专利名称：：反-10，顺-12十八碳二烯酸的生产方法
技术领域：
：本发明涉及通过表达编码反-10，顺-12共辄亚油酸异构酶的核酸分子的转基因微生物从而产生反-10，顺-12十八碳二烯酸的方法。本发明还涉及富含共轭亚油酸的伺料或食品制品(尤其是营养制品)的生产方法。本发明也涉及富含共轭亚油酸的饲料、食品制品和营养制品，和涉及表达编码反-10，顺-12共轭亚油酸异构酶的外来基因的转基因微生物，并涉及同样益生菌在食品或伺料中的用途。本发明的所附实施方案涉及根据本发明的方法产生的发酵油和所述发酵油在药品生产中的用途。
背景技术：
：脂肪酸和甘油三酯在食品工业、动物营养、化妆品和制药方面有多种应用。由其是否是游离饱和脂肪酸或不饱和脂肪酸或是具有增加量的饱和或不饱和脂肪酸的甘油三酯决定，它们适合于很广泛的应用；因此，例如多不饱和脂肪酸添加到嬰儿配方中从而增加营养价值。多种脂肪酸和甘油三酯主要获自微生物例如被孢霉菌，或获自产油植物例如大豆、油料种子、向曰葵等等，其中通常以它们的三酰基甘油酯的形式获得。可选择地，它们最好从动物(例如鱼类)获取。最好通过水解作用制备游离脂肪酸。依赖于预期目的而优选具有不饱和脂肪酸或具有饱和脂肪酸的油脂；因此，例如优选具有不饱和脂肪酸(尤其是多不饱和脂肪酸)的脂类用于人体营养，因为它们对于血液中的胆固醇水平具有阳性效应，而且因此减少心脏疾病的可能性。它们应用于多种^:食的食物或药品中。尤其有价值的不饱和脂肪酸是所谓的共轭不饱和脂肪酸，例如共辄亚油酸。已经发现了共轭脂肪酸的一系列阳性效应；因此，施用共辄亚油酸减少人和动物的体脂肪并^f吏动物饲料向体重的转变增加(WO94/16690、WO96/06605、WO97/46230、WO97/46118)。通过施用共辄亚油酸，也可能对例如过敏反应(WO97/32008)或癌症产生积极的影响(Banni等人，Carcinogenesis,第20巻，1999:1019-1024，Thompson等人，Cancer,Res"第57巻，1997:5067-5072)。共轭亚油酸(CLA)包含具有两个共轭双键的亚油酸(LA)的位置和几何异构体家族。已报道顺-9，反-11CLA(c9,tl1CLA)和反-10,顺-12CLA(tlO，cl2CLA)异构体具有最大的生物活性，包括抗癌、抗动脉粥样硬化、抗糖尿病、抗肥胖、免疫增强应答和对骨形成的阳性作用(Belury，2002;Pariza等人，1999;Pariza等人，2000)。许多最近的研究表明特异的tl0，cl2CLA异构体能够通过减少动物和人的体脂肪含量和增加无脂肪身体组织从而改变机体组成。用tl0，cl2CLA异构体喂养啮齿动物的研究表明其减少体脂肪、增加身体水量、增加机体蛋白质和增加机体灰分(Park等人，1999;deDeckere等人，1999)。在小鼠组织培养中，tl0，cl2CLA异构体减少脂蛋白脂肪酶活性和细胞内甘油三酯浓度(Park等人1999)。其他的小鼠研究表明该异构体减少肝酰基-辅酶A去饱和酶mRNA的表达(Lee等人，1998)和小鼠脂肪细胞中酰基-辅酶A去饱和酶的表达(Choi等人，2000)，从而降低脂肪的合成。此夕卜，Os什owski等人(1999)证明摄入共辄亚油酸(含约30%tl0，cl2CLA的异构体混合物)会导致生长的猪中无脂肪组织增加和脂肪沉积减少，而且Brown等人(2003)揭示了tl0，cl2CLA异构体在人脂肪前体细胞和成熟脂肪细胞中特异性下调甘油三酯累积和PPARY表达。向53个健康男人和女人组补充人CLA(4.2g/d;等量c9，tl1和tl0,cl2CLA)，与补充橄榄油的对照组相比体脂肪减少的比例为3.8。/。(Smedman和Vessby，2001)。Blankson等人，2000得到类似的结果，他们报道了用大于3.4gCLA/天的剂量(等量c9，tl1和tl0，cl2CLA)施用于超重和肥胖的人12周后与对照组比较显著减少体脂肪量。同样，Thorn等人(2001)在12周的试验以后得到相近的结果。tl0，cl2CLA异构体也能减少奶牛的乳脂合成。tl0,cl2CLA异构体的4天皱胃浸出液引起乳脂百分比减少42%和乳脂产量减少44%。而c9，tllCLA对乳脂没有影响(Baumgard等人，2000)。tl0，cl2CLA异构体抑制乳脂合成的机制仍然未知，但是其可能包括抑制涉及脂肪酸从头合成的主要酶(例如酰基-辅酶A羧化酶和脂肪酸合成酶)的活性或合成(Baumgard等人2000)。因此证据表明CLA在促进健康中起重要作用，并且特异性tl0，cl2CLA异构体可以用于治疗超重和肥胖的动物和受试人。通过富集该异构体和掺入功能性食品并作为每日基本成分，可能对这些情况进行预防和治疗。已报道，tl0，cl2和c9，t11CLA异构体都可以行使抗癌活性。具体地，其可以抑制皮肤瘤起始和前胃瘤形成，并且抑制化学诱导的皮肤瘤诱发和乳房和结肠肺瘤发生(Belury，2002)。对CLA执行许多生理效应的4几制仍未完全了解，但是至少提出了两个不同的模型。一个模型提出CLA减少花生四烯酸盐库从而减少下游类花生酸产物的产生，该类花生酸产物调控涉及炎症和癌症的细胞因子的产生。另一个模型包括对已知调控脂类氧化、脂肪细胞分化、能量平衡和动脉粥样硬化形成的基因表达的调控(Behiri,2002;Pariza等人，2000)。CLA可以从亚油酸和亚麻酸、或含亚油酸或亚麻酸的植物油的碱性异构化作用合成制造。当在碱性条件下将油脂加热到180。C时，两个反应被催化;脂肪酸酯键从甘油三酯脂类主链上水解产生游离脂肪酸，和具有两个或更多合适的双键的非共轭不饱和脂肪酸的共轭反应(WO99/32604)。该方法产生约20-35%的顺-9，反-11CLA和约等量的反-10，顺-12CLA,但是相对于其他异构体，可以通过分步结晶法实现这两种异构体的任一种的富集。此外，产生的其他异构体主要是反，反异构体。US3,356,699和US4,164,505中也描述了共辄脂肪酸(例如共扼亚油酸)的化学制备。CLA作为瘤胃细菌中亚油酸生物氢化过程中的中间体而天然形成，因此CLA的天然来源是反刍动物的乳和脂肪。乳脂中的主要CLA异构体是c9，tl1CLA，其占有总乳脂CLA的80-90%,而tl0，cl2CLA异构体只有约1%(Jensen，2002)。除瘤胃微生物群以外，具有将亚油酸转变为c9，tl1CLA异构体能力的培养物的范围是已知的。某些双歧杆菌菌林能够产生CLA(主要是顺9，反-11异构体)(Coakley等人，2003;Rosberg-Cody等人，2004)。能够生物合成CLA异构体(主要是顺9，反-11CLA异构体)的其他种属是作为乳品发酵剂的丙酸杆菌(Jiang等人，1998)、大鼠肠道微生物丛菌林(Chin等人，1994)和某些乳酸杆菌属(Lin等人，1999)。Nordgren(1999)鉴定许多双歧杆菌菌林能够以游离亚油酸作为底物生物合成CLA。WO99/29886描述了食物等级细菌中(尤其在乳品发酵剂中)发现的细菌菌林的用途，其具有通过体外发酵产生CLA的能力。然而，只有少数细菌菌林可以用于生物技术的CLA生产，这些菌林仅可以通过大量和文库篩选方法进行鉴定。这是由于多数可获得的细菌菌林(i)是不能从游离亚油酸产生CLA的，和/或(ii)这些菌林的生长速率被培养基中的游离亚油酸彻底地抑制。专利申请WO99/29886公开了22个受试细菌菌株中仅有4个能够从游离亚油酸产生CLA,并且19个受试菌林的生长速率被培养基中的游离亚油酸抑制超过50%。不幸地，能够从游离亚油酸产生CLA的4个细菌菌林对于培养基中的亚油酸敏感。此外，由鉴定的细菌菌林产生的CLA的70-卯％是由c9，tll/t9，c11-18:2异构体代表的，没有检测到反-10，顺-12十八碳二烯酸。能产生tl0，cl2CLA的种仅有痤齊丙酸杆菌(Propionibacteriiimacnes)(Verhulst等人，1987)和瘤胃细菌埃氏巨球型菌(Megaspheraelsdenii)YJ-4(Kim等人2000)。这些结果证明仍然需要鉴定在经济上具有有利水平的细菌菌林或生物技术生产CLA，尤其是反-10，顺-12十/V暖二烯酸的方法。WO99/32604描述了来自罗伊乳杆菌(Lactobacillusreuteri)的亚油酸盐异构酶。该酶活性可使亚油酸转化为6个不同的CLA种，如下(顺，反)-9，ll-CLA、(反,顺)醫10，12-CLA、(顺，顺)-9，ll-CLA、(顺，顺)-10,12-CLA、(反，反)-9，ll-CLA和(反，反)-10，12画CLA。使用上述异构酶的缺点是反应产量非常低，产生的CLA的纯度不足以用于工业生产方法，而且仅发生很低的空间时间产量。这导致经济上不利的方法。因此，仍然非常需要不具有上述缺点的产生CLA的单一的、经济的生物技术方法。
发明内容因此本发明的目的是提供在微生物中产生共轭亚油酸(尤其是反-10，顺-12共轭亚油酸)的有效方法。此外，本发明的目的是鉴定能够用于有效发酵生产共辄亚油酸的微生物。我们发现可以通过使用表达编码CLA异构酶(尤其A^-10，顺-12共辄亚油酸异构酶)的核酸分子的转基因微生物来实现所述目的，该微生物属于乳酸杆菌科(Lactobacillaceae)、链球菌科(Streptococcaceae)、丙酸杆菌科(Propionibacteriaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)或双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)。意料之外的是，由于多数上述微生物的野生型细胞的生长被培养基中的游离亚油酸所抑制，上述微生物当表达编码(反-10，顺-12)共辄亚油酸异构酶的核酸分子时，能够从亚油酸产生共辄亚油酸(尤其是反-10，顺-12共辄亚油酸)。因而，技术人员事先未预期能够将这些微生物应用于产生共辄亚油酸的发酵进程。更令人吃惊的是，当在乳酸乳球菌(LactococcusIactis)中表达时，反-10，顺-12共轭亚油酸异构酶的表达使转基因微生物将加入的亚油酸的50%转化为反-10，顺-12共轭亚油酸，在大肠杆菌和副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)中转化率分别为40%和30%。发明概述本发明的第一个主题因此涉及在转基因微生物中产生反-10，顺-12共辄亚油酸的方法，包含以下步骤(a)将至少一种编码反-10，顺-12共轭亚油酸异构酶的核酸分子引入到所述樣吏生物中，(b)培养在(a)获得的转基因微生物，(c)通过向培养物中加入亚油酸来资导反-10，顺-12共辄亚油酸的产生，(d)将诱导的培养物培养至少12小时，和(e)从培养基和/或微生物中分离共辄亚油酸。在优选的实施方案中，所述反-10，顺-12共轭亚油酸异构酶的特征在于，其序列i.如SEQIDNo.1所述，或ii.具有SEQIDNo.1所述序列的至少50个连续碱基对，或iii.与具有SEQIDNo.1所述序列的至少100个连续核酸碱基对的序列有至少80%同一性，或iv.在高严格性条件下与具有SEQIDNo.1所述核酸分子的至少50个连续碱基对的核酸片段杂交，或v.编码与SEQIDNo.2所示氨基酸序列至少有75。/。同一性的多肽，并且编码反-10，顺-12共轭亚油酸异构酶。在尤其优选的实施方案中，所述反-10,顺-12共轭亚油酸异构酶是从瘤胃细菌、优选从埃氏巨球型菌YJ-4中分离的。另外，本发明涉及上述方法，其中编码所述反-10，顺-12共辄亚油酸异构酶的核酸分子是从属于丙酸杆菌属(优选从痤疮丙酸杆菌)的微生物中分离的。在优选的实施方案中，本发明涉及根据上述(a)到(e)步骤在转基因微生物中产生共轭亚油酸的方法，其特征在于(a)中所用的微生物选自乳酸杆菌科(Lactobacillaceae)、链球菌科(Streptococcaceae)、丙酸杆菌科(Propionibacteriaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)和双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)，优选所用微生物选自乳球菌属(Lactococcus)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、大肠杆菌属(Escherichia)和双歧杆菌属(Bifidobacterium),更优选所述微生物选自乳酸乳J求菌(Lactococcuslactis)、副干酪乳杆菌和大肠杆菌(Escherichiacoli)。在本发明的优选实施方案中，根据上述(a)到(e)步骤在转基因微生物中产生共轭亚油酸的方法的特征在于在光密度(OD6。。)至少为0.1的微生物培养物中力口入亚油酸。本发明尤其优选的实施方案涉及在转基因微生物中根据上述(a)到(e)步骤产生共轭亚油酸的方法，其特征在于亚油酸的生物转化率高于10%。此外，本发明涉及生产富含共轭亚油酸的饲料或食品产品、或营养制品的方法，其中所用共轭亚油酸是才艮据上述方法产生的。本发明还涉及富含共轭亚油酸的饲料产品、食品产品、和营养制品，其中共轭亚油酸是根据上述方法产生的。另夕卜，本发明涉及表达编码反-10，顺-12共轭亚油酸异构酶的核酸分子的转基因微生物，该酶的序列特征在于(i)如SEQIDNo.1所述的序列，或(ii)具有SEQIDNo.1所述序列的至少50个连续碱基对的序列，或(iii)与具有SEQIDNo.1所述序列的至少100个连续核酸碱基对的序列有至少80%的同一性，或(iv)在高严格性条件下与具有SEQIDNo.1所述核酸分子的至少50个连续碱基对的核酸片段杂交，或(v)编码与SEQIDNo.2所示氨基,列至少有75%同一性的多肽，其中所述核,列优选从瘤胃细菌中、更优选从埃氏巨球型菌中、最优选从埃氏巨球型菌YJ-4中分离，或从属于丙酸杆菌属的微生物、优选痤疮丙酸杆菌中分离，其中所述核酸分子功能上连接于至少一个异源启动子序列。在本发明的更优选的实施方案中，本发明涉及发明的转基因樣吏生物作为食品和饲料中的益生菌的用途，微生物优选属于选自乳球菌属、乳酸杆菌属、丙酸杆菌属、大肠杆菌属和双歧杆菌属，更优选^:生物选自短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)、齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)和假链状双歧杆菌(Bifidobacteriumpseudocatenulatum)。另外，本发明涉及在转基因微生物中根据上述本发明方法产生的发酵油。本发明还涉及根据上述本发明方法产生的发酵油用于治疗癌症的药物生产的用途。附图简述图1:pNZ44画coPAI构建体(SEQIDNo.5)图2:乳酸乳杆菌(l.Zfl"&)pNZ44-coPAI与0.2mg/ml亚油酸培养72小时后上清(A)和膜(B)的GLC层析镨，以及乳酸乳杆菌pNZ44(C)与0.2mg/ml亚油酸培养72小时后的GLC层析i普。(D)tl0，cl2CLA标准物的GLC层析镨。(E)携带pMSP3535-coPAI构建体(未诱导的)的副千酪乳杆菌(Lb.paracasei)NFBC338与0.5mg/ml亚油酸培养48小时后的培养上清的GLC层析谦，和带有pMSP3535构建体的副干酪乳杆菌NFBC338与0.5mg/ml亚油酸培养48小时后的培养上清的GLC层析镨(F)。(G)大肠杆菌pNZ44-coPAI在0.5mg/mlLA中培养72小时后上清的GLC层析语，和pNZ44在0.5mg/mlLA中培养72小时后上清的GLC层析谦(H)。峰1=亚油酸，峰2-tlO，cl2CLA。图3:乳酸乳杆菌pNZ44-coPAI与0.2mg/ml亚油酸(LA)培养72小时后，CLA的产生及亚油酸利用和膜中脂肪酸的积聚。培养物在LA中培养到OD6。q=0.5。图4:大肠杆菌pNZ44-coPAI与0.5mg/mlLA培养72小时后，CLA产生及亚油酸(LA)利用和膜中脂肪酸的积聚。图5:以5-25ng发酵油/脂肪^/ml培养基处理培养5天后的SW480细胞的细胞活力。数据代表以乙醇对照百分比表示的细胞活力，其设定为100%。(A)从37。C培养72小时后的LB培养基提取的LA对照油的GLC谱，和用LA对照油处理的SW480的细胞活力(B)。(C)乳酸乳杆菌pNZ44-coPAI在0.5mg/mlLA中生长72小时后的GM17培养基的GLC谱，和用乳酸乳杆菌tlO，cl2CLA(发酵油)处理后的细胞活力(D)。(E)大肠杆菌pNZ44-coPAI在0.5mg/mlLA中生长后的LB培养基的GLC镨，和用大肠杆菌tl0，cl2CLA(发酵油)处理后的细胞活力(F)。(G)用纯化的合成tl0，cl2CLA异构体(Matreya)和(H)亚油酸(希格玛(Sigma))处理后的细胞活力。****表示与对照油(未发酵的亚油酸)相比具有显著性差异的值(pO.OOl)，***表示显著性差异的值^<0.01)，**表示显著性差异的值(p<0.05)，*表示显著性差异的值^<0.1)。图6:人结肠癌细胞SW480在与不同的油/脂肪酸培养5天后的显微:镜检查。(A)亚油酸未发酵对照油，5ng/ml培养基(放大倍数100x)，和(B)25ng/ml培养基(200x)。(C)大肠杆菌tl0，cl2CLA(发酵油)，5ng/ml培养基(IOOx)，和(D)20ng/ml培养基(200x)。(E)乳酸乳杆菌tl0，cl2CLA(发酵油)、5照/ml培养基(100x)、和(F)20將/ml培养基(200x)。一般定义应该理解本发明并不受限于所述的特定方法学、实验方法、细胞系、细菌种或属、构建体、和试剂。必需注意，除非文中明确指出，在此处和所附权利要求中所用的单数形式也包括复数。因此，例如参考"载体，，指一个或多个载体，并包括本领域技术人员公知的其等同物。约此处所用术语"约"指大约、大致、在……附近或在……区域内。当术语"约"与数字范围结合使用时，其对该范围的修饰是延伸到该数值的上下边界。通常，此处所用术语"约"修饰一个数值的上下变化20%的状态值，优选上下10%(更高或更低)。此处所用术语"或"指详细列出的任一成员。动物用于此处指分类学上指定为动物界(animalia)的生物。优选其为四足动物目(陆生脊推动物)和鱼目(pisces)的脊推动物(vertebrata)。尤其优选鸟纲和哺乳纲，智人(Homosapiens)是尤其优选的哺乳动物。特别尤其优选的是猪科(Suidae)、牛科(Bovinae)、雉科及其相关的雉(Phasianidae)、鸭科、鵝和天鹅(Anatidae)、马科(Equidae)、鲤鱼科(Cyprinidae)和鳟鱼科(Salmonidae)。这些科中最优选的是驯养动物和农用动物。本发明中驯养动物的含意是非自由生活的动物，其习惯于人并主要在人驯养住宅中生活。尤其优选的驯养动物是猫和狗。本发明中农用动物的含意是被人用于经济目的的动物。尤其优选的农用动物是驯养的牛(Bostaurus)、驯养的鸡(Gallusgallusdomesticus)、驯养的猪、驯养的羊(Ovisammonaries)和驯养的灰鶴(Anseranser)。术语生物转化率此处参考共轭亚油酸的产生使用，优选反-10，顺12共轭亚油酸，其指在特定发酵阶段之后或在发酵过程结束时游离亚油酸转化为共辄亚油酸的量的百分比。例如，在表达反-10，顺12共轭亚油酸异构酶的转基因乳酸乳杆菌细胞培养液中加入0.5mg/ml亚油酸，继续培养72小时，然后从培养液样品中提取脂肪酸。样品中CLA/LA的比例用GLC(气液层析法)测定。如果样品中的CLA/LA比例为1:1,那么生物转化率即为50%。细胞指单个细胞。术语"细胞"指细胞群体。该群体可以是包含一种细胞类型的纯化群体。同样，该群体可以包含多于一种的细胞类型。在本发明中，对于细胞群体中可以包含的细胞类型数没有限制。细胞可以是同步化的或非同步化的，优选细胞是同步化的。编码区或编码序列(CDS):当用于参考基因时，其指编码由mRNA分子翻译形成的新生多肽的氨基酸的核苷酸序列。真核生物中编码区的5，侧结合编码起始甲硫氨酸的核苷酸三联体密码子"ATG"，3，侧结合三个特异性终止密码子(即TAA、TAG、TGA)之一。共轭亚油酸(CLA):指亚油酸的位置和几何异构体的混合物，在7和9、9和11、10和12或11和13位点包含双键。特别令人感兴趣的是顺-9，反-11异构体和反10，顺-12异构体，因为所述异构体具有许多有益的作用。异构体可以是位置上不同(主要在7和9、9和11或10和l2位点)(Ha等人，Anticarcinogensfromfriedgroundbeef:heat-alteredderivativesoflinoleicacid.Carcinogenesis.1987Dec;8(12):1881-7)和几4可上不同(顺画顺、顺-反、反-顺、反-反)。对于CLA的单个异构体，顺-9,反-11共轭亚油酸是最具生物学活性的，因为其为掺入细胞膜磷脂、肝磷脂和甘油三酯的主要异构体(Kramer等人，Distributionsofconjugatedlinoleicacid(CLA)isomersintissuelipidclassesofpigsfedacommercialCLAmixturedeterminedbygaschromatographyandsilverion-high-performanceliquidchromatography.Lipids.1998Jun;33(6):549画58.)。在喂以CLA异构体混合物的动物中，其为唯一掺入细胞膜磷脂部分的异构体(Ha等人，Inhibitionofbenzo(a)pyrene-inducedneoplasiabyconjugateddienoicderivativesoflinoleicacid.CancerRes.50:1097-1101(1990);Ip等人，Mammarycancerpreventionbyconjugateddienoicderivativesoflinoleicacid.CancerRes.51:6118-6124(1991))。该异构体也是CLA的主务沃食形式，其获自反刍动物衍生的脂肪，包括乳、乳制品和肉(Chin等人，Dietarysourcesofconjugateddienoicisomeresoflinoleicacid,anewlyrecognizedclassofanticarcinogens.J.FoodComp.andAnal.5:185-197(1992))。术语反-10，顺-12共轭亚油酸和反-10,顺-12CLA此处可以互换4吏用。共轭亚油酸(CLA)异构酶是催化亚油酸或共轭亚油酸异构体异构化的蛋白质，其特征在于在一个碳位点上的双键转移到另一个位点的碳上从而形成一个可能的CLA异构体。反-10，顺-12共轭亚油酸异构酶在本发明中用来指催化亚油酸异构化形成反-10，顺-12共辄亚油酸的酶。术语反-10,顺-12共轭亚油酸异构酶和反-10，顺-12CLA异构酶此处可以互换^f吏用。培养:在本发明方法中指微生物在可控制条件下在液体培养基中生长。依赖于方法中所用的生物体，生长条件可以极为不同，而且通常为本领域技术人员所公知。通常，微生物在含有碳源(通常以糖的形式)、氮源(通常以有机氮源例如酵母提取物，或盐例如硫酸铵的形式)、磷酸源(例如磷酸氢钾)、微量元素(例如铁盐、锰盐、镁盐)、和需要情况下含维生素的液体培养基中生长，生长温度在0-100。C之间，优选在10-65。C、15-55°。之间，更优选在20-50。C、25-45。C之间，尤其优选在30-40。C之间，并供以氧气。生物体可以在需氧或厌氧条件下生长。液体培养基的pH值可以保持在固定值，即在培养过程中调节pH值。pH值范围应该在2-9之间，优选在4-8.5、4.5-8之间，更优选在5-7.5、5.5-7之间。然而，微生物也可以在没有pH调节的条件下培养。可进行分批法、半分批法或连续培养。营养素可以在发酵起始时供应，或半连续或连续地加入。此类方法可以在例如ScardoviV(1986)GenusBifidobacteriumandGenusLactobacillus.InBergey，sManualofSystematicBacteriology[匪PHASneath,MESharpe,JGHolteditor].Baltimore:Williams&Wilkins中找到。表达指基因产物的生物合成。例如，对于结构基因的情况，表达涉及结构基因转录为mRNA和4壬选地随后mRNA翻译为一个或多个多肽。术语发酵油此处用来指含有微生物发酵过程中产生的部分的油和脂肪酸。此处所用发酵指微生物在生长培养基中大批生长。术语需氧和厌氧代谢在用于本发明中时没有差异。术语发酵油指可以从微生物中(尤其是从微生物的细胞膜或发酵液中)回收/分离的脂肪酸部分(例如见实施例8)。功能性等同物关于本发明的核酸序列应该理解为SEQIDNo.1的天然或人工突变。突变可以是一个或多个核酸的插入、缺失或取代，而不减少所述序列表达产物的亚油酸异构化活性。这些功能性等同物与SEQIDNo.1所述序列具有至少80%、优选85%、更优选90%、最优选大于95%、特别尤其优选至少98%、但小于100%的同一性，其中所述同一性通过任一个的SEQIDNo.1所述序列的至少100个、优选至少150个、更优选至少200个连续碱基对的序列来确定并且与SEQIDNo.2所示序列具有基本相同酶活性。功能性等同物尤其是所述序列的同系物。当同系物参考共轭亚油酸异构酶使用时，其指SEQIDNo.1所示核酸分子的直向同源物和旁系同源物。这些直向同源物或旁系同源物编码与SEQIDNo.2在氨基酸水平上具有大于60%、优选65%、70%、75%、80%、更优选85%、90%、95%、或最优选大于95%序列同一性的蛋白质，其中所述同一性通过任一个SEQIDNo.2所述序列的至少100个、优选至少150个、更优选至少200个连续氨基酸并且基本上与SEQIDNo.2所示序列具有相同酶活性的序列来确定。上述功能性等同物与来自痤疮丙酸杆菌的反-10，顺-12共轭亚油酸异构酶(SEQIDNo.l)相比，可以具有减少的或增加的酶活性或生物转化率。在本发明中，功能性等同物的酶活性或生物转化率至少比来自痤疮丙酸杆菌的反-10,顺-12共轭亚油酸异构酶(SEQIDNo.l)在未改变条件下的参考值高50%、优选至少高100%、尤其优选至少高300%、特别尤其优选至少高500%。功能性连接或有效连接应理解为例如调控元件(例如启动子)与要表达的核酸序列和适当情况下的另外调控元件(例如终止子)的有序排列，从而使每个调控元件能够实现其允许、修饰、有利于或另外影响所述核*列表达的预期功能。依赖于核酸序列的排列，表达可以形成正义或反义RNA。为此，不必需在化学意义上的直接连接。基因控制序列(例如增强子序歹ij)也可以从更远的位点、或从其他DNA分子上对耙序列行使功能。此处所用术语功能性连接、"有效连接"、"有效组合"和"有效顺序"参考共辄亚油酸异构酶指至少一个异构酶与核酸序列的连接，从而使异构酶能够在宿主细胞中依靠所述DNA分子来产生或合成。实施例中显示了表达构建体，其中来自痤疮丙酸杆菌的反-10，顺-12共轭亚油酸异构酶(SEQIDNo.l)功能性连接于启动子。可以通过常用重组和克隆技术产生有效连接和表达盒，例如在ManiatisT，FritschEF和SambrookJ(1989)分子克隆实验室操作手册，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor(NY)和SilhavyTJ，BermanML和EnquistLW(1984)基因融合实验，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor(NY)以及在AusubelFM等人.(1987)现代分子生物学实验方法，GreenePublishingAssoc,andWileylnterscience和Gelvin等人(19卯)植物分子生物学手册中的描述。然而，两个序列之间也可能存在另外的序列，例如作为具有限制性内切酶的特异切割位点的连接序列、或信号肽序列。序列的插入也可能导致融合蛋白质的表达。优选地，包含启动子和要表达的核酸序列相连接的表达构建体可以以载体整合的形式存在，并且例如通过转化被插入到细菌基因组中。基因指有效连接于能够以某种方式调控多肽表达的合适调控序列的编码序列。基因包括在编码区(开放读码框，ORF)前(上游)和后(下游)的DNA非翻译调控区(例如启动子、增强子、抑制子等等)，适用情况下也包括在各编码区(即外显子)之间的插入序列(即内含子)。基因也可以包括位于序列的5，-和3，-端的序列，其存在于RNA转录本中。这些序列指"侧翼"序列或区(这些侧翼序列位于mRNA转录本中的5，或3，非翻译序列)。5，-侧翼区可以包含调控序列，例如启动子和增强子，其控制或影响基因的转录。3，-侧翼区可以包含直接终止转录、转录后切割和多聚腺苷酸化的序列。生物体的基因组和基因组DNA:此处用来指在DNA中(或对于某些病毒在RNA中)编码的生物体的全部遗传信息。这既包括基因，也包括非编码序列。术语"染色体DNA"或"染色体DNA序列"应理解为不依赖于细胞周期状态的细胞基因组DNA。因此染色体DNA可以以不同形式组织，它们可以是聚集的或解螺旋的。可以通过本领域内公知的多种方法来证明和分析染色体DNA的插入，例如通过多聚酶链式反应(PCR)分析、DNA印迹分析、荧光原位杂交(FISH)和原位PCR。异源的对于核酸序列，指连接于核酸序列的核苷酸序列，其在天然情况下不连接于核酸序列或连接于核酸序列的不同位置。杂交用于此处包括"核酸链与互补链通过碱基配对连接的任意方法"(Coombs1994,生物技术字典，StocktonPress,NewYorkN.Y.)。杂交和杂交强度(即核酸之间结合的强度)受到以下因素的影响，如核酸之间的互补程度、涉及的严格性条件、形成的杂化物的Tm值、和核酸内部的G:C比例。此处所用术语"Tm"参考"解链温度"使用。解链温度是双链核酸分子群体的一半解链变成单链的温度。计算核酸Tm值的公式是本领域内熟知的。以标准参数表示，当核酸在lMNaCl水溶液中时，Tm值的简单评估可以通过公式Tm=81.5+0.41(%G+C)来计算[见例如Anderson和Young，QuantitativeFilterHybridization,inNucleicAcidHybridization(1985)j。其他参考文献包括更高级的计算，其在计算Tm值的过程中考虑到结构和序列特征。本领域技术人员熟知可以应用许多杂交条件来构成低或高严格性条件；例如考虑探针的长度和本性(DNA、RNA、碱基组成)，和靶的特性(DNA、RNA、碱基组成、存在于溶液中或固定的等等)，以及盐和其他组分的浓度(例如是否存在甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇)，而且杂交溶液可以是多种多样的，从而产生低或高严格性杂交条件。本领域技术人员已知优选更高的严格性从而减少或消除本发明内含子的核苷酸序列与其他核酸序列之间的非特异性结合，而优选较低的严格性来检测大量与本发明的核苷酸序列具有不同同源性的核酸序列。此类条件在Sambrook(分子克隆；实验室操作手册，笫二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor，NY(1989))或现代分子生物学实验方法，JohnWiley&Sons,N.Y.(1989)6.3.1-6.3.6中描述。优选的杂交条件在详述中公开。同一性当用于核酸时指互补的程度。两核酸之间的同一性应理解为各情况下核酸序列在序列全长水平的同一性，其在程序算法GAP(WisconsinPackageVersion10.0，UniversityofWisconsin,GeneticsComputerGroup(GCG)，Madison,USA)的辅助下通过比较来计算，所用参数如下缺口加权12，长度加权4，平均匹配2912，平均不匹配-2003。例如，在核酸水平上与SEQIDNo:1序列具有至少95%同一性的序列应理解为以上述参数组用上述程序算法与SEQIDNo:l序列相比较具有至少95%同一性的序列。其可以是部分的同一性(即小于100%的部分同一性)或完全同一性(即100%的完全同一性)。诱导当根据本发明的方法使用时，指在所用的驱动共轭亚油酸异构酶表达的启动子是诱导型启动子的情况下，用(i)亚油酸或(ii)表达诱导剂接种细胞培养物。引入对于细胞，指要引入细菌细胞的重组DNA表达构建体。术语引入包含例如转染、转导或转化的方法。分离当用于根据本发明方法产生的共轭亚油酸时，指从发酵液、发酵液离心后的细菌沉淀/细菌细胞膜或上清中提取(i)发酵油、或(ii)脂肪酸/脂类部分、或(iii)共辄亚油酸、或(iv)反-10，顺-12共轭亚油酸的方法(见实施例)。可以通过分批操作或补料-分批操作来分离。在分批操作中，所用的所有成分在起始时加入到加工器皿中，并在发酵过程中不添加或撤出材料。在补料-分批操作中，在发酵过程中可以添加或收集材料。微生物用于此处指Woese所定义的酵母种和细菌(Woese等人,"Towardsanaturalsystemoforganisms:proposalforthedomainsArchaea，Bacteria,andEucarya."Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87:4576-4579)，优选的微生物选自乳酸杆菌科、链球菌科、丙酸杆菌科、肠杆菌科和双歧杆菌科，更优选所用微生物选自乳球菌属、乳酸杆菌属、丙酸杆菌属、大肠杆菌属和双歧杆菌属，尤其优选所述^:生物选自乳酸乳球菌、副干酪乳杆菌和大肠杆菌，包括乳酸杆菌种、双歧杆菌种、乳球菌种和酵母。核酸指脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其单链或双链、正义或反义形式的聚合物或杂化物。除非另外说明，特定核酸序列也包含其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)和互补序列，以及明确标明的序列。术语"核酸"可以用于描述"基因"、"cDNA"、"DNA"、"mRNA""寡核苦酸"和"多核苷酸"。核^列用于此处指DNA片段(寡核苷酸、多核苷酸、基因组DNA、cDNA等等)的连续的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸(核苷酸)序列，可以通过DNA测序技术获得代表核苷酸的缩写、字母、字符或字码的列表。核酸分子用于此处指生理上存在于基因组DNA、合适载体或质粒中的DNA分子。核酸分子通过核酸序列来定义。术语"营养制品，，是"营养的，，和"药物的"组合，其指对人健康具有有益作用的食品。营养制品是其为食品或食品的部分的任意物质，并且提供医药或健康益处，包括预防和治疗疾病。此类产品的范围可以从分离的营养素、食品添加物和特异饮食到基因工程设计的食品、草药制品、和加工的食品例如谷类、汤和々大料。光密度(或吸光度)对于细菌培养物，是所述培养物的混浊度(光密度)。为测量光密度，用分光光度计确定通过细胞悬浮液的波长600nm的光的量。混浊度或多或少与细胞数或量直接相关。光密度直接与细胞浓度成比例。更高的细胞浓度导致更高的光密度。在分光光度计中，用光电管来测量通过样品的光。如果样品的细胞密度增加，即变得更为混浊，那么散射光的量就会更大而不能到达光电管。以光密度(OD)或吸光度(A)单位的形式测量。OD(A)=loglo/l其中1『落在样品上的入射光1=透射光；通过样品到达光电管的光量。可以产生标准曲线从而使细胞数或量与光密度读数相关联，即确定包含不同微生物量的一系列样品的光密度和细胞数(或量)。通常样品的光密度与细胞密度直接相关(在Klett-Summerson比色计中，1A单位=500Klett单位)。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>其他未改变的条件指，例如，由要比较的表达构建体之一起动的表达不通过与另外的遗传控制序列(例如增强子序列)的组合来修饰，并且该行。益生菌定义为活的微生物，包括乳酸杆菌种、双歧杆菌种、乳球菌种和酵母，其被宿主摄入以后通过促进肠内微生物群的平衡从而对宿主起到有益作用。以下描迷用作益生菌的多种细菌和酵母双歧杆菌属双歧杆菌是人和动物结肠中的正常定居者。新生儿(尤其是那些母乳喂养的新生儿)在出生后数天即有双歧杆菌定居。双歧杆菌是首先从母乳喂养的婴儿的粪便中分离出来的。这些结肠中的细菌种群相对稳定，直到年老时才出现衰退。许多因素可以影响双歧杆菌种群，包括饮食、抗生素和胁迫。双歧杆菌是革兰氏阳性厌氧菌。它们是无运动、无芽胞形成和过氧化氢酶阴性。它们具有多种形状，包括短杆状、弯曲杆状、棒形杆状和两部分Y形杆状。其名称由它们通常以Y形或分叉形的形式存在而衍生。其DNA的鸟噪呤和胞嘧咬含量在54摩尔％到67摩尔°/。之间。它们是糖解生物体，除在降解葡糖酸盐的过程中，其产生乙酸和乳酸而不产生C02。它们也分类为乳酸细菌(LAB)。迄今为止，分离了30个双歧杆菌种。用于益生菌的双歧杆菌包括青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)、两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)、动物双歧杆菌(Bifidobacteriumanimalis)、嗜热双歧杆菌(Bifidobacteriumthermophilum)、短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、嬰儿双歧杆菌(Bifidobacteriuminfantis)和乳酸双歧杆菌(Bifidobacteriumlactis)。用于益生菌的特异双歧杆菌菌林包括短双歧杆菌菌抹Yakult、短双歧杆菌R070、乳酸双歧杆菌Bbl2、长双歧杆菌R023、两歧双歧杆菌R071、嬰儿双歧杆菌R033、长双歧杆菌BB536和长双歧杆菌SBT-2928。乳酸杆菌乳酸杆菌是人肠和阴道中的正常定居者。乳酸杆菌是革兰氏阳性兼性厌氧菌。它们是无芽胞形成和无鞭毛杆状或^Mf菌。其DNA的鸟嘌呤和胞嘧咬含量在32摩尔％到51摩尔％之间。它们是耐氧或厌氧的和严格发酵的。对于同型发酵菌的情况，葡萄糖主要发酵为乳酸。乳酸杆菌也分类为乳酸细菌(LAB)。迄今为止，鉴定了56个乳酸杆菌属种。用作益生菌的乳酸杆菌包括嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillusadd叩hilus)、短乳酸杆菌(Lactobacillusbrevis)、保加利亚乳酸杆菌(Lactobacillusbulgaricus)、干酪乳酸杆菌(Lactobacilluscasei)、纤维二糖乳酸杆菌(Lactobacilluscellobiosus)、巻曲乳酸杆菌(Lactobacilluscrispatus)、弯曲乳酸杆菌(Lactobacilluscurvatus)、发酵乳酸杆菌(Lactobacillusfermentum)、GG乳酸杆菌(鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)或千酪乳杆菌鼠李糖亚种(Lactobacilluscaseisubspeciesrhamnosus))、力口氏乳酸杆菌(Lactobacillusgasseri)、johnsonii乳酸杆菌、植物乳酸杆菌(Lactobacillusplantarum)和唾液乳酸杆菌(Lactobacillussalivarus)。植物乳酸杆菌299v菌林发现于发酵的生面团中。植物乳酸杆菌本身是人起源的。乳酸杆菌的其他益生菌菌林有嗜酸乳酸杆菌BG2F04、嗜酸乳酸杆菌INT-9、植物乳酸杆菌ST31、罗伊乳酸杆菌(Lactobacillusreuteri)、johnsonii乳酸杆菌LAI、嗜酸乳酸杆菌NCFB1748、干酪乳酸杆菌Shirota、嗜酸乳酸杆菌NCFM、嗜酸乳酸杆菌DDS-1、德氏乳酸杆菌德氏亚种(Lactobacillusdelbmeckiisubspeciesddbmeckii)、德氏乳酸杆菌保加利亚型2038、嗜酸乳酸杆菌SBT-2062、短乳酸杆菌、唾液乳酸杆菌UCC118和副干酪乳杆菌副干酪亚种F19。乳球菌乳球菌是革兰氏阳性兼性厌氧菌。它们也分类为乳酸细菌(LAB)。乳酸乳球菌(以前为乳链球菌)在乳制品中被发现，并且通常负责乳品的发酵。用于或正发展为益生菌的乳球菌包括乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、乳酸乳球菌亚种cremoris(乳脂链球菌Streptococcuscremoris)、乳酸乳球菌乳酸亚种NCD0712、乳酸乳球菌乳酸亚种NIAI527、乳酸乳球菌乳酸亚种NIAI1061、乳酸乳球菌亚种lactisbiovardiacetylactisNIAI8W和乳酸乳球菌亚种lactisbiovardiacetylactisATCC13675。启动子、启动子元件或启动子序列用于此处指，当连接于目的核苷酸序列时，能够控制该目的核苷酸序列转录为mRNA的DNA序列。因此，启动子是DNA序列上为基因提供表达控制元件的识别位点，RNA聚合酶特异性地与之结合并起始该基因的RNA合成(转录)。启动子通常(尽管不是必需)位于目的核苷酸序列的5'端(即上游)(例如接近结构基因的转录起始位点)。当参考启动子使用时，术语"构成型"指启动子能够在没有刺激(例如热激、化学、光等等)的情况下直接转录与其有效连接的核酸序列。通常，构成型启动子基本上能够在细胞的任意生理条件下直接表达转基因。相反，"可调控型，，启动子是在存在刺激(例如热激、化学、光等等)的情况接的核酸序列的转录水平。在细菌中有功能的启动子序列原则上应理解为能够在细菌细胞中指导基因(尤其是外源基因)表达的任意启动子。在本发明中，表达例如可以是构成型的、诱导型的或发育依赖型的。构成型启动子是RNA聚合酶的结合和起始率近似恒定并相对不依赖于外界刺激的启动子。有用的启动子是构成型启动子，例如cos、tac、trp、tet、trp-tet、Ipp、lac、Ipp-lac、laclq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、k誦Pn或K启动子，所有这些启动子最好用于革兰氏阴性细菌中。也包括其他有利的调控序列，例如革兰氏阳性启动子amy和SP02,酵母或真菌启动子ADC1、MFcx、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH。原则上，可以使用带有上述其调控序列的所有天然的细菌启动子用于根据本发明的方法。另外，使用合成的启动子也是有利的。多肽、肽、寡肽、基因产物、表达产物和蛋白质此处可以互换使用，指连续氨基酸残基的聚合物寡聚物。重组或转基因DNA表达构建体对于例如核酸序列(包含所述核酸序列的表达构建体、表达盒或载体)指所有通过实验操作形成的构建体，其中a)所述核酸序列，或b)有效连接于所述核酸序列(a)的遗传控制序列(例如启动子)，或c)(a)和(b)不位于其天然遗传环境中或者通过实验操作被修饰，修饰的实例是一个或多个核苷酸残基的取代、添加、缺失、倒置或插入。天然遗传环境指起源生物体的天然染色体位点或指基因组文库中的存在。对于基因组文库的情况，核酸序列的天然遗传环境优选是固定的，至少部分固定。环境至少在核酸序列的一侧，并具有长度至少50bp、优选至少500bp、尤其优选至少1000bp、特别尤其优选至少5000bp的序列。天然存在的表达构建体(例如天然存在的启动子与相应基因的组合)当被非天然的合成的"人工"方法(例如诱变)修饰时，成为转基因表达构建体。此类方法在(US5,565,350;WO00/15815)中描述。重组多肽或蛋白质指通过重组DNA技术产生的多肽或蛋白质，即由编码所希望多肽或蛋白质的外源重组DNA构建体转化的细胞所产生。重组核酸和多肽也可以包含不是天然存在的而是被修饰、改变、突变或另外人工操作的分子。在本发明的一个实施方案中，重组DNA表达构建体可使一个或多个核酸分子表达。所述根据本发明的重组DNA表达构建体最好包括在细菌中有功能的启动子、附加的调控或控制元件或在细菌中有功能的序列和在细菌中有功能的终止子。另外，该重组表达构建体可以包含附加的功能性元件，例如表达盒，其可以表达例如阳性和阴性筛选标记、才艮告基因、重组酶或核酸内切酶(其影响才艮据本发明的表达盒、栽体或重组生物体的产生、扩增或功能)。此外，重组表达构建体可以包含与目的细菌基因同源的核#列，其具有足够长度从而在引入细菌中以后诱导目的基因位点的同源重组(HR)事件。可以通过常用重组和克隆技术产生本发明的重组转基因表达盒(或包含所述转基因表达盒的转基因载体)，例如在Maniatisl989，分子克隆实验室操作手册，第二版，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor(NY);Silhavy1984，和基因融合实验，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY;以及在Ausubel1987，现代分子生物学实验方法，GreenePublishingAssoc,和WileyInterscience)中的描述。最好可以用载体将根据本发明的表达盒引入细菌，所述载体包含上述核酸、启动子、终止子、调控或控制元件和功能性元件。调控序列指启动子、增强子或其他DNA片段，其结合调控蛋白质例如转录因子，并且由此影响指定基因的转录效率。术语瘤胃细菌指能够从反刍动物(羊、山羊、牛、鹿等)的瘤胃或胃肠道分离的细菌，其中反刍动物的消化过程大部分由细菌来完成。结构基因用于此处指转录为mRNA的DNA序列，这些mRNA随后翻译为特异多肽的特征氨基酸序列。转化用于此处指遗传材料(例如转基因)引入到细胞中。细胞的转化可以是稳定的或瞬时的。术语"瞬时转化，，或"瞬时地转化"指一个或多个转基因引入细胞，而转基因不整合到宿主细胞基因组中。术语"瞬时转化体，，指瞬时掺入一个或多个转基因的细胞。相反，术语"稳定转化"或"稳定地转化"指一个或多个转基因引入并整合到细胞基因组中，优选得到染色体整合和稳定遗传。细胞的稳定转化可以用能够结合一个或多个转基因的核酸序列通过细胞基因组DNA的DNA印迹杂交来检测。可选择地，细胞的稳定转化也可以通过多聚酶链式反应在细胞基因組DNA中扩增转基因来检测。术语"稳定转化体"指一个或多个转基因稳定整合到基因组DNA中的细胞。因此，稳定转化体与瞬时转化体的区别在于稳定转化体的基因组DNA包含一个或多个转基因，而瞬时转化体的基因组DNA不包含转基因。转化也包括以载体的形式将遗传材料引入细菌中，涉及染色体复制和基因表达。这些载体可以在宿主生物体中自主复制。转基因或重组当参考细胞使用时，指包含转基因的细胞、或其基因组通过引入的转基因改变的细胞。转基因细胞可以由几种方法产生，包括向靶细胞中引入(如上所述)包含核酸(通常是DNA)的"转基因"或通过人为干涉(例如通过此处所述方法)将转基因整合到靶细胞的染色体中。对于反刍动物，技术人员可以在下列出版物中找到合适的方法Gregg，K.，Teather，R.M.(1992)Thegeneticmanipulationofrumenbacteria,in"Manipulationofrumenmicroorganisms".K.El-Shazly.Alphagraph，Alexandria,Egypt编辑，第1-12页.Gregg,K.,Schafer，D.，Cooper,C，Alien,G.(1995)Geneticmanipulationofrumenbacteria:nowareality,in"RumenEcologyResearchPlanning.J.Wallace,A.Lahlou-Kassi编辑.Intl.Livestock.Res.Inst.Nairobi,Kenya,第227-240页.Beard，C.E.，Hefford，M.A"Forster，R.J.，Sontakke,S"Teather,R.M"Gregg,K.(1995)StableandefficienttransformationsystemforButyrivibriofibrisolvensOB156.CurrentMicrobiol.30:105-109.Gregg,K.，Allen,G"Beard,C.(1996)Geneticmanipulationofrumenbacteria:frompotentialtoreality.Aust.J.Agric.Res.47:247-256.Wong,CM.，Klieve，A.V"Hamdorf，B.J.，Schafer，D.J.，Brau,L.，Seet，S.G.M.Gregg,K.(2003)FamilyofshuttlevectorsforruminalBacteroides.J.Mol.Microbiol.Biotech.5:57-66.对于乳球菌和乳酸杆菌，技术人员可以在下列出版物中找到合适的方法根据Ruyter等人(1996)描述的方法制备和转化电感受态乳酸乳杆菌，而根据Luchansky等人(1988)的描述用3.5xSMEB(1M蔗糖，3.5mMMgCl2)制备电感受态副干酪乳杆菌NFBC338细胞。用DNAStar软件(DNAStar，Madison,Wisconsin,USA)进行序列分析，deRuyter，P.G.，O.P.Kuipers，和W.M.deVos.1996.ControlledgeneexpressionsystemsforLactococcuslactiswiththefood-gradeinducernisin.ApplEnvironMicrobiol62:3662-7.Luchansky，J.B.，P.M.Muriana，和T.R.Klaenhammer.1988.ApplicationofelectroporationfortransferofplasmidDNAtoLactobacillus,Lactococcus,Leuconostoc，Listeria,Pediococcus，Bacillus,Staphylococcus,EnterococcusandPropionibacterium.MolMicrobiol2:637-46。治疗此处关于癌症治疗指包含发酵油的药物在治疗上的应用，优选包含纯化的共辄亚油酸、更优选用本发明方法产生的反-10，顺-12共轭亚油酸。所述治疗上的应用应该理解为广义的，包含例如所述药物用于(i)预防癌细胞形成、(ii)减少或终止癌细胞生长、和/或(iii)预防癌细胞在机体中扩散的应用。野生型，天然或天然来源的对于生物体、多肽或核酸序列，指所述生物体、多肽或核酸序列是天然存在的或从至少一种天然存在的生物体、多肽或核酸序列中获得的，并且未经改变、突变或其他人为操作。载体能够在宿主细胞中复制的DNA分子。质粒和粘粒是载体的实例。此外，术语"载体"和"运载体"可参考从一个细胞向另一个细胞转移DNA片段的核酸分子而互换使用，其中细胞不需要属于同样生物体(例如向植物细胞转移DNA片段形成农杆菌属细胞)。此处所用术语"表达载体"指包含所希望的编码序列和在特定宿主生物体中表达有效连接的编码序列所需的合适核酸序列的DNA分子。发明详述可以根据本发明在转基因微生物中生产反-10，顺-12共轭亚油酸。本发明的第一个实施方案涉及在转基因微生物中生产反-10，顺-12共辄亚油酸的方法，包括以下步骤(a)向所述微生物中引入至少一种编码反-10，顺-12共轭亚油酸异构酶的核酸分子，(b)培养由(a)获得的转基因微生物，(c)向培养物中加入亚油酸来诱导产生反-10，顺-12共轭亚油酸，(d)诱导培养物继续培养至少12小时，和(e)从培养基和/或微生物中分离共轭亚油酸。在优选的实施方案中，本发明涉及根据上述步骤(a)到(e)在转基因微生物中生产共轭亚油酸的方法，其特征在于所产生的共轭亚油酸是不同CLA同工型的混合物，其包含至少30%、优选至少40%、更优选至少50%、尤其优选至少60%、特别尤其优选至少70%、最优选至少80%的反-10，顺-12共轭亚油酸。另外，通过技术人员公知的方法(例如结晶)可以进一步有利地增加反-10，顺-12共辄亚油酸的异构纯度。在本发明的此外优选的实施方案中，如(a)所述引入微生物中的核酸分子编码具有共轭亚油酸异构酶活性的多肽，其能够使亚油酸(顺-9，顺-12共辄亚油酸)转化为反_10，顺-12共辄亚油酸，该核酸分子选自如下i.具有SEQIDNo.1所述序列的核酸分子，或ii.由(i)中所述核酸分子编码的多肽的功能性等同物，例如a.具有SEQIDNo.1所述序列的至少50个、优选至少75个、更优选至少100个、尤其优选至少125个、特别尤其优选至少150个连续碱基对的核酸分子，或b.与SEQIDNo.l所述序列的至少100个、优选至少125个、更优选至少150个、尤其优选至少175个、特别尤其优选至少200个连续核酸碱基对的序列具有至少80%、优选至少85%、更优选至少90%、尤其优选至少95%、特别尤其优选至少98%同一性的核酸分子，或c.在高严格性条件下与SEQIDNo.1所述序列的至少50个、优选至少100个、更优选至少150个、尤其优选至少200个、特别尤其优选至少500个连续碱基对的核酸片段杂交的核酸分子，或d.编码与SEQIDNo.2所示氨基酸序列具有至少75%、优选至少85%、更优选90%、尤其优选至少95%、特别尤其优选至少98%同一性的多肽的核酸分子。原则上可以从所有微生物中鉴定和分离在(i)和(ii)中定义的核列。SEQIDNo.1或其同系物/功能性等同物最好从细菌、优选能够产生共轭脂肪酸的细菌中分离。所述细菌可以是革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌。菌中分离，例如从丙酸杆菌、乳球菌、双歧杆菌或乳酸杆菌中，最好从双歧杆菌中分离。SEQIDNo.1序列的功能性衍生物还应理解为例如的具有至少75%、优选至少85%、更优选至少90%、尤其优选至少95%、特别尤其优选至少98%同一性的等位变体。按一般定义所描述或使用另外的计算机程序(如PileUp)来计算同一性(J.Mol.Evolution.,25(1987)，351-360，Higgins等人，CABIOS，51989:151-153)。从上述核酸衍生的氨基酸序列是SEQIDNo.2所描述的序列。具体地，等位变体包含从SEQIDNo.l所示序列通过核苷酸缺失、插入或取代获得的功能性变体，并保持了衍生的合成蛋白质的酶活性。上述共辄亚油酸异构酶的功能性等同物可以通过在核酸数据库中的同源检索来确定，或用SEQIDNo.l所述核酸分子的至少50个、优选至少100个、更优选至少150个、尤其优选至少200个、特别尤其优选至少500个连续碱基对的片段和严格性条件通过DNA杂交(基因组DNA文库筛选)来确定。在本发明的优选实施方案中，严格性杂交条件可以选自如下杂交緩冲液包含甲酰胺、NaCl和PEG6000(聚乙二醇，分子量6000)。曱酰胺具有使双链核酸分子失稳定的作用，因此，当用于杂交緩冲液时，其使杂交温度降低到42。C而不减少杂交严格性。NaCl对DNA双链体的退火速率和DNA探针与其互补DNA靶的杂交效率具有正面的影响。PEG增加杂交緩冲液的粘度，从而原则上对杂交效率产生负面影响。杂交緩冲液的组成如下250mMpH7.2的磷酸钠緩冲液、1mMEDTA(乙二胺四乙酸)、7%SDS(g/v)(十二烷基石克酸钠)、250mMNaCl(氯化钠)、10jig/ml单链DNA、5。/o聚乙二醇(PEG)6000、40%甲酰胺。_杂交优选在42。C过夜进行。第二天早上，用2xSSC+0.1%SDS洗杂交滤器3次，每次10分钟。杂交最好用长度至少为50、60、70或80bp、优选至少90bp的片段进行。在尤其优选的实施方案中，杂交应以上述条件用全长核酸序列进行。技术人员可以在下述教科书中找到杂交的更多信息Ausubel等人(eds)，1985，现代分子生物学实验方法，JohnWiley&Sons,NewYork;Hames和Higgins(eds)，1985,核酸杂交实践入门，IRLPressatOxfordUniversityPress,Oxford;Brown(ed)，1991，基本分子生物学实践入门，IRJLPressatOxfordUniversityPress,Oxford.根据本发明的氨基酸序列应理解为包含SEQIDNo.2所示氨基酸序列的蛋白质，或通过取代、倒置、插入或缺失SEQIDNo.2中一个或多个氨基酸残基获得的序列，其中仍然保持或基本不减少SEQIDNo.2所示蛋白质的酶活性。术语基本不减少应理解为具有起始酶的至少10%、优选20%、尤其优选30。/。酶活性的所有酶。例如，特定氨基酸可以用其他具有相似理化性质(空间维数、碱性、疏水性等等)的氨基酸所取代。例如，精氨酸残基变为赖氨酸残基、缬氨酸残基变为异亮氨酸残基或天冬氨酸残基变为谷氨酸残基。或者，可能通过添加或除去一个或多个氨基酸、或通过这些方法中的两个或多个彼此组合来交换序列。在尤其优选的实施方案中，所述反-10,顺-12共轭亚油酸异构酶是从瘤胃细菌(优选从埃氏巨球型菌YJ-4)中分离的。在本发明此外尤其优选的实施方案中，编码反-10，顺-12共轭亚油酸异构酶的核酸分子是从丙酸杆菌属(优选痤疮丙酸杆菌)中分离的。在本发明的特别尤其优选的实施方案中，所述反-10，顺-12共轭亚油酸异构酶是来自痤痴丙酸杆菌的具有登录号CQ766028的反-10，顺-12共轭亚油酸异构酶(SEQIDNo.1)。在本发明的优选实施方案中，上述核酸分子是重组或转基因DNA表达构建体(如一般定义中所定义的)的部分。重组或转基因DNA表达构建体应理解为SEQIDNo.1中给出的序列，或由SEQIDNo.1所述核酸分子编码的多肽的功能性等同物(如上述(ii)中定义的，其功能性连接于有利于增加基因表达的一个或多个调控信号)。这些调控序列是例如诱导物或抑制物结合的序列并且因而调控该核酸的表达。除这些新的调控序列以外，或代替这些序列，可能在实际结构基因上游仍存在这些序列的天然调控，如果需要也可以进行遗传上的改变，从而关闭天然调控而增加基因表达。然而，基因构建体的表达也可以具有简单的结构，即在序列或其衍生物上游不插入另外的调控信号，并且不除去调控其的天然启动子。或者是将天然调控序列突变从而不发生天然调控而增加基因表达。这些改变的启动子也可以独自放置在天然基因的上游，从而增加活性。另外，基因构建体最好还包含一个或多个与启动子功能性连接的所谓增强子序列，以增强核,列的表达。也可能在DNA序列的3，端插入其他有利的序列，例如其他的调控元件或终止子。在基因构建体中可以包含共轭亚油酸异构酶基因的一个或多个拷贝。用于本发明方法的有利调控序列包含在例如启动子，例如cos、tac、trp、tet、trp-tet、Ipp、lac、Ipp-lac、laclq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、Ur或X-PL启动子中，所有这些启动子都最好在革兰氏阴性细菌中使用。其他有利的调控序列包含在例如革兰氏阳性启动子amy和SP02、酵母或真菌启动子ADC1、MFa、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH中。原则上，根据本发明的方法可以使用所有具有上述调控序列的天然启动子。另外使用合成的启动子也是有利的。为了表达存在的基因，所述重组或转基因DNA表达构建体最好包含另外的3，和/或5'末端调控序列来增强表达，根据所选宿主生物体或基因来选择这些调控序列，以达到最佳表达。这些调控序列旨在使特异基因表达成为可能。这意味着取决于宿主生物体，例如该基因仅在诱导后表达或过表达，或者立即表达和/或过表达。为此，优选调控序列或因子对引入基因的表达具有正面影响，因而增强该基因的表达。因此，使用强转录信号(例如启动子和/或增强子)在转录水平上增强调控元件是有利的。然而，也可以通过例如改良RNA稳定性来增强翻译。重组或转基因DNA表达构建体也可以包含引入生物体的另外基因。这些基因可以与根据本发明的异构酶基因在分离的调控下或在相同的调控区调控下。这些基因是例如其他生物合成基因，最好是脂肪酸和脂类合成，其可以增加异构酶起始材料(例如亚油酸)的合成。为了实现在生物体中异源基因的最佳表达，最好根据生物体的特定密码子使用来修饰核酸序列。基于计算机评估有关生物的其他已知基因，可以容易地确定"密码子使用"。为了实现在宿主生物体中、例如微生物中(例如酵母或细菌)的表达，最好将核酸片段插入到载体中，例如质粒、噬菌体或其他DNA，这可使基因在宿主中最优表达。合适的质粒的实例是大肠杆菌的pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHSl、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、plN-lll113-Bl、kgtll或pBdCl，链霉菌的plJ101、plJ364、plJ702或plJ361，杆菌的pUB110、pC194或pBD214，棒状杆菌的pSA77或pAJ667,真菌的pALSl、plL2或pBBl16，酵母中的2ocM、pAG-l、YEp6、YEpl3或pEMBLYe23，或上述质粒的衍生物。所述质粒是可能质粒的一小部分选择。其它质粒是技术人员所熟知的，并且能够在例如《克隆载体》(PouwelsP.H.等人编辑Elsevier,Amsterdam-NewYork-Oxford,1985,ISBN0444卯4018)中找到。合适的植物载体尤其在1直物分子生物合生物技术方法"(CRCPress),第6/7章，pp.71-119描述。除质粒以外，载体也指技术人员所公知的所有其它载体，例如噬菌体、IS元件、线性或环状DNA。这些载体可以在宿主生物体中自主复制或随染色体复制。优选自主复制的载体。载体最好包含根据本发明的核酸序列的至少一个拷贝。为了表达所包含的其他基因，核酸片段还有利地包含3，和/或5'末端调控序列来增强表达，这些序列根据宿主生物和基因的选择而加以选择，以达到最佳表达。这些调控序列可使靶基因表达。这意味着取决于宿主生物体，例如基因只在诱导后表达和/或过表达，或者立即表达和/或过表达。优选调控序列或因子具有正面影响，因而增强被引入的基因的表达。因此，使用强转录信号(例如启动子和/或增强子)在转录水平增强调控元件是有利的。然而，除此之外，也可能通过例如改良mRNA稳定性来增强翻译0在另一实施方案中，根据本发明的基因构建体也可能以线性DNA的形式被有利地引入生物体中，并通过异源或同源重組的方式整合到宿主生物体的基因组中。此线性DNA可能由线性化质粒组成，或仅由作为载体的核酸片段组成，或由根据本发明的核酸序列组成。根据本发明的核酸序列最好与至少一种才艮告基因共同克隆到核酸构建体中，并且将核酸构建体引入基因组中。该报告基因应该可以通过生长测定、荧光测定、化学测定、生物发光测定或抗性测定、或通过光度计测量而容易地检测。相关报告基因的实例是抗生素(例如氨节青霉素、氯霉素、四环素、红霉素)抗性基因或水解酶基因、荧光蛋白质基因、生物发光基因、糖代谢基因或核苷酸代谢基因、或生物合成基因(例如Ura3基因、11v2基因、荧光素酶基因、P-半乳糖苷酶基因、gfp基因、2-脱氧葡萄糖-6-磷酸盐磷酸酶基因、p-葡糖苷酸酶基因、p-内酰胺酶基因、新霉素磷酸转移酶基因或潮霉素磷酸转移酶基因)。在本发明的另一有利实施方案中，根据本发明的核酸序列也可以单独引入生物体中。如果试图向生物体中引入除根据本发明的核^列以外的其他基因，它们可以同在一个具有报告基因的载体中、或每个载体含有一个单独基因与报告基因，可以同时或连续引入多个载体。宿主生物体(=转基因生物体)最好含有根据本发明的核酸和/或根据本发明的核酸构建体的至少一个拷贝。原则上，可以通过技术人员公知的方法将根据本发明的核酸、核酸构建体或载体引入生物体(例如细菌)中。对于微生物的情况，技术人员可以在教科书中找到合适的方法，如在Sambrook，J.等人(1989)分子克隆实验室操作手册，ColdSpringHarborLaboratoryPress,F.M.Ausubel等人(1994)现代分子生物学实验方法，JohnWiley和Sons,D.M.Glover等人，DNA克隆，第1巻，(1995)，IRLPress(ISBN019-963476-9)，Kaiser等人(1994)酵母遗传方法，ColdSpringHarborLaboratoryPress或Guthrie等人，酵母遗传和分子生物学指导，酶学方法，1994，AcademicPress中。根据本发明的方法中合适的生物体或宿主生物体(转基因生物体)原则上是所有能够合成不饱和脂肪酸的生物体和适合于表达重组基因的生物体。其实例选自乳酸杆菌科、链球菌科、丙酸杆菌科、肠杆菌科和双歧杆菌科，优选选自乳球菌属、乳酸杆菌属、大肠杆菌属和双歧杆菌属，最优选所述^:生物选自乳酸乳球菌、副干酪乳杆菌和大肠杆菌。技术人员已知精细化学药品生产的其他合适来源，其也代表有用的核酸分子来源。它们通常包括所有原核或真核细胞，优选单细胞微生物，例如真菌如麦角菌属(Claviceps)或曲霉(Aspergillus),或革兰氏阳性细菌如杆菌属(Bacillus)、才奉状杆菌属(Corynebacterium)、细球菌属(Micrococcus)、短杆菌属(Brevibacterium)、红球菌属(Rhodococcus)、诺卡氏菌属(Nocardia)、乳酪杆菌属(Caseobacter)或节杆菌属(Arthrobacter)，或革兰氏阴性细菌如大肠杆菌属(Escherichia)、黄杆菌属(Flavobacterium)或沙门氏菌属(Salmonella)，或酵母例如赤酿酵母属(Rhodotorula)、汉森酵母属(Hansenula)或假丝酵母属(Candida)。在根据本发明方法中尤其有利的生产菌抹选自放线菌科(Actinomycetaceae)、芽胞杆菌科(Bacillaceae)、短杆菌科(Brevibacteriaceae)、棒状軒菌科(Corynebacteriaceae)、肠軒菌科(Enterobacteriacae)、戈登氏菌科(Gordoniaceae)、孩吏J求菌科(Micrococcaceae)、分枝杆菌科(Mycobacteriaceae)、诺卡氏菌科(Nocardiaceae)、假单月包菌科(Pseudomonaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、链霉菌科(Streptomycetaceae)、毛壳菌科(Chaetomiaceae)、笄霉科(Choanephoraceae)、隐球菌科(Cryptococcaceae)、小克银汉霉科(Cunninghamellaceae)、Demetiaceae、念珠菌科(Moniliaceae)、被孢霉科(Mortierellaceae)、毛霉菌科(Mucoraceae)、腐霉科(Pythiaceae)、酵母菌科(Sacharomycetaceae)、7jC霉科(Saprolegniaceae)、裂殖酵母菌科(Schizosacharomycetaceae)、粪壳菌科(Sodariaceae)、掷孢酵母科(Sporobolomycetaceae)、结节菌科(Tuberculariaceae)、Adelotheciaceae、甲藻纲(Dinophyceae)、牛毛藓科(Ditrichaceae)和绿色鞭毛藻纲(Prasinophyceaeor),选自异常汉森酵母属(Hansenulaanomala)、假丝酵母属(Candidautilis)、麦角菌属(Clavicepspurpurea)、环状芽胞杆菌属(Bacilluscirculans)、枯草芽胞杆菌属(Bacillussubtilis)、杆菌属(Bacillussp.)、乳白少豆杆菌(Brevibacteriumalbidum)、Brevibacteriumalbum、Brevibacteriumcerinum、黄色短軒菌属(Brevibacteriumflavum)、Brevibacteriumglutamigenes、多舆短杆菌属(Brevibacteriumiodinum)、Brevi-bacteriumketoglutamicum、Brevibacteriumlactofermentum、扩展短杆菌属(Brevibacteriumlinens)、Brevibacteriumroseum、Brevibacteriumsaccharolyticum、短軒菌属(Brevibacteriumsp.)、Coryne-bacteriumacetoacidophilum、醋谷氛酸棒状杆菌(Corynebacteriumacetoglutamicum)、Corynebacteriumammoniagenes、谷氛酸棒状軒菌属(Corynebacteriumglutamicum)(=谷氛酸微球菌)、Coryne-bacteriummelassecola、棒状杆菌属(Corynebacteriumsp.)或大肠杆菌属(Escherichiacoli)尤其是大肠杆菌K12和其衍生菌抹。尤其优选的是那些分类于或用作益生菌(如一般定义中所定义的)的细菌。依据宿主生物体，按本领域技术人员公知的方法生长或培养上述过程中使用的生物体。微生物通常生长在液体培养基中，其中包含碳源(通常以糖的形式)、氮源(通常以有机氮源的形式，例如酵母提取物，或例如硫酸铵等盐类)、磷酸源(例如辨酸氢钾)、微量元素(例如铁盐、锰盐和镁盐)、以及适用情况下的维生素，生长温度在0。C到100'C之间，优选在10。C到60°C,更优选在15。C到50°C，同时供以氧气。培养液pH值可以维持在固定值，即在培养过程中调节pH值。pH值应在2-9的范围内。然而，也可以在不调节pH值的条件下培养微生物。可以进行分批发酵、半分批发酵或补料/连续培养。可以在发酵最初开始时引入营养素，或以半连续或连续方式进行随后加料。生物体可以在需氧或厌氧条件下生长。培养液pH值可以维持在固定值，即在培养过程中调节pH值。pH值范围应在2-9之间，优选在4-8.5、4.5-8之间，更优选在5-7.5、5.5-7之间。然而，也可以在不调节pH值的条件下培养微生物。根据本发明的方法最好在0。C到100。C之间的温度进行，优选l(TC到65°C、15。C到55。C，更优选20。C到50。C、25。C到45。C，尤其优选30。C到40°C，同时供以氧气。根据本发明，方法(体外)中的pH值最好保持在4-12之间，优选在4-8.5、4.5-8之间，更优选在5-7.5、5.5-7之间。然而，也可以在不调节pH值的条件下培养^t生物。已知的培养方法的概述可以在Chmiel教科书(Bioprozeptechnik1.Einfi3hrungindieBioverfahrenstechnik(GustavFischerVerlag,Stuttgart,1991))或Storhas教科书(BioreaktorenundperiphereEinrichtungen(ViewegVerlag,Braunschweig/Wiesbaden,1994))中找到。所用的培养基必须以合适的方式满足各自菌林的需要。多种微生物的培养基在美国细菌学会(WashingtonD.C，USA,1981)的"普通细菌学方法手册"中描述。可以根据本发明使用的这些培养基如上所述通常包括一种或多种碳源、氮源、无机盐、维生素和/或微量元素。优选的碳源是糖例如单糖、二糖或多糖。很好的碳源的实例是葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、己酮糖、核酮糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纤维素。糖也可以以复合化合物形式加入到培养基中，例如糖蜜、或其他糖精制的副产品。加入多种碳源的混合物也是有利的。其他可能的碳源是油和脂肪例如豆油、葵花籽油、花生油和/或椰子脂肪，脂肪酸例如棕榈酸、^J旨酸和/或亚油酸，乙醇和/或多元醇例如甘油、甲醇和/或乙醇，和/或有机酸例如乙酸和/或乳酸。氮源通常是有机或无机氮化合物或包括这些化合物的材料。氮源的实例包括液态或气态形式的氨或铵盐(例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵或硝酸铵)、硝酸盐、尿素、氨基酸或复合氮源(例如玉米浆、大豆粉、酵母提取物、肉提取物和其他)。氮源可以单独或作为混合物使用。可能存在于培养基中的无机盐化合物包括钙、镁、钠、钴、钼、钾、锰、锌、铜和铁的氯化盐、磷酸盐或硫酸盐。磷酸、磷酸二氩钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐也可以用作磷源。可以在培养基中加入螯合剂从而保持溶液中的金属离子。尤其合适的螯合剂包括二羟基酚(dihydroxyphenols)例如邻苯二酚或原儿茶酸(protocatechuate),或有机酸例如柠檬酸。根据本发明使用的用于培养微生物的发酵培养基通常也包含其他生长因子例如维生素，或生长促进因子包括例如生物素、核黄素、硫胺素、叶酸、烟酸、泛酸和吡哆醇。生长因子和盐通常从复合培养基成分衍生而来，例如酵母提取物、糖蜜、玉米浆等等。而且也可以向培养基中加入合适的前体。培养基化合物的精确组成很大程度上依赖于特定实验，并且针对各种特异情况进行分别选择。最佳培养基的信息可以从教科书"应用微生物生理学，实践入门"(P.M.Rhodes、P.F.Stanbury编辑，IRLPress(1997)第53-73页，ISBN0199635773)中获得。生长培养基也可以购自供应商例如标准1(默克(Merck))或BHI(脑心浸液，DIFCO)等。所有培养基成分通过加热(1.5巴和121°C，20分钟)或过滤灭菌。各成分可以一起灭菌，或者在需要的情况分别灭菌。所有培养基成分可以在培养开始时就存在，或者任选地连续或分批加入。培养温度通常在15。C到45。C之间，优选在25。C到40。C之间，并且在实验过程中可以保持恒定或可变。培养基的pH值范围应该在5-8.5之间，优选在7左右。在培养过程中培养基pH值可以通过加入碱性化合物来控制，例如加入氢氧化钠、氩氧化钾、氨或氨水，或加入酸性化合物，例如磷酸或硫酸。通过应用消泡剂来控制泡沫形成，例如脂肪酸聚乙二醇酯。通过向培养基中加入合适具有选择作用的物质(例如抗生素)来维持质粒的稳定性。通过向培养物中引入氧或含氧气体混合物(例如空气)来维持好氧条件。培养温度通常从20。C到45。C并且优选从25。C到40°C。培养持续到形成所需产物达到最大量。该目标通常在10小时到160小时以内实现。可能使用包含根据本发明的核酸、核酸构建体或载体的生长细胞用于根据本发明的方法。也可能使用静止的或破裂的细胞。破裂的细胞指例如通过溶剂处理而有渗透性的细胞，或通过酶处理、化学处理(例如弗氏细胞压碎器或超声)或其他方法而破裂的细胞。此方法获得的粗提物对于根据本发明的方法是有利的。该方法也可以使用纯化或部分纯化的酶。同样，有利于在反应中使用的固定化微生物或酶也是合适的。如果根据本发明的方法使用游离生物体或酶，那么可以在提取之前通过例如过滤或离心将它们方便地除去。最好不必需使用固定化生物体或酶，但是仍然可以发生。作为主要起始材料的亚油酸可以分批、半分批或连续加入到反应混合物中。发酵过程的起始材料(优选亚油酸)的浓度不高于3mg/ml，优选不高于2mg/ml，更优选不高于1mg/ml，尤其优选不高于0.5mg/ml。在本发明特别尤其优选的实施方案中，用于诱导反-10，顺-12共轭亚油酸产生的亚油酸的浓度范围为0.1-0.5mg/ml，优选0.4-0.5mg/ml，更优选0.3-0.4mg/ml，尤其优选0.2-0.3mg/ml，最优选0.1-0.2mg/ml。在本发明的另一个实施方案中，加入亚油酸的微生物培养物的光密度(OD6oo)至少为0.1、优选至少0.2、更优选至少0.3或0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39,尤其优选至少0.4或0.41、0.42、0.43、0.44、0.45、0.46、0.47、0.48、0.49，特别尤其优选至少0.5或0.51、0.52、0.53、0.54、0.55、0.56、0.57、0.58、0.59、0.6。然而，亚油酸甚至可以加入到光密度(OD卯。)大于0.6的微生物培养物中。在本发明的优选实施方案中，分离CLA之前，诱导培养物至少要培养12-18小时，优选至少18-24小时，更优选至少24-30小时，尤其优选至少30-42小时，最优选至少42-72小时。对于已建立的类型，根据本发明方法的产物(=共轭不饱和脂肪酸，尤其是CLA,优选反-10，顺-12共轭亚油酸)可以基于反应中所用的亚油酸的量以产量的20-100%、优选30-100%、尤其优选50-100%、更尤其优选60-100%、70-100%、80-100%、90-100%来分离。另外，产物具有高度的异构纯度，需要时有利于通过结晶进一步增加异构纯度。本发明的方法的主要产物是反-10，顺-12共轭亚油酸。可以通过技术人员熟悉的方法从生物体中分离脂肪酸产物。例如通过抽提、盐沉淀和/或不同的层析方法。对于微生物发酵的情况，可以在培养基和/或细胞中积累上述脂肪酸。如果在根据本发明的方法中使用微生物，那么可以在培养以后处理发酵液。按需要，通过分离方法(例如离心、过滤、倾析或这些方法的组合)从发酵液中移出全部或一些的生物体，或者将生物体留在发酵液中。随后用已知方法将发酵液减少或浓缩，例如用旋转蒸发器、薄层蒸发器、降膜式蒸发器、或通过反渗透或纳米过滤。然后最好可以加入另外的组成化合物例如玉米淀粉或硅酸盐。随后浓缩的发酵液最好与组成化合物一起通过冻干、喷雾干燥、喷雾成粒或其他方法来加工。优选用已知方法从生物体中分离脂肪酸或脂肪酸组合物，例如从微生物或生物体生长的培养基中，或从生物体和培养基中，例如通过抽提、蒸馏、结晶、层析或这些方法组合的方法。可以单独使用或与上述方法(例如分离和/或浓缩方法)组合4吏用这些纯化的方法。可以将包含产物的组合物用于进行例如在硅胶板上薄层层析法或例如硅胶镁载体(Florisil)柱层析(BouhoursJ.F"J.Chromatrogr.1979，169，462)，其中所希望的产物或混杂物在层析树脂上保持完整或部分。如果需要，可以用同样或不同的层析树脂重复这些层析步骤。技术人员熟知合适的层析树脂的选择和它们最有效的用途。纯化脂肪酸的可选择方法是例如在尿素存在下结晶。这些方法可以彼此组合使用。可以通过现有技术来确定分离的化合物的鉴定和纯化。这些包括高效液相层析(HPLC)、分光光度法、质傳法(MS)、染色法、薄层层析法、NIRS、酶测定或微生物测定。这些分析方法在Patek等人(1994)Appl.Environ.Microbiol.60:133-140;Malakhova等人(1996)Biotekhnologiya1127-32;和Schmidt等人(1998)BioprocessEngineer.19:67-70.工业化学Ulmann，s百科全书(1996)第A27巻，VCH:Weinheim，第89-90页、521-540页、540-547页、559-566页、575-581页和581-587页；Michal，G(1999)生物化学途径生物化学和分子生物学图片集，JohnWiley和Sons;Fallon,A.等人(1987)HPLC在生物化学中的应用生物化学和分子生物学实验室技术，17巻中和无述。本发明尤其优选的实施方案涉及在转基因微生物中根据上述步骤(a)到(e)生产共轭亚油酸的方法，其特征在于在操作或发酵过程中(分批或补料分批)亚油酸的生物转化率(如在一般定义中所定义的)比乳酸杆菌属的细菌高于10%、优选高于20%、更优选高于30%,比大肠杆菌属的细菌高于10%、优选高于20%、更优选高于30%、尤其优选高于40%,比乳J求菌属的细菌高于10%、优选高于20%、更优选高于30%,尤其优选高于40%、非常特别优选高于50%。此外，本发明涉及生产富舍共轭亚油酸的饲料或食品产品或营养制品的方法，其中根据上述方法产生共轭亚油酸。本发明还涉及富含共轭亚油酸的伺料、食品产品和营养制品，其中根据上述方法产生共轭亚油酸。本发明的组合物具有多种营养的、治疗的和药理学的用途。这些用途包括减少动物体脂肪、增加动物肌肉量、增加动物饲养效率、减少人体重、减弱动物过敏性反应、防止由于免疫刺激导致的动物体重减轻、增加动物骨的矿物含量、防止动物骨骼异常和降低动物血液中胆固醇含量。饲料或食品产品、优选作为饲料或食品产品的添加剂使用的制品，除根据上述方法产生的共轭亚油酸、优选发酵油或纯化的共轭亚油酸异构体混合物、更优选纯化的反-10，顺-12共辄亚油酸以外，也可以包含其他组分。其他组分应依据制品的用途来选择，并且是技术人员一般公知的。本发明含义内考虑的其他组分是例如如下物质其他有机酸、类胡萝卜素、微量元素、抗氧化剂、维生素、酶、氨基酸、矿物质、乳化剂、稳定剂、防腐剂、消结块剂和/或香味增强剂。所述物质的典型实例在才艮据欧洲规则的食品添加剂的各自有效目录中列出，例如当前有效的EC导则95/2/EC。在下文中，列出对于产生本发明的制品合适的其他组分根据其不同的性质和具有所选用途的功能，将这些组分以不同的量加入到制品中。定量混合比还有具有所选用途的功能的物质的方便组合是本领域技术人员所公知的。有机酸优选使用甲酸、丙酸、乳酸、乙酸和柠檬酸，尤其优选甲酸、丙酸或乳酸。在本发明中，类胡萝卜素指四薛类，其中一个或两个芷香酮环与具有9个双键的碳链结合，并且可以是植物或动物来源。类胡萝卜素也指氧合叶黄素。它们的实例是a-、p-、，胡萝卜素、ixin、降胭脂树素、辣椒红(capsanthin)、辣4仅玉红素(capsorubin)、番茄红素(lycopene)、卩-脱辅基國8-胡萝卜素醛、胡萝卜酸乙酯(carotinicacidethylester)和叶黄素、黄莨黄质(flavoxanthin)、黄体素(lutein)、玉米黄质(cryptoaxanthin)、玉红黄质(rubixanthin)、紫黄质(violaxanthin)、紫杉紫素(rhodoxanthin)、还有角黄素(canthaxanthiii)。本发明的制品可以包含例如如下微量元素铬、铁、氟、碘、钴、铜、锰、钼、镍、竭、钒、锌或锡。下面列出的E编号是食品添加剂的导则95/2/EEC中指定的。可以使用的抗氧化剂是例如抗坏血酸(维生素C，E300)、L-抗坏血酸钠(E301)、L-抗坏血酸钓(E302)、抗坏血酸棕榈酸酯(E304)、丁基化羟基苯甲醚(E320)、丁基羟基甲苯(E321)、EDTA二钠钙(E385)、没食子酸酯(gallates)例如没食子酸丙酯(E310)、没食子酸辛酯(E311)、没食子酸十二酯(没食子酸月桂酯)(E312)、异抗坏血酸(E315)、异抗坏血酸钠(E316)、卵砩脂(E322)、乳酸(E270)、多重磷酸盐例如二砩酸盐(E450)、三磷酸盐(E451)、多磷酸盐(E452)、二氧化硫(E220)、亚硫酸钠(E221)、亚硫酸氢钠(E222)、二硫化钠(E223)、亚硫酸钾(E224)、亚硫酸钓(E226)、亚硫酸氢钙(E227)、亚石克酸氢钾(E228)、硒、生育酚(维生素E，E306)、例如a-生育酚(E307)、，生育酚(E308)，S-生育酚(E309)和所有生育三烯酚类(tocotrienols)、氯^1锡(11)(E512)、柠檬酸(E330)、柠檬酸钠(E331)、类胡萝卜素、维生素A、还有柠檬酸钾(E332)。可用的维生素不仅有脂溶性维生素，还有水溶性维生素。脂溶性维生素的实例是维生素A0见黄醇)、维生素D(麦角钙化醇)、维生素E(生育酚和生育三烯酚类)、维生素K(叶绿醌和曱基萘醌)，优选维生素A和E。水溶性维生素的实例是维生素B1(硫胺素)、维生素B2(核黄素)、维生素B5(泛酸)、维生素B6(吡哆醇)、维生素Bl2(钴胺素)、维生素C(抗坏血酸)、维生素H(生物素)、叶酸和烟酸，优选维生素B2和C。制品也可以包含酶。其实例是淀粉酶、蛋白酶和转化酶。本发明中可用的氨基酸是例如谷氨酸、L-肉碱、L-谷氨酰胺、L-牛磺酸、L-天冬氨酸、L-甘氨酸、L-赖氨酸、DL-苯丙氨酸、L-色氨酸、酪氨酸、L-精氨酸、L-半胱氨酸、L-亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-瓜氨酸、L-缬氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-鸟氨酸或L-脯氨酸。尤其优选必需氨基酸，例如L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、DL-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸和L-缬氨酸，特别尤其优选动物营养中重要的氨基酸L-赖氨酸、DL-甲硫氨酸或L-苏氨酸。本发明中的矿物质是例如钠、钾、镁、钙、磷、铁和锌。乳化剂可使用下列物质，例如E420山梨糖醇、E420ii山梨糖醇糖浆、E421甘露糖醇、E422甘油、E431聚氧乙烯(40)硬脂酸盐、E432聚氧乙烯山梨聚糖单月桂酯/聚山梨酸酯20、E433聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯/聚山梨酸酯80、E434聚氧乙烯山梨聚糖单棕榈酸酯/聚山梨酸酯40、E435聚氧乙烯山梨聚糖单硬脂酸酯/聚山梨酸酯60、E436聚氧乙烯山梨聚糖三硬脂酸酯/聚山梨酸酯65、E440果胶、E440i果胶、E440ii酰胺化果胶、E442磷脂铵、E444蔗糖乙酸异丁酯、E445根爭>香甘油酯、E450二磷酸、E450i二磷酸二钠、E450ii二磷酸三钠、E450iii二磷酸四钠、E450iv二磷酸二钾、E450v二磷酸四钾、E450vi二磷酸二钩、E450vii二磷酸二氬锅、E451三砩酸、E451i三磷酸五钠、E451ii三磷酸五钾、E452多磷酸、E452i多磷酸钠、E452ii多磷酸钾、E452iii多磷酸钠4丐、E452iv多碼酸4丐、E460纤维素、E460i微晶纤维素、E460ii纤维素粉、E461曱基纤维素、E463羟丙基纤维素、E464羟丙基曱基纤维素、E465甲基乙基纤维素、E466羧甲基纤维素、E469酶水解的羧甲基纤维素、E470a脂肪酸的钠盐、钾盐和钩盐、E470b脂肪酸的镁盐、E471脂肪酸的单-或二甘油酯、E472a脂肪酸的单-或二甘油酯的乙酸酯、E472b脂肪酸的单-或二甘油酯的乳酸酯、E472c脂肪酸的单-或二甘油酯的柠檬酸酯、E472d脂肪酸的单-或二甘油酯的酒石酸酯、E472e脂肪酸的单-或二甘油酯的单-或二乙酰酒石酸酯、E472f脂肪酸的单-或二甘油酯的混和乙酸和酒石酸酯、E473蔗糖脂肪酸酯、E474蔗糖甘油酯、E475脂肪酸聚甘油酯、E476聚甘油聚蓖麻油酸酯、E477脂肪酸的丙二醇酯、E479与脂肪酸的单-或二甘油酯相互作用的热氧化的大豆、E481硬脂酰-2-乳酸钠、E482硬脂酰-2-乳酸钩、E483硬脂酰酒石酸酯、E491山梨聚糖单硬脂酸酯、E492山梨聚糖三硬脂酸酯、E493山梨聚糖单月桂酸酯、E494山梨聚糖单油酸酯、E495山梨聚糖单棕榈酸酯。稳定剂是保持食品稠度或组成的物质。其实例是抗坏血酸(E300)、尿素(E927b)、乳酸铁(11)(E585)、葡萄糖酸亚铁(E579)、甘油酯(E445)、卵磷脂(E322)、偏酒石酸(E353)、果胶(E440)、蔗糖乙酸异丁酯(E444)和氯化锡(ll)(E512)。防腐剂是通过防止微生物对食品的有害作用从而延长食品储存期限的物质。其实例是E200山梨酸、E201山梨酸钠、E202山梨酸钾、E203山梨酸钩、E210苯曱酸、E211苯甲酸钠、E212苯甲酸钾、E213苯甲酸钾、E214乙基对羟基苯甲^/PHB酯、E215乙基对羟基苯曱酸钠/PHB乙酯钠盐、E216丙基对羟基苯曱^/PHB丙酯、E217丙基对羟基苯甲酸钠/PHB-丙酯钠盐、E218甲基对羟基苯曱^/PHB-曱酯、E219曱基对羟基苯甲酸钠/PHB-甲酯钠盐、E220二氧化硫、E221亚硫酸钠、E222确<氢化钠(sodiumhydrogensulfite)/亚石克酸氢钠(sodiumbisulfite)、E223偏亚硫酸氢钠/二硫化钠(sodiumdisulfite)、E224偏亚硫酸氩钾/亚石克酸钾、E226亚硫酸钓、E227硫氢化钓(calciumhydrogensulfite)、E228硫氩化钾(potassiumhydrogensulfite)/亚硫酸氢钾、E230联苯/二苯、E231邻苯基酚(orthophenylphenol)、E232邻苯酚钠、E233噻唑苯并咪唑、E234乳链菌肽、E235游霉素、E239六亚甲基四胺、E242二甲基碳酸氢钠、E249亚硝酸钾、E250亚硝酸钠、E251硝酸钠和E252硝酸钾。本发明中的消结块剂是能够通过防止颗粒聚集和粘附在一起从而增加食品流动性的天然存在或合成的物质。其实例是E530氧化镁、E535亚纟失氰化钠、E536亚4失氰化钾、E541酸性磷酸铝钠(acidicsodiumaluminumphosphate)、E551二氧化硅、E552珪酸钩、E553ai硅酸镁、E553aii三硅酸镁(无石棉)、E553b滑石(无石棉)、E554硅酸铝钠和E556硅酸铝钙。本发明中的香味增强剂指能够实现或增强食品香味的天然存在或合成的物质。也包括调味料。其实例是E620谷氨酸、E621谷氨酸单钠、E622谷氨酸单钾、E623二谷氨酸钓、E624谷氨酸单铵、E625二谷氨酸镁、E626鸟苷酸、E627鸟苷酸二钠、E628鸟苷酸二钾、E629鸟苷酸钙、E630肌苷酸、E631肌苷酸二钠、E632肌苷酸二钾、E633肌苷酸二钙、E6345-核糖核苷酸钾、E6355-核糖核苷酸二钠、E640甘氨酸和E650乙在一个实施方案中，本发明所用的制品可以包含助剂。根据本发明，助剂指可用于改良产品性质(例如粉末行为、流动性质、吸水能力和储存稳定性)的物质。助剂可以基于糖例如乳糖或麦芽糖糊精，基于谷类或豆类产品例如玉米芯、麸皮和大豆粉，基于矿物盐尤其是钩、镁、钠或钾盐，以及D-泛酸或其盐类(化学的或发酵产生的D-泛酸盐)。在另一个实施方案中，本发明所用的制品可以包含载体。合适的载体是"惰性"载体材料，即不与本发明制品中所用的成分产生不利相互作用的材料。很明显，载体材料在各自所用的例如食品和动物饲料中必需是安全的。合适的载体材料不仅有无机载体，还有有机载体。合适载体材料的实例是低分子量无机或有机化合物和相对高分子量的天然或合成来源的有机化合物。合适的低分子量无机载体的实例是盐，例如氯化钠、碳酸4丐、硫酸钠和硫酸镁、硅藻土或硅酸、或硅酸衍生物例如二氧化硅、硅酸盐或硅胶。合适的有机载体的实例尤其是糖，例如葡萄糖、果糖、蔗糖、以及糊精和淀粉产品。相对高分子量的有机载体的实例是淀粉和纤维素制品，例如尤其是玉米淀粉、玉米芯、地稻外壳、麦麸粗面粉或谷类面粉，例如小麦、黑麦、大麦和燕麦面粉或麦l夫和其混合物。本发明所用的制品可以包含混合的其他组分、载体和助剂。制品中共轭亚油酸的重量分数可以在很广的泛围内变化，通常根据所选择的应用领域(例如农业畜牧业、培育家畜或人营养)的实践考虑来确定。在最简单的情况下，通过混合组分来生产制品。同样可以通过混合各单独组分的溶液来生产制品，合适情况下随后除去溶剂。多种组分的混合物可以以相对于彼此的任意重量比例存在。混合物的最简单形式是将各组分集中在混合器中。此类混合器是本领域技术人员所7>知的，例如来自Ruberg公司(垂直双柄混合器(HM(10-50000I)型)、环层混合器-pelletizer(RMG型)、连续凝集干燥机(HMTK型)、垂直单柄混合器(VM(10-50000I)型)、容器混合器(COM(50-4000I)型)。更多的混合器也可以获自Lodige，Drais，Engelsmann。可以分批或连续操作混合器。在分批混合器中，通常要混合的所有组分以预期的比例带电荷，然后混合足够的时间，时间范围从几分钟到几小时。混合时间和混合应力是特异的，从而使组分在混合物中呈现同质的分散。在连续混合的情况下，连续加入组分，合适情况在预混合以后加入。在连续混合器中，也选择一定的保留时间和混合应力，从而使组分在混合物中呈现同质的*。在连续的情况下与分批混合的情况相比混合时间通常较短而混合应力更高。混合通常在室温下进行，但是取决于所用物质也可以在更高或更低的温度下进行。在优选实施方案中，制品以固体形式存在。依赖于应用的需要，制品可以是平均颗粒大小从10jim到5000nm、优选平均颗粒大小从20nm到1000jim的粉末。可以用MalvernInstrumentsGmbH，MastersizerS仪器来研究得到的粉末产品的颗粒大小分布。组分的混合物可能是纯化的掺和物，即物质以所需的颗粒大小和浓度比混合在一起，合适情况下添加更多的添加剂，如果需要还可以通过包被来保护这些物质。此外，可以使用芯鞘结构，即一种组分位于内部作为芯而另一组分位于外部作为鞘，或相反。当然，对于这些结构，如果需要也可以使用进一步的包被。也可以用共用的载体材料基质或保护性胶体将物质一起包入胶嚢。这些的实例是本领域技术人员所公知的，并且例如在RAMorten:Fat-SolubleVitamins,PergamonPress,1970，第131到145中描述。可以通过本领域技术人员熟知的结晶、沉淀、干燥、造粒或聚集的方法、或其它现代教科书中描述的固体形成方法生产粉末。掺入到医疗食品中的CLA的精确量由食品的预期用途、CLA的使用形式和施用途径决定。也可以由异构体比例决定。然而，医疗食品可以含有重量等同于食品重量的约0.05-1%、或约0.1-0.9%、或约0.2-0.8%、或约0.3-0.7%、或约0.4-0.6%的CLA。在另外实施方案中，食品包含重量等同于食品重量的约1-10%、或约2-8%、或约3-7%、或约4-6%的CLA。CLA含量也可以表示为基于提供的总热量的CLA量，例如每100卡路里0.03-3克CLA。或者，CLA量也可以表示为食物中脂类或脂肪的百分比，例如食物脂类的0.3-100%。另外合适的含共轭亚油酸的饲料和/或食品在美国专利6.042.869(实施例2到9)和US5,760,082(实施例2到5)中描述。所述专利的内容在此引用作为参考。其它专利也描述了多种CLA制品。欧洲专利申请EP779033Al在此处引用作为参考，其公开了含有0.05-20%(按重量计)CLA残余的食用脂肪涂布。其中，商业上可获得的游离脂肪酸混合物含有95.3%的亚油酸含量，将该混合物用NaOH在乙二醇中进行碱性异构化。通过混合10份棕榈油和脂肪酶将游离脂肪酸掺入到甘油三酯中。混合物在45'C搅拌48小时，除去脂肪酶和游离脂肪酸。将70份该组合物和29份水、0.5份乳清蛋白粉末、0.1份盐和少量香料和柠檬酸(以获得pH4.5)混合并加工产生脂肪涂布。其它包含安全有效量的CLA的医疗食品在PCT出版物WO97/46118(Cook等人)中公开，其在此处引用作为参考。其中，公开了用于人肠胃外给药的包含直径约0.33-0.5微米脂肪颗粒的液体医疗食品。乳剂包含0.5-10mg/gm的CLA、或可选择的基于食品液体0.3-100%的CLA或每100卡路里0.03-0.3gm的CLA。该申请也公开了含相似CLA量及2.66gm蛋白质、5.46gm脂肪、10.1gm碳水化合物、133gm水和RDA量(每日推荐量)的维生素和矿物质的婴儿制剂。公开了作为高蛋白质、维生素和矿物质补充剂的低残余液体肠内医疗食品的另一个实例。该补充剂包含产品重量的约0.05-5%的CLA、或液体的约0.3-100%的CLA或每100卡路里约0.03-0.3gm的CLA。另夕卜，140卡路里的典型制剂可以包含7.5gm蛋清固体、O.lgmCLA、27.3gm碳水化合物(例如蔗糖或水解的玉米淀粉)、1.9gm水和RDA量的樣吏生物和矿物质。另外，本发明涉及表达上述编码反-10，顺-12共轭亚油酸异构酶的核酸分子的转基因微生物，该核酸分子特征在于(i)具有SEQIDNo.l所述序列的核酸分子，或(ii)来自由(i)所述的核酸分子编码的多肽的功能性等同物，例如e.具有SEQIDNo.l所述序列的至少50个、优选至少75个、更优选至少100个、尤其优选至少125个、特别尤其优选至少150个连续碱基对的核酸分子，或f.与SEQIDNo.l所述序列的至少IOO个、优选至少125个、更优选至少150个、尤其优选至少175个、特别尤其优选至少200个连续核酸碱基对的序列具有至少80%、优选至少85%、更优选至少90%、尤其优选至少95%、特别尤其优选至少98%同一性的核酸分子，或g.在严格条件下与SEQIDNo.l所述序列的至少50个、优选至少100个、更优选至少150个、尤其优选至少200个、特别尤其优选至少500个连续碱基对的核酸片段杂交的核酸分子，或h.编码与SEQIDNo.2所示氨基酸序列具有至少75%、优选至少85%、更优选至少90%、尤其优选至少95%、特别尤其优选至少98%同一性的多肽的核酸分子。其中所述核酸序列优选从瘤胃细菌中分离、更优选从埃氏巨球型苗、最优选从埃氏巨球型菌YJ-4中分离，或从丙酸杆菌属、优选痤疮丙酸杆菌中分离，其中所述核酸分子功能性连接至少一个异源启动子序列。在另外的优选的实施方案中，本发明涉及本发明转基因微生物用作食品和饲料中益生菌的用途，优选微生物选自上述乳球菌属、乳酸杆菌属、丙酸杆菌属、大肠杆菌属和双歧杆菌属，更优选微生物选自短双歧杆菌、齿双歧杆菌和假链状双歧杆菌。另外，本发明涉及在转基因微生物中根据上述本发明方法产生的发酵油。在优选实施方案中，发酵油从发酵液中分离，并主要由反-10，顺-12共辄亚油酸和9,12-共辄亚油酸组成，并且富含至少20%、30%、40%，优选至少50%、55%、60%,更优选至少65%、70%、75%，尤其优选至少80%、85%、90%,特别尤其优选至少91%、92%、93%、94%、95%的反-10，顺-12共辄亚油酸。为了纯化脂肪酸部分(优选CLA部分)，可以进一步加工所述发酵油(见实施例)。1.通过施用约0.1-1%浓度的CLA来维持白细胞数目从而减弱动物中由1型或TgE超敏介导的过敏反应，如美国专利号3,585,400(Cook等人)中所述，其在此处引用作为参考。该专利公开了用0.25%CLA或对照饮食喂养豚鼠两周，然后在两周时用卵清蛋白免疫和在三周时高度免疫。用表面灌流模式系统来确定喂养CLA是否对过敏诱导的气管收缩有影响。在表面灌流系统中，以CLA喂养的豚鼠的气管比对照喂养的豚鼠的气管更稳定。当过敏原注入到豚鼠气管中时，在CLA喂养的动物组织中观察到较少的气管收缩。CLA喂养的动物的白细胞量与对照动物相比有所增高，CLA喂养的动物白细胞量为3.5x106+/-0.6，而对照动物为2.4x106+/-0.3。2.减少动物体脂肪。在此引用美国专利号5,554,646(Cook等人)作为参考，其公开了CLA用于减少动物体脂肪的用途。在该方法中，使用足够引起体脂肪减少的安全有效的CLA量来喂养动物。用含有0.5%CLA的饮食喂养小鼠，在喂养结束时总脂肪含量显著低于喂以含0.5。/。玉米油的对照小鼠。为减少体脂肪施用的精确的CLA量依赖于动物、CLA的应用形式和施用途径。CLA量的范围通常为约0.001-1g/kg动物体重。3.增加动物体重增长和喂养效率。在美国专利号5,428,072(Cook等人)中公开CLA的此类营养用途。其中，向动物喂养安全有效量的CLA能够增强动物体重增长和喂养效率。向小鸡喂以含0.5。/。CLA的饮食补充剂证明了尽管喂养CLA的鸡消耗较少的食品，但是其与喂以0.5%亚油酸的对照鸡的体重相等。4.防止由免疫刺激引起的食欲缺乏和体重减轻。在此处引用美国专利号5，430，066(Cook等人)作为参考，其公开了使用CLA来促进生长和防止由免疫刺激(例如暴露于内毒素)引起的食欲缺乏和体重减轻以及分解代谢的激素(例如IL-1)的不利作用。以含0.5%CLA的饮食喂养小鸡，随后注射内毒素进行激发，小鸡的体重增加，而用对照饮食喂养的小鸡在暴露于内毒素之后并没有增加体重。用含0.5%CLA的饮食喂养的兔子与用含0.5%玉米油的对照饮食喂养的兔子相比较也得到同样的结果。公开的制品和剂量范围与美国专利号5,554,646中公开的一致。5.保持或提高动物中CD-4和CD-8细胞的水平。在此引用美国专利号5,674，卯2(Cook等人)作为参考，其中公开了保持或提高动物中CD-4和CD-8细胞的水平的方法，和防止或减轻由肿瘤坏死因子(TNF)的产生或外源施用引起的或由病毒引起的不利作用的方法，其包含向动物施用安全有效量的CLA。用对照饮食或含0.5%CLA的饮食喂养小鼠，随后注射TNF进行激发。喂以CLA的小鼠与对照小鼠相比体重减少较小。同样，用含0.5。/。CLA的饮食喂养小鸡，随后翼网注射减毒活鸡痘病毒进行激发，会使小鸡与喂以对照饮食的小鸡相比增加更多的重量。喂以0.5。/。CLA饮食的小鸡与喂以对照饮食的小鸡相比CD-4和CD-8细胞的百分数明显增加。6.改良动物的血脂镨。在此处引用欧洲专利申请779,033Al(Lievense等人)作为参考，其公开了CLA用于改良血脂谱的用途。简言之，用含CLA的饮食喂养仓鼠，其中以饮食总热量的1.5%的比例掺入脂肪涂布形式的甘油三酯。喂以CLA的仓鼠的总胆固醇增加、HDL胆固醇降低和LDL胆固醇降低。7.生产治疗癌症的医药或治疗试剂。本发明的发明者检测了由乳酸乳杆菌和大肠杆菌产生的发酵油对人SW480癌细胞的抗增殖作用，结果清楚地证明tl0，cl2异构体对癌细胞具有细胞毒作用。tl0，cl2CLA抑制细胞生长的作用是剂量依赖的，最高细胞毒作用在浓度20照/ml。乳酸乳杆菌tl0，cl2CLA杀死多数癌细胞，当用最高浓度(20ng/ml)处理时剩余少于8%的活细胞，与之对照的是乙醇对照(=100%)和用大肠杆菌产生的发酵tl0，cl2CLA培育会减少到约20%。先前报道CLA异构体减少SW480细胞活力和刺激细胞凋亡。在Miller等人(2002)的研究中，tl0,cl2CLA异构体是最有效的异构体，其可以减少细胞活力到47-61%，而c9，tllCLA减少到40-52%。CLA也可以抑制MCF-7乳腺癌细胞系的生长(Schultz等人，1992;O'Shea等人，1999)。当用20fig/mltl0，cl2CLA异构体处理MCF-7细胞8天时，细胞数减少15%，而用相等量的c9，tl1CLA异构体在相同条件下引起细胞活力下降60。/。(O'Shea等人，1999)。在另一个研究中，用16jig/mltl0，cl2CLA异构体培育4天使SW480和MCF-7细胞系的活力均减少50-60%(Miller等人，2001)。相反，同样量的亚油酸使SW480细胞的活性增加23%。未发酵的对照亚油酸和纯化亚油酸(希格玛)对细胞活力仅有很小的影响。医药和治疗剂指那些不仅用于预防而且用于治疗动物(优选人)的过敏反应、体脂肪增加、由于免疫刺激引起的食欲缺乏和体重减轻、血脂谱和癌症的试剂。在例如过敏反应、体脂肪增加、由于免疫刺激引起的食欲缺乏和体重减轻、血脂语和癌症的治疗中，制品可以按本领域技术人员通常公知的方法配制，是适合并可以用常规技术进行药剂形式的生产。此类技术例如在"Remingtons药学科学手册"，MackPublishingCo"NewYork,USA，第17版，1985中描述。此类药剂形式或食品添加剂可以是液体、粉末、预混合剂、片剂、胶嚢或混悬液。药量一般为人々大食中约1000ppm(百万分之一)到约10000ppm范围的CLA。然而，因为CLA无毒，所以使用的量的上限并不严格。也可以以多种形式制备用于此类或其他用途的CLA。这些包括无毒的CLA钠或钾盐与药用稀释剂和活化的酯类组合。CLA也可以直接掺入到动物饲料或人食品中，使CLA构成动物或人食品重量的约0.01-2%或更多。序列1.SEQIDNo.1从痤疮丙酸杆菌中分离的反-10，顺-12共轭亚油酸异构酶的核酸序列(登录号CQ766028)2.SEQIDNo.2从痤疮丙酸杆菌中分离的反-10，顺-12共轭亚油酸异构酶的氨基酸序列(登录号CQ766028)3.SEQIDNo.3PCR-引物ERcoPAIl的核酸序列5'-aaaactgcagaggaggaaaaaaaATGGGTTCCATTTCCAAGGA画3'4.SEQIDNo.4ERcoPAI2的核,列5'-CGGGGTACCTCACACGAAGAACCGCGTCA-3'5.SEQIDNo.5载体pNZ44-coPAI的核酸序列实施例为证明和进一步说明特定优选实施方案和本发明的方面，提供如下实施例，其并不限制本发明的范围。在下述实验性公开(和本发明的上述说明书)中，如下缩写为M(摩尔浓度)；mM(毫摩尔浓度)；(微摩尔浓度)；nM(纳摩尔浓度)；mol(摩尔量)；mmol(毫摩尔量)；pmol(微摩尔量)；nmol(纳摩尔量)；gm(克);mg(毫克)；jig(微克)；pg(皮克)；L(升);ml(毫升)；jil(微升)；cm(厘米)；mm(毫米)；Jim(微米)；nm(纳米);。C(摄氏度)；MQ(milli-Q水；进一步除去挥发物的去离子水，提供具有18.2欧姆电阻的纯化水)；PSI(磅/平方英寸)；cDNA(DNA拷贝或互补DNA);DNA(脱氧核糖核酸)；ssDNA(单链DNA);dsDNA(双链DNA);dNTP(三磷酸脱氧核糖核苷酸)；RNA(核糖核酸)；PBS(磷酸盐緩冲液)；OD(光密度)；HEPES(N-2-羟乙基]哌溱-N-[2-乙磺酸)；HBS(HEPES緩冲液)；SDS(十二烷基硫酸钠);Tris-HCI(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)；DMSO(二甲基亚砜)；EGTA(乙二醇_二((3-氨乙基醚)N，N，N，，N'-四乙酸)；EDTA(乙二胺四乙酸)实施例1:培养物和培养基。乳酸乳球菌NZ9800(由于缺失nisA基因而不产生乳链菌肽的乳酸乳杆菌NZ9700衍生物，包含整合在染色体中的nisRK信号转导基因)在M17(Difco实验室，DetroitMichigan,USA)液体培养基和/或含葡萄糖(0.5%w/v)的琼脂中于30。C培养。预先从人胃肠道(GIT)分离益生菌菌林副千酪乳杆菌副干酪亚种NFBC338(Lactobacillusparacaseissp.ParacasdNFBC338)(副干酪乳杆菌NFBC338),按照限制性材料转移合约从爱尔兰Cork综合大学获得。副干酪乳杆菌NFBC338常规在MRS液体培养基(OxoidLtd.,Hampshire,UK)中过夜(约17小时)培养，在缺氧条件下用含厌氧培养气体包(默克，Darmstedt，德国)的厌氧培养罐在37。C培养。在篩选标记氯霉素(5照/ml)的存在下常规培养携带质粒pNZ44的乳酸乳杆菌。以红霉素(IOng/ml)作为筛选标记来常规培养含有载体pMSP3535的副干酪乳杆菌NFBC。在补充氯霉素(20ng/ml)的LB(Luria-Bertani)培养基中培养含有质粒pNZ44的大肠杆菌TOP10(英杰公司(Invitrogen))。人结肠癌细胞获自美国标准培养物收集所(ATCC，马纳萨斯，VA，USA)。tlO，cl2CLA异构体(纯度98%+)获自Matreya(MatreyaInc"PA，USA;)。除另外说明，细胞培养基和补充物购自希格玛Aldrich爱尔兰Ltd.(都柏林，爱尔兰)。SW480细胞维持在补充5%(v/v)胎牛血清、0.2mML-谷氨酰胺、1mMHEPES和1单位/ml青霉素和链霉素的Dulbecco，s极限必需培养基(DMEM)中培养。SW480细胞在96孔板中生长，并且维持在37"C在pH7.2-7.4、需要95%空气和5%C02流量的潮湿空气中。实施例2:DNA操作。设计两个寡核苷酸引物来扩增完整的亚油酸异构酶(coPAI)，从原始构建体pC".l-coPAI(在植物载体中的亚油酸异构酶基因；BASF,德国)产生tl0，cl2CLA。正向引物ERcoPAIl(SEQIDNo.3)包含Pstl限制性内切酶位点和核糖体结合位点(RBS)，在5，端有4个额外的碱基，在RBS和基因起点之间有7个额外碱基；5'-aaaactgcagaggaggaaaaaaaATGGGTTCCATTTCCAAGGA國3'(SEQIDNo.3)。反向引物ERcoPAI2(SEQIDNo.4)包含Kpnl限制性内切酶位点和5，端3个额外碱基；5，-CGGGGTACCTCACACGAAGAACCGCGTCA-3'(SEQIDNo.:4)。使用200ng质粒DNA(pC33.1-coPAI)作为模版，在EppendorfMastercyclerGradient(Eppendorf)中以高保真延伸按供应商所述(罗氏诊断有限公司(RocheDiagnosticsLimited),EastSussex,英格兰)扩增1278bp的coPAI基因。PCR反应在总体积50jd体系中进行，包含lnl的各引物、3mMMgCl2、5nll0x延伸緩冲液、1jildNTP's和0.75fil延伸DNA。PCR条件如下2分钟、15秒变性(94。C)、30秒退火(55。C)、2分钟延伸(72。C)，IO个循环，随后15秒(94。C)、30秒(55。C)、2分钟+5秒/循环(72。C)20个循环和最终一次7分钟72。C循环。PCR反应混合物在1。/。(w/v)琼脂糖凝胶上分析，可见得到的PCR片段。使用Qiagen质粒小量提取试剂盒(Qiagen，WestSussex,UK)从大肠杆菌TOP10、乳酸乳杆菌NZ9800和副干酪乳杆菌NFBC338中分离质粒DNA，对于乳酸乳杆菌和副干酪乳杆菌作微小修饰，即在Pl緩沖液中加入40mg/ml溶菌酶并在37。C培育20分钟(乳酸乳杆菌)和2小时(副干酪乳杆菌)。PCR产物用QiaquickPCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化。两个质粒pNZ8048(含PnisA启动子的乳链菌肽可诱导的质粒)和pNZ44(pNZ8048衍生物，其中PnisA启动子被P44取代，P44是组成型乳酸乳杆菌染色体启动子)和用限制性内切酶Pstl和Kpnl消化coPAI基因片段，随后在15。C用T4DNA连接酶按供应商说明(新英格兰生物实验室，MAUSA(NEB))进行连接反应。构建体在图1中显示。用同样的酶对重组质粒进行两次消化，从而验证正确的克隆，然后通过电穿孔转入乳酸乳杆菌NZ9800。在确i^人序列正确之后，用Pstl和Xbal限制性内切酶(图1)将基因从pNZ8048-coPAI切出，并连接到乳酸杆菌乳链菌肽可诱导的载体pMSP3535的相同位点。制备乳酸乳杆菌电感受态细胞，并根据Ruyter等人所述方法转化，而用3.5xSMEB(1M蔗糖，3.5mMMgCl2)按Luchansky等人所述制备副千酪乳杆菌NFBC338电感受态细胞。用DNAStar软件(DNAStar，Madison,Wisconsin,USA)进行序列分析。实施例3:CLA产品的筛选。标准顺-9，反-11和反-10，顺-12CLA购自Matreya(MatreyaInc.,PA，USA)，亚油酸购自希格玛(希格玛化学(sigmachemical),MO，USA)。测试乳酸乳杆菌、副干酪乳杆菌和大肠杆菌克隆将游离亚油酸(0.1-0.5mg/ml)转化为反-10，顺-12CLA的能力如下；将过夜培养物的1%接种物转移到10ml液体培养基中，培养到OD6()。nm约为0.5。然后加入亚油酸(0.1-0.5mg/ml)，并用30-50ng/ml乳链菌肽(从含2.5%(w/v)乳链菌肽的固体乳中制备，希格玛，N-5764)诱导培养物，再继续培养48-72小时。使进行时间实验的培养物在更大体积的液体培养基中生长，每隔12小时取IOml样品。培养48-72小时以后，将培养物离心，从上清中提取脂肪酸，在氮气下干燥接着进行甲基化，并用气液层析(GLC)分析(Coakley等人，2003)。以百培养物培养后从培养基中回收和提取的亚油酸的量有关，其代表100%的可利用的亚油酸。实施例4:发酵油的制备。将大肠杆菌pNZ44-coPAI和乳酸乳杆菌pNZ44-coPAI克隆(1%过夜培养物)接种于500ml各自培养基中并生长到OD6W)=0.5，然后加入亚油酸(0.5mg/ml)，继续培养72小时。由含亚油酸(0.5mg/ml)的未接种培养基组成的亚油酸对照也在37。C培养72小时，然后提取脂肪酸。从各发酵中制备三个对照样品，未发酵的亚油酸对照也进行甲基化并如(Coakley等人，2003)所述在GLC分析，从而计算样品中CLA/亚油酸的比值。实施例5:发酵油对人SW480结肠癌细胞的抗增殖活性。为了检测培养物(乳酸乳杆菌pNZ44-coPAI和大肠杆菌pNZ44-coPAI)在含亚油酸(0.5mg/ml)的各自培养基中发酵后提取的油的抗增殖活性，将人结肠癌细胞SW480在不同浓度的发酵油中培养。开始在孔中接种1x104细胞，并在37。C培养24小时从而使细胞粘附到预先用每毫升培养基5-20Hgtl0，cl2CLA(来自发酵油和乙醇中的标准tl0，cl2CLA)和5-25ng亚油酸(对照未发酵油和希格玛标准)处理的表面上。来自乳酸乳杆菌和大肠杆菌的发酵油包含1.35:1比例的亚油酸和tlO，cl2CLA。对照瓶用乙醇补充到终浓度为0.1%(v/v)。培养5天以后，测量细胞活力，并用MTS方法(PromegaCorporation,Madison,Wl，USA)确定相对细胞数，该方法是在用MTS四氮唑化合物处理以后的增殖或细胞毒性测定中测定有活力细胞数的比色法。用MTS处理2小时，用96孔板读数器在492nm纪录吸光度。处理后的细胞活力(。/。)以相对于乙醇对照(代表100%)来表示。对各个处理进行一式三份的三次独立的实验，而cl2CLA标准(Matreya)除外，进行一式三份的两次独立的实验，并且用Student'st检验确定各处理之间的显著性差异(p〈0.001)。实施例6:序列分析。来自痤疮丙酸杆菌的1278bp基因(登录号CQ766028)编码亚油酸异构酶蛋白质，产生425个氨基酸的tl0，cl2产物(SEQIDNo.1)。该异构酶分子量为4卯77Da。与数据库中的序列比^JC现克隆的异构酶蛋白质与已知氨基氧化酶的多数序列具有显著同源性(~25-400个氨基酸；NCBI保守结构域研究，Marchler-Bauer等人，2005)。该异构酶的145-423氨基酸与来自痤疮丙酸杆菌的假定氨基氧化酶(登录号Q6A8X5—PROAC;EXPASY/UniProtKB数据库)显示96%的同一性，而与其次的最佳匹配-来自植物稻(Oryzasativa)的蛋白质(日本产植物栽培变种组，登录号Q7XR12—ORYSA;EXPASY/UniProtKB数据库)仅有26%同一性。这些蛋白质的比对区包括黄素结合位点。含黄素的胺氧化酶家族也包含八氢番茄红素氢化酶和相关酶。已鉴定了位于氨基酸残基10-39之间区域的NAD/FAD结合结构域(PROSITE数据库)。该异构酶蛋白质是可溶的，预测该蛋白质定位于细胞质(PSORTb，英属哥伦比亚，加拿大；SOSUI，MitakuGroup，东京，日本)。在10-26氨基酸位置检测到假定的跨膜螺旋(HMMTOP;Tmpred)。然而，由于来自不同数据库的结果没有清楚的一致性，因》匕结果仍然有争i义。除InterProScan(EuropeanBioinformaticsInstitute,Cambridge,UK)在1-23氨基酸之间鉴定出假定的信号肽以外，没有检测到信号肽。实施例7:亚油酸的生物转化。携带构建体pNZ44-coPAI的乳酸乳杆菌能够将游离亚油酸转化为tl0，cl2CLA，而只含载体pNZ44的对照乳酸乳杆菌不能检测到转化为CLA(表1)。乳酸乳杆菌pNZ44-coPAI可以将大于50%的游离亚油酸转化为tl0，cl2CLA(表1，图3)。如果开始时与亚油酸(0.4-0.5mg/ml)共同培养，则乳酸乳杆菌生长不好，因此在培养物OD6。o-0.5时加入脂肪酸。在该点，培养物仍然显示对该浓度的亚油酸的敏感性。较低浓度的游离亚油酸(O.l和0.2mg/ml)观察到更高的转化为CLA的转化率。含有乳酸杆菌载体和coPAI基因(pMSP3535-coPAI)的副干酪乳杆菌NFBC338在OD600=0.5用50ng/ml乳链菌肽诱导并在脂肪酸(0.5mg/ml)中培养48小时以后，可以转化接近30%的LA(从无培养物的对照培养基中回收)。然而，未诱导的副千酪乳杆菌NFBC338pMSP3535-coPAI细胞产生的tl0，cl2CLA与裔导细胞中获得的量接近，未诱导细胞产生24.4%，而乳链菌肽诱导的培养物为28.9%。携带构建体pNZ44-coPAI的大肠杆菌细胞在脂肪酸(0.5mg/ml)存在下培养72小时以后，可以转化约40%的回收的对照LA，而大肠杆菌pNZ44(对照载体)不产生任何CLA(表1，图2和4)。表1.从培养液中回收的亚油酸至tl0，cl2CLA的转化百分数。培养物质粒/构建体诱导/未谈导的加入的LA量(mg/ml培养液)从培养液中回收的亚油酸至U0，cl2CLA的转化百分数副干酪乳杆菌pMSP3535-coPAI50ng乳链菌肽/ml0.528.9+/-0.5NFBC338pMSP3535-coPAI未诱导0.524.4+/-0.4pMSP353550ng乳链菌肽/ml0.50pMSP3535未诱导0.50乳酸乳杆菌NZ9800pNZ44-coPAI-0.2(在OD6()。=0.5)52.2+/-1.0(沉淀中+60.1+/-0.5)pNZ44-0.2(在OD600=0.5)0大肠杆菌pNZ44-eoPAI-0.539.1+/-1.6pNZ44-0.50*百分比形式的全部转化率涉及在没有培养物和有培养物的情况下培养相同的时间后从培养基中回收和提取的亚油酸的量，其代表100%的可利用亚油酸。实施例8:从微生物中分离脂类。双歧杆菌菌林(2。/。接种物)在加入0.5mg/ml亚油酸(希格玛化学公司)的500mlcys-MRS(将0.05%(w/v)L-盐酸半胱氨酸(纯度98%;希格玛化学公司St.Louis，MO，USA)加入MRS培养基中)中生长，来评估底物的生物转化率。亚油酸以30mg/ml储存溶液加入含2%(v/v)吐温80的蒸馏水中。亚油酸储存溶液预先用0.45mmMinisart滤器过滤除菌，并且避光储存于-20。C。菌林在37。C厌氧培养42小时。孵育后，提取在细菌上清中的脂肪酸如下在450ml细菌上清中加入225ml异丙醇(纯度99%;Alkem化学药物公司，Cork,爱尔兰)，涡旋30秒。在该混合物中加入己烷(开始加入170ml，涡旋混合，再力口入340ml)(纯度99%;LabScanLtd"都柏林，爱尔兰)，涡旋并在960xg离心5分钟。将得到的上清(含脂类的己烷层)转移到玻璃管中，在45。C氮气条件下将己烷干燥到2-3ml。脂类在氮气条件下储存于-20。C。如先前所述(Stanton等人，1997)，加入内标物((:13:0十三烷酸(纯度99%，希格玛化学公司))、甲基化和气液层析(GLC)后评估细菌上清的脂肪酸组成和亚油酸转化为CLA的转化水平。实施例9:甲基脂肪酸酯(FAME)的制备和GLC分析。如前述(Stanton等人，1997)在酸催化的甲基化以后通过GLC来分析己烷中的脂类提取物。计算在油(葵花籽油和豆油)中的游离脂肪酸作为酸和碱催化的甲基化以后脂肪酸浓度的差异，用2N甲醇KOH(希格玛化学公司)在室温下进行。参考内标物C13:0进行GLC。在ChrompackCPSil88柱(Chrompack，Middleburg,荷兰，100mx0.25mm内径，0.20"m薄膜厚度)使用氦作为载气在37psi(磅力/平方英寸)压力下进行FAME的分离。注射器温度在225。C下保持恒温10分钟，检测器温度为250°C。层析柱恒温器最初在140。C保持8分钟，然后以程序设计每分钟增加8.5。C直到最终温度为200。C并保持41分钟。用MinichromPC系统(VG数据系统，Manchester,UK)记录和分析收集的数据。参考CLA混合物(Nu-Chek-Prep.Inc.,Elysian，MN)通过保留时间来鉴定反-10，顺-12CLA异构体。用以多种培养物接种和培养后在培养液中存在的CLA和亚油酸的量除以培养前培养液中存在的亚油酸量，来计算CLA转化百分比和培养液中剩余的亚油酸。实施例10:上清中的脂类提取。将接种了CLA或LA的10ml培养物转移到15ml离心管(Sarstedt,Numbrecht，德国)中，然后用三洋Mistral2000R离心机在2197xg室温(20。C)离心20分钟。提取前在4ml上清中加入0.75mgC13:0(十三烷酸，希格玛，纯度99%)作为内标物，提取方法如下在上清中加入2ml异丙醇(Alkem化学药品公司Cork，爱尔兰，纯度99%)和1.5ml己烷(LabScanLtd.都柏林，爱尔兰，纯度99%),涡旋混合，然后再加入3ml己烷，再一次涡旋混合，然后将混合物在2197xg离心5分钟。将所有的上层(含脂肪酸的己烷层)转移到螺旋盖玻璃管中，在N2气流下干燥。然后在制备用于GLC(气液层析)分析的甲基脂肪酸酯(FAME)之前，将玻璃管储存于-2(TC。进行GLC以后，以每毫升培养液中的脂肪酸毫克数计算结果。实施例ll:沉淀中的脂类提取。除去上清以后，通过在10ml生长培养基中的细菌细胞(沉淀)中加入1ml盐溶液(0.137MNaCl、7.0mMK2HPO4、2.5mMKH:jP04)洗涤，将沉淀重悬并涡旋混合，然后在3632xg离心30分钟。除去上清以后，再在lml盐溶液中重悬沉淀，然后在3632xg离心15分钟，和再一次除去上清。将细胞再一次重悬于1ml盐溶液中，在制备用于GLC分析的FAME之前，向其中加入0.75mg<:13:0(如上对于上清所述)作为内标物。进行GLC以后，以每毫升完全生长培养基中的脂肪酸毫克数计算结果，并表示为mg脂肪^7ml。实施例12:曱基脂肪酸酉旨(FAME)的制备。酸催化的甲基化获得游离脂肪酸和甘油三酯结合脂肪酸的衍生物，其如下迷进行在螺旋盖玻璃管中的从上清和沉淀中提取的脂类(在2.4.1和2.4.2部分中描述)重悬于12ml的溶于甲醇中的4%甲醇HC1(v/v)(SupelcoInc.Bellefonte，PA，USA),涡旋混合10秒。甲醇HC1中的脂类在60。C培育1小时，每10分钟涡旋混合一次。然后向溶液中加入2ml水饱和的己烷和5ml己烷，涡旋30秒，然后静置30分钟。随后将含FAME的澄清上层转移到一个管中，加入2ml水饱和的己烷，再次涡旋混合溶液，并静置30分钟。此后，将上层转移到一个新管中，向该层加入0.5g无水疏酸钠(希格玛，纯度99%)终止曱基化反应，并涡旋混合5秒。1小时以后除去上层，在进行GLC分析之前储存于-20。C。实施例13:GLC分析。用配以火焰电离检测器(FID)和Septun程序控制注射器(SPI)的气液层析(GLC-Varian3400，Varian，HarborCity,CA，USA)分析作为甲基脂肪酸酯(FAME)的游离脂肪酸。参考内标物(C,3:。)进行脂肪酸的定量。在ChrompackCPSil88柱(Chrompack，Middleburg,TheNetherlands)(100mx0.25mm内径，0.20m薄膜厚度)上用He作为载气在33psi压力下进行脂肪酸的分离。注射器温度225。C下保持恒温IO分钟，检测器温度为250°C。层析柱维持器最初在140。C保持8分钟，然后以程序设计每分钟增加8.5°C，直到最终温度为200。C并保持41分钟。用MinichromPC系统(VG数据系统，Manchester,UK)记录和分析收集的数据。参考CLA标准(MatreyaInc.PA，USA)通过保留时间来鉴定反-10，顺-12CLA异构体，参考其标准脂肪酸来鉴定反-ll-C18:1和硬脂酸(希格玛化学公司St.Louis，MO，USA)。用内标物C13:0计算CLA异构体峰的校正系数，乂A式如下Cfi-(AisXWti)/(AjXWtis)。其中Cfj是实际CLA异构体的校正系数，Ais指内标物(C，3:。)峰的面积，Ai指CLA峰的面积，Wtj指CLA异构体的重量，Wtjs指内标物的重量。CLA量表示为mg/ml培养液。通过相对于C^Q的面积来计算各脂肪酸的响应系数，其设定为响应系数l.O。用使用培养物接种以后培养液中存在的CLA和亚油酸的量除以培养前培养液中存在的亚油酸的量，来计算CLA转化百分比和培养液中剩余的亚油酸的百分比。百分比形式的全部转化率涉及在没有培养物和实施例14:发酵油对人结肠癌细胞SW480的抗增殖活性。为了研究乳酸乳杆菌pNZ44-coPAI和大肠杆菌pNZ44-coPAI亚油酸发酵以后产生的油的抗增殖作用，在提取的由亚油酸和U0，cl2CLA以1.35:1比例的混合物组成的发酵油存在下培养人结肠癌细胞SW480。从37。C培养72小时之后的LB培养液中提取的亚油酸对照、亚油酸(希格玛，95%)和纯化的合成tl0，cl2CLA异构体(Matreya)也与SW480细胞一起培养，从而比较发酵油和纯化异构体的作用，同时确定加入油的浓度低于亚油酸开始对癌细胞有细胞毒作用的浓度。由于亚油酸在42.8叫/ml培养基(152.5jiM)时对SW480癌细胞具有抗增殖作用，而且在16.9ng/ml培养基(60.2jiM)浓度具有轻微的促增殖作用(Miller等人，2003)，因此选择tl0，cl2CLA(发酵油样品)浓度在5-20ng/ml培养基(等于相同油样品中6.7-27ng亚油^/ml培养基)之间，从而不超过亚油酸抑制细胞生长的阔浓度。以在5-20jig/ml之间浓度的tl0，cl2CLA培养5天以后，与对照亚油酸未发酵油相比，SW480癌细胞的生长有显著的减少(p0.001)。用5-20照/mltl0，cl2CLA处理以后，与99.1%+/曙10.0%(5jig/ml)-95.40/o+/-7.8%(20Hg/ml)(对照未发酵的LA)相比，细胞活力减少到72.6%+/-13.6%(5ng/ml)-7.9%+/-4.5%(20jig/ml)(乳酸乳杆菌CLA)和80.7%+/-6.8%(5ng/ml)-19.6%+/-11.8%(20pg/ml)(大肠杆菌CLA)(图5和6)。用最大浓度(25jig/ml)的亚油酸培养以后，对癌细胞具有显著的抗增殖作用，以未发酵的对照亚油酸处理时细胞活力为76%+/-18.4%，而当使用纯化(95%)希格玛亚油酸时细胞活力为93.2%+/-20.8%。所有的图中乙醇对照=100%细胞活力。在所有浓度都观测到对照油(未发酵的亚油酸)和来自乳酸乳杆菌和大肠杆菌的发酵油(tl0，c12CLA)之间细胞活力的显著性差异(pO.OOl)。以对照亚油酸(未发酵油)和纯化的亚油酸处理以后没有发现细胞活力的显著性差异。同样，以任意浓度的大肠杆菌tl0，cl2CLA(发酵油)和纯化的tl0，cl2CLA(Matreya)处理后均未发现细胞活力的显著性差异。然而，在以10-15Hg/ml(pO.001)和20fig/ml(pO.01)浓度的乳酸乳杆菌tl0，cl2CLA和纯化的tl0，cl2CLA处理时细胞活力有显著性差异。参考文献Alo膽，L.，Cuesta，E.P.andGilliland，S.E.2003.ProductionoffreeconjugatedlinoleicacidbyLactobacillusacidophilusandLactobacilluscaseiofhumanintestinalorigin.J.Dairy.Sci.86:1941-1946.Baumgard，L.H".Corl，B.A.，Dwyer，D.A.,Saeb02，A.andBauman，D.E.2000.Identi打cationoftheconjugatedlinoleicacidisomerthatinhibitsmilkfatsynthesis.Am.J,Physiol.Regul.Integr.Comp.Physiol.278:179-184.Belury，M.2002,Dietaryconjugatedlinol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