电融合微电极和使用其操纵细胞和/或细胞组分的方法

专利名称：电融合微电极和使用其操纵细胞和/或细胞组分的方法
技术领域：
本发明涉及一禾中电融合微电极(declrofiisk)n microelectrode)和iOT其操纵(manipulate)细胞和/或细胞组^(cellularcomponents)的方法。
背景技术：
细胞的电融合和电穿孔包括对细BM加电流。在许多情况下，希望 加直流电之前对细)ia行排列。细胞的排列可以舰吸取鶴空抽吸AI实施。细胞的排列还可以M31施加交流^it行。但是，当M3iM加交流E^t行排列时，细胞的存活率显著斷氐。所以，希望有一种具备AX排列细鹏口传避流电鹏功能的工具。细胞融^(cell&sion)的过程包括可以MaM加一个或多个直流(DC)脉冲诱导的细鹏莫的局 逆渗透。 A^周知，当电融合细胞时，在乡舒DC脉冲之前为细胞排列施加介电^c(dielec(rophoretic)5t流电(AC)，会极^Ctfe^^细胞融合的速率。与介质的^f只以及两个电l紋间的距离有关，AC的j顿对于细胞的排歹诉口定位^^、要的。然而，也已知晓AC对细胞是有害的，并且高电压和/或长的时间段甚至会导鄉胞溶贿lysis)。而且，小室的典型构造设计成能{狄量的细胞在同一时间融合。由于需要大^f只的介质，牛親的低电导率溶^^、需的，其所含的抗氧化成分也会伤害细胞，或者在卵母细胞这种,練瞎况下，甚至封秀导细胞激舌。为了避免同时i顿抗氧化剂和AC，针对现有小室的一个可割戈方法是在解剖显微镜下AI完成单个细胞的排列。总之，对于常规电融合方法的要求，可以将缺点概括为i)需要显然不是生理性的并且会削弱细胞的生存能力的非电解质溶液；ii)由于大的电极间距，AC脉冲的ail会导致劍劳害并随后引起细鹏敬cell distress); iii)单个细胞排列耗费时间；和iv)由于反复f顿，电小室可能会成为病原污染的来源。
本发明是为了克服本领域中的这些和其它不足。发明 本发明一方面涉及一种由具有第一近端和第二远端的管制成的电融合微
电极。所述管在其夕卜表面上具有从管的第一近端遊卖延伸到管的第^^端的导电涂层。本发明另一方面涉及一种电融合微电极^g，其包含如J^f述的电融合微电极和肖,S^述管的第:n^端接纳电融合微电极的固定Xi^oldingtoo1)。
本发明的还一方面涉及含有两个或更多个如上所述的电融合微电极，的系统。本发明再另一方面涉及一种操纵细胞和/^ffl!Ma分的方法。该方、^括
将细胞和/或细胞组分与如上所述的电融合微电极的管的第一近端撤4。这种撤虫
在有交M纟Mg胞和/自胞组分的劍牛下进行。本发明的还另一方面涉及一种操乡，胞和/自胞组分的方法。该方、 ^括
将细胞和/或细胞组分与两个，多个如JJf述的电融合微电极^i虫。在有交 纵细胞和/，胞组分的斜牛下，在每一个微电极管的第一ifi端进行)^细胞禾n/^ffl胞
组分的撤虫。本发明樹共了具备Ax排歹蜘胞和向细胞传3ii:流^s功能的工具。哺乳动物的细胞核移纟調于少,胞，尤其是处理人类卵母细胞时。所以，
获得允许单个细胞排列的工具是理想的。在^^乡鹏制下，#^虫的微电极的{顿使得育,精确定创艘融合的细胞的期望位置，并且由于电极-细胞的直,虫，可避免4OT交流电，以及使用小量的介质。交流电的省去和所需的小体积，使得育,采用可以用油覆盖的常规培养介质。财卜，直接的细胞撤虫甚至会M^I艘4柳的直流电量，斷氏对细胞劍另害的可能性。最后，这种微电樹總的价榭吏其可以一次性j顿，从而杜绝了污染的可能性。
附图简述

图1A-B是本发明的电融合微电极的两个不同的实敲案的平面图。图
1A-B的电融合微电极由具有第一近端和一个第:i^端的管串喊，所述管砂卜表面
上具有从管的第一近端遊卖延伸到管的第^^端的导电涂层。在图1A中，微电极管具有固定吸量管潮勾，其中第一近端是直的。在图1B中，微电极管具有固定吸量管结构，其中第Hfi端是弯曲的。图1C是图1A的电融合微电极的咅舰亂示出了导电涂层怎样环绕微电极管沿圆周延伸。
图2A-D歸出了本发明的电融合微电极管的第一近端的各种实 案的透视图。在图2A中，微电极管的第一近端题的并是开放的。在图2B中，微电极管的第一近端是直的并是密封的。在图2C中，微电极管的第一近端是弯曲的并是开放的。在图2D中，微电极管的第一近端是弯曲的并是密封的。
图3A是本发明的电融合微电极驢的一个实船案的平面图。该电融合微电极装置包含安装在固定工具内的本发明的电融合微电极。如图所示，固定工敲微电极管的第二远端接纳电融合微电极。图3B是图3A所示的电融合微电极，的^A军图。图4是本发明的电融合微电^^fi的一个实m^案的平面图，戶;M^a具
有安装在固定工具内的本发明的电融合微电极。与电源可操作地连接的电极夹(electrode clip)在导电涂层^i接到电融合微电极。图5示出了本发明的系统的一个实 案。所皿统有两个可操作地与真空或抽吸器连接的本发明的电融合微电l^置，每个电融合微电纟M安^W可操作地与电源连接的电极夹。
发明详述本发明的一方面涉及一禾中由具有第一近端和第二远端的管制成的电融合微电极。所述管在其夕卜表面上具有从管的第一近端遊卖延伸至惰的第J端的导电涂层。图1A-B示出了本发明的电S虫合微电极的两个不同的实驗案。如图所示，电融合微电极10由具有近端14 (电极尖端)和远端16的微电极管12制成。在管12的夕卜表面上的导电涂层18从管12的近端14遊卖延伸到远端16。在图1A示出的实驗案中，微电极管12具有固定吸量管结构，其中近端14超的。在图1B显示的实 案中，微电极管12具有固定吸量管结构，其中近端14是弯曲的。电融合微电极10的管12可以是具有不同几何构造的倒可中空管。因此，如果需要，管12的壁可以有角度。在雌的实 案中，管12是圆l翅的。更ifci^t也，管12具有固定吸量管结构(holding pipette configuration^
当然，管12的直径和长度是可变的。如以下更详细描述的那样，管12的直径和长度将根据细胞(和/或细胞组分)的种类以及使用电融合微电极10的操纵的^ 化。典型地，管12的长度为约50-80毫米，直径为约0.5-1.5 。
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微电极10的管12可以由任意数目的包括但不限于玻璃、塑料、PVC、陶瓷和/^^属的材料制成。招腿的实船案中，管12由玻璃制成。甚至更4腿地，管12由硼硅麟玻璃毛细飾喊，其经拉伸和纟^^为固定吸量管娜。
导电涂层18 tt^M31将^^布在管12的夕卜表面上以液体的形 加。在图1C所示的优选的实 "案中，导电涂层18围绕微电极管12沿圆周延伸。适合的电导体包括但不限于铝、铜、银、金、钛、铀、钩和合金以及它们的混合物。微电极管12的近端14可以具有不同的构型。在一个实te"案(图2A-B)中，管12的近端14是直的。在可割戈实航案(图2C-D)中，管12的近端14是弯曲的。当管12的近端14是弯曲的时，Mi5端14的尖端弯曲雌为约0-90度。管12的近端14在尖端处可以是开放的(图2A和2C，开口20)赫封闭的(图2B和2D)。发明另一方面涉及一种具有如上所述的电融合微电极和肖,在微电极管
的第Z^端接纳电融合微电极的固定工具的电融合微电极，。图3A示出了本发明的电融合微电t碟置的一个实皿案。如图所示，电
融合微电极装置62具有安装在固定工具30内的电融合微电极10，电融合微电极
10的近端14伸出固定工具30之外。
固定工具30^^含接纳组件36的管，接纳组件36含有孔34，电融合微电极10从中穿过被接纳。固定工具30还具有主轴32和位于接纳组件36和主轴32之间的电绝缘体38，从而 魅圣接纳组件36的电流不会到胜轴32。
接纳组件36和主轴32可以由相同的材料构成，并且雌由导电的耐用材料构成。另一方面，电绝缘体38由不导电的材料构成，例如塑料。电乡條体38的不导电特性防止电 31接纳组件36传避往轴32。这个设计在电操作实施过程中产生更定域的电 M，这在下面有更详细的讨论。电乡機体38的绝劍争性也允许以衝氐细胞死，B鄉MA固虹具30。图3B是图3A的电融合微电l^g62的爐图，其示出了固定工具30的装配。如图所:示，支持工具30的三个主要组件(接纳组件36、电绝缘体38和主轴32) iKl电绝缘体38上带螺纹的连接器42和主轴32上带螺纹的连接器44相连接。带螺纹的连接器42育,紧固入开口48，开口 48具有与带螺纹的连接器42的螺纹相匹配的带螺纹的壁。同样，带螺纹的连接器44能被紧固入开口50，开口 50具有与带螺纹的连接器44的螺纹相匹配的带螺纹的壁。这种t親的组装 方式防止接纳组件36的导电材料和主轴32的导电材料之间形成电^l虫。
绝缘套管40被安装在管12的远端16 a以防止管12在装入固定工具 30中时发生不希望的移动，并在向导电涂层18施加电流时进一步绝缘固定工具 30。通过将管12 (经由远端16)滑入接纳组件36的孔34 ^!繊电极10安装到 固定工具30中。招腿的实 案中，4微电极10在接纳组件36中安謝寻足够 深，从而使接纳组件36施压固定微电极10。再次参照图3A，根据一个实皿案，管12的第一近端14是开放的(图 2A和2C)，并且电融合微电极體62可操作地与真空或抽吸器连接。 *， 真空^l吸，管的远端可操作地与微电极管12 。真空^tt吸^微电极管 12的连MMM3i接软管46实现。如图3A所示，连接软管46安装在固定工 具30的主轴32内，从而 微电极管12和开口 20的内部抽吸形皿空。
根据图4所示的另一个实脏案，电融合微电I^S62具有在导电涂层 18处与微电极管12连接的电极夹56。电极夹56伏JM31夹持在孔34附近的微 电极管12上而与微电极管12连接。电极夹56经电连接器58与电源连接。根据 该实驗案，电^M电极夹56从电源传避l滑12。在一^H腿的实驗案中，将本发明的电融合微电极體安装在鹏从器 (micromanip麵)上。鹏也，所述鹏纵翻到置显微镜下鹏。适合的,从 器包括但不限于MM188和MM109,纵器，Narishigie Co., LTD (东京，日
本)生产。图5示出了本发明的系统的一个实1 案，fM^、统包含两个电融合微电 极體62，針电融合微电极體可操作地与真空翻吸器54连接。另外，电 融合微电极10与M3^^器58可操作地与电源连接的电极夹56电撤虫。^5^M 系统的一个tt^的实施方案中，本发明的第一电融合微电极装置和与直流电源的 正极^(positive teiminal)连接的第一电极夹58相连，而本发明的第二电融合微电极 装置和与直流电源的负极端(negative tenranal)连接的第二电极夹58相连。
在操作时，可以将本发明的电融合微电极、，和系统用于操纟，胞柳
8鄉胞组分。因此，本发明另一个方面涉及一种操乡胸胞种鄉BMa分的方法。 该方纟跑括将细胞柳自胞组分与本发明的电融合微电极撤虫。在有$娥 胞 和/或细胞组分的劍牛下，在微电极管的第一近端实施细胞种^H胞组分与本发明 的电融合微电极的，虫。本发明的还一个方面涉及一种操纵细胞和/自胞组分的方法。i亥方, 摘每细胞和/或细胞组分与两个颇多个本发明的电融合微电极撤虫。在有 娥纵 细胞称自胞组分的劍牛下，在每一个微电极管的第一近端实施细胞称自胞组 分的撤虫。依照本发明的方法的细胞操纵可以包括细胞和/或细胞组分的排列 (aligning)、融合(fbsing)、电穿孔(electroporating)、电融合(electrofosing)禾口/或移植 (transplanting)。根据本发明的方法的一个实 案，^ffi本发明的电融合微电极实施细胞
禾n/自胞组分的操纵，其中电融合微电极的第一近端是开放的，且其中戶脱电融
合微电极具有在管的第二远端与该微电极可操作ii^i接的真空或抽吸器。根据该 实施方案，接触细胞和减细胞组分M^t细胞和/^ffl胞组分施加吸取(aspiration) 鋤吸(suction)来实施。为了AX排歹踟胞和/或细胞组分这一目的，依照本发明的方法通常将吸 取或抽吸施加到细胞和/鄉胞组分。根据TO法M3iWP滅吸取实鹏胞Al排 列，避免了用于排歹啲交流电的〗顿，从而显著:tfe^高了细胞的存活。细胞存活 的显著提高使 ￡每 ，纵中可^1^1>的细胞 。可以使用微电l跪动与吸取或抽吸的组合来实施本发明的方法。通常，优 劍顿吸取或抽吸排列细胞，然后il51本发明的电融合微电^M加直流电。
本发明的方法待别适合于细胞核移植。iOT本发明的电融合微电极、，、 或系统鄉行细胞核移植，Mm—卵母细胞移出细胞核，并将该细胞核移植 到已经予Bfe摘除了细胞核的第二卵母细胞的卵周隙(perivitellinespace)中，然后{， 一卵母细胞的移植细胞核与第二卵母细胞的细M结合。这MM^所^ffl胞核与 细鹏释方爐流电来完成。如上所述，电融合微电极的长度和直径可以根据细胞的种类和使用微电极 的操纵的鄉而变化。例如当用于哺乳动物细胞的细胞核移植时，管的直樹尤 选在约15 nm至U约25 )jm的范围内。当用于哺乳动物细胞的融合时，管的直4锁选在约60 urn到约100拜的范围内。在一个实M^案中，管的外径可以为约0.97 mm，而管的内径可为约0.69mm。在该实M^案中，戶腐管具有厚度只有约0.28mm 的非常薄的管壁。
实施例掛共以下的实施例是为了阐明本发明的实;^案，而非要限制其范围。
^Mii-电融合微电极的构造长度为78mm，夕卜径为0.97mm和内径为0.69mm的毛细管(Drummond Scientific, Boomall,Pa.)，被巨离一端(近端)10-15mm的iia^7jc平微电极拉伟1藤 (微立帝螺)(Campden Inc., LTD.,伦敦)上拉伸大约60-100拜。将所述管娜段 仪(microforgeXNarishige Co., LTD, Tokyo, J邻an)上切割^W光以获得最终的60卿 的外径和20Mm的内径。
^MM^-不成熟哺乳动物卵母细胞的细胞核移植经穿刺B6D2F1雌小鼠未经促排卵巢的卵泡获得胚泡(germinal vesicle,
GV)阶段的卵母细胞。然后，在补充了细鹏公弛素B的介质中，4顿一个或多个 本发明电融合微电，W51Mi^lWK出细胞核。随后将一个细胞核引A5U已预 先摘除了细胞核的不成熟卵母细胞的卵周隙中。然后将每一个被移植的卵母细胞 方ffi在两个本发明的电融合微电禾及t间，暴露于单^U.0kV/cr^ 50-99 的直流 融合脉冲。30^60併中后，检查卵母细胞的融^象。然后将i鍾组的卵母细SM文 入培养基中并评定其成熟清况。可以将已经排出第一极体的卵母细胞固定并用姬 姆萨(Giemsa)染色进行染色体分析。作为对照，对大约三分之一的卵母细胞不 进行倒可操作，仅仅i^S同样的介质中并暴露于同样的试剂。 实施例3陽胚泡移植经荆UB6D2F1雌小鼠未经糊柳巢的卵泡获得胚泡(GV)阶段的卵母 细胞。在PMSGf湖啲雌小鼠hCGf掛后15小时收集分裂中期n (固)卵母细 胞。然后，在补充了细胞松弛素B的介质中，{顿一个或多个本发明电融合微电 极将细胞核从GV卵母细胞中取出。M3H顿一个或多个本发明电融合微电t鹏 过将分裂中期纺 ^所在的"中心"区和第一极体一起清除而将謹卵母细胞去细 胞核。随后，将GV细胞核引入预先去细胞核的未成熟的(GV) ^熟的(MH) 卵母细胞的卵周隙中。然后将*被如 纵的卵母细!&^§在两个本发明电融 合微电丰fe间，暴露于单^X 1.0 kV/叫50-99 ios的直流融合脉冲以迸行电融合。将30~60併中后显示出融^t象的卵母细I^MJ:歸基中:t歸12个小时4魏胞核 成熟。可以^|糊咄第一极体的卵母细胞固定并用 1萨染色以进行鹏体分析。
虽然出于说明的目的已经详细描述了本发明，f鹏该理解这些细节仅仅只 为该目的，那些本领域的技术人员可以在不背离以下权利要求所限定的本发明的 宗旨和范畴的情况下，对此做出各种改动。
权利要求
1. 一种电融合微电极，其包括具有第一近端和第二远端的管，其中该管具有在其外表面上的导电涂层，所述涂层从该管的第一近端连续延伸至该管的第二远端。
2. 根据权利要求1的电融合微电极，其中所述管具有固定吸量管结构。
3. 根据权利要求1的电融合微电极，其中所述管的第一近端是密封的。
4. 根据权利要求1的电融合微电极，其中所述管的第一近端是开放的。
5. 根据权利要求1的电融合微电极，其中所述管的第一近端是弯曲的。
6. 根据权利要求1的电融合微电极，其中戶腿管由选自由鹏、塑料、PVC、 陶瓷和金属纟賊的组的材料制成。
7. 根据权利要求6的电融合微电极，其中所述管由玻璃制成。
8. 根据权利要求1的电融合微电极，其中所述导电涂层选自由铝、铜、银、 金、钛、钼、鸨、合金和它们的混糊纟诚的组。
9. 根据权利要求1的电融合微电极，其中所述导电涂层环^^述管沿圆周延伸。
10. —种电融合微电极，，其包括根据I51利要求1的电融合微电极，和 育,^^述管的第1端接纳电融合微电极的固定工具。
11. 根据权利要求IO的电融合微电极驢，其中戶腿管的第^fi端是开放的， 所述电融合微电极^3进一步包括.-真空或抽吸器，^^f述管的第r^端与微电极可操作;te^接，从而在第一 近端引起抽吸。
12. 根据权利要求10的电融合微电禾^g，进一步包括..电极夹，其可操作地与电源连接并可舒脱导电涂层鹏接到臓管，使得 电流會鹏电极彭人电源传避断述管。
13. 根据权利要求10的电融合微电tKS，其中所述固^X具进一步包括 管，其包含接纳组件，微电极管的第』端接纳进该接纳组件中； 主轴；和电绝缘体，其位于主轴和接纳组件之间，从而纟魅圣接纳组件的电流不到胜轴。
14. 根据权利要求10的电融合微电极體，进一步包括 为控制固定工具而安装的微櫞从器。
15. —种系统，其包括两个颇多个根据权利要求io的电融合微电i^a。
16. —种操,胞和/或细胞组分的方法，所述方飽括在有繊,胞和/鄉胞组分的餅下，将细胞和/或细胞组分与权利要求1的电融合微电极的管的第一i5端^M。
17. 根据权利要求16的方法，其中所述管的第一近端是开放的，所述电融合 微电极迸一步包括在管的第二远端与微电极可操作;t^^接的真空^l吸器；所述方法进一步包括^0f述撤iM程中对所鄉胞和/或细胞组分施加抽吸。
18. 根据权利要求16的方法，其中朋述电融合微电aiS—步包括可操作地与电源连接并可^^腿导电涂层^3i接到戶脱管的电极夹，所述方法进"^包括棚述擲敏程中对戶;M^胞和/鄉鹏且分施加电流。
19. 根据权利要求16的方法，其中所逝麯虫包括排列、融合、电穿孔、电融合称，植细胞称^9胞组分。
20. —种操鄉胞和/鄉胞组分的方法，臓方飽括将细胞和/自胞组分与两个或更多个权利要求1的电融合微电极撤虫，其中 所述撤鹏繊翻胞和/或细胞组分的斜牛下顿述管的第一近端实施。
全文摘要
本发明涉及一种由具有第一近端和第二远端的管制成的电融合微电极。所述管在其外表面上具有从管的第一近端连续延伸到管的第二远端的导电涂层。还公开了一种电融合微电极装置，其具有电融合微电极和能够在管的第二远端接纳该电融合微电极的固定工具。本发明还涉及具有两个或更多个本发明的电融合微电极的系统，和使用本发明的电融合微电极、装置和系统操纵细胞和/或细胞组分的方法。
文档编号C12M1/42GK101506346SQ200680048161
公开日2009年8月12日 申请日期2006年11月14日 优先权日2005年12月22日
发明者G·D·帕莱尔莫 申请人:康乃尔研究基金会有限公司