利要求18所述的高粱植物的种子。
21.一种转基因大麦植物，其包含有一个编码单子叶丙氨酸转氨酶的重组DNA序列。
22.权利要求21所述的转基因大麦植物，其特征在于，其所述的单子叶丙氨酸转氨酶选自大麦、水稻、甘蔗、玉米、高粱、黑麦、小麦和草的丙氨酸转氨酶。
23.一种来自权利要求21所述的大麦植物的种子。
24.一种转基因甘蔗植物，其包含有一个编码单子叶丙氨酸转氨酶的重组DNA序列。
25.权利要求24所述的转基因甘蔗植物，其特征在于，其所述的单子叶丙氨酸转氨酶选自大麦、水稻、甘蔗、玉米、高粱、黑麦、小麦和草的丙氨酸转氨酶。
26.一种来自权利要求24所述的甘蔗植物的种子。
27.一种产生转基因单子叶植物的方法，其步骤包括(1)选择一个编码丙氨酸转氨酶的核苷酸，(2)选择一个在单子叶植物中可操作的启动子，(3)将选择的核苷酸和选择的启动子结合起来形成一个遗传构造，(4)由遗传构造转化一个单子叶植物细胞形成一个转化细胞，(5)从转化的细胞生长成一个转基因单子叶植物，当表达该构造和不表达该构造的植物在最适度以下的氮源条件下生长，比较在转基因单子叶植物中表达与在不表达所说构造的对照单子叶植物植物中表达的生物量或种子量，其中所说的单子叶植物中所说的核苷酸的表达使得生物量或种子量至少增加了5％～7.5％，7.5～10％，10～15％或15～20％或更多。
28.权利要求27所述的产生转基因单子叶植物的方法，其特征在于，所述的丙氨酸转氨酶选择自由大麦、水稻、甘蔗、玉米、高粱、黑麦、小麦和草丙氨酸转氨酶组成的基团。
29.一种产生转基因水稻植物的方法，其步骤包括(1)选择一个编码丙氨酸转氨酶的核苷酸，(2)选择一个在水稻植物中可操作的启动子，(3)将选择的核苷酸和选择的启动子结合起来形成一个遗传构造，(4)由遗传构造转化一个水稻植物细胞形成一个转化细胞，(5)从转化的细胞生长成一个转基因水稻植物，当表达该构造和不表达该构造的植物在最适度以下的氮源条件下生长时，比较在转基因水稻植物中表达与在不表达所说构造的对照水稻植物植物中表达的生物量或种子量，其中所说的水稻植物中所说的核苷酸的表达使得生物量或种子量至少增加了5％～7.5％，7.5～10％，10～15％或15～20％或更多。
30.权利要求29所述的产生转基因水稻植物的方法，其特征在于，所述的丙氨酸转氨酶选择自由大麦、水稻、甘蔗、玉米、高粱、黑麦、小麦和草丙氨酸转氨酶组成的基团。
31.一种产生转基因玉米植物的方法，其步骤包括(1)选择一个编码丙氨酸转氨酶的核苷酸，(2)选择一个在玉米植物中可操作的启动子，(3)将选择的核苷酸和选择的启动子结合起来形成一个遗传构造，(4)由遗传构造转化一个玉米植物细胞形成一个转化细胞，(5)从转化的细胞生长成一个转基因玉米植物，当表达该构造和不表达该构造的植物在最适度以下的氮源条件下生长时，比较在转基因水稻植物中表达与在不表达所说构造的对照玉米植物植物中表达的生物量或种子量，其中所说的玉米植物中所说的核苷酸的表达使得生物量或种子量至少增加了5％～7.5％，7.5～10％，10～15％或15～20％或更多。
32.权利要求31所述的产生转基因玉米植物的方法，其特征在于，所述的丙氨酸转氨酶选择自由大麦、水稻、甘蔗、玉米、高粱、黑麦、小麦和草丙氨酸转氨酶组成的基团。
33.一种产生转基因小麦植物的方法，其步骤包括(1)选择一个编码丙氨酸转氨酶的核苷酸，(2)选择一个在小麦植物中可操作的启动子，(3)将选择的核苷酸和选择的启动子结合起来形成一个遗传构造，(4)由遗传构造转化一个小麦植物细胞形成一个转化细胞，(5)从转化的细胞生长成一个转基因小麦植物，当表达该构造和不表达该构造的植物在最适度以下的氮源条件下生长时，比较在转基因水稻植物中表达与在不表达所说构造的对照小麦植物植物中表达的生物量或种子量，其中所说的小麦植物中所说的核苷酸的表达使得生物量或种子量至少增加了5％～7.5％，7.5～10％，10～15％或15～20％或更多。
34.权利要求33所述的产生转基因小麦植物的方法，其特征在于，所述的丙氨酸转氨酶选择自由大麦、水稻、甘蔗、玉米、高粱、黑麦、小麦和草丙氨酸转氨酶组成的基团。
35.一种产生转基因高粱植物的方法，其步骤包括(1)选择一个编码丙氨酸转氨酶的核苷酸，(2)选择一个在高粱植物中可操作的启动子，(3)将选择的核苷酸和选择的启动子结合起来形成一个遗传构造，(4)由遗传构造转化一个高粱植物细胞形成一个转化细胞，(5)从转化的细胞生长成一个转基因高粱植物，当表达该构造和不表达该构造的植物在最适度以下的氮源条件下生长时，比较在转基因高粱植物中表达与在不表达所说构造的对照高粱植物植物中表达的生物量或种子量，其中所说的高粱植物中所说的核苷酸的表达使得生物量或种子量至少增加了5％～7.5％，7.5～10％，10～15％或15～20％或更多。
36.权利要求35所述的产生转基因高粱植物的方法，其特征在于，所述的丙氨酸转氨酶选择自由大麦、水稻、甘蔗、玉米、高粱、黑麦、小麦和草丙氨酸转氨酶组成的基团。
37.一种表达重组丙氨酸转氨酶的转基因单子叶植物，当所说的转基因植物和所说的对比的植物在最适度以下的氮源条件下生长时，其中所说的转基因单子叶植物与缺乏所说的重组丙氨酸转氨酶的对照单子叶植物作比较，植物生物量或种子量至少增加5％。
38.一种种子来自于权利要求37中的转基因单子叶植物。
39.权利要求37所述的表达重组丙氨酸转氨酶的转基因单子叶植物，其特征在于，所述的单子叶植物选择自玉米、水稻、小麦、大麦和黑麦组成的基团。
40.权利要求40所述的表达重组丙氨酸转氨酶的转基因单子叶植物，其特征在于，所述的丙氨酸转氨酶选择自由大麦、水稻、甘蔗、玉米、高粱、黑麦、小麦和草丙氨酸转氨酶组成的基团。
41.一种分离的单子叶遗蛋白启动子序列。
42.权利要求41所述的分离的单子叶遗蛋白启动子序列，其特征在于，其所述的单子叶遗蛋白启动子序列选自大麦、水稻、甘蔗、玉米、高粱、黑麦、小麦和草的遗蛋白启动子序列。
43.权利要求42所述的分离的单子叶遗蛋白启动子序列，其特征在于，其所述的单子叶遗蛋白启动子序列是一个高粱遗蛋白启动子序列。
44.权利要求43所述的分离的单子叶遗蛋白启动子序列，其特征在于，其所述的高粱遗蛋白启动子序列包括SEQ ID NO9或它的活性片段。
45.权利要求42所述的分离的单子叶遗蛋白启动子序列，其特征在于，其所述的单子叶遗蛋白启动子序列是一个玉米遗蛋白启动子序列。
46.权利要求45所述的分离的单子叶遗蛋白启动子序列，其特征在于，其所述的玉米遗蛋白启动子序列包括SEQ ID NO10或它的活性片段。
47.一个遗传构造，其包括一个可操作连接到靶基因的单子叶遗蛋白启动子序列。
48.权利要求47所述的遗传构造，其特征在于，其所述的靶基因编码一个但利用蛋白。
49.权利要求48所述的遗传构造，其特征在于，其所述的氮利用蛋白选自高亲和力的硝酸盐运载体、低亲和力硝酸盐运载体、铵运载体、氨水运载体、氨基酸运载体、丙氨酸脱氢酶、谷氨酰胺合成酶、天冬酰胺合成酶、谷氨酸合成酶、谷氨酸2酮戊二酸氨基转移酶、门冬酰胺酶、谷氨酸脱氢酶、硝酸盐还原酶、天冬氨酸转氨酶和丙氨酸氨基转移酶。
50.权利要求49所述的遗传构造，其特征在于，其所述的氮利用蛋白是丙氨酸转氨酶。
51.一种包括权利要求47所述遗传构造的载体。
52.一种转化的植物，其包括一个可操作连接一个单子叶遗蛋白启动子序列的靶基因。
53.权利要求52所述的植物，其特征在于，其所述的靶基因编码一个氮利用蛋白，选自高亲和力的硝酸盐运载体，低亲和力硝酸盐运载体，铵运载体，氨水运载体，氨基酸运载体，丙氨酸脱氢酶，谷氨酰胺合成酶，天冬酰胺合成酶，谷氨酸合成酶，谷氨酸2酮戊二酸氨基转移酶，门冬酰胺酶，谷氨酸脱氢酶，硝酸盐还原酶，天冬氨酸转氨酶和丙氨酸氨基转移酶。
54.权利要求53所述的植物，其特征在于，其所述的氮利用蛋白是丙氨酸转氨酶。
55.一种植物种子，其包括一个可操作连接单子叶遗蛋白启动子序列的靶基因。
56.权利要求55所述的植物，其特征在于，其所述的靶基因编码一个氮利用蛋白，选自高亲和力的硝酸盐运载体，低亲和力硝酸盐运载体，铵运载体，氨水运载体，氨基酸运载体，丙氨酸脱氢酶，谷氨酰胺合成酶，天冬酰胺合成酶，谷氨酸合成酶，谷氨酸2酮戊二酸氨基转移酶，门冬酰胺酶，谷氨酸脱氢酶，硝酸盐还原酶，天冬氨酸转氨酶和丙氨酸氨基转移酶。
57.权利要求56所述的植物种子，其特征在于，其所述的氮利用蛋白是丙氨酸转氨酶。
全文摘要
本发明提供了单子叶植物增加氮利用效率的方法，该方法通过遗传构造修饰来增加丙氨酸转氨酶表达水平和产生植物的水平。特别的，本发明还描述了增加与非转基因植物作比较，在限制性氮源条件下生长的转基因单子叶植物的生物量和产量的方法。在这种方法中，可产生具有期望产量的单子叶植物，同时减少了对高水平氮利用的需要。
文档编号C12N5/04GK101378651SQ200680048718
公开日2009年3月4日 申请日期2006年12月21日 优先权日2005年12月23日
发明者吉恩·克里德尔, 玛丽·迪堡, 阿莎克·K·施瓦特, 艾伦·G·戈德, 乔治·希奥德里斯 申请人:阿凯迪亚生物科学公司