分离的多肽、编码其的多核苷酸、表达其的转基因植物和使用其的方法

专利名称：分离的多肽、编码其的多核苷酸、表达其的转基因植物和使用其的方法
技术领域：
和背景 本发明涉及分离的多肽、编码其的多核苷酸、表达其的转基因植物和使用其的方法。具体而言，本发明可以用于增加转基因植物的肥料使用效率和胁迫抗性以及生物量、活力(vigor)和产量。
肥料是支持“绿色革命”的燃料，直接造成过去40年中农作物产量的不寻常地增加。如果没有肥料使用的相应增加，那么农作物产量中的急剧上升决不可能发生。然而，近年来，关于肥料使用，特别是氮肥对水和大气污染的环境影响的关注日益增加。对于肥料使用的限制已在几个国家中立法，并且预计在未来有进一步的限制。在未来将必需肥料的更多使用，以支持在有限的土地资源上为了快速的人口增长而进行食物和纤维生产。
肥料通常被提及为农业中的头号日常开支费用。在作为主要肥料提供的3种常量营养物[氮(N)、磷酸盐(P)和钾(K)]中，氮是唯一一种通常需要每年补充的，特别是对于占全世界超过一半的种植面积的谷物。
促进植物生长的常见方法一直是且继续是天然以及合成营养物(肥料)的使用。合成营养物通常以植物可用的形式提供常量营养物，例如尿素，和/或无机硝酸盐、磷酸盐或类似化合物。尽管此类营养物可以或多或少地在农民方便时应用，并且可以每当认为需要时应用，但合成营养物的过量使用和合成营养物的无效利用是造成环境问题的主要因素，所述环境问题例如为地下水的富营养化、硝酸盐污染、磷酸盐污染等。
氮是植物的基本常量营养物，负责氨基酸和核酸、辅基、植物激素、植物化学防御等的生物合成。氮通常是植物生长中的限速元素，并且所有大田作物对于无机氮肥具有基本依赖性。因为肥料从大多数土壤类型中被快速耗尽，所以它必须在生长季节期间2或3次提供给生长中的农作物。通常以硝酸铵、硝酸钾或尿素形式提供的氮肥一般占与农作物(例如玉米和小麦)相关的成本的40％。已估计，到2050年，全世界每年将使用超过1亿5千万吨氮肥。植物对氮的使用效率增加将使得能够用较低的肥料输入，或备选地在品质较差的土壤上种植农作物，并因此将在发达和发展中的农业系统中具有显著的经济影响。氮肥的不希望有的效应的概述由Byrnes，Fertilizer Research，26，第209-215页(1990)呈现。尽管植物能够从环境中吸收有机氮，但是所利用的氮的大部分通常来自对铵(NH4+)和硝酸盐(NO3-)形式的无机氮的摄取，及其随后在称为同化的过程中转变成有机氮。
氮同化过程开始于NO3-顺次地通过硝酸盐还原酶(NR)和亚硝酸盐还原酶(NiR)而转变成NH4+。随后，氮通过谷氨酰胺合酶(GS)而掺入谷氨酸(Glu)中，从而获得谷氨酰胺(Gln)。氮同化的主要途径是GS/GOGAT循环(谷氨酰胺合酶/谷氨酸-酮戊二酸胺转移酶)。其余氨基酸通过转氨基作用而从Gln、Glu和Asn合成。
氮(作为氨基酸或以硝酸盐的形式)移动至枝条，在那里它在植物发育的快速步骤期间和向上直至开花时贮存于叶和杆(stalk)中。例如，在玉米中，在籽粒萌芽期间和直至开花时植物积聚大量有机氮。一旦植物的受精发生，籽粒就开始形成且变成植物氮的主要储库(sink)。贮存的氮随后可以从充当贮存区室的叶和杆中重新分布直至籽粒形成。
存在用于限定植物氮代谢的3种主要效率参数 氮摄取效率是地上生物量中N的量(gr Nt)除以施用的N的量(gr/公顷)； 氮利用效率(utilization efficiency)是籽粒产量(gr/植物)除以地上生物量中N的量(gr Nt)；和 氮使用效率(useefficiency)是籽粒产量(gr/植物)除以施用的N的量(gr/公顷)。
氮摄取效率[地上生物量中N的量(gr Nt)/施用的N的量(gr/公顷)]是植物所并入的总氮量，并且是“摄取”(植物的转运能力)、同化过程的代谢效率和植物大小发育速率的函数，因为在生长期间产生的杆和叶的物质团是实际的氮贮存器官。在最终转移至籽粒(产量)的枝条中发现的同化氮的级分在酶促方面受到控制，并因此是用于转基因操作的潜在位点。这个参数实际上等于氮利用效率(NUE)。更佳的籽粒至枝条N-分配将最可能改善籽粒的产量和蛋白质含量。
类似地，可以对其他与产量和总体植物耐受性有直接关联的常量营养物(例如磷(P)和钾(K))进行使用和利用效率的相同计算。
关于主要农作物的NUE仅为30-70％，这由于使用的过量肥料而对于农民的投入费用有直接的负面影响，所述过量的肥料很快会变成生态负担。因此，含硝酸盐的废物代表了具有全球意义的环境问题。硝酸盐渗流入水中引起湖泊、河流和海洋的富营养化(由于导致缺氧和海洋动物区系的破坏的藻类生长而危及水体)。饮用水中的硝酸盐污染可以引起高铁血红蛋白血症，其对婴儿和正在哺乳的母亲特别有害。事实上，农业生产被视为地面和沿岸水体以及饮用水供应的最大的硝酸盐污染者。
植物中肥料使用效率(FUE)的遗传改良可以经由传统育种或经由基因工程来产生。然而，迄今为止，既没有转基因产品，也没有常规育种增强的FUE材料被公布用于商业用途。在关于这点的原因中，最重要的是培育者在最有利的肥料条件下选择他们的原种(elite)系，从而忽略了FUE的改良(产量才是销售的主要驱动力，而不是投入成本的减少)。在关于改善的FUE的转基因解决方案方面的努力由公司例如Monsanto(参见例如Choo等人的美国专利申请20020046419；Edgerton等人的美国专利申请2005010879；和Chomet等人的美国专利申请2006 0179511)、Arcadia Biosciences和Biogemma来进行。
近来，发表了综述，其中概括了通过由学院实验室采取的转基因手段来改善FUE的努力(Good AG等人，Trends Plant Sci.2004 Dec；9(12)597-605)。Yanagisawa和同事(Proc Natl Acad Sci U SA.2004 May 18；101(20)7833-8)报道了鼓舞人心的结果，他们发现，经遗传改造而获得的碳骨架生产增加(2-酮戊二酸，来自GS/GOGAT循环的OG)支持了转基因拟南芥(Arabidopsis)在低氮条件下的生长。因为许多酶参与碳骨架生产，所以所述转基因是激活参与该途径的多个基因的关键转录因子(Dof1)。在低氮条件下，拟南芥转基因植物中的氮含量高约30％。Good等人的美国专利号6,084,153公开了胁迫响应性启动子用于控制丙氨酸胺转移酶(AlaAT)的表达的用途。Good等人进一步公开了，当与对照植物相比较时，转基因卡诺拉油菜植物改善了干旱和氮缺乏耐受性。然而，Yanagisawa等人的Dof1构建体和Good等人的干旱诱导的AlaAT构建体都没有在商业品系中在真实的田间条件下进行评估。因此，结果的经济关联性仍有待证实。
因此，鉴定这样的多核苷酸和多肽具有广泛公认的需要并且将是高度有利的，所述多核苷酸和多肽改善在表达其的转基因植物中的肥料使用/摄取效率，所述转基因植物没有上述局限性。
发明概述 根据本发明的一个方面，提供了核酸构建体，其包含与选自SEQ IDNO68、1、4、5、8、9、11、13、16、19、20、23、24、27、30、32、37、42、49、50、51、53、54、55、56、57、58、64、69、70、73、77、78、79、80、84、86、87、93、94、98、101、102、103、104、105、106、107、108和109的核苷酸序列至少85％同一的核酸序列，和能够指导所述核酸序列在宿主细胞中转录的启动子序列。
根据所述优选实施方案中更进一步的特征，所述核酸序列如SEQID NO68、1、4、5、8、9、11、13、16、19、20、23、24、27、30、32、37、42、49、50、51、53、54、55、56、57、58、64、69、70、73、77、78、79、80、84、86、87、93、94、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、219-767、1317、1318、1319、1320、1321、1322、1323、1324、1325、1326、1327、1328、1329、1330、1331、1332、1333、1334、1335或1336中所示。
根据本发明的另一个方面，提供了分离的多肽，其包含与SEQ IDNO177、110、113、114、117、118、120、122、125、128、129、132、133、136、139、141、146、151、158、159、160、162、163、164、165、166、167、173、178、179、182、186、187、188、189、193、195、196、202、203、207、210、211、212、213、214、215、216、217或218中所示氨基酸序列至少85％同源的氨基酸序列。
根据本发明的另外一个方面，提供了包含外源多核苷酸的植物细胞，所述外源多核苷酸包含编码多肽的核酸序列，所述多肽具有与SEQID NO177、110、113、114、117、118、120、122、125、128、129、132、133、136、139、141、146、151、158、159、160、162、163、164、165、166、167、173、178、179、182、186、187、188、189、193、195、196、202、203、207、210、211、212、213、214、215、216、217或218至少85％同源的氨基酸序列。
根据所述优选实施方案中更进一步的特征，所述植物细胞形成植物的部分。
根据所述优选实施方案中更进一步的特征，所述氨基酸序列如SEQ ID NO177、110、113、114、117、118、120、122、125、128、129、132、133、136、139、141、146、151、158、159、160、162、163、164、165、166、167、173、178、179、182、186、187、188、189、193、195、196、202、203、207、210、211、212、213、214、215、216、217、218、768-1051、1053-1098、1100-1315或1316中所示。
根据本发明的另外一个方面，提供了增加植物对胁迫条件的耐受性的方法，所述方法包括在所述植物中表达编码多肽的外源多核苷酸，所述多肽具有与SEQ ID NO177、110、113、114、117、118、120、122、125、128、129、132、133、136、139、141、146、151、158、159、160、162、163、164、165、166、167、173、178、179、182、186、187、188、189、193、195、196、202、203、207、210、211、212、213、214、215、216、217、218、1341或1343至少85％同源的氨基酸序列，从而增加所述植物对所述胁迫条件的耐受性。
根据本发明的另外一个方面，提供了增加植物的生物量、活力和/或产量的方法，所述方法包括在所述植物中表达编码多肽的外源多核苷酸，所述多肽具有与SEQ ID NO177、110、113、114、117、118、120、122、125、128、129、132、133、136、139、141、146、151、158、159、160、162、163、164、165、166、167、173、178、179、182、186、187、188、189、193、195、196、202、203、207、210、211、212、213、214、215、216、217、218、1341或1343至少85％同源的氨基酸序列，从而增加所述植物的生物量、活力和/或产量。
根据本发明的另外一个方面，提供了增加植物的肥料使用效率和/或摄取的方法，所述方法包括在所述植物中表达编码多肽的外源多核苷酸，所述多肽具有与SEQ ID NO177、110、113、114、117、118、120、122、125、128、129、132、133、136、139、141、146、151、158、159、160、162、163、164、165、166、167、173、178、179、182、186、187、188、189、193、195、196、202、203、207、210、211、212、213、214、215、216、217、218、1341或1343至少85％同源的氨基酸序列，从而增加所述植物的肥料使用效率和/或摄取。
根据所述优选实施方案中更进一步的特征，所述表达通过下述来实现 (a)用所述外源多核苷酸转化所述植物的细胞； (b)从所述细胞产生成熟植物；和 (c)在适合于在所述成熟植物中表达所述外源多核苷酸的条件下培养所述成熟植物。
根据所述优选实施方案中更进一步的特征，所述转化通过将核酸构建体引入所述植物细胞中来实现，所述核酸构建体包含所述外源多核苷酸和至少一种能够指导所述外源多核苷酸在所述植物细胞中转录的启动子。
根据所述优选实施方案中更进一步的特征，所述至少一种启动子是组成型启动子。
根据下述本发明的优选实施方案中进一步的特征，所述启动子是组成型启动子。
根据所述优选实施方案中更进一步的特征，所述组成型启动子是CaMV 35S启动子。
根据所述优选实施方案中更进一步的特征，所述启动子是诱导型启动子。
根据所述优选实施方案中更进一步的特征，所述诱导型启动子是非生物胁迫诱导型启动子。
根据所述优选实施方案中更进一步的特征，所述启动子是组织特异性启动子。
根据所述优选实施方案中更进一步的特征，所述组织是根组织。
根据所述优选实施方案中更进一步的特征，所述宿主细胞是植物细胞。
根据所述优选实施方案中更进一步的特征，所述植物细胞形成双子叶植物细胞的部分。
根据所述优选实施方案中更进一步的特征，所述植物细胞形成单子叶植物细胞的部分。
根据所述优选实施方案中更进一步的特征，所述胁迫条件是非生物胁迫。
根据所述优选实施方案中更进一步的特征，所述非生物胁迫选自盐度、干旱、低温、高温、重金属毒性、无氧生活、渗压剂和营养物缺乏。
根据所述优选实施方案中更进一步的特征，所述营养物是氮。
根据所述优选实施方案中更进一步的特征，所述植物是双子叶植物。
根据所述优选实施方案中更进一步的特征，所述植物是单子叶植物。
根据所述优选实施方案中更进一步的特征，所述多核苷酸包含选自SEQ ID NO68、1、4、5、8、9、11、13、16、19、20、23、24、27、30、32、37、42、49、50、51、53、54、55、56、57、58、64、69、70、73、77、78、79、80、84、86、87、93、94、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、219-767、1317、1318、1319、1320、1321、1322、1323、1324、1325、1326、1327、1328、1329、1330、1331、1332、1333、1334、1335、1336、1340或1342的核酸序列。
根据所述优选实施方案中更进一步的特征，所述氨基酸序列如SEQ ID NO177、110、113、114、117、118、120、122、125、128、129、132、133、136、139、141、146、151、158、159、160、162、163、164、165、166、167、173、178、179、182、186、187、188、189、193、195、196、202、203、207、210、211、212、213、214、215、216、217、218、768-1051、1053-1098、1100-1316、1341或1343中所示。
根据所述优选实施方案中更进一步的特征，所述条件是非生物胁迫条件。
根据所述优选实施方案中更进一步的特征，所述条件是肥料缺乏条件。
根据本发明的另外一个方面，提供了用于灌溉的方法，所述方法包括 (a)在土壤上或土壤中放置滴灌系统，以获得在X和Y方向上彼此相隔20-40cm分布的灌溉孔；和 (b)以0.5-2升水/小时的灌溉速率通过每个所述灌溉孔进行连续灌溉。
根据本发明的一个进一步的方面，提供了用于模拟干旱条件的灌溉系统，其包含 (i)具有在X和Y方向上彼此相隔20-40cm分布的灌溉孔的滴灌系统；和 (ii)用于以0.5-2升水/小时通过每个所述灌溉孔进行连续灌溉的水供应和控制系统。
本发明通过提供这样的多核苷酸和多肽成功地解决了目前已知布置的缺点，所述多核苷酸和多肽在表达其的转基因植物中改善肥料使用/摄取效率。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。尽管可以在本发明的实践和测试中使用与本文描述的那些相似或等价的方法和材料，但下文描述了合适的方法和材料。在冲突的情况下，以本专利说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实施例仅是举例说明性的而不意欲是限制性的。
附图简述 在此仅作为例子通过参考附图来描述本发明。在现在详细地具体参考附图的情况下，应当强调，所显示的细节仅作为例子并且是为了本发明的优选实施方案的举例说明性讨论，并且为提供被认为是本发明的原则和概念方面的最有用和容易理解的描述而呈现。在这点上，不试图比对于本发明的基本理解来说所需的更详细地显示本发明的结构细节，使用附图进行的描述使得下述内容对于本领域技术人员来说是显而易见的本发明的几种形式如何能够在实践中具体体现。
在附图中

图1A是示意性的图解，描述了干旱中植物根系的发育。不足的土壤湿度诱导较深根系的形成。该图改编自JE Weaver[RootDevelopment of Field Crops.McGraw Hill Inc.，New York，第291页(1926)]。
图1B是示意性的图示，其显示了被选择用于改善NUE性状的生物学策略以及所述策略向在计算机数据挖掘(computational datamining)期间执行的查询的变换。
图2A-D显示了FUE_1的数字化表达。
图3A-D是曲线图，显示了作为土壤中的氮含量的函数的对照基因(氮转运蛋白和谷氨酰胺合酶)的表达。植物在10升罐中生长，使用浓度渐增的NH4NO3(0.005、0.05、0.5和5mM)或KNO3(0.01、0.1、1或5mM)。植物生长约30天，并将组织在液氮中进行速冻。从组织中提取RNA，并随后用DNA酶进行处理。将RNA进行逆转录，并用于使用实时PCR的定量测定法。对于标准化，将每个点处的表达除以4个持家基因的表达的几何平均值，如实施例2中所述的。显示的结果是标准化的表达和于所检查的最高浓度(5mM NH4NO3或5mM KNO3)时测量的表达水平之间的比率。
图4A-K是曲线图，显示了与氮利用率(availability)相关的本发明多核苷酸序列的表达。
图5A-E是曲线图，显示了与氮利用率反相关的本发明多核苷酸序列的表达。
图6是用于从数字图像中对植物莲座型叶丛面积进行定量的技术的示意性逐步图示。处理步骤过滤掉个体植物的绿色部分。在指定独个ROIs(目的区(Region of Interest))后，计算由莲座型叶丛区域覆盖的面积并输出至工作表。
图7A-B是照片，显示了本发明的多核苷酸增加氮使用效率的能力。图7A是在TT105启动子下表达FUE_504(SEQ ID NO108)的转基因-T1植物。图7B是在35S启动子下表达FUE_43(SEQ ID NO70)的1个代表性转基因事件。植物在非常受限的氮条件(0.05和0.2mM结合无机氮(combined inorganic nitrogen))下生长。对照植物(在相同启动子下表达报道基因的植物或非转基因植物)类似地进行处理。将小植株大小方面的众所周知的差异变换成所测量的小植株鲜重方面的显著差异。
图8是照片，显示了来自表达FUE_34_Evo(SEQ ID NO54)的3个独立转基因事件的转基因植物。如通过三盲测定法(triple blindassay)所测定的，该植物在每个结节处显示出令人印象深刻的分枝。来自该植物的根系也是高度分枝和紧凑的(未显示)。
图9显示了表达FUE_40(也称为FUE6/40，SEQ ID NO11)的植物的5个独立转基因事件。明显值得注意的是，花茎是异常笔直和不易弯曲的。此外，可以计数到异常高数目的长角果。因此，表达FUE_40的转基因植物是非常多产的。
图10依照本发明的教导的灌溉系统的图解。
优选实施方案的描述 本发明涉及分离的多肽、编码其的多核苷酸、表达其的转基因植物和使用其的方法。具体而言，本发明可以用于增加转基因植物的肥料使用效率和胁迫抗性以及生物量、活力和产量。
参考附图和随附的说明可以更好地理解本发明的原则和操作。
在详细解释至少一个本发明的实施方案前，应当理解，本发明在其应用方面不限制于下述说明书中所示的或由实施例例示的细节。本发明能够是其他实施方案或者能够以各种方式来实践或施行。此外，应当理解，本文所使用的措辞和术语用于描述目的，并且不应被视为限制性的。
由于氮(N)肥成本的增加和农作物植物生产的利润处于风险中，因此科学家面临开发改善N使用效率(NUE)的策略的挑战。因此，施肥不足或施肥过多导致利润丧失。较低的N施用率导致减少的生物量，如可以由减少的分蘖、大小、差的籽粒灌浆、减少的产量以及低的氨基酸和蛋白质含量所证明的。备选地，氮的过量施用可以导致减少的产量、更高的投入成本和增加的对环境的危险。
在使本发明变为实际的同时，本发明人通过艰苦的生物信息学分析和实验揭示了多核苷酸序列和由其编码的多肽，其可以用于产生转基因植物，所述转基因植物具有改善的肥料使用效率、胁迫耐受性、营养价值(例如，氨基酸和蛋白质含量)、生物量、产量和/或活力。
如在下文和随后的实施例部分中所举例说明的，基于几个标准来选择玉米多核苷酸序列(参见随后的实施例部分的实施例1)。这些包括在根尖处，特别是在水分胁迫的根(例如，干旱)中高水平的计算出的数字化表达。关于上述多核苷酸序列的第二次过滤基于它们的直向同源序列(即，双子叶植物或其他单子叶植物物种)的数字化表达。选择出显示与玉米基因(例如受试的经胁迫处理的植物的根文库)相似的数字化表达的直向同源基因。数据挖掘和注释工具用于过滤出可能对细胞代谢具有广泛影响的基因。例如，选择出可以修饰根构造(architecture)、增加氮贮存能力、改善氮同化过程和增强滞绿(stay-green)性状的基因。最终选择出那些基因用于分子验证(参见实施例3和9)。应用于鉴定本发明的多核苷酸序列的计算机过滤的示意性图示呈现于图1B中，并且其仅为了举例说明而提供。
如此鉴定的序列通过实验进行验证。如实施例6-11中所示，已证明表达本发明的核酸序列的转基因植物具有增加的肥料使用/摄取效率、对非生物胁迫的耐受性、生物量和产量。这些结果强烈地支持本发明方法的稳健性，并证实这些基因在农业中的用途。
因此，根据本发明的一个方面提供了核酸构建体，其包含与选自SEQ ID NO68、1、4、5、8、9、11、13、16、19、20、23、24、27、30、32、37、42、49、50、51、53、54、55、56、57、58、64、69、70、73、77、78、79、80、84、86、87、93、94、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、1340和1342的核苷酸序列至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更多例如100％同一的核酸序列。
核酸序列可以编码多肽序列，所述多肽序列包含与SEQ ID NO 177、110、113、114、117、118、120、122、125、128、129、132、133、136、139、141、146、151、158、159、160、162、163、164、165、166、167、173、178、179、182、186、187、188、189、193、195、196、202、203、207、210、211、212、213、214、215、216、217、218、1341或1343至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更多例如100％同源的氨基酸序列。
同源性(例如同源性百分比)可以使用任何同源性比较软件来测定，所述同源性比较软件包括例如国立生物技术信息中心(NationalCenter of Biotechnology Information，NCBI)的BlastP软件，例如通过使用缺省参数。
同一性(例如同源性百分比)可以使用任何同源性比较软件来测定，所述同源性比较软件包括例如国立生物技术信息中心的BlastP软件，例如通过使用缺省参数。
根据本发明的这个方面的一个优选实施方案，分离的多核苷酸如SEQ ID NO68、1、4、5、8、9、11、13、16、19、20、23、24、27、30、32、37、42、49、50、51、53、54、55、56、57、58、64、69、70、73、77、78、79、80、84、86、87、93、94、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、219-767、1317、1318、1319、1320、1321、1322、1323、1324、1325、1326、1327、1328、1329、1330、1331、1332、1333、1334、1335或1336中所示。
本发明的核酸序列(在本文中也称为分离的多核苷酸)指单或双链核酸序列，其是分离的且以RNA序列、互补多核苷酸序列(cDNA)、基因组多核苷酸序列和/或复合的多核苷酸序列(例如，上述的组合)的形式提供。
如本文所使用的，短语“互补多核苷酸序列”指通过使用逆转录酶或任何其他RNA依赖性DNA聚合酶而从信使RNA的逆转录产生的序列。此类序列随后可以通过使用DNA依赖性DNA聚合酶而在体内或体外进行扩增。
如本文所使用的，短语“基因组多核苷酸序列”指衍生(分离)自染色体的序列，因此它代表了染色体的连续的部分。
如本文所使用的，短语“复合的多核苷酸序列”指这样的序列，其是至少部分地互补的和至少部分地基因组的。复合的序列可以包括编码本发明的多肽所需的某些外显子序列，以及插入其间的某些内含子序列。内含子序列可以是任何来源的，包括其他基因，并且通常将包括保守的剪接信号序列。此类内含子序列可以进一步包括顺式作用表达调控元件。
本发明的多肽的核酸序列可以就植物表达进行优化。此类优化的序列在SEQ ID NO1317、1319、1320、1321、1322、1324、1325、1326、1327、1328、1329、1330、1331、1332、1333、1334、1335和1336中提供。此类序列修饰的例子包括但不限于，更紧密地接近在目的植物物种中通常发现的那种的经改变的G/C含量，和去除在所述植物物种中非典型地发现的密码子(通常被称为密码子优化)。
短语“密码子优化”指选择合适的DNA核苷酸用于在结构基因或其片段内使用，所述DNA核苷酸接近目的植物内的密码子使用。因此，优化的基因或核酸序列指这样的基因，在所述基因中天然或天然存在的基因的核苷酸序列已进行修饰，以便利用在植物中统计学上优选的或统计学上偏好的密码子。核苷酸序列通常在DNA水平上进行检查，并且使用任何合适的程序来确定对于在植物物种中的表达来说优化的编码区，例如如Sardana等人(1996，Plant Cell Reports 15677-681)中所描述的。在这种方法中，密码子使用的标准差(密码子使用偏倚的量度)可以通过下述方式来计算首先找到该天然基因的每种密码子的使用相对于高度表达的植物基因的密码子使用的平方比例偏差(squared proportional deviation)，随后计算平均方差(averagesquared deviation)。使用的公式为1SDCU＝n＝1N[(Xn-Yn)/Yn]2/N，其中Xn指在高度表达的植物基因中密码子n的使用频率，其中Yn指在目的基因中密码子n的使用频率，和N指在目的基因中的密码子总数目。使用Murray等人(1989，Nuc Acids Res.17477-498)的数据，汇编出来自双子叶植物的高度表达基因的密码子使用的表格。
依照关于特定植物细胞类型的优选密码子使用来优化核酸序列的一种方法基于密码子优化表的直接使用，而不进行任何额外的统计学计算，所述密码子优化表例如为通过日本的NIAS(NationalInstitute of Agrobiological Sciences)DNA库在密码子使用数据库(Codon Usage Database)中在线提供的那些(http://www.kazusa.or.jp/codon/)。该密码子使用数据库包含用于许多不同物种的密码子使用表，其中每个密码子使用表基于在Genbank中存在的数据通过统计学方法来确定。
通过使用上述表来确定在特定物种(例如，稻)中每种氨基酸的最优选或最偏爱的密码子，编码目的蛋白质的天然存在的核苷酸序列可以是针对那种特定植物物种进行优化的密码子。这通过序列方式来完成关于氨基酸，用统计学上更偏爱的相应密码子替换在特定物种基因组中可能具有低统计学发生率的密码子。然而，可以选择一种或多种较不偏好的密码子，以删除现有的限制位点，以在潜在有用的接头处形成新的限制位点(5′和3′末端以添加信号肽或末端盒，可以用于切割片段并将片段剪接在一起以产生正确的全长序列的内部位点)，或消除可能负面影响mRNA稳定性或表达的核苷酸序列。
天然存在的编码核苷酸序列可以在任何修饰前已包含相应于在特定植物物种中的统计学上偏好的密码子的许多密码子。因此，天然核苷酸序列的密码子优化可以包含确定天然核苷酸序列内的哪些密码子就特定植物而言不是统计学上偏好的，并且依照特定植物的密码子使用表来修饰这些密码子，以产生密码子优化的衍生物。经修饰的核苷酸序列可以就植物密码子使用来说是全部或部分优化的，条件是由经修饰的核苷酸序列编码的蛋白质以比由相应的天然存在或天然的基因编码的蛋白质更高的水平产生。通过改变密码子使用来构建合成基因在例如PCT专利申请93/07278中得到描述。
因此，本发明包括上文描述的核酸序列；其片段，可与之杂交的序列，与其同源的序列，与其直向同源的序列，以不同的密码子使用编码相似多肽的序列，特征在于突变例如一个或多个核苷酸的删除、插入或置换(天然存在的，或者随机地或以靶向方式人工诱导的)的经改变的序列。
本发明的核酸序列可以编码先前未表征的多肽。
因此，本发明提供了这样的多肽，其具有与选自SEQ ID NO177、110、113、114、117、118、120、122、125、128、129、132、133、136、139、141、146、151、158、159、160、162、163、164、165、166、167、173、178、179、182、186、187、188、189、193、195、196、202、203、207、210、211、212、213、214、215、216、217、218、1341或1343的氨基酸序列至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％，或更多例如100％同源的氨基酸序列。
根据本发明的这个方面的一个实施方案，分离的多肽包含选自177、110、113、114、117、118、120、122、125、128、129、132、133、136、139、141、146、151、158、159、160、162、163、164、165、166、167、173、178、179、182、186、187、188、189、193、195、196、202、203、207、210、211、212、213、214、215、216、217、218、768-1051、1053-1098、1100-1315、1316、1341或1343的氨基酸序列。
本发明还包括与上述多肽同源或直向同源的序列，上述多肽的片段，以及具有突变例如一个或多个氨基酸的删除、插入或置换(天然存在的，或者随机地或以靶向方式人工诱导的)的多肽。
本发明的多核苷酸和多肽用于植物表达。
如本文所使用的，术语“植物”包含整株植物、植物的祖先和后代以及植物部分，包括种子、枝条、茎、根(包括块茎)，以及植物细胞、组织和器官。因此，术语“植物”还包含悬浮培养物、胚胎、分生组织区域、愈伤组织、叶、配子体、孢子体、花粉和小孢子。在本发明的方法中特别有用的植物包括属于绿色植物(Viridiplantae)总科的所有植物，特别是具有商业价值的单子叶植物和双子叶植物，包括选自下述非限制性列表的饲料或草料用豆科植物、观赏植物、食物农作物、树或灌木金合欢属物种(Acacia spp.)、槭属物种(Acerspp.)、猕猴桃属物种(Actinidia spp.)、七叶树属物种(Aesculusspp.)、新西兰贝壳杉(Agathis australis)、Albizia amara、三色桫椤(Alsophila tricolor)、须芒草属物种(Andropogon spp.)、落花生属物种(Arachis spp)、槟榔(Areca catechu)、Asteliafragrans、鹰嘴紫云英(Astraga luscicer)、多小叶红苏木(Baikiaeaplurijuga)、桦属物种(Betula spp.)、芸苔属物种(Brassica spp.)、木榄(Bruguiera gymnorrhiza)、红紫丁香(Burkea africana)、紫铆(Butea frondosa)、Cadaba farinosa、朱缨花属物种(Calliandraspp)、茶(Camel lasinensis)、美人蕉(Canna indica)、辣椒属物种(Capsicum spp.)、决明属物种(Cassia spp.)、距瓣豆(Centroema pubescens)、木瓜属物种(Chaenomeles spp.)、肉桂(Cinnamomum cassia)、小果咖啡(Coffea arabica)、Colophospermum mopane、绣球小冠花(Coronillia varia)、Cotoneaster serotina、山楂属物种(Crataegus spp.)、甜瓜属物种(Cucumis spp.)、柏木属物种(Cupressus spp.)、银蕨(Cyatheadealbata)、榅桲(Cydonia oblonga)、Ciyptomeria laponica、香茅属物种(Cymbopogon spp.)、Cynthea dealbata、榅桲(Cydoniaoblonga)、Dalbergia monetaria、大叶骨碎补(Davaliladivaricata)、山蚂蝗属物种(Desmodium spp.)、粗糙蚌壳蕨(Dicksonia squarosa)、Diheteropogon amplectens、迪奥豆属物种(Dioclea spp)、镰扁豆属物种(Dolichos spp.)、Doiycnium rectum、Echinochloa pyramidalis、Ehrartiaspp.、穇子(Eleusinecoracana)、画眉草属物种(Era grestis spp.)、刺桐属物种(Erythrinaspp.)、桉属物种(Eucalyptus spp)、Euclea schimpen、Eulaliavillosa、荞麦属物种(Fagopyrum spp.)、Felloa sellowiana、草莓属物种(Fragaria spp.)、千斤拔属(Flemingia spp.)、Freycinetiabanksii、东亚老鹳草(Geraniu mthunbergi)、银杏(Ginkgo biloba)、野大豆(Glycine javanica)、墨西哥丁香属物种(Gliricidia spp.)、陆地棉(Gossypium hirsutum)、银桦属物种(Grevillea spp.)、鞘籽古夷布提木(Guibourtia coleosperma)、岩黄芪属物种(Hedysarum spp.)、牛鞭草(Hemarthia altissima)、黄茅(Heteropogon contortus)、大麦(Hordeum vulgare)、红苞茅(Hyparrhenia rufa)、小连翘(Hypericum erectum)、Hypertheliadissoluta、异花木蓝(Indigo incarnata)、鸢尾属物种(Iris spp.)、麻疯树(Jatropha curcas)、Leptarrhena pyrolifolia、胡枝子属物种(Lespediza spp.)、莴苣属物种(Lettuca spp.)、银合欢(Leucaenaleucocephala)、Loudetia simplex、Lotonus bainesi、百脉根属物种(Lotus spp.)、Macrotyloma axifiare、苹果属物种(Malus spp.)、木薯(Maniho tesculenta)、紫苜蓿(Medicago sativa)、水杉(Metasequoia glyptostroboides)、香蕉(Musa sapientum)、烟草属物种(Nicotianum spp.)、驴食豆属物种(Onobtychis spp.)、鸟足豆属物种(Ornithopus spp.)、稻属物种(Oryza spp.)、Peltophorum african urn、狼尾草属物种(Pennisetum spp.)、Perseagratissima、碧冬茄属物种(Petunia spp.)、菜豆属物种(Phaseolusspp.)、槟榔竹(Phoenix canariensis)、新西兰剑麻(Phormiumcookianum)、石楠属物种(Photinia spp.)、白云杉(Picea glauca)、松属物种(Pinus spp.)、豌豆(Pisum sativum)、新西兰罗汉松(Podocarpus totara)、Pogonarthria flecki、Pogonarthriasquarrosa、杨属物种(Populus spp.)、瓜叶牧豆(Prosopiscineraria)、花旗松(Pseudotsuga menziesi)、Pterolobiumstellatum、西洋梨(Pyrus communis)、栎属物种(Quercus spp.)、厚叶石斑木(Rhaphiolepsis umbellata)、美味棒花棕(Rhopalostylissapida)、Rhu.s natalensis、欧洲醋栗(Ribes grossularia)、茶藨子属物种(Ribes spp.)、刺槐(Robinia pseudoacacia)、蔷薇属物种(Rosa spp.)、悬钩子属物种(Rubus spp.)、柳属物种(Salixspp.)、红裂稃草(Schyzachyrium sanguineurn)、金松(Sciadopitysverticillata)、北美红杉(Sequoia sempen′irens)、巨杉(Sequoiadendron giganteum)、两色高粱(Sorghum bicolor)、菠菜属物种(Spinacia spp.)、Sporobolus fimbriatus、Stiburusalopecuroides、矮柱花草(Stylosanthos humilis)、葫芦茶属物种(Tadehagi spp)、落羽杉(Taxodium distichum)、阿拉伯黄背草(Themeda triandra)、三叶草属物种(Trifollum spp.)、小麦属物种(Triticum spp.)、异叶铁杉(Tsuga heterophylla)、越桔属物种(Vaccinium spp.)、蚕豆属物种(Vicia spp.)、葡萄(Vitisvinifera)、Watsonia pyramidata、马蹄莲(Zantedeschiaaethiopica)、玉蜀黍(Zea mays)、苋属植物、洋蓟、天门冬、球花甘蓝、抱子甘蓝、卷心菜、卡诺拉油菜(canola)、胡萝卜、花椰菜、芹菜、散叶甘蓝(collard greens)、亚麻、羽衣甘蓝、兵豆、油用油菜(oilseed rape)、咖啡黄葵、洋葱、马铃薯、稻、大豆、稻草、甜菜、甘蔗、向日葵、番茄、南瓜、茶、树。备选地，可以使用藻类及其他非绿色植物。
在植物内表达本发明的外源多核苷酸可以通过下述方式来实现用外源多核苷酸转化植物的一种或多种细胞，随后从转化的细胞中产生成熟植物，并且在适合于在成熟植物内表达外源多核苷酸的条件下培养成熟植物。
优选地，转化通过将核酸构建体引入植物细胞中来实现，所述核酸构建体包含本发明的外源多核苷酸和至少一种能够指导外源多核苷酸在植物细胞中转录的启动子。合适的转化方法的更多细节在下文提供。
如本文所使用的，术语“启动子”指位于基因转录起始位点上游的DNA区域，RNA聚合酶与所述DNA区域结合以起始RNA的转录。启动子控制基因在何处(例如，植物的哪个部分，动物内的哪个器官，等等)和/或何时(例如，在生物体生存期中的哪个阶段或状况)表达。
任何合适的启动子序列可以被本发明的核酸构建体使用。下述类型的启动子是用于过表达所选基因的启动子的非限制性例子通用启动子、根特异性启动子、根尖特异性启动子、干旱诱导的根启动子、生物胁迫诱导的启动子、非生物胁迫诱导的启动子、氮诱导的启动子、铵或硝酸盐诱导的启动子、磷肥诱导的启动子、叶特异性启动子、诱导型启动子、组成型启动子、具有2个或更多个上述特征的启动子、或其他新型启动子。
启动子的选择很大程度上基于目的表型，并且通过如下因素来确定，例如组织(例如，种子、果实、根、花粉、维管组织、花、心皮等)、可诱导性(例如，对创伤、热、冷、干旱、光、病原体等作出响应)、时机、发育阶段等。众多已知的启动子已得到表征，并且可以有利地用于促进本发明的多核苷酸在目的转基因植物或细胞中表达。然而，应当采取措施以选择将会介导转基因的所需表达水平的启动子，以便避免再分配过量能源，这可能影响最终产量、强度、质量和倒伏以及叶病原体的发生率。这还应从经济观点进行审视。
合适的组成型启动子包括例如，CaMV35S启动子(SEQ ID NO1337；Odell等人，Nature 313810-812，1985)；拟南芥At6669启动子(SEQ ID NO1514，PCT No WO2004/104162)；TT105(SEQ IDNO1339，PCT NO.WO2004/081173)；玉米Ubi 1(Christensen等人，Plant Sol.Biol.18675-689，1992)；稻肌动蛋白(McElroy等人，Plant Cell 2163-171，1990)；pEMU(Last等人，Theor.Appl.Genet.81581-588，1991)；和合成的Super MAS(Ni等人，The PlantJournal 7661-76，1995)。其他组成型启动子包括美国专利号5,659,026；5,608,149；5.608,144；5,604,121；5.569,5975.466,785；5,399,680；5,268,463；和5,608,142中的那些。
合适的组织特异性启动子包括但不限于，叶特异性启动子，例如由下述参考文献描述的Yamamoto等人，Plant J.12255-265，1997；Kwon等人，Plant Physiol.105357-67，1994；Yamamoto等人，Plant Cell Physiol.35773-778，1994；Gotor等人，Plant J.3509-18，1993；Orozco等人，Plant Mol.Biol.231129-1138，1993；和Matsuoka等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 909586-9590，1993。特别优选的是根启动子，例如ROOTP启动子[SEQ ID NO1338；基因ATXTH19的上游区(AT4G30290，木葡聚糖内转葡糖基酶(Xyloglucan endotransglucosylase)/水解酶19，在Vissenberg K，等人Plant Cell Physiol.2005Jan；46(1)192-200中描述]。
已知各种植物基因启动子响应于环境的、激素的、化学轭、发育的信号并且以组织活性方式调节基因表达。例子为，种子特异性启动子的(例如美国专利号5,773,697中描述的油菜籽蛋白、菜豆蛋白或DC3启动子)，在果实成熟期间有活性的果实特异性启动子，例如dru1启动子(美国专利号5,783,393)或2A11启动子(美国专利号4,943,674)和番茄多聚半乳糖醛酸酶启动子(Bird等人(1988)PlantMol.Biol.11651-662)，根特异性启动子，例如ARSK1，和在美国专利号5,618,988、5,837,848和5,905,186中公开的那些，表皮特异性启动子，包括CUT1(Kunst等人(1999)Biochem.Soc.Tians.28651-654)，花粉活性启动子例如PTA29、PTA26和PTA13(美国专利号5,792,929)，在维管组织中有活性的启动子(Ringli和Keller(1998)Plant Mol.Biol.37977-988)，花特异性的(Kaiser等人(1995)Plant Mol.Biol.28231-243)，花粉(Baerson等人(1994)Plant Mol.Biol.261947-1959)，心皮(Ohl等人(1990)Plant Cell 2837-848)，花粉和胚珠(Baerson等人(1993)PlantMol.Biol.22255-267)，生长素诱导型启动子(例如van der Kop等人(1999)Plant Mol.Biol.39979-990或Baumann等人(1999)Plant Cell 11323-334中描述的启动子)，细胞分裂素诱导型启动子(Guevara-Garcia(1998)Plant Mol.Biol.38743-753)，响应赤霉素的启动子(Shi等人(1998)Plant Mol.Biol.381053-1060，Willmott等人(1998)Plant Mol.Biol.38817-825)等等。另外的启动子是响应下述因素而引起表达的那些热(Ainley等人(1993)Plant Mol.Biol.2213-23)，光(例如，Kuhlemeier等人(1989)Plant Cell1471-478中描述的豌豆rbcS-3A启动子，以及Schaffier和Sheen(1991)Plant Cell 3997-1012中描述的玉米rbcS启动子)，创伤(例如，Siebertz等人(1989)Plant Cell 1961-968中描述的wun1)，病原体(例如Buchel等人(1999)Plant Mol.Biol.40387-396中描述的PR-1启动子，和Manners等人(1998)Plant Mol.Biol.381071-1080中描述的PDF1.2启动子)，和化学药品例如茉莉酮酸甲酯或水杨酸(Gatz(1997)Annu.Rev.Plant Physiol.PlantMol.Biol.4889-108)。此外，表达的时机可以通过使用诸如在衰老时(Gan和Amasino(1995)Science 2701986-1988)；或在种子发育晚期时(Odell等人(1994)Plant Physiol.106447-458)起作用的那些启动子的启动子来控制。
启动子的其他例子是SUC2启动子(Truernit和Sauer，Planta.(1995)196564-70)，和胁迫诱导型启动子例如RD29A(Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki K.Plant Cell(1994)6251-264)，来自PlantProm数据库的启动子(Shahmuradov等人Nucleic Acids Res.(2003)31114-7)，稻CatB启动子(Iwamoto等人Plant Physiol Biochem.(2004)42241-9)，磷酸转运蛋白基因家族的根特异性和磷酸盐缺乏诱导型大麦启动子(HvPht1；1和HvPht1；2)(Schunmann等人(2004)；55855-65)，在专利号WO 2004/081173、专利号US 5633363、专利号WO 2000/15662、专利号WO 2004/013169、专利号US 2005/010974、专利号WO2005/035770、专利号US 2001/0047525、专利号US 5837848、专利号US 6018099等中举例说明的组织特异性和组成型启动子。
本发明的核酸构建体优选地进一步包含合适的选择标记和/或复制起点。优选地，所使用的核酸构建体是穿梭载体，其可以在大肠杆菌(其中构建体包含合适的选择标记和复制起点)中繁殖并且与细胞中的繁殖相容。根据本发明的构建体可以是例如质粒、杆粒、噬菌粒、粘粒、噬菌体、病毒或人工染色体。
本发明的核酸构建体可以用于稳定地或瞬时地转化植物细胞。在稳定的转化中，本发明的外源多核苷酸被整合到植物基因组中，如此它代表了稳定的和经遗传的性状。在瞬时的转化中，外源多核苷酸由转化的细胞表达，但它不整合到基因组中，如此它代表了瞬时性状。
存在用于将外源基因引入单子叶植物和双子叶植物中的各种方法(Potrykus，I.，Annu.Rev.Plant.Physiol.，Plant.Mol.Biol.(1991)42205-225；Shimamoto等人，Nature(1989)338274-276)。
引起外源DNA稳定整合到植物基因组DNA中的原则方法包括2种主要方法 (i)土壤杆菌(Agrobacterium)介导的基因转移Klee等人(1987)Annu.Rev.Plant Physiol.38467-486；Klee和Rogersin Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants，第6卷，Molecular Biology of Plant Nuclear Genes，由Schell，J.和Vasil，L.K.编辑，Academic Publishers，San Diego，Calif.(1989)第2-25页；Gatenby，in Plant Biotechnology，由Kung，S.和Arntzen，C.J.编辑，Butterworth Publishers，Boston，Mass.(1989)第93-112页。
(ii)直接DNA摄取Paszkowski等人，in Cell Culture andSomatic Cell Genetics of Plants，第6卷，Molecular Biology ofPlant Nuclear Genes，由Schell，J.和Vasil，L.K.编辑，AcademicPublishers，San Diego，Calif.(1989)第52-68卷；包括用于将DNA直接摄取到原生质体中的方法，Toriyama，K.等人(1988)Bio/Technology 61072-1074。由植物细胞的短暂电休克诱导的DNA摄取Zhang等人Plant Cell Rep.(1988)7379-384，Fromm等人Nature(1986)319791-793。通过粒子轰击将DNA注射到植物细胞或组织内，Klein等人Bio/Technology(1988)6559-563；McCabe等人Bio/Technology(1988)6923-926；Sanford，Physiol.Plant.(1990)79206-209；通过使用微量移液管(micropipette)系统Neuhaus等人，Theor.Appl.Genet.(1987)7530-36；Neuhaus和Spangenberg，Physiol.Plant.(1990)79213-217；细胞培养物、胚胎或愈伤组织的玻璃纤维或碳化硅须晶转化，美国专利号5,464,765；或通过直接使DNA与正在萌发的花粉一起温育，DeWet等人，Experimental Manipulation of Ovule Tissue，编辑Chapman，G.P.和Mantell，S.H.和Daniels，W.Longman，London，(1985)第197-209页；和Ohta，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)83715-719。
土壤杆菌系统包括使用包含指定DNA区段的质粒载体，所述指定DNA区段整合到植物基因组DNA中。植物组织的接种方法依植物物种和土壤杆菌递送系统而变化。广泛使用的方法是叶盘操作程序，其可以用任何为起始全植物分化提供良好来源的组织外植体来进行。Horsch等人，Plant Molecular Biology Manual A5，Kluwer AcademicPublishers，Dordrecht(1988)第1-9页。补充的方法采用与真空渗入相组合的土壤杆菌递送系统。土壤杆菌系统在转基因双子叶植物的制备中特别可行。
存在直接将DNA转移到植物细胞中的各种方法。在电穿孔中，使原生质体短暂暴露于强电场。在显微注射中，使用非常小的微量移液管直接将DNA机械注射到细胞内。在微粒轰击中，将DNA吸附在微粒例如硫酸镁晶体或钨颗粒上，并对微粒进行物理加速从而进入细胞或植物组织中。
稳定转化后，进行植物繁殖。植物繁殖的最常见方法是通过种子。然而，通过种子繁殖的再生具有这样的缺点，即由于杂合性而在农作物中缺乏一致性，因为种子根据由孟德尔法则控制的遗传方差(genetic variances)而由植物产生。基本上，每个种子在遗传上都是不同的，并且每个种子将伴随其自身特异的性状而生长。因此，优选的是，产生转化的植物，从而使得再生的植物具有与亲本转基因植物相同的性状和特征。因此，优选的是，转化的植物通过微繁殖法(micropropagation)进行再生，所述微繁殖提供了转化的植物的快速且一致的繁殖。
微繁殖法是从单个组织块生长出新一代植物的方法，所述单个组织块已从所选亲本植物或栽培品种上切离。这种方法允许大量繁殖具有表达融合蛋白的优选组织的植物。所产生的新一代植物在遗传上等同于原始植物，并且具有原始植物的所有特征。微繁殖法允许在短时间段中大量产生优质植物材料，并且提供以保留原始转基因或转化植物的特征的方式快速增殖所选栽培品种。对植物进行克隆的优点是植物增殖的速度以及所产生的植物的品质和一致性。
微繁殖法是需要在阶段之间改变培养基或生长条件的多阶段操作程序。因此，微繁殖方法涉及4个基本阶段阶段1，最初的组织培养；阶段2，组织培养物增殖；阶段3，分化和植物形成；和阶段4，温室培养和锻炼(hardening)。在阶段1(最初的组织培养)期间，建立组织培养物并证实不含污染物。在阶段2期间，增殖最初的组织培养物直至产生足够数目的组织样品以达到生产目的。在阶段3期间，将在阶段2中生长的组织样品分开并生长为个体小植株。在阶段4时，将转化的小植株转移至温室以进行锻炼，在其中逐渐增加植物对光的耐受性从而使得它可以在自然环境中生长。
优选地，就目的性状(例如，改善的FUE、胁迫耐受性等)进一步选择如上所述产生的成熟的转化植物。此类筛选测定法的例子在下文和随后的实施例部分中提供。因此，例如，可以在正常或胁迫条件下就改善的营养价值(例如改善的油、氨基酸和/或蛋白质含量，以及N含量本身)来筛选转基因植物，如下文将进一步描述的。备选地或另外地，使转化和未转化的(野生型)植物暴露于非生物胁迫条件，例如水恶化，亚适温度，营养物缺乏，或优选地盐胁迫条件。盐胁迫可以以许多方式来实现，例如通过用高渗溶液灌溉植物，通过在高渗生长溶液(例如，霍格兰溶液)中以水培方式培养植物，或通过在高渗生长培养基(例如，MS培养基)中培养植物。因为不同植物在它们对盐度的耐受性方面显著不同，所以优选根据具体植物栽培品种或变种的具体特征来调整灌溉水、生长溶液或生长培养基中的盐浓度，以便对植物的生理学和/或形态学施加轻度或中度的影响(关于合适浓度的指导，请参见Bernstein和Kafkafi，Root Growth Under SalinityStress InPlant Roots，The Hidden Half第3版Waisel Y，EshelA和Kafkafi U.(编辑)Marcel Dekker Inc.，New York，2002，和其中的参考文献)。在暴露于胁迫条件后，经常地监控植物直至在野生型植物中出现实质的生理学和/或形态学影响。随后，将不显示实质的生理学和/或形态学影响，或者显示比野生型植物更高的生物量的转化植物鉴定为耐受非生物胁迫的植物。
尽管稳定转化是目前优选的，但本发明也设想了叶细胞、分生细胞或全植物的瞬时转化。
瞬时转化可以通过上述的直接DNA转移方法中的任何一种或者通过使用经修饰的植物病毒进行的病毒感染来实现。
已显示对于转化植物宿主有用的病毒包括CaMV、TMV和BV。使用植物病毒的植物转化在下述文献中得到描述美国专利号4,855,237(BGV)，EP-A 67,553(TMV)，日本公开申请号63-14693(TMV)，EPA 194，809(BV)，EPA 278,667(BV)，和Gluzman，Y.等人，Communications in Molecular BiologyViral Vectors，Cold SpringHarbor Laboratory，New York，第172-189页(1988)。用于在许多宿主(包括植物)中表达外源DNA的假病毒颗粒在WO87/06261中得到描述。
优选地，本发明的病毒是无毒力的，因此不能引起严重症状例如减少的生长率、花叶病、环斑病、卷叶病、黄化、条斑病、痘形成、瘤形成和纹孔病。合适的无毒力病毒可以是天然存在的无毒力病毒或人工减毒的病毒。病毒减毒可以通过使用本领域众所周知的方法来实现，包括但不限于，亚致死性加热、化学处理或通过定向诱变技术，例如由Kurihara和Watanabe(Molecular Plant Pathology 4259-269，2003)，Gal-on等人(1992)，Atreya等人(1992)和Huet等人(1994)所描述的。
合适的病毒毒株可以从可得的来源例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)，或者通过从受感染植物中分离而获得。从受感染的植物组织中分离病毒可以通过本领域众所周知的技术来实现，例如由Foster和Tatlor(编辑)“Plant Virology ProtocolsFrom Virus Isolationto Transgenic Resistance(Methods in Molecular Biology(HumanaPr)，第81卷)”，Humana Pr ess，1998所描述的。简而言之，将被认为包含高浓度的合适病毒的受感染植物的组织，优选嫩叶和花瓣，在缓冲液(例如，磷酸盐缓冲溶液)中磨碎以产生受病毒感染的汁液，所述汁液可以在随后的接种中使用。
用于在植物中引入和表达非病毒外源多核苷酸序列的植物RNA病毒的构建由上述参考文献以及下述参考文献所展示Dawson，W.O.等人，Virology(1989)172285-292；Takamatsu等人EMBO J.(1987)6307-311；French等人Science(1986)2311294-1297；和Takamatsu等人FEBS Letters(1990)26973-76。
当病毒是DNA病毒时，可以对病毒本身进行合适的修饰。备选地，为了易于构建具有外源DNA的所需病毒载体，可以首先将病毒克隆到细菌质粒中。随后，可以将病毒从质粒中切出。如果病毒是DNA病毒，那么可以使细菌复制起点与病毒DNA附着，所述病毒DNA随后被细菌复制。这种DNA的转录和翻译将产生使病毒DNA壳体化的外壳蛋白。如果病毒是RNA病毒，那么病毒一般以cDNA进行克隆并插入质粒内。随后，该质粒用于进行所有构建。随后，RNA病毒通过下列过程来产生转录质粒的病毒序列，和翻译病毒基因以产生使病毒RNA壳体化的外壳蛋白。
用于在植物中引入和表达非病毒外源多核苷酸序列(例如包括在本发明构建体中的那些)的植物RNA病毒的构建由上述参考文献以及美国专利号5,316,931所展示。
在一个实施方案中，提供了植物病毒多核苷酸，其中已从病毒多核苷酸中删除了天然外壳蛋白编码序列，插入了非天然的植物病毒外壳蛋白编码序列和非天然启动子，优选地是非天然的外壳蛋白编码序列的亚基因组启动子，所述启动子能够在植物宿主中表达、包装重组植物病毒多核苷酸，和通过重组植物病毒多核苷酸确保宿主的全身感染。备选地，外壳蛋白基因可以通过在其内插入非天然的多核苷酸序列来失活，从而产生蛋白质。重组植物病毒多核苷酸可以包含一种或多种另外的非天然的亚基因组启动子。每种非天然的亚基因组启动子能够在植物宿主中转录或表达邻近基因或多核苷酸序列，并且不能彼此以及与天然亚基因组启动子重组。非天然的(外源的)多核苷酸序列可以插入至邻近天然植物病毒亚基因组启动子，或者邻近天然和非天然的植物病毒亚基因组启动子，如果包括超过一种多核苷酸序列。非天然的多核苷酸序列在宿主植物中在亚基因组启动子的控制下进行转录或表达，以产生所需产物。
在第二个实施方案中，提供了与第一个实施方案中相同的重组植物病毒多核苷酸，除了下列之外将天然外壳蛋白编码序列置于邻近所述非天然外壳蛋白亚基因组启动子之一而不是非天然外壳蛋白编码序列。
在第三个实施方案中，提供了重组植物病毒多核苷酸，其中天然外壳蛋白基因邻近其亚基因组启动子，并且将一种或多种非天然的亚基因组启动子插入病毒多核苷酸内。插入的非天然的亚基因组启动子能够在植物宿主中转录或表达邻近的基因，并且不能彼此以及与天然亚基因组启动子重组。非天然的多核苷酸序列可以插入至邻近所述非天然的亚基因组植物病毒启动子，从而使得所述序列在宿主植物中在亚基因组启动子的控制下进行转录或表达，以产生所需产物。
在第四个实施方案中，提供了与第三个实施方案中相同的重组植物病毒多核苷酸，除了下列之外天然外壳蛋白编码序列被非天然的外壳蛋白编码序列替换。
病毒载体通过由重组植物病毒多核苷酸编码的外壳蛋白进行壳体化，从而产生重组植物病毒。所述重组植物病毒多核苷酸或重组植物病毒用于感染合适的宿主植物。所述重组植物病毒多核苷酸能够在宿主中复制，在宿主中全身性地传播，并在宿主中转录或表达外源基因(外源多核苷酸)，以产生所需蛋白质。
用于给植物接种病毒的技术可以在下述参考文献中找到Foster和Taylor(编辑)“Plant Virology ProtocolsFrom Virus Isolationto Transgenic Resistance(Methods in Molecular Biology(HumanaPr)，第81卷)”，Humana Press，1998；Maramorosh和Koprowski(编辑)“Methods in Virology”7卷，Academic Press，New York1967-1984；Hill，S.A.“Methods in Plant Virology”，Blackwell，Oxford，1984；Walkey，D.G.A.“Applied Plant Virology”，Wiley，New York，1985；以及Kado和Agrawa(编辑)“Principles andTechniques in Plant Virology”，Van Nostrand-Reinhold，New York。
除了上述外，还可以将本发明的多核苷酸引入叶绿体基因组中，从而使得能够获得叶绿体表达。
用于将外源多核苷酸序列引入叶绿体基因组中的技术是已知的。这种技术涉及下述操作程序。首先，对植物细胞进行化学处理以便使每个细胞的叶绿体数目减少至约1个。随后，经由粒子轰击将外源多核苷酸引入细胞内，以为了将至少一个外源多核苷酸分子引入叶绿体内。选择外源多核苷酸以使得它可经由同源重组整合到叶绿体的基因组中，所述同源重组通过叶绿体所固有的酶而容易地实现。为此，除了目的基因外，外源多核苷酸包含源自叶绿体基因组的至少一段多核苷酸链段。此外，外源多核苷酸包含选择标记，所述选择标记通过顺次的选择操作程序而用于确定叶绿体基因组的所有或基本上所有拷贝在此类选择后将包含外源多核苷酸。关于这种技术的更多细节在美国专利号4,945,050；和5,693,507中找到，所述专利通过提及而合并入本文。因此，多肽可以通过叶绿体的蛋白质表达系统来产生，并且变得整合到叶绿体的内膜中。
因为植物中的本发明的性状(例如，NUE和非生物胁迫耐受性)可以涉及累加地或协同地起作用的多种基因(参见，例如，Quesda等人，Plant Physiol.130951-063，2002)，所以本发明还设想在单个宿主植物中表达多个外源多核苷酸，以从而达到优良的NUE、耐受性、生物量和/或产量。
在单个宿主植物中表达多个外源多核苷酸可以通过将多个核酸构建体共引入到单个植物细胞内来达到，每个所述核酸构建体包含不同的外源多核苷酸。随后，经转化的细胞可以使用上文描述的方法再生为成熟植物。
备选地，在单个宿主植物中表达多个外源多核苷酸可以通过将单个核酸构建体共引入到单个植物细胞中来达到，所述单个核酸构建体包含多个不同的外源多核苷酸。此类构建体可以被设计成具有单个启动子序列，所述单个启动子序列可以转录包括所有不同外源多核苷酸序列的多顺反子信息。为了使得能够共翻译由该多顺反子信息编码的不同多肽，多核苷酸序列可以经由内部核糖体进入位点(IRES)序列进行互连，所述IRES序列促进位于IRES序列下游的多核苷酸序列的翻译。在这种情况下，编码上述不同多肽的经转录的多顺反子RNA分子将从加帽的5′末端和多顺反子RNA分子的2个内部IRES序列开始翻译，从而在细胞内产生所有不同的多肽。备选地，构建体可以包含各自与不同的外源多核苷酸序列连接的几个启动子序列。
用包含多个不同外源多核苷酸的构建体转化的植物细胞可以使用上文描述的方法再生为成熟植物。
备选地，在单个宿主植物中表达多个外源多核苷酸可以通过将不同的核酸构建体(包含不同的外源多核苷酸)引入到多个植物内来达到。随后，再生的转化植物可以进行杂交育种，并且使用常规植物育种技术就优良性状例如NUE、非生物胁迫耐受性和/或生物量来选择所得到的后代。
如上所述，本发明的转基因植物可以用于改善众多商业上需要的性状，它们都是相互关连的，如下文所讨论的。
如本文所使用的，术语“性状”指可以总体(直接或间接地)改善植物的商业价值的植物特征或品质。
如本文所使用的，术语“改善”或“增加”指本发明的转基因植物的性状比非转基因植物(例如，转染的模拟物，或首次用于实验的)改善或增加至少约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。
下述是可以使用本发明的多核苷酸或多肽来改善的性状的举例说明性例子。
肥料使用效率——尽管下文将更详细阐述氮(N)使用效率(NUE)，但应当理解，本发明设想了通过本发明的转基因植物增加/改善从土壤中吸收的所有矿物质和有机部分的总体肥料使用效率，例如磷酸盐(PUE)和钾(KUE)。
N被植物使用的效率尤其受到N摄取效率和N利用效率的影响。植物摄取的N量(或N含量，kg N)与供应/施加的N量(kg Ns)之比是摄取效率(kg Nkg-1 Ns)，而籽粒产量(kg籽粒)与N摄取(kgN)之比是N利用效率(NUE，kg籽粒kg-1N)。参见Moll1982 Analysisand interpretation of factors which contribute to efficiencyof nitrogen utilization.Argon.J.74562-564。NUE还受到经由氨挥发、硝化作用-反硝化作用、沥滤和流失而引起的N损失的影响，所述N损失减少N对植物的可用性。
本发明人认识到，改变根构造的基因可以用于改善NUE。基本原理是将根的较大部分置于其中肥料被沥滤掉的较深土壤层中，或增加其中肥料被浓缩的土壤覆盖层。这种策略已证明对于大豆(Miller，CR，IOchoa，KL Nielsen，D Beck，JP Lynch.2003.Genetic variationfora dventitious rooting in response to low phosphorusavailabilitypotential utility for phosphorus acquisition fromstratified soils.Functional Plant Biology 30973-985)和玉蜀黍(Zhu，J，JP Lynch.2004.The contribution of lateral rootingto phosphorus acquisition efficiency in maize(Zea mays L.)seedlings.Functional Plant Biology 31949-958)以及其他农作物植物中的磷缺乏是成功的。根形态发生明显受到发育程序编制以及受到环境条件的影响。干旱导致根结构的显著向下发育，以达到位于较深土壤层中的水(参见图1A)，而局部营养物可用性引起局部根侧生长(outgrowth)，这增加了根系的总吸收表面。根系的发育通常是高度不对称的，并且反映了根针对环境因素调整其生长和发育的能力。基因和基因表达控制发育改变，如在ANR1(其是在NO3-信号传导中具有作用的推定的转录因子)的情况下。当ANR1通过反义或共抑制被下调时，所得到的转基因品系在它们对于NO3-的局部化供应所作出的根应答方面是有缺陷的(Zhang，H.，Forde，B.G.1998，AnArabidopsis MADS box gene that controls nutrient-inducedchanges in root architecture，Science 270407)。因此，改变本发明的多核苷酸在转基因植物中的表达可以对根形态发生具有所需影响，它们中的一些可以正面影响NUE和非生物/生物胁迫耐受性和/或增加植物产量和活力。具体例子包括FUE_7、FUE_16和FUE_34_Evo。
另外选择了增强细胞内贮存的那些基团，其减少胞质浓度，从而降低对于负责不同形式肥料的摄取的膜转运蛋白的能量屏障。这样，可以获得较高的肥料摄取率。类似地，如从任何酶促反应或途径中所预期的，如果肥料同化的产物被有效地从细胞环境中去除，那么可以预期形成这种产物的酶促途径以加速的速度发生，从而导致改善的同化或使用效率。
在改善FUE的另外一种方法中，鉴定了第三组基因。那些基因与参与无机肥料形式转变成有机材料(同化过程)的生物化学途径有关。解放同化过程中的瓶颈允许有希望实现增加的营养物使用效率，如转录因子Dof1的情况(Yanagisawa Sd，Akiyama A，Kisaka H，UchimiyaH，Miwa T.Metabolic engineering with Dof1t ranscription factorin plantsImproved nitrogen assimilation and growth underlow-nitrogen conditions.Proc Natl Acad Sci U S A.2004 May 18；101(20)7833-8)。使用这种方法发现的基因解除了生物化学瓶颈，导致增加的肥料使用效率。FUE_101和FUE_102包含转运蛋白活性，并因此可以用于改善营养物摄取。
贮存能力——本发明的多核苷酸和多肽序列旨在增强植物的总体贮存能力。通过植物在其发育早期中吸收和贮存矿物质氮的能力来预先确定关于籽粒生产的能力(Hirel等人，Plant Physiol，March 2001，第125卷，第1258-1270页)。因此，以硝酸盐或氨基酸形式的增加的贮存能力非常可能增加籽粒产量。本发明包括改善植物的氮或任何代谢营养物贮存能力的分子机制。例子包括氨基酸、蛋白质、淀粉和油、纤维、灰分、叶绿素和矿物质含量。
植物蛋白质含量与籽粒中的N浓度直接相关(参见Mosse 1990 J.Agric.Food Chem.3818-24)。这对于改善食物的营养价值是非常有价值的。例如，与消费平均蛋白质(6-7％)的精白米的儿童相比较，消费高蛋白(10％)的精白米的儿童显示出改善的生长[Juliano(1993)Rice in Human Nutrition.IRRI和FAO，Rome]。因此，在使N从生长部分再移动至可食部分(例如，籽粒)方面显示出高效率的转基因植物是非常有价值的。因为在开花时的氮水平决定籽粒产量，所以本发明的多核苷酸序列的过表达将改善籽粒产量和/或在整个植物水平上增强籽粒的蛋白质含量。此外，植物的溶解物含量增加阻止了由于热、干旱、盐度、渗压剂等引起的蒸发和水损失，因此提供了对上述胁迫的更佳的植物耐受性。预期FUE_501、FUE_502、FUE_503、FUE_504或FUE_49、FUE_51、FUE_52、FUE_53或FUE_100和FUE_101的过表达增加其中它们进行了表达的组织的贮存能力。这可以导致更强的储库能力，和由于增强的从土壤中的吸收而导致更好地使用所施加的肥料(特别是氮)。因为在开花时的氮水平决定籽粒产量，所以预期上述基因的过表达也将改善籽粒产量和/或增强籽粒的蛋白质含量和整个植物蛋白质水平。此外，植物的溶解物含量增加将阻止由于热、干旱、盐度、渗压剂等引起的蒸发和水损失，从而提供了对上述胁迫的更佳的植物耐受性。
延迟的叶衰老(senescence)或“滞绿”——使营养物摄取在植物周期内较久地延伸，从而提供了增加的贮存氮的能力以及在籽粒灌浆期间提供光合产物的能力。如果植物在授粉期间具有更多的绿叶，那么更多的氮将可用于重新分布至谷粒，引起肥料使用效率和可能地还有籽粒产量方面的改善。本发明中呈现的基因中的一些增加“滞绿”性状或显示出增加的生长(更快的生长和/或更大的叶和杆)，作为改善肥料使用效率、籽粒产量和植物的总体胁迫耐受性的机制。
转化酶是已知当在衰老激活启动子下表达时延迟衰老的酶(Balibrea Lara等人，Plant Cell 161276-1287，2004)。FUE_30和FUE_31具有预测的转化酶活性，并因此可以延长植物的滞绿特征并因此增加植物中贮存氮的总体能力以用于在籽粒灌浆期间的重新分布。
除了其他过程外，细胞分裂素尤其参与叶衰老的抑制。FUE_55是与tRNA异戊烯基转移酶具有惊人的相似性的基因，所述tRNA异戊烯基转移酶是细胞分裂素代谢途径中重要的酶。FUE_55在根或枝条中增加的表达将增加细胞分裂素的水平，从而导致叶扩展和细胞复制增强、衰老延迟、组织的储库强度增加、氮利用增强等。
玉米素是天然存在的细胞分裂素。FUE_505是推定的含AP2结构域的转录因子，基于微阵列实验，它与ARR基因(拟南芥应答调节蛋白)紧密地聚类在一起，所述ARR基因介导枝条对于细胞分裂素的应答。ARR基因是玉米素应答性的，并且在向氮饥饿植物添加氮后被诱导。FUE_505与ARRs一起的共调节表明了在细胞分裂素应答中的作用。由于枝条的细胞分裂素应答的连续活化，FUE_505的组成型表达将很可能延迟叶衰老并改善氮利用和植物生长。
胁迫耐受性——预期本发明的转基因植物显示出对生物和非生物胁迫的耐受性。
本文使用的短语“胁迫”指对于植物的代谢、生长、繁殖和/或生存力的任何不利影响。因此，非生物胁迫可以通过亚最佳环境生长条件来诱导，例如盐度、水剥夺、泛滥、冰冻、低或高温、重金属毒性、无氧生活、营养物缺乏(还包括营养物的不易接近，例如由于沥滤)、大气污染或UV照射。生物胁迫可以例如通过环境中发现的病原体来诱导。
如本文所使用的，短语“胁迫耐受性”指植物忍耐胁迫(非生物)而在代谢、生长、生产力和/或生存力方面不遭受本质改变的能力。优选地，本发明的经遗传改造的植物显示出比非转基因植物多至少约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或甚至更高的耐受性。
植物经历一系列环境攻击。这些中的几种(包括盐胁迫、普遍渗透胁迫、干旱胁迫和冰冻胁迫)具有影响全植物和细胞的水可用性的能力。随后，不意外地，涉及针对这种胁迫集合的植物应答。在近期的综述中，Zhu指出，“大多数对水胁迫信号传导的研究主要集中于盐胁迫，这是因为植物对盐和干旱的应答密切相关并且它们的机制相互重叠”(Zhu(2002)Ann.Rev.Plant Biol.53247-273)。针对这组胁迫的类似应答和途径的许多例子已得到证明。例如，CBF转录因子已显示出制约对于盐、冰冻和干旱的抗性(Kasuga等人(1999)Nature Biotech.17287-291)。拟南芥rd29B基因响应于盐和脱水胁迫而被诱导，这是主要通过ABA信号转导过程介导的过程(Uno等人(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9711632-11637)，导致与在rd29B启动子内的上游元件结合的转录因子的活性改变。在冰叶日中花(Mesembryanthemum crystallinum)(冰花)中，Patharker和Cushman已证明，钙依赖性蛋白激酶(McCDPK1)通过暴露于干旱和盐胁迫而被诱导(Patharker和Cushman(2000)Plant J.24679-691)。还证明，胁迫诱导的激酶磷酸化转录因子，估计可能改变其活性，尽管靶转录因子的转录物水平并不响应于盐或干旱胁迫进行改变。类似地，Saijo等人证实，当过表达时，稻盐/干旱诱导的钙调蛋白依赖性蛋白激酶(OsCDPK7)赋予稻以增加的盐和干旱耐受性(Saijo等人(2000)PlantJ.23319-327)。
暴露于脱水调动了植物中与冰冻胁迫时类似的存活策略(参见，例如，Yelenosky(1989)Plant Physiol 89444-451)，并且干旱胁迫诱导冰冻耐受性(参见，例如，Siminovitch等人(1982)PlantPhysiol 69250-255；和Guy等人(1992)Planta 188265-270)。除了低温驯化蛋白质的诱导，允许植物在低水条件下存活的策略可以包括例如减少表面积、或者产生表面油或蜡。在另一个例子中，植物的溶解物含量增加阻止了由于热、干旱、盐度、渗压剂等引起的蒸发和水损失，因此提供了对上述胁迫的更佳的植物耐受性。
应当理解，参与对于一种胁迫的抗性的某些途径(如上所述)还将参与对于由相同或同源基因调节的其他胁迫的抗性。当然，全部抗性途径是相关的，不是相同的，并因此并非控制对一种胁迫的抗性的所有基因将控制对其他胁迫的抗性。然而，如果基因制约对于这些胁迫之一的抗性，那么测试对于这些相关胁迫的抗性对于本领域技术人员将是显而易见的。评估胁迫抗性的方法在随后的实施例部分中进一步提供。
预期本发明的转基因植物忍耐胁迫的能力影响植物生物量、活力和产量。还预期相反面呈现出良好的结果，实质上，预期改善的生物量、活力和/或产量改善了本发明的转基因植物对胁迫条件的忍耐力。
如本文所使用的，短语“植物生物量”指在生长季节中由植物产生的组织的量或数量，其还可以决定或影响植物产量或每生长面积的产量。
如本文所使用的，短语“植物活力”指在给定时间中由植物产生的组织的量或数量。因此，增加活力可以决定或影响植物产量或每生长时间或生长面积的产量。
如本文所使用的，短语“植物产量”指作为植物生产的产物而被产生和收获的组织的量或数量。因此，增加产量可以影响可在某一特定生长时间中从植物获得的经济利益。
为了分析转基因对植物生理学的影响，可以评估总产量和生物量，植物对于肥料缺乏和非生物胁迫的耐受性，所述非生物胁迫例如为干旱、盐度、冷和热胁迫、冰冻等。同样具有重要性的是，评估植物在其任何部分是否包含含量增加的蛋白质、游离氨基酸、油和任何其他具有价值的代谢化合物。
下文概述了可以用于证明本发明的转基因植物或转基因是否合格的测定法(这些和其他测定法的进一步描述在随后的实施例部分中提供)。
肥料使用效率——为了分析转基因植物是否对肥料更有应答性，植物在具有有限量的肥料的琼脂平板或罐中生长。就其总体大小、到达开花所需时间、产量、枝条和/或籽粒的蛋白质含量来评估植物。关于肥料使用效率的测试的一种示例方法在Yanagisawa等人(Proc NatlAcad Sci U S A.2004；1017833-8)的工作中提供，其中就在限制氮的条件下(例如以硝酸盐或铵形式的0.01mM、0.05mM、0.15mM、0.3mM、1mM、3mM氮)的生长率来检查转基因拟南芥的种子。所检查的参数是成熟植物的总体大小、其湿重和干重、产生的种子重量、平均种子大小和产生的种子数目/植物。可以进行测试的其他参数是叶的叶绿素含量(因为氮植物状态和叶翠绿程度是高度相关的)、种子或其他植物部分(例如叶或枝条)的氨基酸和总蛋白质含量、油含量等。类似地，并不提供限制量的氮，而是可以添加浓度渐增的磷酸盐或钾。再次，所测量的相同参数与上文列举的相同。以这种方法，除了氮使用效率(NUE)之外，通过检查转基因植物在营养物限制条件下茁壮成长的能力来评估磷酸盐使用效率(PUE)和钾使用效率(KUE)。
氮测定——用于植物的结构部分中N浓度测定的操作程序包括将有机N转变成NO3-的过硫酸钾消化法(Purcell和King 1996 Argon.J.88111-113)，经修饰的Cd-介导的NO3-至NO2-的还原(Vodovotz 1996Biotechniques 20390-394)和通过Griess测定法测量亚硝酸盐(Vodovotz 1996，同上)。针对NaNO2的标准曲线在550nm处测量吸光度值。该操作程序在Samonte等人，2006Agron.J.98168-176中详细描述。
籽粒蛋白质浓度——将籽粒蛋白质含量(g籽粒蛋白质m-2)估计为籽粒N的质量(g籽粒Nm-2)乘以k-5.13的N/蛋白质转换率的乘积(Mosse 1990，同上)。籽粒蛋白质浓度被估计为籽粒蛋白质含量/籽粒的单位质量之比(g籽粒蛋白质kg-1籽粒)。
油含量——油的量表示为干重百分比。油含量被定义为通过用特定溶剂(通常为己烷或石油醚)萃取而可以从种子中取出的材料(脂质)的最大量。油含量通过将种子磨碎并在连续萃取器中萃取油来直接测量。间接的油含量分析可以使用核磁共振(NMR)光谱法或近红外(NI)光谱法来进行。NMR技术测量液态样品中由氢原子吸收的共振能，而NI利用样品对于近红外辐射能(1100-2500nm)的吸收。尽管NIR法的精确性不如萃取法好，但NMR法在进行仔细校准时产生非常准确和精确的结果。
干旱耐受性测定法/渗压剂测定法——实施对干旱的耐受性，以鉴定在急剧水剥夺后赋予更佳的植物存活的基因。为了分析转基因植物是否对干旱更有耐受性，可以进行在培养基中由非离子型渗压剂山梨糖醇产生的渗透胁迫。使对照和转基因植物发芽并在植物琼脂平板中生长4天，这之后将它们转移至包含500mM山梨糖醇的平板中。该处理引起生长迟缓，随后通过测量植物重量(湿和干)、产量，和通过作为到达开花所需时间进行测量的生长率来比较对照和转基因植物。
相反地，用过表达上述候选基因的植物进行基于土壤的干旱筛选。使来自对照拟南芥植物或过表达本发明多肽或使本发明多肽沉默的其他转基因植物的种子发芽并转移至罐。在停止灌溉并将罐置于吸水纸上以增强土壤干燥速度后获得干旱胁迫。当大多数对照植物产生严重萎蔫时，将转基因和对照植物彼此相比较。在获得相当部分的对照植物显示出严重萎蔫后给植物再加水。就下列2个标准中的每一个，与对照相比较而对植物进行分级对干旱条件的耐受性和再加水后的恢复(存活)。
盐度耐受性测定法——预期对于高盐具有耐受性的转基因植物在高盐中显示出更好的发芽、幼苗活力和生长。取决于其发育阶段，植物在其对NaCl的耐受性方面不同，因此评估了种子发芽、幼苗活力和植物生长应答。盐度耐受性测试采用不同发育阶段的植物，并且用从底部和从上方施加的浓度渐增的NaCl(例如50mM、100mM、200mM、400mM)来灌溉它们，以确保盐的均匀分散。在抑制对照植物的浓度处，在它们的外部表型表现、萎蔫程度、以及达到成熟和产生后代的总体成功方面，将转基因植物与对照植物相比较。所测量的耐受性的定量参数是平均湿重和干重、以及产生的种子重量、平均种子大小和每株植物产生的种子数目。进行渗透胁迫测定法(包括NaCl和甘露醇测定法)，以确定渗透胁迫表型是否是NaCl特异性的，或者它是否是一般的渗透胁迫相关表型。对于渗透胁迫耐受的植物还可以对于干旱和/或冰冻具有更多的耐受性。对于盐和渗透胁迫发芽实验，使培养基补充有例如50mM、100mM、200mM NaCl，或100mM、200mM NaCl，400mM甘露醇。
冷胁迫耐受性——为了分析冷胁迫，将成熟的(25天大)植物转移至4℃小室1-2周，使用基本的光照。其后将植物移回到温室。2周后在对照和转基因植物之间比较导致生长迟缓和其他表型的由冷却期导致的损害，其通过测量植物重量(湿和干)，和通过比较作为到达开花所需时间进行测量的生长率、植物大小、产量等来进行。
热胁迫耐受性——通过使植物暴露于34℃以上的温度一定时期来实现热胁迫耐受性。在5天后将植物移回至22℃以进行恢复和评估之后，相对于内部对照(非转基因植物)或未暴露于冷或热胁迫的植物来检查植物耐受性。
发芽测试比较了来自转基因植物的可以完成发芽过程的种子百分比与来自以相同方式处理的对照植物的种子百分比。考虑了正常条件，例如于22℃在22小时光照-2小时黑暗的每日循环下进行温育。在种植后4-14天进行发芽和幼苗活力的评估。基础培养基是50％Murashige-Skoog培养基(MS)+维生素。
还在不利条件下检查了发芽，所述不利条件例如为冷(在低于10℃而不是22℃的温度下温育)或使用包含高浓度渗压剂例如山梨糖醇的种子吸涨溶液(浓度为50mM、100mM、200mM、300mM、500mM、和直至1000mM)或施加浓度渐增的盐(50mM、100mM、200mM、300mM、500mM NaCl)。
测定植物活力、产量和生物量的方法是本领域众所周知的(参见实施例9和实施例10)。
本发明对于育种和观赏目的也是有价值的。因此，设想与根构造相关的本发明的多核苷酸和多肽序列(FUE_34_Evo，SEQ ID NO54，还参见实施例11和图8)也可以用于控制植物分蘖，并且如此可以进行上调或下调以控制分枝和分蘖。下调植物中的基因表达的方法是本领域众所周知的。
因此，本发明对于促进农作物植物中商业上所需的性状具有高度的农业价值。
如本文所使用的，术语“约”指±10％。
在检查并不希望为限制性的下述实施例后，本发明的另外目的、优点和新型特征对于本领域普通技术人员将是显而易见的。另外，如上文所描述的和如下文权利要求部分中所要求保护的本发明的各种实施方案和方面中的每一个可以在下述实施例中找到实验支持。
实施例 现在参考下述实施例，所述实施例连同上文说明书一起以非限制性方式举例说明了本发明。
一般而言，本文使用的术语和本发明中使用的实验操作程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。此类技术在文献中得到充分说明。参见，例如，“Molecular CloningA laboratory Manual”Sambrook等人，(1989)；“Current Protocols in Molecular Biology”第I-III卷，Ausubel，R.M.编辑(1994)；Ausubel等人，“CurrentProtocols in Molecular Biology”，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，＂A Practical Guide to MolecularCloning＂，John Wiley and Sons，New York(1988)；Watson等人，“Recombinant DNA”，Scientific American Books，New York；Birren等人(编辑)“Genome AnalysisA Laboratory Manual Series”，第1-4卷，Cold SpringH arbor Laboratory Press，New York(1998)；如美国专利号4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中所述的方法；“Cell BiologyA Laboratory Handbook”，第I-III卷，Cellis，J.E.编辑(1994)；“Current Protocols inImmunology”第I-III卷，Coligan J.E.编辑(1994)；Stites等人(编辑)，“Basic and Clinical Immunology”(第8版)，Appleton和Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell和Shiigi(编辑)，“SelectedMethods in Cellular Immunology”，W.H.Freeman and Co.，NewYork(1980)；可用的免疫测定法在专利和科学文献中得到详尽描述，参见，例如美国专利号3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；“Oligonucleotide Synthesis”Gait，M.J.编辑(1984)；“Nucleic Acid Hybridization＂Hames，B.D.和HigginsS.J.编辑(1985)；“Transcription and Translation”Hames，B.D.和Higgins S.J.编辑(1984)；“Animal Cell Culture”Freshney，R.I.编辑(1986)；“Immobilized Cells and Enzymes”IRL Press，(1986)；“A Practical Guide to Molecular Cloning”Perbal，B.，(1984)和“Methods in Enzymology”第1-317卷，Academic Press；“PCR ProtocolsA Guide To Methods AndApplications”，Academic Press，San Diego，CA(1990)；Marshak等人，“Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual”CSHL Press(1996)；所有这些参考文献通过提及而合并入本文，就如同在本文中完全阐述一样。本文件自始至终提供了其他一般参考文献。认为其中的操作程序是本领域众所周知的，并且为了读者的方便而提供。其中包含的所有信息通过提及而合并入本文。
实施例1 使用生物信息学和分子工具来鉴定多核苷酸和预测基因作用 通过RNA表达谱、序列相似性、基因注释、生物化学途径、DNA、ESTs、蛋白质和表达数据库的深入分析来鉴定适合于增加FUE和/或非生物或生物胁迫耐受性的多核苷酸，所述蛋白质和表达数据库是公众可获得的，并用作对于允许实施数据挖掘的一系列专有的(proprietary)计算机算法的输入数据。
使用准确表达作图借助于定量实时PCR进行性状关联，以使不同组织中和在特异性生长条件下的表达水平相关联，用于阐明表达的多核苷酸的功能。
材料和方法 鉴定与增加的FUE相关的多核苷酸序列 本方法基于下文实施例中描述的3个阶段，基本上为生物信息学过滤、分子分析和植物中(in planta)验证。下文是生物信息学算法的描述。
A.生物信息学过滤 将DNA序列聚类为基因聚簇——EST(表达序列标签)聚类的目的是将共有转录物或基因亲本的所有ESTs合并成同一个聚簇。通常，将聚类的ESTs集合成反映转录物多样性的一个或多个共有序列(重叠群)，提供这些重叠群从而使得它们所包含的信息最真实地反映所抽样的生物学。使基因聚簇片段化，将EST数据和(如果已知的)基因mRNA序列数据合并，置于准确的背景中，并通过基因编入索引，从而使得关于单个基因的所有表达数据在单个索引类别中，并且每个索引类别包含关于唯一一种基因的信息(Burke等人，1999，D2_clusterA Validated Method for Clustering EST and Full-length cDNASequences.Genome Research，9(11)，1135-1142)。对于汇编(assembly)使用Compugen LEADS平台(http://www.cgen.com/research/Publications/LEADSwhitepaper.pdf)。
计算关于在几个植物物种中的所有基因聚簇的数字化表达——数字化表达(也称为电子Northern印迹法)比较来自非标准化的cDNA文库的大量随机ESTs的发生率。贮存于数据库中的那些标签的相对频率的变化随后用于阐明相应基因的差异表达。数字化Northern数据可以用于提供在植物中不同器官之间或在不同生理学状态的差异表达的定量评估(胁迫对正常)。这种工具基于形成该聚簇的EST序列而展示出基因的实际表达谱。该工具可以提供在植物解剖学(即，基因在哪个组织/器官中表达)、发育阶段(即，可以发现基因的发育阶段)和处理特性(即，提供基因得以表达的生理条件，例如干旱、冷、病原体感染等)方面的聚聚簇表达谱。考虑到ESTs在不同聚簇中的随机分布，数字化表达提供了概率值，其描述了具有总N ESTs的聚簇包含来自文库的某一集合的X ESTs的概率。关于概率计算，考虑下述因素a)聚簇中的ESTs数目，b)源于特定文库或相关文库的组的ESTs数目，c)可用的代表所述物种的ESTs总数目。这样，具有低概率值的聚簇高度富含来自显示出特有表达的目的文库组的ESTs。此外，使用专有词汇表(有限的术语一览表)，其考虑了每个EST文库的注释，并使用特定关键词来描述关于组织类型、处理和发育阶段的与序列相关的实验数据。基于给基因聚簇提供序列的文库来源，将选自专有词汇表的术语与计算的数字化表达相组合，以建立关于每种特定基因的表达谱。建立这种谱的统计和图解表示法以用于数字化表达计算。因为注释来自受控的词汇表，所以用描述特定组织、发育阶段或处理的特定关键词来仔细分析整个数据库。
整合关于每种基因的所有相关数据，包括来自微阵列实验的表达数据、数字化表达、注释、本体论(ontology)、基因家族、保守基序等——使用从来自多个植物物种的基因组数据库中形成直向同源基因的组的专有工具。为了给所鉴定的基因提供进一步的支持，作为一个整体来测试直向同源基因或直向同源组，以根据在其所计算的数字化表达中最重要的关键词来察看目的性状的牵涉。
基因选择——这根据几种生物学上合理的假设来进行，以查询上述数据库。基因选择通过使用仔细选择的标准过滤特定基因组来完成。最终的基因集应包含有限数目的基因，所述基因可以在下述分子分析和转基因实验中进行操作。本文使用的不同标准对于下述每种基因详细地进行描述。
用于本发明的基因选择考虑了植物科学中广泛接受的几个概念。营养物缺乏引起根构造的适应，特别显著的例如是在富含营养物的小块地内的根增殖，以增加营养物摄取。营养物缺乏还引起植物代谢途径的活化，这最大化了吸收和同化过程。在这个过程中，基因被触发并活化，引起构造改变(Jose Lopez-Bucio等人，The role of nutrientavailability in regulating root architecture，Current Opinionin Plant Biology 2003，6280-287)。经触发的基因的表达改造可以引起植物还在其他条件下显示出构造改变和增强的代谢。其次，众所周知的是，植物通常通过产生更深的根系来响应干旱，所述更深的根系允许接近位于更深土壤层中的水分(Morgan，J.M.和A.G.Condon.1986.Water use，grain yield，and osmoregulation in wheat.Aust.J.Plant Physiol.13523 532和Yiwei Jiang和BingruHuang，2001，Crop Science 411168-1173)。触发这种效应将允许植物接近位于更深土层中的营养物，特别是易于溶解于水中的那些营养物(如硝酸盐)。第三，不同的非生物胁迫(例如，干旱、渗压剂、冷、热、辐射、盐度、营养物缺乏等)使用胁迫特异的以及普通的胁迫途径来引起其应答(Gabriela M.Pastori和Christine H.Foyer，Common Components，Networks，and Pathways ofCross-Tolerance to Stress，Plant Physiol，June 2002，第129卷，第460-468页)。这提供了区分参与每种途径的基因的可能性。
植物对胁迫的响应就能量而言是昂贵的，如此影响了植物产量。特定基因的精确改造提供了仅部分活化胁迫应答而不引起产量的相伴损失的能力。因此，进行几次查询以区分在普通的和胁迫特异的应答期间活化的基因。因为某些植物应答例如增强的根系或优良的贮存能力在最佳生长条件下也是高度优选的，所以本发明设想形成具有改善的FUE的改良植物，所述改良植物此外还显示出增强的对于对产量造成不利影响的其他非生物植物胁迫的响应。
为了鉴定改善FUE的基因，从Genbank版本145(2004年12月)中提取来自玉米的416899 EST和23563 mRNA转录物序列，通过就载体、低复杂性序列和来自公共数据库的已知重复序列所实施的筛选来进行净化，并且随后使用Compugen’s LEADS平台进行聚类和汇编成重叠群。
使用描述了所使用的植物组织、为了培养植物所应用的处理和在获取组织时的植物发育阶段的关键词来检查和注释Genbank 146中关于玉米和其他物种的EST文库，所述其他物种例如为大豆、番茄、大麦、高粱、稻、棉花、小麦和拟南芥。将显著性值分配给在来自每个EST文库或共享相同注释的文库组的每个重叠群中的ESTs频率。显著性值基于这样的统计学测试，所述统计学测试考虑了来自重叠群中给定类别的ESTs数目、整个产出物(production)中这些ESTs的数目、重叠群的大小和产出物中的ESTs总数目。
另外，整合了在Nottingham Arabidopsis Stock Centre(NASC，http://affymetrix.arabidopsis.info/)处可免费获得的拟南芥微阵列实验，其包括描述了解剖学、发育和各种胁迫实验的实验。为了使LEADS玉米产出物的重叠群与来自其他物种的相应聚簇相联系，使用了直向同源物探测器算法，所述算法除了其他过滤器外尤其使用交互BLAST分析(reciprocal BLAST analysis)，以鉴定其他植物物种中最相似的基因。
下文描述了用于选择每种基因的参数。下述表1将内部标识符(可互换使用的NUE_XXX或FUE_XXX)与SEQ ID NO相关联。
表1 值得注意的是，过表达倍数(“倍数”)被计算为关于某一类别(“关键词”)而在基因或直向同源组中发现的ESTs数目与根据正常分布预期的ESTs数目之间的比率。对于计算出的过表达倍数估计概率值(P-值)。基于本文呈现的结果和与如上所述的人工辅助处理相组合的其他计算过滤来选择基因。
由于其在玉米中的强烈根表达(如表2以及图2A和2B中所示)，以及其直向同源物的表达模式，例如在大豆和稻中的表达模式(如表3以及图2C和2D中所示)，所以选择出FUE_1。此外，FUE_1显示出一些与RCc3蛋白(GENEBANK登记号L27208)的同源性，所述RCc3蛋白是推定与脂质转运相关的已知根特异性蛋白质。
表2FUE_1在玉米中的数字化表达解剖学
表3FUE_1直向同源物组的数字化表达解剖学
FUE_2是功能未知的蛋白质，其显示出使其与根，特别是在干旱胁迫下与根相关联的数字化表达。
FUE_3是在玉米中(表4和表5)以及在大麦和稻中特别是于根中表达的推定的非特异性脂质转移蛋白。它在干旱情况下在根中的表达在高粱、玉米、稻和大麦中的整个进化过程中是保守的(如表6和7中所示)。表明，该基因还在大麦和稻中在盐度胁迫下表达以及在大麦中在氮缺乏下表达。
表4FUE_3在玉米中的数字化表达解剖学
表5FUE_3在玉米中的数字化表达处理
表6FUE_3直向同源物组的数字化表达解剖学
表7FUE_3直向同源物组的数字化表达处理
FUE_4也是在干旱胁迫下显示出特异性的数字化表达(如表8和9中所示)的功能未知的蛋白质。
表8FUE_4在玉米中的数字化表达解剖学
表9FUE_4在玉米中的数字化表达处理
FUE_5是泛醌醇-细胞色素C还原酶复合物样蛋白，其在几种胁迫下并且特别是在干旱和盐度下在玉米(如表10中所示)和稻根中表达。
表10FUE_5在玉米中的数字化表达处理
FUE_6显示出与多重胁迫相关锌指蛋白的同源性，其在玉米中在籽粒发育期间，和在根中，特别是在干旱胁迫下表达(如分别在表11和12中显示的)。本发明人揭示，FUE_6和FUE_40是相同转录物的部分。FUE_6代表该转录物的5′区，而FUE_40代表3′区。为了方便起见，这种转录物在本文中以名称FUE_40出现。
表11FUE_6在玉米中的数字化表达解剖学
表12FUE_6在玉米中的数字化表达处理
FUE_7是显示出与抗冻蛋白的相似性的假设蛋白质，其在大麦和玉米中在根中占优势地表达并且在干旱胁迫期间具有更明显的表达(如表13和14中所示)。
表13FUE_7直向同源物组的数字化表达解剖学
表14FUE_7直向同源物组的数字化表达处理
FUE_8显示出与Acyl-ACP硫酯酶的同源性，并且在玉米根中在干旱胁迫下表达(如表15中所示)。高粱和稻直向同源物也显示出与干旱的明确关联，如通过构成所述基因的序列的来源所揭示的。
表15FUE_8在玉米中的数字化表达解剖学
FUE_9是在玉米根中在干旱胁迫下表达的假设蛋白质。
FUE_10显示出与电子转运相关蛋白的同源性，其显示出在玉米中只与干旱相关的(如表16和17中所示)和与其他非生物胁迫相关的强烈根表达(如在大豆中发现其直向同源物的表达)。
表16FUE_10在玉米中的数字化表达解剖学
表17FUE_10在玉米中的数字化表达处理
FUE_11显示出与由物理阻抗诱导的蛋白(physical impedanceinduced protein)的同源性，并且在玉米中也在干旱胁迫期间在根中表达。
FUE_12是在水分胁迫(干旱)下在玉米根中，和在其他非生物胁迫(例如干旱)下在大麦中，和在氮缺乏和热胁迫下在高粱中表达的未知蛋白质。
FUE_13显示出与致病相关蛋白10的同源性，并且在不同胁迫下在玉米中表达(干旱、病原体如镰孢霉)。大麦和稻直向同源物特别是在非生物和生物胁迫下强烈地表达，使这种蛋白质与普遍存在的对于胁迫的植物应答相联系。
FUE_14是显示出与萌发蛋白样蛋白6的同源性的玉米蛋白质。其大麦直向同源物的数字化表达使这种蛋白质与病原体应答以及干旱和氮缺乏应答相联系。
FUE_15是也在玉米根中表达的推定的由生长素调节的蛋白质。来自大麦、稻的其直向同源物与干旱以及其他生物和非生物胁迫(例如病原体应答)相关联。在番茄和大豆中，该蛋白质与对于病原体和营养物缺乏的应答相联系。
FUE_16是在玉米根中在水分胁迫下强烈表达(如表18和19中所示)的Uclacyanin 3-样蛋白。来自大麦、稻、大豆和番茄的其直向同源物也在根中表达，但参与对其他几种生物和非生物胁迫的应答，特别是对于光反应(如表20和21中所示)。
表18FUE_16在玉米中的数字化表达解剖学
表19FUE_16在玉米中的数字化表达处理
表20FUE_16直向同源物组的数字化表达解剖学
表21FUE_16直向同源物组的数字化表达处理
FUE_17是在玉米和其他植物物种中显示出数字化表达的假设蛋白质，使其与对于干旱(玉米、大麦和高粱)、病原体(稻、大豆和番茄)的应答以及在大麦中对于氮缺乏和水涝的应答相联系。
由于其注释和来源于根的显著EST含量(特别是在FUE_30的情况下)而选择FUE_30和FUE_31。FUE_30和FUE_31具有预测的转化酶活性，所述转化酶是已知当在衰老激活启动子下表达时延迟衰老的酶(Balibrea Lara等人，Plant Cell 161276-1287，2004)。FUE_30可以延长植物的滞绿特征，并因此增加植物中贮存氮的总体能力以用于在籽粒灌浆期间的重新分布。
FUE_32被注释为主要固有样蛋白质并且其小麦直向同源物包含从根中分离的几种序列。此外，所选择的玉米基因显示出与BrevisRadix的同源性。Brevis Radix是细胞增殖和延伸的新型调节剂，当使它失活时产生具有较短的根的植物(Mouchel等人，Genes和Development第18卷700714，2004)。
FUE_54显示出与生长素应答性蛋白的同源性。所述基因包含来自根和受胁迫组织，以及其来自高粱和稻的最佳直向同源物的显著EST注释，所述最佳直向同源物在胁迫条件下特异性表达并且可能在根中富集。
FUE_33和FUE_100编码腈水解酶。腈水解酶是生长素生物合成途径中重要的酶，其将3-吲哚乙腈转变成3-吲哚乙酸(生长素)。腈水解酶在根中的表达增加将放大总体生长素水平，并诱导根延伸、次生根形成、增强的向重力性反应等。
FUE_34和FUE_35以及FUE_46和FUE_47均为特别是在受胁迫的根中表达的可能转录因子，这通过提供基因序列的EST文库来判断。因为这些转录因子与水分胁迫文库高度相关，所以修饰这些基因的表达可能将激活诱导与胁迫相关的结构和代谢变化的基因。
FUE_36、FUE_37和FUE_38显示出一定程度的与ABA-应答性基因和/或胁迫注释基因的相似性，并且具有源自根文库的显著含量的序列。FUE_36可能具有与SAPK8具有惊人的相似性的蛋白激酶活性，这证实了在胁迫应答中的作用，所述SAPK8是其表达水平在ABA处理期间或在盐度条件下增加的蛋白质。FUE_37具有源自根并特别是在水分胁迫下的根的几乎全部序列(如表22和23中所示)。来自大麦、小麦和甘蔗的直向同源物也支持该基因主要在根中表达的论点。表明，这种基因涉及对于水分胁迫剥夺、高渗盐度反应、冷和其他胁迫的应答。
表22FUE_37直向同源物组的数字化表达解剖学
表23FUE_37直向同源物组的数字化表达处理
FUE_38源自各种受胁迫的根文库(如表24和25中所示)并且显示出与PKABA1的显著的相似性。PKABA1转录物水平在正在生长的幼苗中几乎无法检测，但在对植物实施脱水、冷和渗透胁迫时被急剧诱导(Holappa LD和Walker-Simmons MK Plant Physiol.第108卷1203-1210，1995)。这种基因的经修饰的表达模式可以提供提高的非生物胁迫耐受性、提高的活力、增加的产量和更好的肥料使用效率。
表24FUE_38直向同源物组的数字化表达解剖学
表25FUE_38直向同源物组的数字化表达处理
使用在(http://affymetrix.arabidopsis.info/narrays/supersearch.p1？searchterms＝afgn)处可获得的微阵列拟南芥表达数据而选择出FUE_48。鉴定了具有在根中的富集的表达并且对于ABA和非生物胁迫(盐度、渗压剂和冷)具有高度应答性的基因。所述基因之一在玉米中具有直向同源物(FUE_48)，其显示出含量增加的源自根的序列。可能的高粱直向同源物是主要由源自胁迫的序列组成的基因，特别是来自水分胁迫和干旱条件(如表26中所示)。FUE_48显示出与SIP(种子吸涨蛋白)的相似性。
表26FUE_48直向同源物组的数字化表达处理
FUE_39是根表达的钙依赖磷酸酶B样Ca++结合蛋白。钙依赖磷酸酶是由胁迫条件差异调节的Ca++感知蛋白激酶，所述胁迫条件例如为盐、干旱、冷和创伤胁迫。钙参与根的几种重要行为例如向重力性、向水性等，并且是用于各种信号转导途径的重要的第二信使。与参照植物相比较，其中涉及FUE_39的蛋白质级联的连续活化可以提供有利的性质或所需的性状，包括改善的非生物胁迫耐受性、提高的活力和产量、改善的肥料使用等。
FUE_40和FUE_41是在根中(特别是在胁迫条件下)表达的基因。FUE_40的高粱直向同源物具有源自受胁迫的组织(包括根)的几种序列。FUE_41和FUE_40显示出与胁迫应答性蛋白质的相似性。
FUE_43、FUE_44和FUE_45具有疏远的与大肠杆菌通用胁迫蛋白的相似性，并且它们的组成序列包含很大部分的根受胁迫组织(关于FUE_43如表27中所示，和关于FUE_44如表28中所示)。FUE_43显示出与乙烯应答性蛋白质的相似性。FUE_44和FUE_45显示出弱的与早期结瘤蛋白样蛋白质的相似性。在不同的启动子下异位表达的那些蛋白质可能在转基因植物中产生有利的效应，例如增强的胁迫耐受性、在最佳和不利条件下改善的生长，这主要是由于根构造中可能的修饰。
表27FUE_43直向同源物组的数字化表达处理
表28FUE_44直向同源物组的数字化表达处理
使用微阵列拟南芥表达数据选择出FUE_50，在所述微阵列拟南芥表达数据中如果它们也是生长素和乙烯应答性的，那么选择根特异性基因。根据计算的数字化表达，本发明中呈现的玉米直向同源物在根中在水分胁迫条件下和在致病相关组织中表达。玉米基因显示出与结瘤蛋白的相似性，所述结瘤蛋白是已知在结节和侧根发育期间所涉及的蛋白质(Papadopoulou等人，Plant Mol Biol.1996；30403-17)。
FUE_501是推定的拟南芥(Arabidopsis thaliana)氨基酸转运蛋白，其在盐度、渗压剂下显示出增加的表达，并且也是脱落酸应答性的(ABA-非生物胁迫应答激素)。FUE_51(FUE_501的玉米同源物)主要由衍生自受胁迫根序列的序列构成，并且具有作为氨基酸转运蛋白的暂时注释。根据数字化表达，FUE_51的高粱直向同源物参与胁迫应答。它的大麦直向同源物具有源自根和受胁迫根的序列。此外，小麦直向同源物显示出几种源自根的序列。
FUE_502是推定的氨基酸转运蛋白，其在盐度胁迫和渗压剂期间在根和枝条中显示出增加的表达。FUE_52，它的最接近的玉米直向同源物，也具有与氨基酸转运蛋白的相似性并且为源自根和受胁迫根的序列的重要代表。
FUE_503在种子中具有显著表达，这暗示在将氨基酸摄取入正在发育的种子中方面的强烈作用。此外，该基因在盐度下和响应茉莉酮酸甲酯而强烈上调。由于其对于ABA、盐度(特别是枝条)、渗压剂和冷的强烈应答而选择出FUE_504。FUE_49在翻译的氨基酸水平上显示出与FUE_504的强相似性，但在编码核苷酸水平上很低。它的高粱直向同源物具有明显源自水分胁迫/干旱文库的序列。
FUE_53是推定的氨基酸转运蛋白，其具有组成源自根并特别是受胁迫根的基因的几乎所有序列。高粱、稻和小麦直向同源物包含几种源自根和在胁迫文库下的根的序列。
FUE_101和FUE_102显示出与氨基酸转运蛋白的相似性。FUE_102特别地由源自冷处理的幼苗和病原体感染的玉米穗尖的序列组成。
FUE_55是与tRNA异戊烯基转移酶具有惊人的相似性的基因，所述tRNA异戊烯基转移酶是细胞分裂素代谢途径中重要的酶。FUE_55在根或枝条中增加的表达将增加细胞分裂素的水平，从而导致叶延展和细胞复制增强、衰老延迟、组织的储库强度增加、氮利用增强等。FUE_55特别是在胚乳中表达，所述胚乳是可能为植物中最强的储库的组织。
FUE_505是在2个重要的基因列表中存在的推定的含AP2结构域的转录因子。一个列表包括玉米素应答性的基因(玉米素是天然存在的细胞分裂素)，而第二个基因列表包括在向氮饥饿植物添加氮后被氮诱导的基因(Wang等人，Plant Physiology，June 2003，第132卷，第556-567页)。FUE_505在ARR(拟南芥应答调节物)的聚簇中发现，所述ARR调节枝条对细胞分裂素的应答。根细胞分裂素的产生根据氮可用性而增加(Yamada等人，FEBS Lett.第436卷，第76-80页，1998)。它与ARRs一起的共调节表明了在细胞分裂素应答中的可能作用。由于枝条的细胞分裂素应答的连续活化，FUE_505的组成型表达非常可能将改善氮利用和植物生长。
实施例2 在计算机上(in-silico)表达的多核苷酸的mRNA表达 使用逆转录测定法及随后的定量实时PCR(qRT-PCR)分析来测定mRNA水平。在不同组织、发育阶段、生长条件和/或不同遗传背景之间比较RNA水平。在不同实验条件/遗传背景下mRNA水平之间的相关性分析作为关于基因在植物中的作用的证据。
方法 RT-PCR分析——从在装满3号蛭石(Vermiculite Size 3)的10升白色桶中生长的玉米植物中新鲜切下根和叶。用自来水向桶内加水直至来自商业杂种的种子发芽。在整个生长期间(5周)，植物用包含2mM CaCl2、1mM MgSO4、1mM KH2PO4、7mM KCl和微量元素混合物的pH5.7-5.8的溶液以2升/桶/天进行灌溉。硝酸铵以下述浓度添加5mM、0.5mM、0.05mM、0.005mM或根本无。对于使用硝酸钾代替硝酸铵的实验，浓度如下2mM CaCl2、2mM MgSO4、1mM KH2PO4、5mM KCl，以及一种下述浓度的KNO35mM、1mM、0.1mM、0.01mM，用补充浓度的KCl以维持10mM的钾终浓度。
定量实时RT-PCR(qRT-PCR)——为了检验表达水平、特异性和性状关联，对从植物的几个部分中提取的总RNA进行逆转录及随后的定量实时PCR(qRTPCR)，所述部分包括例如成熟的和年幼的叶、根和根分生组织、外壳、雄花穗、穗丝等，它们来自如上所述在土壤或罐上在最佳或营养物缺乏条件下生长的植物。对于先前通过生物信息学而预测与肥料使用效率相关的所有基因，测量信使RNA(mRNA)水平，并且分析表达水平和植物营养物状态之间的相关性。使用RNeasy植物小型试剂盒(Qiagen，Germany)并使用由制造商提供的方案从玉米的叶或根中提取总RNA。使用1.5μg总RNA，使用300 U SuperScript II Reverse Transcriptase酶(Invitrogen)、225ng随机脱氧核苷酸六聚物(Invitrogen)、500μM dNTPs混合物(Takara，Japan)、0.2体积x5RT缓冲液(Invitrogen)、0.01M DTT、60U RNAsin(Promega)来进行逆转录，添加经DEPC处理的DDW直至37.5μl。RT反应体系于42℃温育5分钟，随后为70℃15分钟。cDNA在TrisEDTA(pH＝8)中进行1:20稀释。对于qRT-PCR使用5mL稀释的cDNA。
对cDNA(5μL)进行定量RT-PCR，使用x 1 SYBR GREEN PCR主(master)混合物(Applied Biosystems)，正向和反向引物各0.3μM，并添加DDM直至20μL。在Stratagene MX3000实时PCR仪中进行qPCR反应，使用下述条件50℃2分钟，95℃10分钟，40次的95℃15秒和60℃1分钟，随后为95℃15秒，60℃60秒，和70次的60℃10秒，在每次循环中增加+0.5℃。对于每种基因，从来自5个稀释度(稀释度-1:60、1:200、1:600、1:2000、1:10000)的所有样品的RTs库中制备标准曲线。标准曲线图[ct(循环阈值)对log(浓度)]应具有R>＝0.98，而效率为100％+/-5％。使用扩增反应的效率(E)和相应的C.T.(样品穿过阈值时的那个循环)来计算在qPCR中测量的表达水平(Qty)，Qty＝E-C.T.。就非特异性PCR产物或引物二聚体的不存在来证明所获得的解离曲线是否合格。反应至少重复2次。该计算方法基于这样的假设，即GOI(目的基因)和持家基因的反应效率是相似的。
为了使玉米植物的不同组织和生长条件之间的表达水平标准化，将每种基因的表达除以下述4种持家基因的表达的几何平均值肌动蛋白(GenBank登记号AY107106)、RPL19(GenBank登记号AY103679)、亲环蛋白(GenBank登记号X68678)和延伸因子1α(EF1A，GenBank登记号AF136823)。
表29下述引物用于qRT-PCR分析 结果 实时RT-PCR分析提供了计算机选择的多核苷酸序列与氮使用确实相关的证据。尽管大多数基因是由于其与干旱的关联而被选择出来，但发现基因对植物内的氮状况有应答，这暗示干旱和营养物缺乏胁迫之间的串扰。关于在这个测定法中所使用的RNA小组确实反映与氮状态相关的真实变化的证据可以在图3A-D中找到，其中与氮摄取和同化相关的已知基因显示出其表达水平根据灌溉溶液中所使用的氮肥水平而变化。所述曲线图表示了对于每种基因所发现的标准化表达水平除以在灌溉溶液中所使用的最高氮肥浓度下的表达水平。图3A和3B显示了分别对于2种高亲和力的硝酸盐和铵转运蛋白而发现的结果。如所预期的，在较高浓度的底物下，高亲和力转运蛋白的表达下调。相反地，在底物不足的条件下明显必需的那些高亲和力的转运蛋白在低硝酸盐和铵浓度时上调(参见图3A和3B)。如对于氮同化途径中的2种关键酶例如谷氨酰胺合酶1C和谷氨酰胺合酶2所预期的，它们的表达在高底物浓度下上调，如分别在图3C和3D中所显示的。通常，高N浓度上调低亲和力的转运蛋白。相反地，低N浓度上调高亲和力的转运蛋白。参与N同化(n至氨基酸的转变)的酶在氮存在时被上调。实施例1中所鉴定的基因显示出对于对照基因所发现的独特的氮应答行为(图3A-D)。如对于关键对照同化酶所发现的，FUE_3(如图4A中所示)显示出在高底物浓度下上调，这表明这种基因与植物的氮状况的明确关联以及因此它与氮相关应答的联系。对于FUE_3所发现的相同上调在实施例1中所包括的几种其他基因中被发现，例如FUE_12(如图4B中所示)、FUE_30(如图4C中所示)、FUE_33(如图4D中所示)、FUE_34(如图4E中所示)、FUE_38(如图4F中所示)、FUE_43(如图4G中所示)、FUE_47(如图4H中所示)、FUE_48(如图4I中所示)、FUE_49(如图4J中所示)和FUE_52(如图4K中所示)。
然后再次，在实施例1中包括在当氮肥供应不足时显示出紧密上调的基因。预期这种类型的基因与参与在氮缺乏条件下的氮同化、贮存和使用的途径相关，如高亲和力的硝酸盐和铵转运蛋白的情况(图2C和2D)。图5A显示了关于FUE_4的结果，所述FUE_4是在低氮肥可用性下经历强上调的基因，这表明这种基因在对氮缺乏条件的植物内源性应答中的明确作用。同样地，实施例1中的其他基因展现出与FUE_4相似的氮应答性曲线，例如FUE_10(如图5B中所示)、FUE_37(如图5C中所示)、FUE_46(如图5D中所示)和FUE_50(如图5E中所示)。
总之，本文呈现的结果清楚地暗示了计算机选择的基因和氮相关途径之间的紧密相关性。
实施例3 基因克隆和用于植物表达的双元载体的制备 克隆策略 将在上文在实施例1中选择并在实施例2中验证的50种基因中的28种基因克隆到双元载体内以用于产生转基因植物。对于克隆，首先鉴定全长开放读码框(ORF)。通过将几种翻译算法的结果与来自其他植物物种的已知蛋白质相比较，分析EST聚簇和在某些情况下分析mRNA序列以鉴定完整开放读码框。在未发现完整编码序列的情况下，使用来自Ambion或Clontech的RACE试剂盒(RACE＝Rapid Accessto cDNA Ends)从在上文实施例2中描述的植物样品中制备RNA，从而得以获取基因的全cDNA转录物。
为了克隆全长cDNAs，对于从叶、根或其他植物组织(在正常或营养物缺乏条件下生长)中提取的总RNA进行逆转录及随后的PCR(RT-PCR)。使用其他地方描述的标准方案(Sambrook J.，E.F.Fritsch和T.Maniatis.1989.Molecular Cloning.A LaboratoryManual.，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York.)来进行总RNA提取、cDNA产生和PCR扩增，并且对于本领域技术人员来说是基本的。使用PCR纯化试剂盒(Qiagen)来纯化PCR产物，并且使用ABI377测序仪(Applied Biosystems)进行经扩增的PCR产物的测序。
为了促进cDNAs的克隆，给每种引物的5′原有末端添加8-12bp延长部分。引物延长部分包括核酸内切酶限制位点。使用2种参数来选择限制位点a.该位点不存在于cDNA序列中。b.正向和反向引物中的限制位点经过设计，使得经消化的cDNA以有义形式插入用于转化的双元载体内。例如，通过将源于pGL3基本质粒载体(Promega，登记号U47295；bp4658-4811)的合成poly-(A)信号序列插入双元载体pBI101.3(Clontech，登记号U12640)的HindIII限制位点中来构建pPI质粒载体。
纯化PCR产物(PCR Purification Kit，Qiagen，Germany)，并根据所使用的引物(Roche，Switzerland)用限制位点进行消化。将经消化的PCR产物克隆到用相同的限制酶进行消化的双元载体pPI中。将经消化的PCR产物和线性化的质粒载体使用T4DNA连接酶(Roche，Switzerland)进行连接。使用下述引物从提取自上述组织的RNA中克隆下述基因 表30-从cDNA文库中克隆的基因和用于克隆的引物

某些经克隆的多核苷酸的合成序列从商业供应商(GeneArt，GmbH)处定购。基于在实施例1中描述的推定的所编码的多肽序列，在计算机上设计合成的DNA。
为了优化编码序列，使用从植物转录组中计算出的密码子使用表(此类表的例子可以在http://www.kazusa.or.jp/codon/处可在线获得的Codon Usage Database中找到)。优化的编码序列以如下方式进行设计在编码的氨基酸序列中不引入变化，而同时使用对于在双子叶植物主要是番茄和拟南芥；和单子叶植物例如玉米中的表达来说优选的密码子。此类优化的序列促进更好的翻译速率和因此更高的蛋白质表达水平。向该经优化的序列添加侧翼的、另外的独特限制酶位点——在5′末端处的SalI、Xba I、BamHI、SmaI，和在3′末端处的SacI。对于其制备了密码子优化的合成序列的基因是FUE_2(SEQ ID NO1317)、FUE_3(SEQ ID NO1319)、FUE_4(SEQ ID NO1320)、FUE_40(SEQ ID NO1321)、FUE_7(SEQ ID NO1322)、FUE_8(SEQID NO1324)、FUE_9(SEQ ID NO1325)、FUE_10(SEQ ID NO1326)、FUE_12(SEQ ID NO1327)、FUE_13(SEQ ID NO1328)、FUE_14(SEQ ID NO1329)、FUE_16(SEQ ID NO1330)、FUE_37(SEQ ID NO1331)、FUE_41(SEQ ID NO1332)、FUE_46(SEQ IDNO1333)、FUE_47(SEQ ID NO1334)、FUE_49(SEQ ID NO1335)、FUE_52(SEQ ID NO1336)。
合成两种未优化的序列并进行克隆以用于在转基因植物制备中过表达，所述两种未优化的序列被命名为“FUE_2_Original”(SEQ ID NO1318)和“FUE_7_Original”(SEQ ID NO1323)，等同于其内源性的玉米序列。
包含FUE基因和用于驱动其表达的植物功能性启动子的双元载体的产生——通过将源于pGL3基本质粒载体(Promega，登记号U47295；bp4658-4811)的合成poly-(A)信号序列插入双元载体pBI101.3(Clontech，登记号U12640)的HindIII限制位点中来构建质粒pPI。在某些情况下，所使用的主链双元质粒是pGI，其类似于pPI但GUS基因被GUS-内含子基因替换(Vancanneyt.G，等人，MGG 220，245-50，1990)。pGI用于克隆所有多核苷酸序列，其最初在35S启动子的控制下[Odell，JT，等人，Nature 313，810-812(28 February 1985)；SEQ ID NO1337]。
将一些多核苷酸序列克隆在如下所述的其他优先启动子下。这些启动子之一由于其在根中的富集表达而在本文中被命名为“RootP”(SEQ ID NO1338)，使用下述引物通过直接PCR从分离自拟南芥的基因组DNA中扩增和克隆出该启动子。
表31 该启动子是基因ATXTH19(AT4G30290，木葡聚糖内转葡糖基酶/水解酶19)的1110bp上游区。已显示该经克隆的序列驱动根特异性表达(Vissenberg K等人，Plant Cell Physiol.2005 Jan；46(1)192-200)。将下述基因克隆入RootP启动子序列的下游FUE_3、FUE_4、FUE_8、FUE_9、FUE_13、FUE_14、FUE_16、FUE_33、FUE_34_Evo。由uid A基因(GENBANK登记号S69414)编码的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)作为对照。
TT105启动子(SEQ ID NO1339；2004/081173)用于以与由35S启动子介导的水平不同的水平介导组成型的普遍存在的表达。启动子TT105包含包括第一个外显子和第一个内含子的一部分的ELP基因(木质素异位沉积，GENBANK登记号NM_100466，AT1G05850)上游区域。克隆在TT105启动子下的基因是FUE_502、FUE_504、FUE_39和FUE_52。此处再次将由uid A基因编码的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)克隆在TT105启动子下。
实施例4 表达FUE基因的转基因植物的产生 材料和方法 拟南芥的转化——根据下述参考文献来完成Clough SJ，Bent AF.(1998)Floral dipa simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.Plant J.16(6)735-43；和Desfeux C，Clough SJ，Bent AF.(2000)Femalereproductive tissue sare the primary targets of Agrobacterium-mediated transformation by the Arabidopsis floral-dip method.Plant Physiol.123(3)895-904)。简而言之，使用由Clough SJ和Bent AF(10)以及由DesfeuxC等人(11)描述的Floral Dip程序(具有少量修改)来转化拟南芥Columbia变种(T0植物)。简而言之，将拟南芥Columbia(Co10)T0植物播种在装满湿泥炭基生长混合物的250ml罐中。罐用铝箔和塑料圆盖覆盖，放置于4℃3-4天，随后打开并在生长室中于18-24℃以16/8小时的光/暗循环进行温育。T0植物在开花期前6天准备用于转化。携带具有FUE基因的双元载体的土壤杆菌的单个菌落在补充有卡那霉素(50mg/L)和庆大霉素(50mg/L)的LB培养基中进行培养。该培养物于28℃在剧烈摇动下温育48小时，并在4000rpm下离心5分钟。将包含土壤杆菌细胞的粒状沉淀重悬浮于转化培养基中，所述转化培养基包含半强度(2.15g/L)的Murashige-Skoog(Duchefa)；0.044μM苄氨基嘌呤(Sigma)；112μg/L B5 Gambourg维生素(Sigma)；5％蔗糖；和在双蒸馏水中的0.2ml/L Silwet L-77(OSI Specialists，CT)，pH为5.7。
通过下列方式来进行T0植物的转化将每个植物倒置在土壤杆菌悬浮液中，从而使得花茎被淹没3-5秒。将每个经接种的T0植物立即置于塑料托盘中，随后用干净的塑料圆盖覆盖以维持湿度，并在黑暗中在室温下放置18小时以促进感染和转化。随后打开经转化的(转基因)植物上的盖子，并将植物转移至温室以进行恢复和成熟。转基因T0植物在温室中生长3-5周直至长角果变成褐色且干燥的，随后收获来自植物的种子并置于室温下直至播种。
为了产生具有所述基因的T1和T2转基因植物，通过浸入70％乙醇中1分钟，随后浸入5％次氯酸钠和0.05％ Triton X-100中5分钟来对从转基因T0植物收集的种子进行表面灭菌。将经表面灭菌的种子在无菌蒸馏水中充分洗涤，随后置于培养平板上，所述培养平板包含半强度的Murashige-Skoog(Duchefa)；2％蔗糖；0.8％植物琼脂；50mM卡那霉素；和200mM羧苄青霉素(carbenicylin)(Duchefa)。培养平板于4℃温育48小时，随后转移至生长室于25℃再温育一周。将有生活力的T1拟南芥植物转移至新鲜的培养平板上以进行另外一周的温育。温育后，从培养平板中取出T1植物，并种植在包含于250ml罐中的生长混合物之中。使转基因植物在温室中生长至成熟。在与用于培养和生长T1植物相同的条件下，培养从T1植物收获的种子并生长至成熟以作为T2植物。从每种构建体制备至少10个独立的转化事件，关于其收集大量T2种子。
玉蜀黍的转化——该程序根据(Bronwyn R.Frame等人，Agrobacterium tumefaciens-Mediated Transformation of MaizeEmbryos Using a Standard Binary Vector System，Plant Physiology，May 2002，第129卷，第13-22页)或在别处从Iowa State University的Plant Transformation Facility(http://www.agron.iastate.edu/ptf/Web/mainframe.htm)可获得的几种方案来完成。
实施例5 根据表达水平来选择表达FUE基因的转基因拟南芥植物 材料和方法 转基因植物如上文实施例4中所述进行生长。如上文实施例2中所述的，从来自转基因植物的10朵新鲜切离的花中提取总RNA。为了测定转基因的相对表达水平，如上文实施例2中所述进行qRT-PCR反应，并且针对在相同样品中测量的2种持家基因的表达的几何平均值对结果进行标准化。
表31-用于选择转基因植物的引物 结果 对于每种构建体筛选约12个转基因事件。结果是高度重复性的，并且显示出，在12个随机转化事件内发现转基因表达的约20-40倍差异。此类发现的代表性例子显示于表32、33和34中。基于这些发现，获取显示出比中值更高的表达水平的5个不同事件以用于进一步的基因功能验证(参见实施例6-9)。
表32 表33 表34 实施例6 在组织培养测定法中的改善的肥料使用效率 材料和方法 测定法1使用小植物的氮使用效率测定法——该测定法根据Yanagisawa-S.等人(“Metabolic engineering with Dof1transcription factor in plantsImproved nitrogen assimilationand growth under low-nitrogen conditions”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101，7833-7838)(具有少量改动)来进行。
将在补充有选择试剂的0.5 x MS[Murashige-Skoog]中生长7-10天的转基因植物转移至2种氮限制条件中其中结合氮浓度(NH4NO3和KNO3)是0.2mM或0.05mM的MS培养基。使植物再生长30-40天，并且随后进行拍照，从琼脂中逐个取出(没有根的枝条)并立即称重(鲜重)以用于随后的统计分析。将对于其只能获得T1种子的构建体播种在选择性培养基上并将至少25株幼苗(每一个代表独立的转化事件)小心地转移至氮限制培养基。关于对于其可获得T2种子的构建体，分析不同的转化事件。通常，将来自每个事件的25个随机选择的植物转移至氮限制培养基，使之再生长3-4周并在此阶段结束时逐个称重。将转基因植物与在相同条件下平行生长的对照植物相比较。在相同启动子下表达uidA报道基因(GUS)的模拟转基因植物用作对照。
统计分析——为了鉴定赋予显著改善的氮使用效率(或对非生物胁迫的耐受性或扩大的根构造，参见下文)的基因，将从转基因植物获得的结果与从对照植物获得的结果相比较。使用单向ANOVA来分析植物面积数据、种子重量数据和植物重量数据。为了鉴定具有优越性能的基因和构建体，分别分析来自所测试的独立转化事件的结果。此外，还在考虑了从所测试的所有独立转化事件和具体构建体获得的结果的情况下分析基因和构建体。对于基因对对照的分析，应用Student′s t检验或Tukey HSD检验，使用p<0.05的显著性。使用JMP统计学软件包(版本5.2.1，SAS Institute Inc.，Cary，NC，USA)。在下文实施例6-9中使用相同的统计学分析。
结果 就许多商业上所需的性状来验定本发明的多核苷酸序列。
图7显示了FUE_504或FUE_39改善表达其的转基因植物的NUE的能力。明显地，生长在氮上的转基因植物比对照植物更大和更重，所述对照植物在用于表达转基因的相同启动子下表达对照基因。为了验证由转基因植物达到的重量增加是统计学上显著的，对植物逐个称重并分析整个事件群体的结果。如下表35中所示，表达FUE_504的转基因植物比对照相应物明显更重。该结果证实了NUE的改善，因为表达FUE_504的转基因植物能够生产比从类似的贫氮培养基开始的对照植物明显更多的生物量。
表35
值得注意的是，无论何时，将T1植物用于测定FUE_504的效应；因此所测试的每个植物是不同转化事件的结果。考虑到这点，显而易见的是，对于T1植物发现的效应是与转基因整合位点不相关的转基因的结果。当验定T2植物时，所述结果是可重现的，由此在3个独立转化中在限制氮的条件下增加的鲜重是明显的。对于FUE_39和FUE_52获得了类似的结果。如下表36中所示，3个独立的转基因事件有助于在限制氮的条件下小植物生物量的增加。所述结果表明，FUE_39和FUE_502的表达也诱导了氮使用效率中的显著改善。
表36从在0.05mM结合氮浓度(NH4NO3和KNO3)下生长30天的～25个小植物中测量的鲜重的最小二乘平均值 (使用Student′s t检验进行分析的结果) 不由相同字母连接的水平是显著不同的 当在0.2mM组结合氮浓度下检查相同事件时获得相似的结果。当与对照植物相比较时，用TT105::NUE_39转化的4个事件产生统计学上显著更高的生物量。如表37中所示，在用TT105::NUE_52转化的3个事件和用TT105::NUE_504转化的2个事件中获得了相似的结果。
表37从在0.2mM结合氮浓度(NH4NO3和KNO3)下生长30天的～25个小植物中测量的鲜重的最小二乘平均值 (使用Student′s t检验进行分析的结果) 不由相同字母连接的水平是显著不同的 如下表38中所示，在使用在组成型的普遍存在的启动子(35S)下过表达FUE_8、FUE_14或FUE_40的转基因植物的T1种子进行的测定法之中也获得阳性结果。
表38从在0.05和0.2mM结合氮浓度(NH4NO3和KNO3)下生长27天的～25个小植物中测量的鲜重的最小二乘平均值 (使用Student′s t检验MANOVA进行分析的结果) 不由相同字母连接的水平是显著不同的 对于表达FUE基因的其他构建体的不同事件获得了相似的结果。如下表39中所示，使用这种测定法检查了具有在35S启动子下的FUE_39基因的另外构建体。此外，如下表39中所示，过表达FUE_49基因的2个独立转化事件和用FUE_4、FUE_3或FUE_43转化的另外事件显示出在所测试的2种氮限制条件下产生明显更高的生物量。
表38从在0.05和0.2mM结合氮浓度(NH4NO3和KNO3)下生长27天的～25个小植物中测量的鲜重的最小二乘平均值 (使用Student′s t检验MANOVA进行分析的结果) 不由相同字母连接的水平是显著不同的 考虑到使用这种测定法而获得的结果，几种FUE基因已显示出它们诱导氮使用效率的显著改善的能力。显示出显著结果的基因是FUE_504、FUE_39、FUE_52、FUE_502，以及下述基因的组FUE_14、FUE_8、FUE_40和FUE_49、FUE_3、FUE_4和FUE_43。
测定法2氮使用效率全植物测定法在受限制的氮浓度下的生长速率——开发了被设计用于鉴定改善的氮使用效率的另外测定法。这种测定法跟踪在温室中在受限制的氮可用性下生长的植物的莲座型叶丛区域生长。播种经表面灭菌的种子，并使植物于25℃以23小时光-1小时暗的日循环下在存在有2％蔗糖的0.5 x Murashige-Skoog培养基中生长7-10天。然后，将相似大小的幼苗小心地转移至装满惰性生长培养基支持物(精细的珍珠岩混合物)的100ml罐。使幼苗进一步发育一周，其间用包含丰富供应的微量和常量营养物的溶液进行灌溉。用至少2体积的低硝酸盐自来水从罐中洗去过量的肥料。然后，逐个检查植物，并且只选择健康的植物用于生长速率分析。将选择的植物随机分布在几个托盘中，并用于关于在氮限制条件下的生长率分析的测定法。通过用包含0.5mM无机氮(结合的KNO3和NH4NO3浓度)并补充有2mM CaCl2、1.25mM KH2PO4、1.50mM MgSO4、5mM KCl、0.01mM H3BO3和微量元素的溶液灌溉植物来达到恒定氮限制条件。为了跟踪植物生长，在氮限制条件开始当天和随后每2-3天给托盘拍照，进行另外的～20天。然后，使用图6中描述的方法从数码照片中测定莲座型叶丛植物面积。ImageJ软件用于从数码照片中定量植物大小(http://rsb.info.nih.gov/ij/)，其中使用被设计用于分析作为时间的函数的来自独个植物的莲座型叶丛区域大小的专有脚本。将生长百分比计算为植物莲座型叶丛面积除以在第1天时测量的起始植物面积之比。为了在该实验内鉴定转基因植物，使用PCR来检查选择标记基因的存在。从植物获取叶样品，提取基因组DNA并作为用于PCR的模板，所述PCR使用对于所述选择标记基因来说特异的引物。给阳性植物加上标签，以便从该分析中排除非转基因植物。
表40用于PCR分析的引物 结果 与在其中FUE_39显示出改善的NUE的先前测定法之中获得的结果相一致，此处呈现的结果显示出，FUE_39显著改善全植物中的NUE。如下表41中所示，发现当与野生型植物或在用于表达FUE_39转基因的相同启动子下表达GUS报道基因的转基因植物相比较时，表达FUE_39的2个独立转基因事件显示出增强的NUE。
表41FUE_39显示出在限制氮的条件下的生长速率测定法的结果。显示了显示出增强的NUE的2个事件。
不由相同字母连接的水平是显著不同的 除了FUE_39外，还发现过表达FUE_7和FUE_41的事件在限制氮的条件下显示出增加的生长速率。如表42中所示，在35S启动子下的FUB_7、FUE_41、FUE_50、FUE_16表达明显比对照植物(野生型或在35S启动子下表达报道基因)更好。
表42 不由相同字母连接的水平是显著不同的 因此，本文描述的测定法跟踪植物在限制氮的条件下生长的能力。因为上述转基因植物明显比对照植物发育得更快，所以可以假定突出的事件能够使可用的氮同化并将其转变成有机物质。因为类似地处理在该实验中的所有植物，所以该结果表明，突出的事件能够更有效地利用可用的氮并因此显示出增强的氮使用效率。
测定法3处于受限制的氮可用性情况下的种子产量测定法——玉米植物吸收并将大多数氮贮存在叶和杆中直至开花。贮存的营养物随后重新分布至正在发育中的谷粒之中。在本测定法中，植物在如上文测定法2中所述的受限制的氮条件下生长约45天，随后只使用自来水来进行生长直至完全成熟。因此，植物被迫将贮存的氮重新分布至正在发育中的种子。预期贮存更多的氮的植物具有更佳的产量。从独个植物收集种子，并且将产量测量为种子重量。对于每个受试事件通常测量至少大约6个转基因植物的产量。
结果 在这种测定法中，如表43中所示，发现过表达FUE_43(在35S启动子下)的转基因植物具有增加的种子产量。事件之一的结果在下面呈现。
表43 不由相同字母连接的水平是显著不同的 如通过本文公开的不同测定法的结果所证实的，本文显示的结果作为整体来看证实了，来自本发明的基因能够改善氮使用效率的不同方面。
实施例7 评估在非生物胁迫条件下的转基因植物生长 对盐度或渗透胁迫的耐受性旨在鉴定在高盐、干旱或其组合或其他环境胁迫下赋予更好的发芽、幼苗活力或生长的基因。在不同发育阶段时，植物在其对盐胁迫、高渗压剂和干旱的耐受性方面不同。因此，在不同胁迫条件下独立地评估种子发芽、植物发育和产量。
获取处于不同发育阶段的植物并用浓度渐增的NaCl(例如50mM、100mM、200mM、400mM)或浓度恒定的NaCl来灌溉它们，由此产生典型的盐度耐受性测试。随后在抑制对照植物的浓度下，在其外部表型表现、萎蔫程度以及达到成熟和产生后代的总体成功方面，将转基因植物与对照植物进行比较。所测量的耐受性的定量参数包括平均湿重和干重、以及产生的种子重量、平均种子大小和产生的种子数目/植物。进行渗透胁迫测定法(包括NaCl和甘露醇测定法)，以确定渗透胁迫耐受表型是否是NaCl特异性的，或者它是否是一般的渗透胁迫相关表型。进行干旱测定法，例如在长时间段期间停止灌溉并测量萎蔫率、恢复和最终产量。一般而言，对渗透胁迫耐受的植物更耐受干旱、盐度和冰冻条件，并因此就农艺学性状而言是高度有价值的。
材料和方法 用于就改善的非生物胁迫耐受性来测试植物的方法包括在不利条件(例如高盐度和高渗压剂)下测试发芽和幼苗生长。
在非生物胁迫下的发芽测定法——发芽测试比较了来自转基因植物的、可以完成发芽过程(从种皮中的胚根伸出和子叶的完全打开)的种子百分比和来自以相同方式处理的对照植物的种子百分比。在种植后持续3周进行发芽和幼苗活力的评估。为了测量发芽和幼苗生长，将来自T2植物的种子进行表面灭菌并逐个播种在方形琼脂平板上，所述琼脂平板包含例如补充有高盐度(150mM NaCl)或高渗压剂(210mM甘露醇)的固化基础培养基(补充有0.8％植物琼脂的50％Murashige-Skoog培养基(MS)+维生素)。在播种后，将平板转移至4℃ 2-3天以用于分层(stratification)，并随后生长3周。
为了跟踪不利条件下的发芽和生长，人工或自动筛选植物并测定植物大小。从每种构建体分析选自实施例5的各种独立转化事件。将表达来自本发明的基因的植物与在相同条件下在相同平板上播种的对照植物(野生型或用模拟物转化的植物)进行比较。
在非生物胁迫下的幼苗生长——用幼苗进行的补充实验跟踪植物对不利条件的耐受性。在卡那霉素存在(对于转基因植物)或不存在(对于野生型对照植物)下，将经表面灭菌的种子播种在基础培养基[补充有0.8％植物琼脂作为固化剂的50％ Murashige-Skoog培养基(MS)+维生素]中。在播种后，将平板转移至4℃ 2-3天以用于分层，并随后于25℃以23小时光-1小时暗的日循环生长7-10天。在这个时间点时，将随机选择的幼苗小心地转移至包含高盐度条件(150mMNaCl)或类似于在干旱期间发现的高渗透性的条件(210mM甘露醇)的平板。使用数字成像，作为时间的函数来跟踪植物生长。为了跟踪在不利条件下的植物生长，在它们转移至胁迫条件的当天(第1天)给植物拍照。随后在将植物转移至胁迫条件后每数日获取照片，并且直到转移后12天。然后，根据数码照片测定莲座型叶丛植物面积。ImageJ软件用于从数码照片中定量植物大小(http://rsb.info.nih.gov/ij/)。设计专有脚本以分析作为时间的函数的独个植物莲座型叶丛区域的大小。图6显示了用于图像面积定量的方法。在每个胁迫实验中，从每个构建体分析5-10个独立转化事件，并且分析来自每个事件的至少6个随机选择的植物。使表达来自本发明的基因的植物与在相同的胁迫诱导平板上播种的对照植物(内部对照)或与在相同实验中使用的所有对照植物的平均测量值(所有对照)进行比较。
结果 通过跟踪在胁迫期间的植物生长测定了盐度和渗压剂耐受性，如由植物绿色面积所证明的。使用上述程序来检查几种基因和构建体，并发现显著的耐受性结果。例如，过表达下述基因的转基因植物显示出对高盐度胁迫的统计学上显著改善的耐受性FUE_7、FUE_10、FUE_14、FUE_16、FUE_33、FUE_37、FUE_39、FUE_40、FUE_41、FUE_47、FUE_50、FUE_502、FUE_503和FUE_504。
此外，下述基因在当暴露于高渗透性胁迫时将非生物胁迫耐受性赋予过表达其的转基因植物方面提供了统计学上显著的结果FUE_3、FUE_9、FUE_10、FUE_13、FUE_37、FUE_39、FUE_40、FUE_41、FUE_43、FUE_49、FUE_502、FUE_503和FUE_504。
此外，发现表达FUE_43和FUE_503的转基因植物在高渗压剂条件下具有增加的发芽能力(数据未显示)。
另外，表达下述基因的转基因植物显示出显著增加的对盐度或高渗透性的非生物胁迫耐受性FUE_10、FUE_37、FUE_39、FUE_40、FUE_41、FUE_502和FUE_504。
应当指出，一般地，表达上述基因并且在某些情况下还在不同启动子下的几个转基因事件支持了所述结果的重要性。表44a-b概述了这些发现。结果表示为相对于当转移至胁迫条件(即，第1天)时的植物大小的生长面积百分比。
表44a-在盐度胁迫下显示出改善的幼苗生长的基因列表


表44b-在渗压剂胁迫下显示出改善的幼苗生长的基因列表


实施例8 评估在转基因植物中根构造的改变 现代农业中的许多关键性状可以通过根构造方面的改变来加以解释。根的大小和深度与干旱耐受性和肥料使用效率相关。较深的根系可以接近贮存于较深土层中的水。类似地，高度分枝的根系提供了更好的土壤覆盖度，并因此可以有效地吸收可用的所有常量和微量营养物，产生增强的肥料使用效率。为了测试转基因植物是否产生不同的根结构，使植物生长在垂直放置的琼脂平板中。每数日给平板拍照并且根据数码照片评估被植物根覆盖的最大深度和总面积。从制备的每种构建体，重复检查几个独立转化事件。为了评估根特征之间的显著差异，采用使用Student′s t检验的单ANOVA，以便鉴定显示出突出的根特征的事件并为所述发现提供统计学得分(统计学测定法如上所述)。
结果 当分析根构造的不同方面，例如覆盖的根总面积和由根系达到的最大深度(长度)时，发现表达FUE基因的转基因植物具有显著的特征。例如，基于在发芽后21天进行的测量，发现过表达FUE_10和FUE_49的转基因植物具有更高的根区域覆盖率(参见表45)。
表45在第21天时测量的根面积(cm2) 不由相同字母连接的水平是显著不同的 类似地，发现过表达原始FUE_16和FUE_7的植物产生最长的根构造(参见下表46)。发现FUE_16在测试的所有天(发芽后7、14和21天)时，从测试的所有构建体中产生最快的穿透性根系。
在实践中，这些发现暗示，在相同时间段内，与其他植物相比较，过表达FUE_16和FUE_7_Original的植物达到更深的土层。预期这些植物最大限度地从土壤中获取肥料和水并更好地经得住更长时期的干旱。
表46在第21天时测量的根长度(cm)的统计学分析 不由相同字母连接的水平是显著不同的 增强的根构造使得表达FUE基因的转基因植物能够更成功地吸收土壤中可用的营养物(肥料)和水。增加的摄取和营养物回收对于改善的肥料使用效率和非生物胁迫耐受性来说是关键特征。较深的根系使得植物接近较深土层中可用的水，增强了对延长的干旱期的耐受性并因此在严苛条件下也确保高产量。
实施例9 表达FUE_40的植物的特征在于用于最大种子生产的植物构造 多种产生种子的器官(荚果、水果等)和强壮的花茎的存在是产生高种子产量的关键特征。在使本发明变为实际的同时，本发明人惊讶地发现，在组成型启动子下表达FUE_40的转基因植物具有改善的生殖器官构造。花茎是异常坚硬和强壮的，并且携带大量长角果(参见图9，显示了不同的独立转化事件)。结果通过三盲测定法来证实，所述测定法鉴定出每株植物具有更多长角果的植物，这可能是由于侧生花序枝条的更快速生长。有趣的是，所有植物是具有相同构建体(在35S启动子下的NUE40)的不同转化事件(参见图9)。植物发育特征的这个变化可以用于显著增加植物的种子产量。
实施例10 CT-9(SEQ ID NO1340、1341)和CT-71(SEQ ID NO1342、1343)赋予转基因番茄以干旱耐受性和增加的产量 在进一步使本发明变为实际的同时，本发明人令人惊讶地揭示出，CT_9(SEQ ID NO.1340、1341，先前公开于PCT申请号WO2005/121364中)和CT_71(SEQ ID NO.1342和1343，先前公开于PCT申请号WO2005/121364中)在表达其的转基因植物中赋予干旱耐受性和增加的产量。CT_9和CT_71公开在Evogene Ltd.的PCR申请号WO2005/121364中和在US5,597,718(CT_71)中。
材料和实验操作程序 干旱测定法——本文描述的干旱测定法通过控制供水量和干旱间隔在模拟干旱胁迫的田间条件中实现。该测定法，单来源滴灌系统(onesource dripping irrigation system，OSDI)，类似于农田，因为它以相对统一的方式产生水分缺乏并使得能够测量干旱对于小规模植物群体的影响。
因此，本灌溉方法可以如下实现 (a)在土壤上或土壤中放置滴灌系统，以获得在X和Y方向上彼此相隔20-40cm(例如，30cm)分布的灌溉孔；和 (b)以0.5-2升水/小时的灌溉速率通过每个所述灌溉孔进行连续灌溉。
用于模拟干旱条件的灌溉系统的一种布置(10)可以依照本发明的教导来使用，所述灌溉系统的布置包含下述组分并在图10中图解说明 (i)具有在X和Y方向上彼此相隔20-40cm分布的多个灌溉孔(12)的滴灌系统；和 (ii)用于以0.5-2升水/小时通过每个所述灌溉孔进行连续灌溉的水供应和控制系统(14)。
所使用的优选滴头是具有抗虹吸和抗排干系统的压力补偿的厚壁滴头线(来自Netafim Israel的UniRamTM CNL #16010，流速1.6l/小时)。抗虹吸系统防止泥土回流到滴头线内，而抗排水(CNL)系统消除排水和再充填效应，并改善脉冲式灌溉的效率。
OSDI法基于线来源喷洒灌溉系统(Hanks等人，1976 Soil Sci.SocAm.J.40，第426-429页)而开发出来，进行了明显的改动。不用喷洒灌溉，而使用滴灌。为了产生均匀和深的湿润层(至少60cm深度)而不是通常由滴灌而产生的洋葱形状的层，使用允许在相对长的时间段中提供少量水的低压补偿滴灌系统。
在靠近Rehovot，Israel的开放田间网室(nethouse)中，在2006年夏季(从7月到9月)期间，在轻质土壤中进行该实验。
土壤的水容量通过从下述3个深度抽取土壤样品并使用标准操作程序来进行测量0-20cm、20-40cm和40-60cm。每周定期测量这些土层中的含水量。该土壤包含5％湿存水，而该土壤的最大水容量为20％。在播种之前将所有肥料施加到土壤内。计算所有季节足够的磷和钾的量。通过灌溉系统，如所推荐的并对所有处理相等地来施加氮。
每行宽193cm，包含3条滴灌线，产生9个滴头/1平方米的覆盖率。对每种处理分开进行水控制。在实验开始前使土壤完全干燥。
播种在苗圃条件下在规则的水灌溉下进行。在进入湿润土壤内4周后移植幼苗。在移植前用于均匀地灌溉的水量在60cm深度处达到最大水容量(20％w/w)，然而不产生水超负荷。根据商业生长方案将每株植物靠近滴头移植，植物之间距离30cm，而总密度为2600株植物/1000平方米。该实验在包含用不同水分水平和间隔灌溉的3行(WLI-0、WLI-1、WLI-2)的4个地块中组织。不同的水方案在移植后4周当植物达到开花阶段时才开始。根据标准生长方案的建议，在每周开始时计算在测定法期间每周供应的水量。
WLI-0处理接受推荐的总每周灌溉体积，但分成3次灌溉。另外2种其他处理(WLI-1和WLI-2)表示2种不同水平的水分缺乏。WLI-1也是一周灌溉3次，但供应的水量是给WLI-0供应的灌溉的一半。在每周结束时，WLI-1植物获得达到最大土壤水容量所需的水量。WLI-2不是在一周期间而是在每周开始时进行灌溉。供应水以达到最大水容量。水分胁迫实验在整个开花期(23天)期间持续，相应于4个循环的上述的胁迫。其后，所有处理获得推荐的水量。
水量的计算等于干燥土壤和具有最大水容量的土壤中的含水量之间的差异。在每个胁迫循环结束时，根据土壤中的实际含水量来比较处理之间的水量(表47) 表47在第4个胁迫循环结束(23天)时土壤中的含水量(％)
值得注意的是，在胁迫期间，与对照(WLI-0)相比较，处理WLI-1和WLI-2获得总共少75％的水。
基因克隆和表达——CT-9和CT-71的生物信息学鉴定、克隆和表型评估在专利号WO2005/121364中得到描述。
经由根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)转化，将与包含35S启动子的双元构建体连接的CT-9或CT-71转化到番茄植物中。
60μL根瘤土壤杆菌LB4404感受态细胞(约109细胞/ml)用20ng双元质粒经由电穿孔进行转化，使用MicroPulser电穿孔仪(Biorad)、0.2cm杯池(cuvette)(Biorad)和EC-2电穿孔程序(Biorad)。
土壤杆菌细胞在0.8mL LB液体培养基上于28℃生长3小时，并将0.2mL细胞悬浮液铺板在LB-琼脂平板上，所述LB-琼脂平板补充有抗生素链霉素300mg/L(对于土壤杆菌菌株LB4404)和卡那霉素50mg/L(Sigma)。随后，平板于28℃温育48小时。使土壤杆菌菌落进行生长，并对土壤杆菌细胞进行PCR扩增，使用被设计成跨越双元载体中的插入序列的引物。
PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上进行分离，并且通过与DNA梯带(MBI Fermentas)相比较来确定产物大小。使用用于PCR扩增的引物来对具有预期大小的PCR产物进行测序。进行插入序列的测序，以验证将正确克隆引入了土壤杆菌细胞中。
使用ABI 377测序仪(Amersham Biosciences Inc.)来进行DNA测序。
用CT_9或CT-71转化Micro-Tom番茄植物——番茄(西红柿)(Lycopersicon esculentum，var MicroTom)的转化和转基因植物的培养根据Curtis等人，1995 Methods Mol Biol.1995；4459-70，和Meissner等人，2000.Plant J.2000May；22(3)265-74来进行。在转化后，T1 MicroTom番茄植物在包含于1000ml罐中的混合物之中生长，直至座果和T2种子收获。将在35S启动子调节下过表达CT-9或CT-71基因的转基因micro-tom番茄植物与M82商业品种植物进行异花授粉。随机获取源于代表了位置效应的4个不同插入事件的4株植物。包含转基因的F1杂种用于进一步评估。从相同转基因群体中分离的非转基因植物用作阴性对照。为了区分转基因和非转基因植物，使用NPTII基因的引物来进行PCR筛选，如实施例6中所述的。
结果 在约90％红色果实的果实成熟阶段时，评估植物并收获果实。通过测量株冠的质量、根长度和质量来评估植物性能。对于每个植物，通过获取绿色和红色全尺寸的(full size)果实来测量产量。结果使用单侧Anova检验进行分析并概括于下表48中。
表48与对照植物相比较，表达CT-9基因的在严重水分胁迫(WLI-2)下生长的植物品系的果实总产量 a，b，c-不由相同字母连接的水平是统计学上显著不同的(P<0.05) 与对照植物相比较，过表达CT-9的转基因品系在严重水分缺乏条件(WLI-2)下显示出显著更高的果实产量。
对于表达CT-9和CT-71的品系，在规则的水灌溉下还观察到产量的改善(参见下表49)。
表49与在有利的水灌溉(WLI-0)下生长的对照植物相比较，过表达CT-9的品系的果实总产量 a，b，c-不由相同字母连接的水平是统计学上显著不同的(P<0.05) 实施例11 过表达FUE_34_Evo的植物的特征在于增强的侧出分枝 侧芽活化的控制在现代农业以及花卉和观赏植物的培育中可以具有重要的作用。在现代玉米育种的情况下，多年来育种者致力于减少分蘖(侧枝)的工作，以便产生同时达到成熟的单外皮(husk)植物。另一方面，稻育种中的分蘖控制同样也具有重要性，因为多重分蘖将允许在同一个植物上产生几个圆锥花序，而过度分蘖对植物具有有害影响。类似地，侧出分枝对于观赏植物是重要的，例如以从同一个茎产生多个花朵，或从每个茎上产生单朵大花。
如图8中所示，表达外源FUE_34_Evo的植物的特征在于枝条的多重分枝。FUE_34 Evo(SEQ ID NO54)在组成型的普遍存在的启动子下的表达引起异常活跃的侧出分枝表型。用这些构建体获得的所有转基因事件在每个结节处显示出这种特别的分枝表型。这种表型可以是植物顶端优势丧失的结果，或者更可能是由于FUE_34_Evo在普遍存在的组成型启动子下的连续表达。Evo_34是MADS盒转录因子，其另外还包含对于cAMP-和cGMP-依赖性蛋白激酶、酪蛋白激酶II和蛋白激酶C的推定的磷酸化位点。在根偏爱启动子(例如RootP)下的表达引起紧密的高度分枝的根表型的产生。因此，FUE_34_Evo可以用于例如改造出具有受控的分枝的植物，这通过添加在植物的某些解剖学部分处和/或在某一发展阶段时具有活性的组成型或诱导型启动子来实现。类似地，该基因可以被沉默并且以此方式非常可能避免分蘖或侧出分枝。该基因的另一个潜在用途是用于MSA(标记辅助育种)。
实施例12 同源和直向同源序列 表50列出了本发明的多核苷酸序列和多肽序列的直向同源和同源序列的概括，所述直向同源和同源序列使用BLAST(TBLASTX程序)鉴定，在至少85％的整个蛋白质长度上具有至少85％的相似性。
表50 应当理解，为了清晰起见，在分开的实施方案情况下描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方案中组合提供。相反地，为了简洁起见，在单个实施方案情况下描述的本发明的各种特征也可以分开地或以任何合适的亚组合进行提供。
尽管已结合其具体实施方案对本发明进行了描述，但显然许多备选方案、修饰和变化形式对于本领域技术人员将是显而易见的。因此，意欲包括落入所附权利要求的精神和广泛范围内的所有此类备选方案、修饰和变化形式。本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请以及GenBank登记号通过提及而整体并入本说明书中，其程度就好像特别地且独个地指明每个单个出版物、专利或专利申请或者GenBank登记号通过提及而合并入本文一样。此外，本申请中任何参考文献的引用或鉴定不应被解释为承认此类参考文献可作为本发明的现有技术。
CD-ROM内容 下文列出了两份CD-ROMs的文件内容，所述CD-ROMs一并附上且与本申请一起提交。这些文件通过提及而并入本文，并因此构成所提交的申请的一部分。文件信息提供为文件名/字节大小/创建日期/机器格式/操作系统。
序列表.txt/2,977,792字节/2006年10月24日/Notepad/PC
权利要求
1.核酸构建体，其包含与选自SEQ ID NO68、68、1、4、5、8、9、11、13、16、19、20、23、24、27、30、32、37、42、49、50、51、53、54、55、56、57、58、64、69、70、73、77、78、79、80、84、86、87、93、94、98、101、102、103、104、105、106、107、108和109的核苷酸序列至少85％同一的核酸序列，和能够指导所述核酸序列在宿主细胞中转录的启动子序列。
2.权利要求1的核酸构建体，其中所述启动子是组成型启动子。
3.权利要求2的核酸构建体，其中所述组成型启动子是CaMV35S启动子。
4.权利要求1的核酸构建体，其中所述启动子是诱导型启动子。
5.权利要求4的核酸构建体，其中所述诱导型启动子是非生物胁迫诱导型启动子。
6.权利要求5的核酸构建体，其中所述启动子是组织特异性启动子。
7.权利要求6的核酸构建体，其中所述组织是根组织。
8.权利要求1的核酸构建体，其中所述宿主细胞是植物细胞。
9.权利要求8的核酸构建体，其中所述植物细胞形成双子叶植物细胞的部分。
10.权利要求8的核酸构建体，其中所述植物细胞形成单子叶植物细胞的部分。
11.权利要求1的核酸构建体，其中所述核酸序列如SEQ ID NO68、68、1、4、5、8、9、11、13、16、19、20、23、24、27、30、32、37、42、49、50、51、53、54、55、56、57、58、64、69、70、73、77、78、79、80、84、86、87、93、94、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、219-767、1317、1318、1319、1320、1321、1322、1323、1324、1325、1326、1327、1328、1329、1330、1331、1332、1333、1334、1335或1336中所示。
12.分离的多肽，其包含与SEQ ID NO177、110、113、114、117、118、120、122、125、128、129、132、133、136、139、141、146、151、158、159、160、162、163、164、165、166、167、173、178、179、182、186、187、188、189、193、195、196、202、203、207、210、211、212、213、214、215、216、217或218中所示氨基酸序列至少85％同源的氨基酸序列。
13.植物细胞，其包含外源多核苷酸，所述外源多核苷酸包含编码多肽的核酸序列，所述多肽具有与SEQ ID NO177、110、113、114、117、118、120、122、125、128、129、132、133、136、139、141、146、151、158、159、160、162、163、164、165、166、167、173、178、179、182、186、187、188、189、193、195、196、202、203、207、210、211、212、213、214、215、216、217或218至少85％同源的氨基酸序列。
14.权利要求13的植物细胞，其中所述植物细胞形成植物的部分。
15.权利要求13或14的分离的多肽或植物细胞，其中所述氨基酸序列如SEQ ID NO177、110、113、114、117、118、120、122、125、128、129、132、133、136、139、141、146、151、158、159、160、162、163、164、165、166、167、173、178、179、182、186、187、188、189、193、195、196、202、203、207、210、211、212、213、214、215、216、217、218、768-1051、1053-1098、1100-1315或1316中所示。
16.增加植物对胁迫条件的耐受性的方法，其包括在所述植物中表达编码多肽的外源多核苷酸，所述多肽具有与SEQ ID NO177、110、113、114、117、118、120、122、125、128、129、132、133、136、139、141、146、151、158、159、160、162、163、164、165、166、167、173、178、179、182、186、187、188、189、193、195、196、202、203、207、210、211、212、213、214、215、216、217、218、1341或1343至少85％同源的氨基酸序列，从而增加所述植物对所述胁迫条件的耐受性。
17.增加植物的生物量、活力和/或产量的方法，其包括在所述植物中表达编码多肽的外源多核苷酸，所述多肽具有与SEQ ID NO177、110、113、114、117、118、120、122、125、128、129、132、133、136、139、141、146、151、158、159、160、162、163、164、165、166、167、173、178、179、182、186、187、188、189、193、195、196、202、203、207、210、211、212、213、214、215、216、217、218、1341或1343至少85％同源的氨基酸序列，从而增加所述植物的生物量、活力和/或产量。
18.增加植物的肥料使用效率和/或摄取的方法，其包括在所述植物中表达编码多肽的外源多核苷酸，所述多肽具有与SEQ ID NO177、110、113、114、117、118、120、122、125、128、129、132、133、136、139、141、146、151、158、159、160、162、163、164、165、166、167、173、178、179、182、186、187、188、189、193、195、196、202、203、207、210、211、212、213、214、215、216、217、218、1341或1343至少85％同源的氨基酸序列，从而增加所述植物的肥料使用效率和/或摄取。
19.权利要求16、17或18的方法，其中所述表达通过下述来实现
(a)用所述外源多核苷酸转化所述植物的细胞；
(b)从所述细胞产生成熟植物；和
(c)在适合于在所述成熟植物中表达所述外源多核苷酸的条件下培养所述成熟植物。
20.权利要求19的方法，其中所述转化通过将核酸构建体引入所述植物细胞中来实现，所述核酸构建体包含所述外源多核苷酸和至少一种能够指导所述外源多核苷酸在所述植物细胞中转录的启动子。
21.权利要求20的方法，其中所述至少一种启动子是组成型启动子。
22.权利要求20的方法，其中所述组成型启动子是CaMV35S启动子。
23.权利要求20的方法，其中所述至少一种启动子是诱导型启动子。
24.权利要求23的方法，其中所述诱导型启动子是非生物胁迫诱导型启动子。
25.权利要求20的方法，其中所述至少一种启动子是组织特异性启动子。
26.权利要求16、17或18的方法，其中所述胁迫条件是非生物胁迫。
27.权利要求26的方法，其中所述非生物胁迫选自盐度、干旱、低温、高温、重金属毒性、无氧生活、渗压剂和营养物缺乏。
28.权利要求26的方法，其中所述营养物是氮。
29.权利要求16、17或18的方法，其中所述植物是双子叶植物。
30.权利要求16、17或18的方法，其中所述植物是单子叶植物。
31.权利要求16、17或18的方法，其中所述多核苷酸包含选自SEQ ID NO68、1、4、5、8、9、11、13、16、19、20、23、24、27、30、32、37、42、49、50、51、53、54、55、56、57、58、64、69、70、73、77、78、79、80、84、86、87、93、94、98、101、102、103、104、105、106、107、108、109、219-767、1317、1318、1319、1320、1321、1322、1323、1324、1325、1326、1327、1328、1329、1330、1331、1332、1333、1334、1335、1336、1340或1342的核酸序列。
32.权利要求16、17或18的方法，其中所述氨基酸序列如SEQ IDNO177、110、113、114、117、118、120、122、125、128、129、132、133、136、139、141、146、151、158、159、160、162、163、164、165、166、167、173、178、179、182、186、187、188、189、193、195、196、202、203、207、210、211、212、213、214、215、216、217、218、768-1051、1053-1098、1100-1316、1341或1343中所示。
33.权利要求19的方法，其中所述条件是非生物胁迫条件。
34.权利要求19的方法，其中所述条件是肥料缺乏条件。
35.用于灌溉的方法，其包括
(a)在土壤上或土壤中放置滴灌系统，以获得在X和Y方向上彼此相隔20-40cm分布的灌溉孔；和
(b)以0.5-2升水/小时的灌溉速率通过每个所述灌溉孔进行连续灌溉。
36.用于模拟干旱条件的灌溉系统，其包含
(i)具有在X和Y方向上彼此相隔20-40cm分布的灌溉孔的滴灌系统；和
(ii)用于以0.5-2升水/小时通过每个所述灌溉孔进行连续灌溉的水供应和控制系统。
全文摘要
提供了核酸构建体。这些构建体包含与选自SEQ ID No68、1、4、5、8、9、11、13、16、19、20、23、24、27、30、32、37、42、49、50、51、53、54、55、56、57、58、64、69、70、73、77、78、79、80、84、86、87、93、94、98、101、102、103、104、105、106、107、108和109的核苷酸序列至少85％同一的核酸序列中的任何一种，和能够指导所述核酸序列在宿主细胞中转录的启动子序列。还提供了表达这些核酸构建体的转基因植物和使用其的方法。
文档编号C12N15/82GK101505587SQ200680047610
公开日2009年8月12日 申请日期2006年10月24日 优先权日2005年10月24日
发明者R·叶林, A·绍尚, E·果尔德, S·阿亚尔, H·卡尔奇 申请人:伊沃基因有限公司