用于rna治疗的肽核糖核酸缩合粒子的复合物及方法

专利名称：用于rna治疗的肽核糖核酸缩合粒子的复合物及方法
专利说明用于RNA治疗的肽核糖核酸缩合粒子的复合物及方法 发明领域 本发明一般涉及RNA干扰和RNA治疗剂递送领域。更具体地，本发明涉及肽核糖核酸缩合粒子的复合物和组合物，及其用于药剂的用途和作为治疗剂递送的用途。本发明一般涉及在RNA干扰中使用肽核糖核酸缩合复合物来对哺乳动物基因表达进行基因特异性抑制的方法。

背景技术：
RNA干扰(RNAi)是指序列特异性转录后基因沉默的方法，其由称为短干扰RNA(siRNA)的双链RNA(dsRNA)所介导。参见Fire等，Nature391806，1998，和Hamilton等，Science 286950-951，1999。RNAi由不同的群(flora)和门共享，并且被认为是进化保守的、抗外源基因表达的细胞防御机制。参见Fire等，Trends Genet.15358，1999。
因此，RNAi是一种使用小的非编码RNA来使基因表达沉默的普遍存在的内源性机理。参见Dykxhoorn，D.M.和J.Lieberman，Annu.Rev.Biomed.Eng.8377-402，2006。RNAi可以调节细胞死亡、分化和发育中所涉及的重要基因。RNAi还可以保护基因组使其免受转座子和病毒编码的遗传成分侵入。当siRNA被引入细胞时，其与内源性RNAi结构结合而高特异性破坏含互补序列的mRNA的表达。任何引起疾病的基因和任何细胞类型或组织都有可能被靶向。该项技术已被快速用于基因功能分析和药物靶发现和验证。利用RNAi也很有希望用于治疗，但是将siRNA引入体内细胞依然是重大障碍。
RNAi的机理是通过裂解靶mRNA，尽管仍未得到完全证实。RNAi反应涉及核酸内切酶络合物，该核酸内切酶络合物被称为诱导RNA沉默的络合物(RISC)，其介导与siRNA双链体反义链互补的单链RNA的裂解。靶RNA的裂解发生在与siRNA双链体反义链互补的区域的中部(Elbashir等，Genes Dev.15188，2001)。
进行RNAi的一种方式是在细胞中引入或表达siRNA。另一种方式是利用称为切酶(dicer)的内源性核糖核酸酶III。切酶的一种活性是将长dsRNA加工成siRNA。参见Hamilton等，Science 286950-951，1999；Berstein等，Nature 409363，2001。由切酶获得的siRNA通常总长为约21-23个核苷酸，带有约19个双链的碱基对。参见Hamilton等，同上；Elbashir等，GenesDev.15188，2001。实质上，长dsRNA可以作为siRNA的前体引入细胞中。
RNAi疗法、反义疗法和基因疗法等的开发，产生了对基于活性核酸的物质引入细胞中的有效方式的需求。一般而言，核酸在细胞或血浆中只能稳定极短的时间。但是，可以通过聚集和结合成缩合的复合物来稳定基于核酸的物质，所述缩合的复合物所展现的粒子足够小以用于细胞递送。
所需要的是包括小粒子的复合物以及制备所述复合物的方法，其中所述小粒子含有用于细胞内递送并最终作为治疗剂的活性核酸物质。特别地，需要将双链RNA递送至细胞以产生RNAi反应的复合物和方法。
发明概述 本发明通过提供用于RNA干扰和其他治疗方法的一系列肽-核糖核酸复合物和组合物，克服了本领域的这些及其他缺点。本发明特别提供了复合物和制备所述复合物的方法，所述复合物包括与一个或多个肽缩合成稳定的小粒子的一个或多个核糖核酸物质，所述稳定的小粒子具有通过RNA干扰来抑制靶基因表达的活性。该概述与


、发明详述以及所附的实施例、权利要求和附图一起，作为一个整体，涵盖了所公开的发明。
在一些方面中，本发明提供了用于RNA干扰和其他治疗方法的一系列肽-RNA复合物和组合物，包括含有缩合成稳定的小粒子的RNA和肽的复合物，所述稳定的小粒子具有通过RNAi来抑制靶基因表达的活性。本发明的复合物一般作为合成肽与核酸的多种混合物或缩合物提供。
在其他方面中，本发明的缩合复合物和组合物包括肽-RNA络合物的稳定小粒子。在一些实施方案中，这些复合物和粒子可以通过交联进一步稳定。在其他实施方案中，本发明的复合物和组合物包括诸如聚乙二醇的隐形(stealthing)或表面改性剂以便促进递送。
在另外的方面中，本发明的复合物包括一个或多个核糖核酸与一个或多个肽组分的缩合络合物。所述肽组分可以具有足够的正电荷以便结合核糖核酸，从而形成非共价连接的肽-核糖核酸缩合复合物。
在一些方面中，本发明的缩合复合物可以形成均匀的粒子。在一些实施方案中，肽-核酸复合物球形粒子的直径具有窄的分布，平均小于1000纳米(nm)。
本发明的肽-核酸缩合复合物可以提供它们自身的多组分制剂。在一些实施方案中，复合物可以与用于药物递送的其他物质相结合，例如用于递送至细胞的载体或赋形剂，或者用于体内治疗的各种递送基质。
在一些实施方案中，通过以下方式由一个或多个核糖核酸和一个或多个肽提供复合物将至少一个核糖核酸物质溶解于含水溶液中，然后向所述含水溶液添加至少一个肽组分，从而使粒子缩合成小于1000nm的直径，之后向所述含水溶液添加增加所述粒子质量的第二或后续肽组分。
在另外的实施方案中，通过以下方式由一个或多个核糖核酸物质和一个或多个肽组分提供复合物将第一肽组分溶解于含水溶液中，然后向所述含水溶液添加所述核糖核酸物质，从而使粒子缩合成小于1000nm的直径，之后向所述含水溶液添加增加所述粒子质量的第二或后续肽组分。
在本发明的一个方面中，依据对核酸的相对亲和力来选择肽组分。可以对肽组分进行选择，以便允许所述肽组分与核酸结合程度的变化。
在一些方面中，核糖核酸-肽缩合复合物可以可逆地结合。核糖核酸与一定量带正电荷的核糖核酸结合肽的复合物在细胞外的生物环境中基本上是稳定的，并且在接触细胞内的内体后释放出核糖核酸。所述释放可以产生RNAi反应。
在另外的方面中，提供了稳定肽-核糖核酸复合物的结构和方法，包括在所述复合物内交联核糖核酸结合肽。防止肽-核糖核酸复合物在生物有机体内降解的方法包括交联所述复合物内的至少一部分肽。
本发明进一步提供了所述复合物作为药剂的用途，以及制备用于动物和人类RNAi疗法的药剂的用途。
附图简述 图1在不同的G1498浓度和不同的氮/磷比(N/P)下，siRNA G1498与肽PN183的缩合粒子的直径。对于在特定N/P处的各组的三条柱形图而言，最左边的柱形的G1498浓度为100ug/ml，中间的柱形的浓度为50ug/ml，最右边的柱形的浓度为10ug/ml。在N/P为0.2至0.5处，当G1498的浓度为10ug/ml时，粒子是相当小的。
图2在不同的氮/磷比(N/P)下，siRNA G1498与肽PN183的缩合粒子的直径。对于在特定N/P处的各组的两条柱形图而言，左边的柱形采用了涡旋，而右边的柱形未采用涡旋。数据在混合之后立即获取。
图3在不同的氮/磷比(N/P)下，siRNA G1498与肽PN183的缩合粒子的直径。对于在特定N/P处的各组的两条柱形图而言，左边的柱形采用了涡旋，而右边的柱形未采用涡旋。数据在混合之后30分钟获取。
图4在不同的氮/磷比(N/P)下，siRNA G1498与肽PN183的缩合粒子的直径。对于在特定N/P处的各组的两条柱形图而言，左边的柱形采用了涡旋，而右边的柱形未采用涡旋。数据在混合之后60分钟获取。
图5在不同的氮/磷比(N/P)下，siRNA G1498与肽PN183的缩合粒子的直径。对于在特定N/P处的各组的两条柱形图而言，左边的柱形采用了涡旋，而右边的柱形未采用涡旋。数据在混合之后24小时获取。
图6在G1498浓度为100ug/ml时，siRNA G1498与肽PN183的缩合粒子于不同pH值的直径。
图7在氯化钠浓度增加时，所获得的siRNA G1498与肽PN183的缩合粒子的直径。
图8在不同的N/P比和不同的组分添加顺序下，所获得的siRNAG1498与肽PN183的缩合粒子的直径。对于在特定N/P处的各组的两条柱形图而言，左边的柱形是首先添加siRNA获得的，而右边的柱形是首先添加肽获得的。
图9siRNA G1498与肽PN183的缩合粒子的电子透射显微照片。图例长度标记为200nm。
图10siRNA G1498与肽PN183的缩合粒子的透射电子显微照片。图例长度标记为200nm。
图11通过鼻内施用包括siRNA Inm-4和肽PN183以及PN939的组合物而在小鼠模型中进行LPS诱导TFN-α表达(pg/ml)的敲低(knock down)试验结果。最左边的柱形图是缓冲液对照，随后是Inm-4/PN183/PN939缩合物的数据，右边跟随的是与戊二醛(G)交联的Inm-4/PN183/PN939复合物的数据。安慰剂不含siRNA，而Qneg含有无活性的siRNA。
图12lac-z siRNA与肽PN183以及各种第二肽的缩合物在大鼠神经胶质肉瘤成纤维细胞9L/LacZ中lac-z表达的体外敲低试验结果。最左边的柱形图是使用HiPerFectTM(Qiagen；Valencia(巴伦西亚)，California(加利福尼亚))的比较数据，随后是本发明各种复合物的数据。PN183的N/P比为0.75，而第二肽的N/P比为0.3。
发明详述 本发明提供了用于RNA干扰和其他治疗方法的一系列肽-RNA复合物和组合物。更具体地，本发明包括含有缩合成稳定的小粒子的RNA和肽的复合物，所述稳定的小粒子具有通过RNAi抑制靶基因表达的活性。
本发明的复合物一般作为合成肽与核酸的混合物或缩合物提供。可以使用各式各样的肽来形成复合物。肽的质量通常小于约120kDa，或小于约60kDa，或小于约30kDa。复合物的肽可以是粘膜渗透性调节剂或粘膜渗透促进剂。
缩合的复合物包括肽-RNA络合物的稳定小粒子。这些复合物和粒子可以通过使用各种试剂交联而进一步稳定。在一些实施方案中，本发明的复合物和组合物包括诸如聚乙二醇的隐形或表面改性剂以便促进递送。
本发明的复合物包括由一个或多个核糖核酸和一个或多个肽组分构成的缩合络合物。所述肽组分可以具有足够的正电荷以便结合核糖核酸，从而形成非共价连接的肽-核糖核酸缩合复合物。提供了稳定的核糖核酸络合物，所述核糖核酸络合物包括核糖核酸和与该核糖核酸结合的肽，所述肽的量在体内条件下有效地稳定了所述核糖核酸。肽-核酸络合物组分的结合部分是由于离子力，并且可以包括其他不同的相互作用，比如范德华力或氢键。
本发明的肽-核酸缩合复合物可以包括均匀的粒子。肽-核酸复合物球形粒子的直径可以具有窄的分布，平均小于1000纳米(nm)。球形粒子的直径可以小于1000纳米，为约0.5纳米至约400纳米，约10纳米至约300纳米，约40纳米至约100纳米。稳定粒子的ζ电位值可以大于约20毫伏，或者大于约30毫伏。
本文使用的术语“均匀的”是指复合物的大部分粒子具有窄的直径分布。在均匀粒子复合物中可以存在超过一种的直径分布。窄的直径分布与粒度分布图中的峰相对应，该粒度分布图基于对粒度分析仪的原始相关系数与时间的数据。优选地，均匀的复合物在一个窄的直径分布中具有至少30％的粒子。
本发明的肽-核酸缩合复合物提供了它们自身的多组分制剂，并且可以与用于药物递送的其他物质进一步结合，例如用于递送至细胞的载体或赋形剂，或者用于体内治疗的各种递送基质。
本发明的复合物和组合物可以分散于药学上可接受的介质中，与基质结合，或者与用于递送至细胞或受治疗者的载体或媒介物结合。包括本发明复合物或粒子的分散体的溶液可以作为治疗剂递送。
肽组分 适用于本发明复合物的肽组分可以是合成的或者是从天然或其他来源获得的。
肽组分长度上可以含有2至约1000个氨基酸、2至约600个氨基酸、2至约60个氨基酸、5至约30个氨基酸和5至约25个氨基酸。
所述肽组分可以包括多个正电荷。例如，肽组分可以包括1至约100个正电荷、5至约30个正电荷和9至约15个正电荷。肽组分的正电荷可以由带正电荷的赖氨酸或精氨酸残基提供。
可以使用各式各样的肽来形成肽-核酸复合物。肽组分的质量通常小于约120kDa，或小于约60kDa，或小于约30kDa。肽组分的肽可以任选地与聚合物轭合或衍生化，所述聚合物如聚环氧烷、聚环氧乙烷、聚环氧丙烷或其组合。例如，本发明复合物的肽组分可以与聚乙二醇(PEG)共价衍生化。
促进多核苷酸递送的多肽的功能域对于递送siNA进入细胞的能力是有用的。这些功能域包括膜附着区、基因融合区和核苷酸结合区。膜附着描述了示例性的促进多核苷酸递送的多肽结合细胞膜的能力。基因融合特征反映了脱离细胞膜并进入细胞质的能力。肽的膜附着区和基因融合区机械紧密地连接在一起(即，肽进入细胞的能力)，因此从实验上可能难以区分开。最后，核苷酸结合描述了肽与核苷酸结合的能力。
复合物的肽可以含有已知促进复合物跨屏障(如粘膜屏障)递送的结构特征。促进递送的特征的实例包括各种蛋白质转导域。肽组分可以是粘膜渗透性调节剂。
本发明促进多核苷酸递送的多肽的蛋白质转导域实例包括 1.TAT蛋白质转导域(PTD)(SEQ ID NO1)KRRQRRR； 2.穿透素PTD(SEQ ID NO2)RQIKIWFQNRRMKWKK； 3.VP22 PTD(SEQ ID NO3)DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVD； 4.Kaposi FGF信号序列(SEQ ID NO4)AAVALLPAVLLALLAP和(SEQ ID NO5)AAVLLPVLLPVLLAAP； 5.人β3整合素信号序列(SEQ ID NO6)VTVLALGALAGVGVG； 6.gp41融合序列(SEQ ED NO7)GALFLGWLGAAGSTMGA； 7.窄吻凯门鳄(Caiman crocodylus)Ig(v)轻链(SEQ ID NO8)MGLGLHLLVLAAALQGA； 8.hCT-衍生肽(SEQ ID NO9)LGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP； 9.转运体(Transportan)(SEQ ID NO10)GWTLNSAGYLLKINLKALAALAKKIL； 10.寡聚体(Loligomer)(SEQ ID NO11)TPPKKKRKVEDPKKKK； 11.精氨酸肽(SEQ ID NO12)RRRRRRR；和 12.两亲性模型肽(SEQ ID NO13)KLALKLALKALKAALKLA。
本发明促进多核苷酸递送的多肽的病毒融合肽基因融合域的实例包括 1.流感病毒HA2(SEQ ID NO14)GLFGAIAGFIENGWEG； 2.仙台病毒F1(SEQ ID NO15)FFGAVIGTIALGVATA； 3.呼吸道合胞病毒F1(SEQ ID NO16)FLGFLLGVGSAIASGV； 4.HIV gp41(SEQ ID NO17)GVFVLGFLGFLATAGS；和 5.埃博拉病毒GP2(SEQ ID NO18)GAAIGLAWIPYFGPAA。
在一些实施方案中，提供了引入DNA结合域或基序的促进多核苷酸递送的多肽，所述DNA结合域或基序在本发明的方法和组合物中促使多肽-siNA络合物形成和/或促进siNA的递送。基于这点，示例性的DNA结合域包括各种“锌指”域，如针对下文表1中鉴别的DNA结合调节蛋白质和其他蛋白质所描述的(参见，如Simpson等，J.Biol.Chem.27828011-28018，2003)。
表1 不同DNA结合蛋白质的示例性锌指基序
在表1中，本文将序列Sp1、Sp2、Sp3、Sp4、DrosBtd、DrosSp、CeT22C8.5和Y4pB1A.4分别指定为SEQ ID NO19、20、21、22、23、24、25和26。
表1示出用于双链DNA结合的保守锌指基序，其特征为C-x(2，4)-C-x(12)-H-x(3)-H基序模式(SEQ ID NO27)，该基序自身可用于选定和设计其他根据本发明的促进多核苷酸递送的多肽。
用于构建本发明促进多核苷酸递送的多肽的备选DNA结合域包括，例如HIV Tat蛋白质序列部分。
在本发明的一些实施方案中，促进多核苷酸递送的多肽可以通过将任何前述结构元件、域或基序结合入一个多肽中来构建，所述多肽介导了siNA进入靶细胞的改善的递送。例如，TAT多肽的蛋白质转导域可以与流感病毒血凝素蛋白(称为HA2)N端的20个氨基酸融合，从而获得促进多核苷酸递送的多肽。
本发明的复合物可以包括一个或多个肽组分。肽组分可以具有足够的正电荷来结合核糖核酸以便形成非共价结合的肽-核糖核酸缩合复合物。虽然肽-核酸络合物组分的结合一部分是由于离子力，但是所述结合也可以涉及其他各种相互作用，比如范德华力、氢键或疏水作用。络合物可以保留水相互作用，或高溶剂浓度的区域。
提供了稳定的肽-核糖核酸络合物，所述肽-核糖核酸络合物包括核糖核酸和与该核糖核酸结合的肽，所述肽的量在体内条件下有效地稳定了所述核糖核酸。
表2示出一些用于本发明复合物的肽实例。
表2 肽 下文所附实施例中给出了用于本发明复合物的肽的另外实例。
缩合复合物及其制剂 本发明提供了肽-核糖核酸缩合复合物，所述肽-核糖核酸缩合复合物包括的粒子直径小于约1000nm，为约0.5nm至约400nm，约10nm至约300nm和约40nm至约100nm。
所述复合物的肽组分可以为粒子质量的5-95％，或者为粒子质量的45-95％。
在本发明的一些实施方案中，通过以下方式从一个或多个核糖核酸物质和一个或多个肽组分提供肽-核酸复合物将核糖核酸物质与肽组分在含水溶液中缩合，由此形成直径小于1000nm的粒子。
一般而言，本发明的复合物包括由一个或多个肽和一个或多个核酸形成的肽-核酸缩合物。所述缩合物在部分地由肽相对于核酸的氮/磷比(N/P比)来表征。
本发明的复合物可以包括直径小于1000nm的缩合粒子，其中每个粒子包括至少10个双链核糖核酸(dsRNA)分子和至少10个肽。本文使用的“至少10个肽”是指偏摩尔量为10个肽分子，所述肽分子的结构可以相同或不同。因此，“至少10个肽”可以是一种肽结构的偏摩尔量，或者是两种或多种不同肽结构的偏摩尔量。
通常，本文使用的术语如“肽”和“核酸”以及“dsRNA”和“siRNA”，是指那些分子的量足以形成本发明的复合物。换言之，通常，这些术语是指偏摩尔量而不是指个别的分子。例如，“肽”是一个或多个肽分子，如阿伏加德罗常数的肽分子。“向核糖核酸物质添加两个肽”是指两种不同结构的肽各自以偏摩尔量与核糖核酸物质混合。
络合物或缩合物中与核酸(NA)结合的肽的量可使用一分子对的肽∶NA配料比从所结合的核酸量获得，所述肽∶NA配料比也称为氮/磷比(N/P比)。缩合之后溶液中剩余的游离肽量由物料平衡得出。因此，本文的N/P配料比是指初始缩合溶液中一个肽组分与一个核酸物质的初始N/P配料比。
通常，溶液中核酸物质的浓度仅受其溶解度的限制。调节溶液的肽组分浓度以提供所需的N/P比。
在一些实施方案中，调节溶液肽组分的浓度以提供约1的组合N/P比。当N/P比为大约1时，则根据离子电荷，肽组分或核酸物质都不过量。
在一些实施方案中，调节溶液各种肽组分的浓度以提供约0.2至约50、约0.5至约20、约0.5至约7或约0.5至约2.5的N/P比。
溶液的pH通常小于约11，小于约9和小于约8。可任选地涡旋溶液以混合组分。
在一些实施方案中，通过向含有肽组分的溶液添加核酸物质来制备缩合复合物。
在一些实施方案中，溶液可以含有无机盐或有机盐。例如，含水溶液可含有氯化钠，所述氯化钠的浓度小于或等于约1M，小于或等于约0.5M，小于或等于约0.25M。
任选地，可从溶液中分离特定粒度分布的肽-核酸缩合复合物。在一些实施方案中，过滤含有肽-核酸缩合复合物的溶液以分离不同粒度的粒子。
在其他实施方案中，透析含有肽-核酸缩合复合物的溶液以除去过量或未结合的肽组分。
在一些实施方案中，将分离的肽-核酸粒子进行冷冻干燥。
在本发明的一些实施方案中，通过以下方式从一个或多个核糖核酸物质和一个或多个肽组分提供肽-核酸复合物将至少一个核糖核酸物质溶解于含水溶液，然后向所述含水溶液添加至少一个肽组分，从而使粒子缩合成直径小于1000nm，之后向所述含水溶液添加第二肽组分或后续肽组分，由此增加所述粒子的质量。
在本发明的一些实施方案中，通过以下方式从一个或多个核糖核酸物质和一个或多个肽组分提供肽-核酸复合物将第一肽组分溶解于含水溶液，然后向所述含水溶液添加所述核糖核酸物质，从而使粒子缩合成直径小于1000nm，之后向所述含水溶液添加第二肽组分或后续肽组分，由此增加所述粒子的质量。
在本发明的一个方面中，提供了肽-核酸复合物，其中的肽组分通过其对核酸的相对亲和力进行选择。例如，各种肽与核酸的相对结合分析通过测量肽对SYBR金核酸结合染料的置换来进行。通过鉴定肽组分对复合物中核酸的相对亲和力，可以选择肽组分以改变肽组分与核酸结合度。
改变肽组分与核酸的结合度允许首先使用较强结合的肽组分、之后使用较弱结合的肽组分来形成缩合粒子，反之亦然，或者允许多次添加不同结合强度的组分。
在一些实施方案中，希望与核酸物质缩合的第一肽组分具有比后续肽组分更高的对所述核酸物质的结合亲和力。在这些实施方案中，调节溶液中第一肽组分的浓度以提供约0.2至约7，约0.2至约2.5，或约0.2至约1的N/P比。在这些实施方案中，调节后续肽组分的浓度以提供约0.2至约50，约0.5至约20，约0.5至约7，或约0.5至约2.5的N/P比。
可逆结合的核糖核酸-肽缩合复合物包括核糖核酸和一定量带正电荷的核糖核酸结合肽，所述核糖核酸和核糖核酸结合肽形成了在细胞外生物环境中基本上稳定的核糖核酸-肽缩合物，并且在与细胞内的内体接触后可以释放出核糖核酸。
提供了多种肽-核酸缩合物，其中的肽包括一定量的有效地结合核糖核酸的带正电荷的残基。核糖核酸-肽缩合物在细胞外的生物环境中基本上是稳定的，并且可以在细胞内以有效产生RNAi反应的方式释放核糖核酸。
在本发明的一些方面中，使用试剂来交联肽-RNA缩合物。例如，肽-RNA缩合物的稳定性可以通过引入二醛基(如戊二醛)来交联肽或粒子上的表面胺基而增加。交联剂的其他实例包括甲醛、丙烯醛和二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)。交联的缩合复合物可以具有提高的对血清内切核酸酶代谢的抗性。
在一些实施方案中，与核酸物质缩合的第一肽组分在添加后续肽组分之前进行交联。任选地，第一肽组分的缩合物可以在添加后续肽组分之后进行交联。在一些实施方案中，第一肽组分的缩合物在添加后续肽组分之前和之后进行交联。
稳定肽-核糖核酸复合物的方法包括将所述复合物内的核糖核酸-结合肽与例如戊二醛交联剂进行交联。保护生物有机体内肽-核糖核酸复合物免受降解的方法包括使用例如戊二醛交联剂来交联所述复合物内的至少一部分肽。
本发明的肽-核糖核酸复合物也可以通过添加表面改性剂如表面活性剂、中性脂质或聚环氧乙烷来稳定。例如，添加至缩合复合物溶液的聚乙二醇可以粘附至该复合物的粒子。例如，可以添加非离子的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，以稳定复合物的粒子。
本文包括本发明复合物用于制备动物和人类RNAi疗法中使用的药剂的用途。
核酸物质 用于本发明的核酸物质可以是单链核酸、双链核酸、修饰的核酸或抗降解的核酸、RNA、DNA-RNA嵌合体、反义核酸或核酶。
关于这点，本发明提供了通过RNA干扰来调节基因表达的复合物、组合物和方法。本发明的复合物或组合物可以向细胞释放产生RNAi反应的核糖核酸物质。本发明的复合物或组合物在与细胞内的内体接触后可以向细胞释放核糖核酸物质。核糖核酸物质在细胞内的释放提供了细胞中基因表达的抑制。
用于本发明的核糖核酸物质可以靶向各种基因。例如，本发明的siRNA物质具有与TNF-α基因区互补的序列。在本发明的一些实施方案中，复合物和组合物用于调节肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达。TNF-α与例如肺部疾病中产生的炎性过程相关，并具有抗炎作用。通过递送本发明组合物来阻滞TNF-α，可用于治疗或预防类风湿性关节炎的病征和/或症状。
本发明提供了通过RNA干扰来调节TNF-α表达和活性的复合物、组合物和方法。
TNF-α的表达和/或活性可通过向细胞递送例如siRNA分子Inm-4进行调节。Inm-4是与人TNF-α基因序列同源的双链21-nt siRNA分子。Inm-4在有义链上具有3’dTdT突出端，在反义链上具有3’dAdT突出端。Inm-4的一级结构为 (SEQ ID NO44)有义 5’-CCGUCAGCCGAUUUGCUAUdTdT (SEQ ID NO45)反义 5’-AUAGCAAAUCGGCUGACGGdTdT TNF-α的表达和/或活性可通过向细胞递送例如siRNA分子LC20进行调节。LC20是与人TNF-α基因序列同源的双链21-nt siRNA分子。LC20针对人TNF-α的3’-UTR区。LC20具有19个碱基对，其中在有义链上具有3’dTdT突出端，在反义链上具有3’dAdT突出端。钠盐形式的分子量为14,298。LC20的一级结构为 (SEQ ID NO46)有义 (5′)GGGUCGGAACCCAAGCUUAdTdT (SEQ ID NO47)反义 (5′)UAAGCUUGGGUUCCGACCCdTdA 本发明的siRNA可以具有与病毒基因区互补的序列。例如，本发明的一些组合物和方法用于调节流感病毒基因组的表达。
关于这点，本发明提供了通过RNA干扰来调节流感病毒表达及感染活性的组合物和方法。流感病毒的表达和/或活性可以通过向细胞递送例如短干扰RNA分子进行调节，所述短干扰RNA分子具有与流感病毒RNA聚合酶亚单元区互补的序列。例如，表3示出了与流感病毒RNA聚合物亚单元序列同源的双链siRNA分子。
表3 靶向流感病毒的双链siRNA分子 本发明的siRNA可以具有与流感病毒RNA聚合酶亚单元区互补的序列。
本发明提供了施用针对流感病毒mRNA的siNA的组合物和方法，所述siNA有效地下调了流感病毒RNA，并由此减少、预防或改善流感病毒感染。
RNA干扰疗法 在一些实施方案中，本发明提供了复合物、组合物和方法，所述方法通过向受治疗者施用含有有效量RNAi-诱导复合物的组合物来抑制受治疗者靶转录物的表达，其中所述RNAi-诱导复合物如短干扰寡核苷酸分子或其前体。RNAi使用小的干扰RNA(siRNA)来靶向信使RNA(mRNA)并减少翻译。例如，本发明使用的siRNA可以是用于dicer酶切加工的前体，如加工成siRNA的长dsRNA。本发明提供了治疗或预防疾病或病征的方法，该疾病或病征与靶转录物的表达或靶转录物编码的肽或蛋白质的活性有关。
可以使用基于RNAi的治疗策略，通过停止病毒或微生物的生长或功能以及通过停止疾病通路中内源性基因产物的功能，来治疗各式各样的疾病。
在一些实施方案中，本发明提供了用于递送RNAi-诱导复合物的新型组合物和方法，所述RNAi-诱导复合物如短干扰寡核苷酸分子及其前体。特别地，本发明提供了含有RNAi-诱导复合物的组合物，该RNAi-诱导复合物靶向受治疗者细胞、组织和/或器官的一种或多种转录物。
siRNA可以是具有长度约为19个核苷酸的互补区的两条RNA链。siRNA任选地包括一个或两个单链突出端或环。
shRNA可以是具有自互补区的RNA单链。所述RNA单链可以与茎和环，或者与RNA 5′部分和/或3′部分的一个或多个未配对的部分一起形成发夹结构。
活性治疗剂可以是化学修饰的siNA，其对体内核酸酶降解具有改善的抗性和/或具有改善的细胞摄取，并且保留了RNAi活性。
本发明的siRNA物质可以具有与靶基因区互补的序列。本发明的siRNA可以具有29-50个碱基对，例如，dsRNA具有与靶基因区互补的序列。可选地，双链核酸可以是dsDNA。
在一些实施方案中，活性剂可以为短干扰核酸(siNA)、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微RNA或调节基因产物表达的短发夹RNA(shRNA)。
提供了类似的方法和组合物，该方法和组合物靶向表达了与受治疗者特定疾病病征相关的一种或多种不同的基因，所述基因包括大量基因中的任何一种，已知其表达作为与选定疾病病征相关的偶然因素或必然因素而异常增加。
本发明的RNAi-诱导复合物可以与其他用于疾病病征的已知治疗一起施用。
在一些实施方案中，本发明的特征组合物含有与促进递送的复合物混合或络合或轭合的小核酸分子，如短干扰核酸、短干扰RNA、双链RNA、微RNA或短发夹RNA。
本文使用的术语“短干扰核酸”、“siNA”、“短干扰RNA”、“siRNA”、“短干扰核酸分子”、“短干扰寡核苷酸分子”以及“化学修饰的短干扰核酸分子”，是指例如能够通过以序列特异性方式介导RNA干扰(RNAi)或基因沉默来抑制或下调基因表达或病毒复制的任何核酸分子。
在一些实施方案中，siNA是包括自互补性有义区和反义区的双链多核苷酸分子，其中所述反义区包括与用于下调表达的靶核糖核酸分子中核苷酸序列互补的核苷酸序列或其部分，所述有义区包括与所述靶核糖核酸序列或其部分相对应(即，序列与其基本同一)的核苷酸序列。
“siNA”指小干扰核酸，例如siRNA，其为短长度的双链核酸或其任选的较长前体。在一些实施方案中，本发明有用的siNA的长度被优化为约20bp至50bp的长度。但是，对于有用的siNA(包括siRNA)的长度没有特殊限制。例如，siNA起初可以以前体形式存在于细胞中，该前体形式在本质上不同于一经递送或递送至靶细胞后存在并发挥基因沉默活性的siNA的最终形式或加工形式。例如，siNA的前体形式包括前体序列元件，所述前体序列元件在递送时或递送后被加工、降解、改变或裂解得到在细胞内具介导基因沉默活性的siNA。在一些实施方案中，有用的siNA应具有前体的长度，例如约100-200个碱基对，或50-100个碱基对，或小于约50个碱基对，该长度在靶细胞内获得了具有活性的加工的siNA。在其他实施方案中，有用的siNA或siNA前体的长度为大约10bp至49bp，或15bp至35bp，或约21bp至30bp。
在本发明的一些实施方案中，使用促进多核苷酸递送的多肽来促使比常规siNA(包括siNA的大核酸前体)更大的核酸分子的递送顺利进行。例如，可以采用本文的方法和组合物来促进较大的核酸的递送，所述较大的核酸代表所需siNA的“前体”，其中在递送至靶细胞之前、期间或之后所述前体的氨基酸被裂解或以其他方式加工形成用于调节靶细胞内基因表达的活性siNA。
例如，可以选择作为环状单链多核苷酸的siNA前体多核苷酸，其具有两个或多个包括自互补性有义区和反义区的环结构和茎，其中所述反义区包括与靶核酸分子或其部分的核苷酸序列互补的核苷酸序列，所述有义区具有与靶核酸序列或其部分相对应的核苷酸序列，并且其中该环状多核苷酸可以在体内或体外被加工生成能够介导RNAi的活性siNA分子。
本发明的siNA分子，特别是非前体形式，可少于30个碱基对，或者为约17-19bp，或19-21bp，或21-23bp。
siRNA可以介导哺乳动物系统中的选择性基因沉默。具有短环并且在茎中具有19至27个碱基对的发夹RNA也选择性地使与双链茎中的序列同源的基因表达沉默。哺乳动物细胞可将短发夹RNA转化为siRNA，以介导选择性基因沉默。
RISC介导单链RNA的裂解，该单链RNA具有与siRNA双链体反义链互补的序列。靶RNA的裂解在与siRNA双链体反义链互补的区域内发生。当具有21个核苷酸的siRNA双链体含有两个核苷酸3′突出端时，通常最具活性。
将具有2-核苷酸3′突出端的21-mer siRNA双链体的3′突出端片段置换为脱氧核糖核酸不会对RNAi活性产生不利的影响。允许将siRNA每端多达4个的核苷酸置换为脱氧核糖核酸，但是完全置换为脱氧核糖核酸可导致无RNAi活性。
可选地，siNA可以作为一种或多种转录产物进行递送，所述转录产物由编码一种或多种siNA并指导它们在靶细胞内表达的多核苷酸载体表达。在这些实施方案中，有待在靶细胞内表达的siRNA最终转录产物的双链部分长度可以为，例如15bp至49bp，15bp至35bp，或约21bp至30bp。
在本发明的一些实施方案中，两条链被配对的siNA双链区可以含有凸起或错配部分，或两者。两条链被配对的siNA双链部分不限于完全配对的核苷酸片段，并且可以含有例如因错配(对应的核苷酸不是互补的)、凸起(在一条链上缺少对应的互补核苷酸)或悬垂而导致的非配对部分。非配对部分的包含程度为它们不干扰siNA的形成。在一些实施方案中，“凸起”可包括1至2个非配对的核苷酸，并且两条链配对的siNA双链区可以含有约1至7，或约1至5个凸起。此外，siNA双链区中包含的“错配”部分可以以约1至7，或约1至5的数目存在。通常在错配的情况中，一个核苷酸为鸟嘌呤，另一个为尿嘧啶。例如，所述错配可归因于编码有义RNA的相应DNA中C至T的突变，G至A的突变，或其组合(mixtures)，但也包括其他的原因。
本发明siNA的末端结构可以是平端或黏端(突出端)，只要siNA保留其使靶基因表达沉默的活性即可。黏端(突出端)结构不限于3′突出端，其还包括5′突出端结构，只要其保留诱导基因沉默的活性即可。此外，突出端核苷酸的数目不限于2个或3个核苷酸，还可以为任何数目的核苷酸，只要其保留诱导基因沉默的活性即可。例如，突出端可以包括1至约8个核苷酸，或2至4个核苷酸。
具有黏端(突出端)结构的siNA长度可以借助各端配对的双链体部分和任何突出端部分来表示。例如，带有2-bp 3’反义突出端的25/27-mer siNA双链体具有25-mer有义链和27-mer反义链，其中配对部分的长度为25bp。
任何突出端序列都可以具有对靶基因的低特异性，并且可以不与靶基因序列互补(反义)或同一(有义)。只要siNA保留基因沉默的活性，其就可以在突出端部分中包含低分子量结构，所述低分子量结构例如天然RNA分子，如tRNA、rRNA、病毒RNA；或人工RNA分子。
siNA的末端结构可以具有茎-环结构，在该茎-环结构中，双链核酸一侧的末端通过连接体核酸如连接体RNA连接。双链区(茎-环部分)的长度可以为，例如15bp至49bp，或15bp至35bp，或约21bp至30bp长。可选地，有待在靶细胞中表达的最终转录产物——双链区的长度可以为，例如，约15bp至49bp，或15bp至35bp，或约21bp至30bp长。
siNA可以含有单链多核苷酸，所述单链多核苷酸具有与靶核酸分子或其部分的核苷酸序列互补的核苷酸序列，其中所述单链多核苷酸可含有末端磷酸基团，如5′-磷酸(参见，例如Martinez等，Cell.110563-574，2002和Schwarz等，Molecular Cell 10537-568，2002)或5′，3′-二磷酸。
本文使用的术语siNA分子不限于仅含有天然存在的RNA或DNA的分子，还包括化学修饰的核苷酸和非核苷酸。在一些实施方案中，本发明的短干扰核酸分子缺少含有2′-羟基(2′-OH)的核苷酸。在一些实施方案中，短干扰核酸无需存在具有2′-羟基的核苷酸来介导RNAi，因而本发明的短干扰核酸分子任选地不包括任何核糖核苷酸(如，具有2′-OH的核苷酸)。但是，无需在siNA分子内存在核糖核苷酸以支持RNAi的siNA分子可以具有附着的一个或多个连接体，或其他附着或缔合的基团、部分，或含有一个或多个带有2′-OH基团的核苷酸的链。siNA分子可包括的核糖核苷酸为核苷酸位置的至少约5％、10％、20％、30％、40％或50％。
本文使用的术语siNA包括能够介导序列特异性RNAi的核酸分子，例子如短干扰RNA(siRNA)分子、双链RNA(dsRNA)分子、微RNA分子、短发夹RNA(shRNA)分子、短干扰寡核苷酸分子、短干扰核酸分子、短干扰修饰的寡核苷酸分子、化学修饰的siRNA分子和转录后基因沉默RNA(ptgsRNA)分子等。
在一些实施方案中，siNA分子包括分开的有义序列和反义序列或分开的有义区和反义区，其中所述有义区和反义区通过核苷酸连接体分子或非核苷酸连接体分子共价连接，或者通过离子相互作用、氢键、范德华相互作用、疏水性相互作用和/或堆积作用进行非共价连接。
“反义RNA”是具有与靶基因mRNA互补的序列的RNA链，其可通过结合靶基因mRNA来诱导RNAi。
“有义RNA”是具有与反义RNA互补的序列的RNA链，并退火为其互补性的反义RNA以形成siRNA。
本文使用的术语“RNAi构建体”或“RNAi前体”是指诱导RNAi的复合物，如小干扰RNA(siRNA)、发夹RNA，及其他可在体内裂解形成siRNA的RNA种类。本文的RNAi前体还包括能够使在细胞中形成dsRNA或发夹RNA的转录物和/或可以在体内产生siRNA的转录物生成的表达载体(也称为RNAi表达载体)。
si杂交分子是具有类似于siRNA功能的双链核酸。si杂交分子是由RNA链和DNA链构成的，而不是双链的RNA分子。优选地，RNA链是结合靶mRNA的反义链。由DNA链与RNA链杂交形成的si杂交分子具有杂交的互补部分并且优选有至少一个3’突出端。
用于本发明的siNA可以由两个分开的寡核苷酸装配，在该寡核苷酸中一条链是有义链而另一条是反义链，其中所述反义链和有义链是自互补的(即，每条链包括与另一条链中的核苷酸序列互补的核苷酸序列；比如所述反义链和有义链形成双链体或双链结构，例如其中的双链区为约19个碱基对)。所述反义链可包括与靶核酸分子或其部分中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，而所述有义链可包括与该靶核酸序列或其部分相对应的核苷酸序列。可选地，siNA可以由一个寡核苷酸装配，在该寡核苷酸中siNA的自互补性有义区和反义区经由基于核酸或基于非核酸的连接体进行连接。
在一些实施方案中，用于细胞内递送的siNA可以是带有双链体、不对称双链体、发夹或不对称发夹二级结构的多核苷酸，其具有自互补性有义区和反义区，其中所述反义区包括与分开的靶核酸分子或其部分中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，而所述有义区包括与该靶核酸序列或其部分相对应的核苷酸序列。
可在siNA中做出的化学修饰的实例包括磷硫酰核苷酸间键合、2′-脱氧核糖核苷酸、2′-O-甲基核糖核苷酸、2′-脱氧-2′-氟代核糖核苷酸、“通用碱基”核苷酸、“无环”核苷酸、5-C-甲基核苷酸，和末端甘油基和/或倒置的脱氧无碱基残基掺入。
siNA分子的反义区可包括位于所述反义区3′-端的磷硫酰核苷酸间键合。反义区可包括位于所述反义区5′-端的约1至约5个的磷硫酰核苷酸间键合。siNA分子的3′-端核苷酸突出端可包括在核酸的糖、碱基或骨架经化学修饰的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。3′-端核苷酸突出端可包括一个或多个通用碱基核糖核苷酸。3′-端核苷酸突出端可包括一个或多个无环核苷酸。
例如，化学修饰的siNA在一条链中可具有1，2，3，4，5，6，7，8或更多个磷硫酰核苷酸间键合，或者在每条链中可具有1至8个或更多个磷硫酰核苷酸间键合。磷硫酰核苷酸间键合可存在于siNA双链体的一条或两条寡核苷酸链，例如存在于有义链、反义链或两条链。
siNA分子可包括位于有义链、反义链或两条链的3′-端、5′-端或3′-端和5′-端两者的一个或多个磷硫酰核苷酸间键合。例如，示例性的siNA分子可包括位于有义链、反义链或两条链的5′-端的1，2，3，4，5或更多个连续的磷硫酰核苷酸间键合。
在一些实施方案中，siNA分子在有义链、反义链或两条链中包括1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多个嘧啶磷硫酰核苷酸间键合。
在一些实施方案中，siNA分子在有义链、反义链或两条链中包括1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多个嘌呤磷硫酰核苷酸间键合。
siNA分子可包括环状核酸分子，其中siNA长度为约38至约70个核苷酸，例如，约38，40，45，50，55，60，65或70个核苷酸，具有约18至约23个碱基对，例如，约18，19，20，21，22或23个碱基对，其中环状寡核苷酸形成了具有约19个碱基对和2个环的哑铃形结构。
环状siNA分子可包含两个环基序，其中siNA分子的一个或两个环部分是生物可降解的。例如，环状siNA分子的环部分在体内可被转化生成带有3′-端突出端的双链siNA分子，如包括约2个核苷酸的3′-端核苷酸突出端。
siNA分子中修饰的核苷酸可在反义链、有义链或两者中。例如，修饰的核苷酸可具有Northern构象(如，Northern假旋转环，参见，例如Saenger，Principles of Nucleic Acid Structure，Springer-Verlag编，1984)。具有Northern构型的核苷酸实例包括锁核酸(LNA)核苷酸(如，2′-O，4′-C-亚甲基-(D-呋喃核糖基)核苷酸)、2′-甲氧基乙氧基(MOE)核苷酸、2′-甲基-硫代-乙基核苷酸、2′-脱氧-2′-氟代核苷酸、2′-脱氧-2′-氯代核苷酸、2′-叠氮基核苷酸和2′-O-甲基核苷酸。
化学修饰的核苷酸可抵抗核酸酶降解，而同时保持介导RNAi的能力。
双链siNA分子的有义链具有位于该有义链的3′-端、5′-端或3′-端和5′-端两者的端帽部分，如倒置的脱氧无碱基部分。
轭合物的实例包括在Vargeese等人2003年4月30日提交的美国申请序号10/427,160中所描述的轭合物和配体，通过引用将其全部内容(包括附图)并入本文。
在本发明的一些实施方案中，所述轭合物可经由生物可降解的连接体来共价连接于化学修饰的siNA分子。例如，轭合物分子可在化学修饰的siNA分子的有义链、反义链或两条链的3′-端进行连接。
在一些实施方案中，轭合物分子在化学修饰的siNA分子的有义链、反义链或两条链的5′-端进行连接。在一些实施方案中，轭合物分子在化学修饰的siNA分子的有义链、反义链或两条链的3′-端和5′-端进行连接，或其任何组合。
在一些实施方案中，轭合物分子包括促使化学修饰的siNA分子递送进入诸如细胞的生物系统中的分子。
在一些实施方案中，连接于化学修饰的siNA分子的轭合物分子为聚乙二醇、人血清白蛋白，或介导细胞摄取的细胞受体的配体。本发明所涵盖的可连接于化学修饰的siNA分子的具体轭合物分子的实例在Vargeese等人的美国专利公布文本第20030130186号和美国专利公布文本第20040110296号中描述，由此通过引用将各篇的全部内容并入。
siNA可包含连接siNA有义区与siNA反义区的核苷酸连接体、非核苷酸连接体或混合的核苷酸/非核苷酸连接体。在一些实施方案中，核苷酸连接体的长度可为3，4，5，6，7，8，9或10个核苷酸。在一些实施方案中，核苷酸连接体可为核酸适配子。本文使用的术语“适配子”或“核酸适配子”包括与靶分子特异性结合的核酸分子，其中所述核酸分子包含由其自然环境中的靶分子识别的序列。或者，适配子是与靶分子结合的核酸分子，其中该靶分子不容易与核酸结合。
例如，可使用适配子来结合蛋白质的配体结合域，从而防止天然存在的配体与蛋白质的相互作用。参见，例如Gold等，Annu.Rev.Biochem.64763，1995；Brody和Gold，J.Biotechnol.745，2000；Sun，Curr.Opin.Mol.Ther.2100，2000；Kusser，J.Biotechnol.7427，2000；Hermann和Patel，Science287820，2000；以及Jayasena，Clinical Chemistry 451628，1999。
非核苷酸连接体可以为无碱基核苷酸、聚醚、多胺、聚酰胺、肽、碳水化合物、脂质、聚合烃或其他聚合物(如聚乙二醇，比如具有2至100个乙二醇单元的那些)。具体的实例包括由以下文献描述的那些Seela和Kaiser，Nucleic Acids Res.186353，1990及Nucleic Acids Res.153113，1987；Cload和Schepartz，J.Am.Chem.Soc.1136324，1991；Richardson和Schepartz，J.Am.Chem.Soc.1135109，1991；Ma等，Nucleic Acids Res.212585，1993及Biochemistry 321751，1993；Durand等，Nucleic Acids Res.186353，1990；McCurdy等，Nucleosides&Nucleotides 10287，1991；Jschke等，Tetrahedron Lett.34301，1993；Ono等，Biochemistry 309914，1991；Arnold等，国际公布文本第WO 89/02439号；Usman等，国际公布文本第WO 95/06731号；Dudycz等，国际公布文本第WO 95/11910号，以及Ferentz和Verdine，J.Am.Chem.Soc.1134000，1991。
“非核苷酸连接体”是指可掺入核酸链中一个或多个核苷酸单元位置处的基团或化合物，包括糖和/或磷酸置换，并且其允许剩余的碱基表现出它们的酶活性。所述基团或化合物可以是无碱基的，因为其不含有通常识别的例如位于糖C1位的核苷酸碱基，如腺苷、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶。
在一些实施方案中，修饰的siNA分子可具有磷酸骨架修饰，包括一个或多个硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、磷酸三酯、吗啉代、酰胺化氨基甲酸酯、羧甲基、乙酰基酰胺化物(acetamidate)、聚酰胺、磺酸酯、磺酰胺、氨基磺酸酯、甲缩醛(formacetal)、硫代甲缩醛和/或烷基甲硅烷基置换。寡核苷酸骨架修饰的实例在以下中给出Hunziker和Leumann，Nucleic Acid AnaloguesSynthesis and Properties，in Modern SyntheticMethods(核酸类似物在现代合成方法中的合成和性质)，VCH，pp.331-417，1995，以及Mesmaeker等，Novel Backbone Replacements for Oligonucleotides，in Carbohydrate Modifications in Antisense Research(反义研究的碳水化合物修饰中寡核苷酸的新型骨架置换)，ACS，pp.24-39，1994。
可进行化学修饰的siNA分子通过以下步骤合成(a)合成siNA分子的两条互补链；和(b)在适合获得双链siNA分子的条件下使两条互补链退火在一起。在一些实施方案中，siNA分子互补部分的合成通过固相寡核苷酸合成进行，或者通过固相串联寡核苷酸合成进行。
使用本领域已知的方案来合成寡核苷酸(如，某些修饰的寡核苷酸或缺少核糖核苷酸的寡核苷酸部分)，例如在以下文献中所描述的Caruthers等，Methods in Enzymology 2113-19，1992；Thompson等，国际PCT公布第WO 99/54459号；Wincott等，Nucleic Acids Res.232677-2684，1995；Wincott等，Methods Mol.Bio.7459，1997；Brennan等，Biotechnol Bioeng.6133-45，1998；以及Brennan，美国专利第6,001,311号。RNA(包括本发明某些siNA分子)的合成遵循一般的规程，例如在以下文献中所描述的Usman等，J.Am.Chem.Soc.1097845，1987；Scaringe等，Nucleic Acids Res.185433，1990；以及Wincott等，Nucleic Acids Res.232677-2684，1995；Wincott等，MethodsMol.Bio.7459，1997。
本文使用的“不对称发夹”是线性siNA分子，其包括反义区、包含核苷酸或非核苷酸的环部分，和有义区，所述有义区包括的核苷酸与所述反义区相比更少，减少的程度为所述有义区具有足够的互补核苷酸来与所述反义区进行碱基配对并形成带环的双链体。
本文使用的“不对称双链体”是具有两条分开的链的siNA分子，所述两条分开的链包括有义区和反义区，其中所述有义区包括的核苷酸与所述反义区相比更少，减少的程度为所述有义区具有足够的互补核苷酸来与所述反义区进行碱基配对并形成双链体。
本文使用的“调节基因表达”是上调或下调靶基因的表达，其包括上调或下调细胞中存在的mRNA水平，或mRNA翻译，或由靶基因编码的蛋白质或蛋白质亚基的合成。
本文使用的术语“抑制”、“下调”或“减少表达”是指基因表达、或编码一个或多个蛋白质或蛋白质亚基的RNA分子或等价的RNA分子的水平、或由靶基因编码的一个或多个蛋白质或蛋白质亚基的水平或活性，被减少到不存在本发明的核酸分子(如siNA)时所观察到的水平之下。
本文使用的“基因沉默”是指细胞中基因表达的部分或完全抑制，并且还可以称为“基因敲低”。基因沉默的程度可通过本领域已知的方法来确定，其中的一些方法概述于国际公布文本第WO 99/32619号。
本文使用的术语“核糖核酸”和“RNA”是指含有至少一个核糖核苷酸残基的分子。核糖核苷酸是在β-D-核糖-呋喃糖部分的2′位置处带有羟基的核苷酸。这些术语包括双链RNA，单链RNA，分离的RNA如部分纯化的RNA、基本纯的RNA，合成RNA，重组产生的RNA，以及通过添加、缺失、置换、修饰和/或改变一个或多个核苷酸而不同于天然存在的RNA的修饰和改变的RNA。RNA的改变可包括例如向siNA的端部添加非核苷酸物质，或例如在RNA的一个或多个核苷酸内部添加非核苷酸物质。
RNA分子中的核苷酸包括非标准核苷酸，如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA被称为类似物。
“高度保守的序列区”是指靶基因中核苷酸序列的一个或多个区不会显著地从一代变化至另一代，或者从一种生物系统变化至另一种生物系统。
“有义区”是指与siNA分子的反义区具有互补性的siNA分子的核苷酸序列。此外，siNA分子的有义区可包括与靶核酸序列具有同源性的核酸序列。
“反义区”是指与靶核酸序列具有互补性的siNA分子的核苷酸序列。此外，siNA分子的反义区可包括与siNA分子的有义区具有互补性的核酸序列。
“靶核酸”是指其表达或活性即将被调节的任何核酸序列。靶核酸可为DNA或RNA。
“互补性”是指核酸可以通过传统的沃森-克里克结合方式或通过其他非传统的结合方式与另一核酸序列一起形成氢键。
本文使用的术语“生物可降解的连接体”是指被设计为连接一个分子与另一个分子的生物可降解的连接体的核酸或非核酸连接体分子，所述一个分子与另一个分子例如生物活性分子与siNA分子，或siNA分子的有义链与反义链。对生物可降解的连接体进行设计，使其稳定性可被调节以用于特定目的，如递送至特定的组织或细胞类型。基于核酸的生物可降解的连接体分子的稳定性可进行不同的调节，例如，通过组合核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸和化学修饰的核苷酸，所述化学修饰的核苷酸如2′-O-甲基、2′-氟代、2′-氨基、′-O-氨基、2′-C-烯丙基、2′-O-烯丙基及其他2′-修饰的或碱基修饰的核苷酸。生物可降解的核酸连接体分子可以是二聚体、三聚体、四聚体或较长的核酸分子，例如长度为约2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20个核苷酸的寡核苷酸；或者可包括一个带有基于磷的键合的核苷酸，所述基于磷的键合例如氨基磷酸酯键合或磷酸二酯键合。生物可降解的核酸连接体分子还可包括核酸骨架、核酸糖或核酸碱基修饰。
就本文描述的2′-修饰的核苷酸而言，“氨基”是指2′-NH2或2′-O--NH2，其可以是修饰或未修饰的。此类修饰的基团在例如Eckstein等人的美国专利第5,672,695号和Matulic-Adamic等人的美国专利第6,248,878号中描述。
施用 例如，用于递送本发明使用的核酸分子的一些方法在以下文献中描述Akhtar等，Trends Cell Bio.2139，1992；Delivery Strategies for AntisenseOligonucleotide Therapeutics，Akhtar编，1995；Maurer等，Mol.Membr.Biol.16129-140，1999；Hofland和Huang，Handb.Exp.Pharmacol.137165-192，1999；以及Lee等，ACS Symp.Ser.752184-192，2000。Sullivan等人的国际PCT公布文本第WO 94/02595号进一步描述了用于递送酶核酸分子的一般方法。可以利用这些方案来补充或完善本发明所涵盖的任何核酸分子的实际递送。
核酸分子和肽可通过本领域技术人员已知的各种方法来施用至细胞，包括但不限于在单独含有siNA和肽的剂型内施用，或者在进一步含有一种或多种其他组分的剂型内施用，所述其他组分如药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、佐剂、乳化剂、缓冲剂、稳定剂、防腐剂等。在某些实施方案中，siNA和/或肽可被包囊入脂质体中，通过离子电渗疗法施用或者引入其他的基质中施用，如水凝胶、环糊精、生物可降解的纳米胶囊、生物粘附微球或蛋白质的载体(参见，例如，O′Hare和Normand，国际PCT公布文本第WO 00/53722号)。或者，核酸/肽/基质组合可通过直接注射或通过使用输液泵来进行局部递送。本发明核酸分子的直接注射(无论是皮下、肌内还是皮内注射)，均可使用标准的针和注射器方法或者通过无针技术来进行，所述无针技术如以下描述的那些Conry等，Clin.Cancer Res.52330-2337，1999，以及Barry等，国际PCT公布文本第WO 99/31262号。
本发明的组合物可有效地用作药物。所述药物预防、调节了患者疾病状态或其他不利情况的发生或严重程度，或者对患者疾病状态或其他不利情况进行治疗(使一种或多种症状减轻至可检测或可测量的程度)。
因此，在其他实施方案中，本发明提供了药物组合物和方法，其特征在于存在或施用了一种或多种聚核酸，所述聚核酸通常为与肽组合、络合或轭合的一种或多种siNA，任选地与药学上可接受的载体如稀释剂、稳定剂、缓冲剂等进行配制。
本发明通过提供用以调节与受治疗者特定疾病状态或其他不利情况相关的基因表达的短干扰核酸(siNA)分子，实现了其他的目的和优势。通常，siNA靶向的基因是作为与受治疗者疾病状态或不利情况相关的偶然因素或必然因素以升高的水平表达的基因。由于这个原因，siNA将基因表达有效地下调至预防、减轻一种或多种相关疾病症状严重程度或减少一种或多种相关疾病症状发生的水平。或者，对于各种截然不同的疾病模型而言，靶基因的表达不会作为疾病或其他不利情况的结果或后果而必然升高，靶基因的下调通过降低基因表达仍然产生治疗效果(即，减少选定的mRNA和/或靶基因蛋白质产物的水平)。或者，本发明的siNA可靶向较低表达的一种基因，其导致表达受靶基因产物或活性负调节的“下游”基因的上调。
本发明的这种siNA可以以任何形式施用，例如经皮施用或通过局部注射施用。提供了类似的方法和组合物，该方法和组合物靶向表达了与动物受治疗者选定疾病病征相关的一种或多种不同的基因，所述基因包括大量基因中的任何一种，已知其表达作为与选定疾病病征相关的偶然因素或必然因素而异常增加。
本发明的负电荷多核苷酸(如RNA或DNA)可通过任何标准的方式在具有或没有稳定剂、缓冲剂等等情况下形成药物组合物而施用于患者。当需要使用脂质体递送机理时，遵循形成脂质体的标准规程。本发明的组合物还可被配制并用作口服施用的片剂、胶囊剂或酏剂，直肠施用的栓剂，可注射施用的无菌溶液、悬浮液，以及本领域已知的其他组合物。
本发明还包括此处所描述组合物的药学上可接受的剂型。这些剂型包括上述复合物的盐，如酸加成盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、乙酸盐和苯磺酸盐。
siNA还可以以栓剂的形式施用，如用于药物的直肠施用。这些组合物可通过将药物与适宜的无刺激性赋形剂混合而制备，所述赋形剂在常温为固体但在直肠温度为液体，因而其在直肠中可熔化并释放药物。这样的材料包括可可脂和聚乙二醇。
核酸分子可通过本领域技术人员已知的多种方法来施用至细胞，包括但不限于包囊入脂质体中，通过离子电渗疗法施用或者通过引入其他的基质中施用，如生物可降解的聚合物、水凝胶、环糊精(参见，例如，Gonzalez等，Bioconjugate Chem.101068-1074，1999；Wang等，国际PCT公布文本第WO 03/47518和WO 03/46185号)、聚(乳酸-乙醇酸共聚物)(PLGA)和PLCA微球(参见，例如美国专利第6,447,796号和美国专利申请公布号US2002130430)、生物可降解的纳米胶囊、生物粘附微球；或者通过蛋白质载体施用(O′Hare和Normand，国际PCT公布第WO 00/53722号)。或者，核酸/基质组合通过直接注射或通过使用输液泵来进行局部递送。本发明核酸分子的直接注射(无论是皮下、肌内还是皮内注射)，均可使用标准的针和注射器方法或者通过无针技术来进行，所述无针技术如以下文献描述的那些Conry等，Clin.Cancer Res.52330-2337，1999，以及Barry等，国际PCT公布文本第WO 99/31262号。本发明的分子可用作药物。所述药物预防、调节了受治疗者疾病状态的发生，或者对受治疗者疾病状态进行治疗(使症状减轻至某种程度，优选使所有的症状减轻至某种程度)。
可将本发明阳离子肽中的任何一种或组合进行选择或组合，以获得有效的促进多核苷酸递送的多肽试剂，从而诱导或促使本发明方法和组合物中的siNA的细胞内递送。
药物组合物 本发明还包括此处描述复合物的药学上可接受的剂型或组合物。这些剂型包括上述复合物的有机盐和无机盐，如酸加成盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、乙酸盐和苯磺酸盐。
含水悬浮液包含与适用于制备含水悬浮液的赋形剂混合的活性物质。所述赋形剂为悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍树胶和阿拉伯胶；分散剂或润湿剂，其可以为天然存在的磷脂(如卵磷脂)，或烯化氧(alkylene oxide)与脂肪酸的缩合产物(例如聚氧乙烯硬脂酸酯)，或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物(例如十七乙烯氧基十六烷醇)，或环氧乙烷与由脂肪酸和己糖醇衍生的部分酯的缩合产物(如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯)，或环氧乙烷与由脂肪酸和己糖醇酐衍生的部分酯的缩合产物(例如聚乙烯失水山梨糖醇单油酸酯)。含水悬浮液还可以包含一种或多种防腐剂，例如苯甲酸乙酯或苯甲酸正丙酯、苯甲酸对羟酯；一种或多种着色剂；一种或多种调味剂；以及一种或多种甜味剂，如蔗糖或糖精。
含油悬浮液通过将活性成分悬浮于植物油或矿物油中制备，所述植物油例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油，所述矿物油如液体石蜡。含油悬浮液可以包含增稠剂，例如蜂蜡、固体石蜡或十六醇。可加入甜味剂和调味剂以提供适口的口服制剂。这些组合物可通过添加抗氧化剂如抗坏血酸来进行保护。
适用于含水悬浮液制剂的可分散的粉末和颗粒通过水的加入来实现活性成分与分散剂或润湿剂、悬浮剂以及一种或多种防腐剂的混合。也可存在其他的赋形剂，例如甜味剂、调味剂和着色剂。
本发明的药物组合物还可以为水包油乳剂的形式。油相可为植物油或矿物油，或其混合物。适宜的乳化剂可以是天然存在的树胶，例如阿拉伯胶或黄蓍树胶；天然存在的磷脂，例如大豆卵磷脂；以及由脂肪酸和己糖醇或己糖醇酐衍生的酯或部分酯，例如失水山梨糖醇单油酸酯，以及所述部分酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯。乳剂还可以包含甜味剂和调味剂。
药物组合物可以是可注射的无菌含水悬浮液或含油悬浮液的形式。该悬浮液可使用适宜的分散剂或润湿剂和/或悬浮剂来配制。可注射的无菌制剂还可以是存在于无毒的相互可接受的稀释剂或溶剂(例如1，3-丁二醇溶液)中的可注射的无菌溶液或悬浮液。
在用于药物组合物的可接受的载体、基质和溶剂中，可以采用的是水、林格氏液和等渗的氯化钠溶液。此外，习惯采用无菌的不挥发油作为载体、基质、溶剂或悬浮介质。出于此目的，可以采用任何温和的不挥发油，包括合成的甘油一酯或甘油二酯。另外，脂肪酸如油酸在可注射的制剂中得到了应用。
由此通过引用而分别将本文引证的所有出版物、参考文献、专利和专利申请的全部内容逐一地并入。
虽然本发明已经就某些实施方案进行了描述，而且许多细节也为说明的目的而被提出，但是对于本领域技术人员显而易见的是，本发明包括其他的实施方案，并且本文描述的一些细节可以进行相当大的改变而不脱离本发明。本发明包括所述的其他实施方案、改进和等价。
本文使用的术语“一(a)”、“一(an)”、“所述(the)”以及描述本发明的类似术语和权利要求中的类似术语，应解释为包括单数和复数。术语“包括(comprising)”、“具有(having)”和“包含(containing)”应解释为开放式术语，其含义为，例如“包括但不限于”。本文列举的数值范围预期单独地指落入该范围内的各个分开的数值，如同其被本文单独地列举，而无论该范围内的一些数值是否被明确地列举。本文所采用的具体数值应理解为示例性的并且不限制本发明的范围。
本文给出的实施例以及本文使用的示例性语言，仅用于说明的目的而不预期限制本发明的范围。
实施例 制备实施例1 PN0826siRNA复合物水溶液。复合物如下制备将82.12μl不含核糖核酸酶的水加至离心管，然后加入10μl G1498(1mg/ml，于不含核糖核酸酶的水中)。涡旋该溶液以混合。最后，添加7.88μl PN0826(1mg/ml，于不含核糖核酸酶的水中)并涡旋混合。
制备实施例2 PN0826、F-108和水。复合物如下制备首先向离心管添加82.12μl不含核糖核酸酶的水，然后添加10μl G1498(1mg/ml，于不含核糖核酸酶的水中)。涡旋混合。之后添加7.88μl PN0826(1mg/ml，于不含核糖核酸酶的水中)并涡旋混合。最后，添加5μl Pluronic F108(20mg/ml，0.2μM过滤)并吹吸混合。
制备实施例3 Cy5-Inm4、PN0183，过夜。复合物如下制备首先向离心管添加119.40μl的10mM Hepes/5％葡萄糖缓冲液(pH 5.0)，然后添加15.60μl的肽PN0183(2mg/ml，于不含核糖核酸酶的水中)并涡旋混合。该溶液在4°贮存过夜。最后，添加15μl Cy5-Inm4(1mg/ml，于不含核糖核酸酶的水中)并再次涡旋混合。
制备实施例4 Cy5-Inm4、PN0183、F127，过夜。复合物如下制备首先向离心管添加119.40μl的10mM Hepes/5％葡萄糖缓冲液(pH 5.0)，然后添加15.60μl的肽PN0183(2mg/ml，于不含核糖核酸酶的水中)和7.5μl的Pluronic F127(20mg/ml，0.2μM过滤)。涡旋混合。该溶液在4°贮存过夜。最后，添加15μl Cy5-Inm4(1mg/ml，于不含核糖核酸酶的水中)并再次涡旋混合。
制备实施例5 G1498、PN0183、稀释用水，首先添加肽。复合物如下制备首先向离心管添加85.83μl的10mM Hepes/5％葡萄糖缓冲液(pH 5.0)，然后添加4.17μl的肽PN0183(5mg/ml，于不含核糖核酸酶的水中)，并涡旋混合。最后，向该溶液加入10μl G1498(1mg/ml，于不含核糖核酸酶的水中)并再次涡旋混合。
制备实施例6 G1498、PN0183、稀释用缓冲液，首先添加肽。复合物如下制备首先向离心管添加85.83μl的10mM Hepes/5％葡萄糖缓冲液(pH 5.0)，然后添加4.17μl的肽PN0183(5mg/ml，于pH 5.0的10mM Hepes/5％葡萄糖缓冲液中)，并涡旋混合。最后，向该溶液加入10μl G1498(1mg/ml，于pH 5.0的10mM Hepes/5％葡萄糖缓冲液中)并再次涡旋混合。
制备实施例7 G1498、PN0183，首先添加肽且不涡旋。复合物如下制备首先向离心管添加85.83μl的10mM Hepes/5％葡萄糖缓冲液(pH 5.0)，然后添加4.17μl的肽PN0183(5mg/ml，于pH 5.0的10mM Hepes/5％葡萄糖缓冲液中)，并吹吸混合。最后，向该溶液加入10μl G1498(1mg/ml，于pH 5.0的10mM Hepes/5％葡萄糖缓冲液中)并再次吹吸混合。
制备实施例8 G1498、PN0183，首先添加肽并通过稀释降低浓度。复合物如下制备首先向离心管添加85.83μl的10mM Hepes/5％葡萄糖缓冲液(pH 5.0)，然后添加4.17μl的肽PN0183(5mg/ml，于pH 5.0的10mM Hepes/5％葡萄糖缓冲液中)，并涡旋混合。向该溶液加入10μl G1498(1mg/ml，于pH 5.0的10mM Hepes/5％葡萄糖缓冲液中)并再次涡旋混合。最后，将该溶液稀释10倍至较低浓度。
制备实施例9 G1498、PN0183，首先添加siRNA。复合物如下制备首先向离心管添加85.83μl的10mM Hepes/5％葡萄糖缓冲液(pH 5.0)，然后添加10μlG1498(1mg/ml，于pH 5.0的10mM Hepes/5％葡萄糖缓冲液中)，并涡旋混合。
制备实施例10 G1498、PN0183，首先添加肽并等待30分钟。复合物如下制备首先向离心管添加85.83μl的10mM Hepes/5％葡萄糖缓冲液(pH 5.0)，然后添加4.17μl的肽PN0183(5mg/ml，于pH 5.0的10mM Hepes/5％葡萄糖缓冲液中)，并涡旋混合。最后，向该溶液加入10μl G1498(1mg/ml，于pH 5.0的10M Hepes/5％葡萄糖缓冲液中)并再次涡旋混合。将该溶液在冰上平衡30分钟。
制备实施例11 G1498、PN0183，首先添加肽并等待60分钟。复合物如下制备首先向离心管添加85.83μl的10mM Hepes/5％葡萄糖缓冲液(pH 5.0)，然后添加4.17μl的肽PN0183(5mg/ml，于pH 5.0的10mM Hepes/5％葡萄糖缓冲液中)，并涡旋混合。最后，向该溶液加入10μl G1498(1mg/ml，于pH 5.0的10mM Hepes/5％葡萄糖缓冲液中)并再次涡旋混合。将该溶液在冰上平衡60分钟。
制备实施例12 G1498、PN0183，首先添加肽并等待24小时。复合物如下制备首先向离心管添加85.83μl的10mM Hepes/5％葡萄糖缓冲液(pH 5.0)，然后添加4.17μl的肽PN0183(5mg/ml，于pH 5.0的10mM Hepes/5％葡萄糖缓冲液中)，并涡旋混合。最后，向该溶液加入10μl G1498(1mg/ml，于pH 5.0的10mM Hepes/5％葡萄糖缓冲液中)并再次涡旋混合。将该溶液在冰上平衡24小时。
制备实施例13 Inm4、PN0183、PN0939，在即将剂量给药之前添加siRNA。复合物如下制备首先向离心管添加259.1μl的10mM Hepes/5％葡萄糖缓冲液(pH5.0)，然后添加15.60μl的PN0183(5mg/ml，于pH 5.0的10mM Hepes/5％葡萄糖缓冲液中)和10.30μl的PN0939(5mg/ml，于pH 5.0的10mMHepes/5％葡萄糖缓冲液中)。涡旋混合。最后，添加15.00μl的Inm4(5mg/ml，pH 5.0的10mM Hepes/5％葡萄糖缓冲液)。涡旋混合。
制备实施例14 Inm4，依次为siRNA、PN0183、PN0939，并吹吸混合。复合物如下制备首先向离心管添加172.00的10mM Hepes/5％葡萄糖缓冲液(pH 5.0)，然后添加10μlInm4(5mg/ml，于pH 5.0的10mM Hepes/5％葡萄糖缓冲液中)。吹吸混合。稍后加入11.20μl的PN0183(5mg/ml，于pH 5.0的10mMHepes/5％葡萄糖缓冲液中)。吹吸混合。最后，加入6.80μl PN0939(5mg/ml，于pH 5.0的10mM Hepes/5％葡萄糖缓冲液中)。再次吹吸混合。将该溶液在冰上平衡1小时。
制备实施例15 Inm4，依次为siRNA、PN0183、PN0939，并涡旋混合。复合物如下制备首先向离心管添加2289.50μl的10mM Hepes/5％葡萄糖缓冲液(pH5.0)，然后添加24.00μl Inm4(20mg/ml，于不含核糖核酸酶的水中)。涡旋混合。稍后加入53.60μl的PN0183(10mg/ml，于pH 5.0的10mM Hepes/5％葡萄糖缓冲液中)。涡旋混合。最后，加入32.90μl PN0939(20mg/ml，于pH 5.0的10mM Hepes/5％葡萄糖缓冲液中)。吹吸混合。将该溶液在冰上平衡1小时。
制备实施例16 Inm4，依次为siRNA、PN0183、PN0939，且pH 7.4。复合物如下制备首先向离心管添加376.19μl的10mM Hepes/5％葡萄糖缓冲液(pH 7.4)，然后添加5μlInm4(20mg/ml，于不含核糖核酸酶的水中)。涡旋混合。稍后加入15.39μl的PN0183(7.26mg/ml，于不含核糖核酸酶的水中)。涡旋混合。最后，加入3.42μl PN0939。吹吸混合。
制备实施例17 G1498、PN0183和叔丁醇。复合物如下制备首先向离心管添加72.93μl的10mM Hepes/5％葡萄糖缓冲液(pH 5.0)，然后添加4.17μl PN0183(5mg/ml，于pH 5.0的10mM Hepes/5％葡萄糖缓冲液中)。涡旋混合。稍后加入10μl的G1498(1mg/ml，于pH 5.0的10mM Hepes/5％葡萄糖缓冲液中)。再次涡旋混合。最后，加入12.90μl叔丁醇并吹吸混合。
制备实施例18 G1498、PN0183和乙醇。复合物如下制备首先向离心管添加73.33μl的10mM Hepes/5％葡萄糖缓冲液(pH 5.0)，然后添加4.17μl PN0183(5mg/ml，于pH 5.0的10mM Hepes/5％葡萄糖缓冲液中)。涡旋混合。稍后加入10μl的G1498(1mg/ml，于pH 5.0的10mM Hepes/5％葡萄糖缓冲液中)。再次涡旋混合。最后，加入12.50μl乙醇并吹吸混合。
制备实施例19 Lac-Z、PN0183、PN0939。复合物如下制备将5.0μl的Lac-Z siRNA(20μM)稀释入120μl的OPTI-MEM培养基。向121.40μl的OPTI-MEM培养基添加1.62μl的PN0183(1mg/ml)和1.98μl的PN0939(1mg/ml)。合并两种溶液并吹吸混合。
Lac-Z的结构为 有义CN2938.(SEQ ID NO64) 5′-r(CUACACAAAUCAGCGAUUU)dTdT-3′ 反义CN2939.(SEQ ID NO65) 5′-r(AAAUCGCUGAUUUGUGUAG)dTdC-3′ 制备实施例20 Lac-Z、PN0183、PN0938。复合物如下制备将5.0μl的Lac-Z siRNA(20μM)稀释入120μl的OPTI-MEM培养基。将1.62μl的PN0183(1mg/ml)和0.97μl的PN0938(1mg/ml)一起添加至122.41μl的OPTI-MEM培养基。合并两种溶液并吹吸混合。
制备实施例21 Lac-Z、PN0183、PN0939并交联。复合物如下制备将5.0μl的Lac-ZsiRNA(20μM)稀释入120μl的OPTI-MEM培养基。将1.62μl的PN0183(1mg/ml)和1.98μl的PN0939(1mg/ml)添加至119.80μl的OPTI-MEM培养基。合并两种溶液并吹吸混合。然后添加1.60μl的戊二醛(0.05％，W/V)并吹吸混合。该溶液在室温平衡1小时。
制备实施例22 Lac-Z、PN0183、交联、PN0939。复合物如下制备将5.0μl的Lac-ZsiRNA(20μM)稀释入120μl的OPTI-MEM培养基。将1.62μl的PN0183(1mg/ml)添加至119.80μl的OPTI-MEM培养基。合并两种溶液然后添加1.60μl的戊二醛(0.05％，W/V)。吹吸混合。该溶液在室温平衡1小时。最后，添加1.98μl的PN0939(1mg/ml)。吹吸混合。
制备实施例23 Lac-Z、PN0183、交联、PN0939、交联。复合物如下制备将5.0μl的Lac-Z siRNA(20μM)稀释入120μl的OPTI-MEM培养基。将1.62μl的PN0183(1mg/ml)添加至119.80μl的OPTI-MEM培养基。合并两种溶液然后添加0.8μl的戊二醛(0.05％，W/V)。吹吸混合。该溶液在室温平衡1小时。之后添加1.98μl的PN0939(1mg/ml)和0.8μl的戊二醛(0.05％，W/V)。吹吸混合。
制备实施例24 Lac-Z、PN0183、交联、透析、PN0939。复合物如下制备首先通过添加158.6μl的10mM Hepes/5％葡萄糖缓冲液(pH 7.4)、103.45μl的Lac-Z siRNA(20μM)和33.53μl的PN0183(1mg/ml)来使Lac-Z siRNA与PN0183合并。涡旋混合。然后添加4.4μl的戊二醛(0.05％，W/V)。吹吸混合。该溶液在室温平衡2小时。之后该溶液在4°透析过夜。将43.5μl的交联合并液稀释入331.5μl的OPTI-MEM。将4.96μl的PN0939(0.1mg/ml)稀释入57.54μl的OPTI-MEM。合并两种稀释的溶液并吹吸混合。
制备实施例25 Lac-Z、PN0183、PN0826和PEG 3350。复合物如下制备将5.0μl的Lac-Z siRNA(20μM)和1.6μl的PN0183(0.1mg/ml)添加至120μl的OPTI-MEM培养基，并涡旋混合。将3.96μl的PN0826(0.1mg/ml)和2.50μl的PEG 3350(10mg/ml)添加至118.54μl的OPTI-MEM培养基。合并两种溶液并吹吸混合。
实施例1 肽-siRNA亲和力的金色染料置换试验 各种肽与siRNA经由快速筛选的相对结合通过间接测量SYBR金色核酸结合染料的置换来评估。在测量平板中制备siRNA、肽和SYBR金色染料的两份缓冲液混合物，以使肽和SYBR金色染料同时竞争性结合siRNA。siRNA的浓度固定在10μg/mL，并且其与各种肽的滴定液合并，其中所述各种肽的浓度范围与0.05至10的肽∶siRNA配料比相对应。因为SYBR金色染料只有在结合于siRNA之后才发出荧光，所以肽与siRNA的结合抑制了染料的结合，从而减少荧光。因此，荧光的量与肽和siRNA的结合呈逆相关。计算了Kd和Bmax值。更大的Kd值表示肽与siRNA之间更强的结合亲和力。
SYBR金色核酸结合染料储备液(10,000x浓缩物)由Invitrogen(Carlsbad，CA)供应，并于-20℃贮存。在使用无Hyclone核酸酶的水以1∶100稀释之前，允许该浓缩物平衡至室温。将该浓缩物在实验平板中以1∶10稀释成用于试验的最终10x浓缩物。这是实现与浓度范围高达50μg/mL浓度的siRNA双链体线性结合的最佳稀释。用来生成用于说明SYBR金色染料与G1498siRNA线性结合的标准曲线的值示于表4。
表4 G1498 siRNA标准曲线值 样品在384孔分析平板中直接混合。首先，使用多通道移液管将5μLSYBR金色染料移至每个孔中，多通道移液管的尖端触及孔的底部以完全吸出溶液。其次，使用单通道移液管添加22.5μL的2x溶液。最后，使用多通道移液管添加22.5μL的2x siRNA。立即使用箔材覆盖平板并轻轻地敲打，以便混合并震落孔壁的任何液滴。
使用从Molecular Devices(Sunnyvale，CA)获得的SpectraMax荧光平板读数仪来测量荧光。平板设置包括读数前的振摇，每孔读数一次，其中激发波长为495nm，发射波长为537nm。在添加siRNA 30分钟内对平板读数。
肽结合的Scatchard曲线 Scatchard曲线是肽结合(结合肽/游离肽)与结合肽的曲线。该曲线的线性回归斜率为-1/Kd，Bmax为y轴截距。由于游离肽和结合肽的浓度不能直接测量，因此使用间接测量的siRNA来进行计算。根据测量的荧光使用标准曲线来确定游离的siRNA。根据已知的siRNA初始浓度(10μg/mL)的质量平衡从标准曲线确定结合的siRNA。
通过假定一分子对的(siRNA∶肽)结合摩尔比等于(siRNA∶肽)配料比，来从结合的siRNA计算结合的肽。根据这项计算的结合肽量，通过质量平衡来计算游离的肽。
粒度和ζ电位 采用Malvern Zetasizer Nano ZS(马尔文纳米粒度仪)(Malvern，Worcestershire，UK)在25°测量粒度和ζ电位，其使用了DTS1060C清洁的一次性ζ电池。用于粒度测量的分散剂是粘度为1.0200CP的PBS，或粘度为0.8872CP的水。用于ζ电位测量的分散剂是粘度为0.8872CP的水。将分散剂粘度用作样品粘度。当测量ζ电位和粒度时，使用清洁的一次性ζ电池。当仅测量粒度时，则使用小体积一次性分级比色皿。
实施例2 在不同核酸浓度和N/P比下缩合粒子的大小 图1显示在不同的G1498浓度和不同的N/P比下，siRNA G1498与肽PN183的缩合复合物的粒子直径。对于在特定N/P处的各组的三条柱形图而言，最左边的柱形的G1498浓度为100ug/ml，中间的柱形的浓度为50ug/ml，最右边的柱形的浓度为10ug/ml。在N/P为0.2至0.5处，当G1498的浓度为10ug/ml时，粒子是相当小的，因此不显示该柱形。
在N/P比低于约1.4处，对于所有浓度的siRNA而言，粒度均低于约200nm。在N/P比为约1.4或超过约1.4处，除了最高浓度(100ug/ml)之外，对于所有浓度的RNA而言，缩合粒子的大小保持在低于约200nm。
实施例3 在不同核酸浓度和N/P比下缩合粒子的大小 图2-5显示在混合后的不同时间和不同的氮/磷比(N/P)下，所获得的siRNA G1498与肽PN183的缩合复合物的粒子直径。在图2-5的每一幅中，对于在特定N/P比处的各组的两条柱形图而言，左边的柱形采用了涡旋，而右边的柱形未采用涡旋。
图2中的粒度是在混合后立即获得的，而图3、图4和图5的粒度分别是在混合后30分钟、60分钟和24小时获得的。
实施例4 pH对缩合粒子大小的影响 图6显示在G1498浓度为100ug/ml以及N/P比为1.4时，不同pH值下获得的siRNA G1498与肽PN183的缩合复合物的粒子直径。
在pH低于约12时，缩合粒子的大小减少，并且随着pH的降低而继续减小。pH低于约11时粒度低于约500nm。
强度为反向散射光子(反向散射模式)的量度。粒度是使用扩散自相关算法计算的尺寸。
实施例5 盐浓度对缩合粒子大小的影响 图7显示在不同的氯化钠浓度下，所获得的siRNA G1498与肽PN183的缩合复合物的粒子直径。
在氯化钠浓度高达约0.5时，粒度从约100nm增加至约275nm。在氯化钠浓度大于约0.5时，缩合粒子的大小上下波动。
实施例6 RNA和肽的加入顺序对缩合粒子大小的影响 图8显示在不同的N/P比和不同的混合顺序下，siRNA G1498与肽PN183的缩合复合物的粒子直径。在N/P比为约0.5或低于约0.5时，粒度受到添加顺序的影响并不大。在N/P比高于约0.5，并且在首先将siRNA引入溶液再向siRNA溶液添加肽时，粒度一般较小。
实施例7 缩合粒子的形态 肽-RNA缩合复合物的粒子形态通过透射电子显微镜(TEM)成像法来确定。使用了以下方案 将15uL样品滴至格栅顶部，10min； 浸入半浓度的Karnofsky氏液； 浸入二甲砷酸盐缓冲液； TEM对比剂3％乙酸双氧铀(UA)； 浸入水，3X，浸入UA，在湿滤纸上吸掉余量，干燥。
混合物1(最初的Karnovsky氏混合物) 16％多聚甲醛溶液20mL； 50％戊二醛EM级别8mL； 0.2M磷酸钠缓冲液25mL； 蒸馏水 25mL。
最终混合物为78mL的0.08M缓冲液，其中有5％戊二醛，4％甲醛。
该混合物的摩尔渗透压浓度超过2000m OSM。
二甲砷酸钠缓冲液0.1M； 二甲砷酸钠4.28gm； 氯化钙25.0gm； 0.2N盐酸2.5ml； 用蒸馏水稀释至200ml，pH 7.4。
使用上述不放热的方案，图9显示siRNA G1498(浓度100ug/ml)与肽PN183(N/P＝1.4)的缩合复合物粒子的TEM。该图像显示粒子大小均匀并且具有球形形态。粒度低于100nm，通常为大约50-60nm。
使用上述放热的方案，图10显示siRNA G1498(浓度100ug/ml)与肽PN183(N/P＝1.4)的缩合复合物粒子的TEM。该图像显示粒子大小均匀并且具有球形形态。粒度低于100nm，通常为大约30-60nm。
实施例8 肽-RNA缩合复合物的粒度特征 表5概括了一些肽-RNA缩合复合物的粒度特征。
表5 肽-RNA缩合物的粒度特征 例如，N/P为0.5时的G1498/PN183复合物展示的峰为总强度的98.7％，峰直径为73.3nm，峰宽为32.9nm，Z-平均直径为63.8。
实施例9 在使用肽-RNA缩合物的LPS刺激的小鼠肺中TFN-α的体内敲低试验 通过使用肽-siRNA缩合复合物转染细胞来测定SiRNA的敲低活性。将随机siRNA序列用作阴性对照。
图11显示通过鼻内施用包括siRNA Inm-4和肽PN183以及PN939的缩合复合物的组合物而在小鼠模型中进行LPS诱导TFN-α表达(pg/ml)的敲低试验结果。
在图11中，最左边的柱形图是缓冲液对照，随后是Inm-4/PN183/PN939缩合物的数据，右边跟随的是与戊二醛(G)交联的Inm-4/PN183/PN939复合物的数据。安慰剂不含siRNA，而Qneg含有无活性的siRNA。
表6给出了图11的数据。
表6 在使用Inm-4siRNA的LPS刺激小鼠肺中TFN-α的敲低
剂量经鼻内施用。在剂量给药后4小时和24小时，使用0.625ng LPS(50μl)对动物进行诱导。LPS后2小时收集肺。进行TNFαELISA试验和BCA总蛋白质试验。用于试验的材料和方法如下 动物正常小鼠 剂量0.5mg/kg 体积50uL 重复n＝3 组总数10 对照基质、Qneg siRNAInm4 剂量给药使用Inm4制备0.5mg/kg的制剂。每种制剂总共有200ul。每只小鼠(n＝3)接受50ul。
siRNA制品使用Hepes/缓冲液将现有的20mg/ml Inm-4siRNA储备液稀释为5mg/ml。使用现有的3.29mg/ml Qneg储备液。
肽使用缓冲液将肽稀释为合适的浓度(10mM Hepes/5％葡萄糖)。
赋形剂制品使用戊二醛(0.05％W/V)，0.2um过滤至无菌。
制剂制品将各组分添加至Bio-pur Eppendorf 1.5ml管。
(A)首先加入缓冲液，作为其他组分小体积的接受体积。
(B)按照以下顺序加入所有的组分siRNA、肽-1、肽-2、添加剂(如果有的话)、缓冲液。
(C)使用戊二醛对制剂进行交联，在剂量给药前等待1小时。
表7给出了代表性的制剂。
表7 肽-siRNA复合物制剂 表8和表9给出了代表性制剂的细节。
表8 表9 实施例10 在大鼠神经胶质肉瘤成纤维细胞(9L/LacZ)中Lac-z表达的体外敲低试验 图12显示lac-z siRNA与肽PN183以及各种第二肽的缩合复合物在大鼠神经胶质肉瘤成纤维细胞9L/LacZ中lac-z表达的体外敲低试验结果。
在图12中，最左边的柱形图是使用HiPerFectTM(Qiagen；Valencia(巴伦西亚)，California(加利福尼亚))的比较数据，随后是本发明各种复合物的数据。PN183的N/P比为0.75，而第二肽的N/P比为0.3。表10给出了图12的数据。
表10 Lac-z体外敲低试验
用于本试验的材料和方法如下 细胞9L/LacZ 剂量100nM；基于100ul总转染体积。
体积25uL制剂体积。
重复n＝3。
组总数20。
对照Qneg w/Alexis 546。
siRNALacZ。
Lac-Z或Qneg54ul siRNA+17.28ul PN0183+1278ul OPTI-MEM。
使用OPTI-MEM培养基将肽稀释至合适的浓度。所有的赋形剂均0.2um过滤至无菌。
制剂 (A)使用OPTI-MEM一起稀释siRNA和PN0183以形成粒子。涡旋。
(B)使用OPTI-MEM稀释递送基质。涡旋混合该递送基质。
(C)对于每种制剂而言，首先向96个孔中加入稀释的递送基质，然后加入siRNA/PN0183制剂。吹吸混合。在送至转染前等待30分钟。转染每种制剂为125ul，其对于5个孔是足够的。每孔(n＝3)接受25ul。
表11给出了代表性的制剂。
表11 表12给出了代表性制剂的细节。
表12
实施例11 在大鼠神经胶质肉瘤成纤维细胞(9L/LacZ)中Lac-z表达的体外敲低试验 表13显示各种缩合复合物对大鼠神经胶质肉瘤成纤维细胞9L/LacZ中lac-z表达的体外敲低试验结果。
表13 在大鼠模型细胞系9L/LacZ中Lac-z表达的敲低 用于本试验的材料和方法如下 细胞9L/LacZ。
剂量100nM；基于100ul的总转染体积。
体积25uL制剂体积。
重复n＝3。
组总数20。
对照Qneg w/Alexis 546。
siRNALacZ。
转染每种制剂有125ul，其对于5个孔是足够的。每孔(n＝3)接受25ul。
肽制品使用OPTI-MEM培养基将肽稀释至合适的浓度。
赋形剂制品所有的赋形剂均0.2um过滤至无菌。
制剂制品 (A)对于无PN0183的制剂而言，首先加入递送基质，然后加入siRNA，吹吸混合。
(B)对于有PN0183的制剂而言，首先制备siRNA和PN0183的络合物。在96孔平板中，首先添加递送基质，然后添加siRNA/PN0183络合物，吹吸混合。
(C)对于交联的制剂而言，首先制备siRNA/PN0183络合物，然后进行透析(4°，过夜)或者不进行透析。之后在次日清晨，首先添加另一递送基质，然后添加siRNA/PN0183络合物，随后吹吸混合。
表14给出了代表性的制剂。
表14 表15、表16和表17给出了代表性制剂的细节。
表15 表16 表17
实施例12 促进多核苷酸递送的多肽 示例性的促进多核苷酸递送的多肽PN73是从人组蛋白2B(H2B)蛋白质的氨基酸序列获得的，其示于下文。存在于H2B蛋白质内的加下划线的残基13至48标识出了用以衍生PN73的片段。其还可以通过H2B氨基酸12至48表示。PN73的一级结构也示于下文。
H2B(组蛋白2B)氨基酸序列(SEQ ID NO66) MPEPAKSAPAPKKGSKKAVTKAQKKDSKKRKRSRKFSYSVYVYKVLKV HPDTGISSKAMGIMNSFVNDIFERIAGEASRLAHYNKRSTITSREIQTAVRL LLPGELAKHAVSEGTKAVTKYTSSK PN73(13-48)(SEQ ID NO42) NH2-KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-酰胺 表18示出了一些促进多核苷酸递送的多肽突变体的结构，所述突变体是通过示例性的促进多核苷酸递送的多肽PN73的残基置换和缺失来制备的。
表18 PN73残基置换和缺失序列 表19示出了示例性的促进多核苷酸递送的多肽PN73及其截短的衍生物的结构。以下列出的PN360和PN361的氨基酸序列与对应的PN73氨基酸序列进行比对。
表19 PN73缺失系列
PN360具有PN73的N端，但是缺失PN73的C端，而PN361具有PN73的C端，但缺失PN73的N端。PN766代表PN73的15个C端氨基酸。PN73、PN360、PN361和PN766未使用C端FITC(荧光素-5-异硫氰酸酯)(即，-GK[ε]G-酰胺)进行标记。表19还示出PN73的11个截短的形式，所述截短的形式是通过从肽的N端同时缺失3个连续的残基(除PN768外)而形成的。所有这些肽均使用C端FFTC(荧光素-5-异硫氰酸酯)标记物(即，-GK[ε]G-酰胺)进行标记，以使含有所述肽的细胞能被荧光显微镜检测到和/或被流式细胞仪分选。PN766和PN708具有相同的氨基酸序列，唯一的不同之处在于PN708具有C端FITC标签。
实施例13 用于siRNA细胞摄取和靶基因敲低的体外方法和规程 本实施例对用于评价实施例12中表18和表19所列示例性促进多核苷酸递送的多肽促进siRNA细胞摄取和siRNA介导的靶基因敲低活性效力的方法和规程进行了说明。还评价了细胞生存力。下文详细解释了用于每项试验的细胞培养条件和规程。
细胞培养物 原代人单核细胞来自健康供体的新鲜人血样品从Golden WestBiologicals购买。为了分离单核细胞，在接收后立即用PBS以1∶1的比例对血液样品进行稀释。通过Ficoll(Amersham)梯度从全血中首先分离出外周血单核细胞(PBMC)。使用Miltenyi CD 14阳性选择试剂盒和所提供的规程(MILTENYT BIOTEC)从PBMC中进一步纯化单核细胞。为了评价单核细胞制品的纯度，将细胞与抗CD 14抗体(BD Biosciences)一起孵育，然后通过流式细胞仪分选。单核细胞制品的纯度超过95％。
人单核细胞的活化通过向细胞培养物添加0.1-1.0ng/ml的脂多糖、LPS(Sigma，St Louis，MO)来进行，以便刺激肿瘤坏死因子-±(TNF-±)的产生。在与LPS孵育3小时后收获细胞，并根据制造商的说明书通过Quantigene试验(Genospectra，Fremont，CA)来测定mRNA水平。
小鼠尾部成纤维细胞小鼠尾部成纤维(MTF)细胞是从C57BL/6J小鼠的尾部获得的。将尾部切除，浸入70％乙醇中，然后使用刀片切成小段。这些段用PBS洗涤三次，然后在37℃的振荡器中与0.5mg/mL胶原酶、100单位/mL青霉素和100μg/mL链霉素一起孵育以破坏组织。之后将尾段在完全培养基(Dulbecco改良的必需培养基，含有20％FBS、1mM丙酮酸钠、非必需氨基酸和100单位/mL青霉素以及100μg/mL链霉素)中培养直至确立细胞。按照上述叙述的，在37℃，5％CO2下将细胞于完全培养基中培养。
细胞生存力(MTT试验) 使用MTT试验(MTT-100，MatTek试剂盒)对细胞生存力进行评价。该试剂盒测量了四唑盐的摄取以及四唑盐向甲

(formazan)染料的转化。在脂质的剂量给药期结束前1小时，通过将2mL的MTT浓缩物与8mL的MTT稀释液混合来制备融化和稀释的MTT浓缩物。每种细胞培养物插入片段用含有Ca+2和Mg+2的PBS洗涤两次，然后转移至新的96孔转运平板，该平板的每个孔含有100μL的混合MTT溶液。之后将该96孔转运平板在37℃和5％CO2下孵育3小时。在3小时孵育后，除去MTT溶液并将培养物转移至第二96孔饲料盘，该盘的每个孔含有250μL MTT提取溶液。向每个培养孔的表面添加另外150μL MTT提取溶液，并将样品在室温避光放置，最少2小时，最多24小时。然后用移液管尖端刺穿插入膜，并且允许上部孔和下部孔中的溶液混合。将200μL的混合提取溶液连同提取的空白(阴性对照)转移至96孔平板，以便使用全自动定量绘图酶标仪进行测量。在平板读数仪上于570nm处测量样品的光密度(OD)，其中减去了650nm处的背景。细胞生存力以百分数表示，并且如下计算已处理的插入片段的OD读数除以PBS处理的插入片段的OD读数，再乘以100。出于本试验的目的，假定PBS对细胞生存力无影响，因而其代表100％的细胞生存力。
siRNA制品 寡核苷酸的合成使用标准的2-氰基乙基亚磷酰胺法(1)在长链烷基胺控制的孔玻璃上进行，所述孔玻璃使用选定的5’-O-二甲基三苯甲基-2’-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3’-O-琥珀酰基核糖核苷衍生化，或者在适用时使用5′-O-二甲基三苯甲基-2’-脱氧-3’-O-琥珀酰基胸腺嘧啶载体衍生化。所有的寡核苷酸都采用ABI 3400DNA/RNA合成仪(Applied Biosystems，福斯特城，CA)在0.2μmol或1μmol量程进行合成——使用浓缩的NH4OH从固体载体裂解，并在55℃使用NH4OH∶乙醇为3∶1的混合物进行脱保护。通过将碱基脱保护的RNA与N-甲基吡咯烷酮/三乙胺/三乙胺三氢氟酸盐(NMP/TEA/3HF；体积比6∶3∶4)溶液(600μL/μmol)在65℃孵育2.5小时而实现2’-TBDMS保护基的脱保护。A、U、C和G(Proligo，Boulder，CO)的对应结构单元、5’-二甲氧基三苯甲基-N-(tac)-2’-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-3’-[(2-氰基乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺和修饰的亚磷酰胺、5’-DMTr-5-甲基-U-TOM-CE-亚磷酰胺、5’-DMTr-2′-OMe-Ac-C-CE亚磷酰胺、5’-DMTr-2′-OMe-G-CE亚磷酰胺、5’-DMTr-2′-OMe-U-CE亚磷酰胺、5’-DMTr-2′-OMe-A-CE亚磷酰胺(Glen Research，Sterling VA)均直接从供应商处购买。三乙胺三氢氟酸盐、N-甲基吡咯烷酮和浓缩的氢氧化铵从Aldrich(密尔沃基，WI)购买。所有HPLC分析和纯化都在采用XterraTM C18柱的Waters 2690HPLC系统上进行。所有其他试剂从Glen科技有限公司(Glen Research Inc)购买。根据RP-HPLC所测定的，寡核苷酸被纯化至超过97％的纯度。用于小鼠注射的siRNA从Qiagen(巴伦西亚，CA)购买，为体内级别，其在退火后进行HPLC纯化。单链siRNA的量用分光光度法测定，其基于钠盐形式在λ＝260nm处的计算的吸光系数35.0μg/OD。当两条链被退火时，观察到大约10％的减色现象；因此，对于定量的双链形式而言，吸光系数降低了10％。siRNA的内毒素水平通常等于或小于0.0024EU/mg。
肽合成 通过采用Rainin Symphony合成仪CLEAR-酰胺树脂上的固相Fmoc化学来合成肽。偶联步骤使用5当量的HCTU和Fmoc氨基酸与过量的N-甲基吗啡啉进行40分钟。Fmoc的去除通过使用20％的哌啶DMF溶液来对肽树脂进行2个10分钟循环的处理而实现。一旦完成整个肽之后，使用哌啶除去Fmoc基团，并用DMF充分洗涤。马来酰亚胺基修饰的肽通过以下制备在6当量的N-甲基吗啡啉存在下，使3.0当量的3-马来酰亚胺基丙酸和HCTU与肽树脂的N端偶联。偶联的程度由Kaiser检验监测。通过添加10mL含有2.5％水和2.5三异丙基硅烷的TFA，然后在室温轻微搅拌2h来使肽从树脂上裂解。通过使用醚进行研磨然后进行过滤来收集所得的粗品肽。将粗产物溶解于微孔水(Millipore water)并冷冻至干燥。将粗品肽溶解于15mL含有0.05％TFA和3mL乙酸的水中，并通过5mL注射环以5mL/min的流速装载至Zorbax RX-C8反向(22mm ID ×250mm，5μm粒度)。通过运行0.1％B/min的线性AB梯度来完成纯化，其中溶剂A为0.05％的TFA水溶液，溶剂B为0.05％的TFA乙腈溶液。纯化的肽通过HPLC和ESMS进行分析。
流式细胞仪 荧光活化细胞分选(FACS)分析采用贝克曼库尔特FC500细胞分析仪(富勒敦，加利福尼亚)进行。根据所使用的荧光探针(FAM或Cy5用于siRNA，FITC和PE用于CD14)来调节仪器。将碘化丙啶(Fluka，St Louis)和AnnexinV(R&D系统，明尼阿波利斯)用作细胞生存力和细胞毒性的指示剂。下文详细给出了简明的逐步方案。
(a)在暴露于siRNA/肽络合物后，细胞孵育至少3小时。
(b)用200μl PBS洗涤细胞。
(c)用15μl TE分离细胞，在37℃孵育。
(d)使用30μl FACS溶液(含有0.5％BSA和0.1％叠氮化纳的PBS)将细胞重新悬浮于5个孔中。
(e)将全部5个孔合并至管中。
(f)向每管添加5μl PI(碘化丙啶)。
(g)根据制造商的说明书使用荧光活化细胞分选(FCAS)分析细胞。
对于siRNA摄取分析，使用PBS洗涤细胞，胰蛋白酶进行处理(仅附着的细胞)，然后通过流式细胞仪分析。上文描述的siRNA指定BA的摄取也通过细胞中的Cy5或FITC荧光强度来测量，而细胞生存力通过添加碘化丙啶或AnnexinV-PE进行评估。为了区分细胞摄取与荧光标记siRNA的膜插入，使用锥虫蓝来猝灭细胞膜表面的荧光。
实施例14 示例性的促进多核苷酸递送多肽的缺失分析 多肽PN73的全长形式和截短形式进入细胞的效力通过使用原代小鼠尾部成纤维(MTF)细胞的细胞摄取试验来进行体外检测。接受FITC标记肽的培养物中细胞的数目由流式细胞仪测量。肽细胞摄取的百分数相对于培养物中存在的细胞总数来表示。此外，使用平均荧光强度(MFI)来评价细胞内存在的FITC标记的肽的量。MFI与细胞内FITC标记的肽的量直接相关更高的相对MFI值与更高的细胞内FITC标记的肽的量相关。肽在0.63μM、2.5μM和10μM浓度进行评价；PN768在2μM、10μM和50μM检测。
在转染的前一天，将示例性的促进多核苷酸递送的多肽PN73的全长形式和截短形式暴露于细胞。在室温使用Opti-

培养基(Invitrogen)稀释FITC标记的肽约5分钟，然后添加至细胞。在PBS中转染细胞3小时并用PBS洗涤，使用胰蛋白酶进行处理，之后通过流式细胞仪分析。如上测定细胞生存力。使用锥虫蓝来猝灭细胞膜表面的任何荧光而区别细胞摄取和膜插入。
对于细胞摄取试验而言，全长FITC标记的PN73肽(PN690)在所有的测试浓度达到了将近100％的细胞摄取(10μM结果显示于表20题为“％肽细胞摄取”的列中)。除了PN768需要50μM的浓度之外，其余的PN73截短形式在10μM浓度时获得了与PN690相当的细胞摄取百分数(圆括号中的值)，这表明PN73的N端残基无需肽具有进入细胞的能力。PN73的5个C端残基(鉴定为PN768)对于肽细胞摄取是足够的。PN73的截短形式在0.63μM显示出与肽长度成比例的降低的细胞摄取活性。换言之，肽在0.63μM浓度进行测试的一般观察结果为，随着PN73肽的长度减少，其细胞摄取活性降低，因此表明肽细胞摄取活性具有剂量依赖性。
表20概括了细胞摄取和靶基因敲低(KD)的数据。
表20 PN73肽缺失系列的功能域分析概括
NT＝未测试；所给定的肽浓度(圆括号中)是达到给定摄取(％)或MFI相对值的那些。
表20显示PN73的N端缺失部分(参见PN361)使siRNA细胞摄取活性减少50％；而C端残基(参见PN360)的去除也降低了siRNA细胞摄取活性。这些数据显示示例性的促进多核苷酸递送的多肽PN73的C端结构域有助于肽的核苷酸细胞摄取活性。
通过本发明siRNA/促进多核苷酸递送的多肽络合物有效敲低靶基因表达得到了证实。具体而言，评价了siRNA/肽络合物调节人肿瘤坏死因子-α(hTNF-α)基因表达的能力。靶向hTNF-α(hTNF-α)基因的重要性在于，当该基因在人类和其他哺乳动物受治疗者中过表达时，参与介导类风湿性关节炎(RA)发生或发展。
将人单核细胞用作模型系统，以测定siRNA/肽络合物对hTNF-α基因表达的作用。Qneg代表随机siRNA序列并起阴性对照的作用。将观察到的Qneg敲低活性标准化至100％(100％基因表达水平)，并且下列siRNA中每种的敲低活性表示为阴性对照的相对百分数A19S21，21/21和LC20。A19S21，21/21和LC20是靶向hTNF-αmRNA的siRNA。示例性的促进多核苷酸递送的多肽PN643(全长PN73减去C端标记物)、PN690(带有C端FITC标记物的全长PN73)以及来自缺失序列的PN73截短形式、PN660、PN735、PN654和PN708与上述列出的siRNA络合，以便测定它们对每种siRNA降低人单核细胞中hTNF-α基因表达水平能力的影响。示例性的促进多核苷酸递送多肽PN73的全长形式和截短形式的敲低活性概括于上文的表20中。“KD”列中的“+”表明肽/siRNA络合物的敲低活性为Qneg阴性对照siRNA的80％(与Qneg阴性对照相比，mRNA水平降低20％)。“+/-”表明肽/siRNA络合物的敲低活性为Qneg阴性对照siRNA的大约90％(与Qneg阴性对照相比，mRNA水平降低10％)。最后，“-”表明肽/siRNA络合物与Qneg阴性对照相比没有显著的敲低活性。
健康人血从Golden West Biologicals(CA)购买，外周血单核细胞(PBMC)使用Ficoll-Pague plus(Amersham)梯度从血液中纯化。然后使用由Miltenyi Biotech获得的磁微珠从PBMC部分纯化人单核细胞。将分离的人单核细胞重新悬浮于添加有4mM谷氨酰胺、10％FBS、1x非必需氨基酸和1x pen-strep的IMDM中，并在4℃贮存直至使用。
在96孔平底平板中，将人单核细胞以100K/孔/100μl接种于OptiMEM培养基(Invitrogen)。在室温下，示例性的促进多核苷酸递送的多肽与20nMsiRNA以1∶5的摩尔比于OptiMEM培养基中混合5分钟。在孵育结束时，向混合物添加FBS(最终为3％)，并将50μl的混合物添加至细胞。细胞在37℃孵育3小时。在孵育之后，将细胞转移至V底平板，并以1500rpm持续5分钟以使其沉淀。细胞重新悬浮于生长培养基(含有谷氨酰胺、非必需氨基酸和pen-strep的IMDM)。在孵育过夜后，通过应用1ng/ml的LPS(Sigma)3小时来刺激单核细胞，以提高TNF-α表达的表达水平。在通过LPS诱导之后，如上收集细胞用于mRNA定量，如果需要，保存上清液用于蛋白质定量。
对于mRNA测量而言，根据制造商的说明书来使用从Genospectra(CA)获得的分支DNA技术。为了量化细胞中的mRNA水平，测量了看家基因(cypB)和靶基因(TNF-α)mRNA，并使用cypB标准化TNF-α读数以获得相对的发光单位。
一般而言，对于所有测试的siRNA，PN643(全长非FITC标记的PN73)和PN690(全长FITC标记的PN73)具有相当的siRNA敲低活性，如“KD”列中以“+”标明的(表20显示的结果)。另外，对于所有测试的siRNA，PN660的siRNA敲低活性与PN643和PN690的相当，其表明PN73肽最靠近N端的9个残基的去除不会影响siRNA介导的靶TNF-αmRNA的敲低活性。PN654针对A19S21和21/21siRNA显示出适度的敲低活性，而不是针对LC20siRNA(在敲低活性列中，敲低活性以“±”表示)。但是，与PN708或PN735络合的siRNA并未导致针对任何siRNA的可观测的敲低活性。
实施例15 促进多核苷酸递送的多肽PN708 如上所述，细胞摄取试验测定了在与肽络合时接受Cy5-轭合的siRNA的细胞数目。siRNA细胞摄取通过流式细胞仪评价(细节参考实施例2)。摄取以百分数表示，其如下计算含有Cy5-轭合的siRNA的细胞数目除以培养物中转染细胞和未转染细胞的总数。平均荧光强度(MFI)由流式细胞仪测量，并且其确定了存在于细胞内的Cy5-轭合的siRNA的量。MFI值与细胞内Cy5-轭合的siRNA的量直接相关，因此，MFI值越高表明细胞内存在的Cy5-轭合的siRNA的数目越多。
在本实施例中，PN643(全长PN73减去C端标记物)、PN690(带有C端FITC标记物的全长PN73)和PN708(通过缺失PN73的21个N端残基而衍生的15-mer)在5μM、10μM、20μM和40μM进行测试。PN643和PN690还在2.5μM进行了测试，并且PN690另外测试了1.25μM。PN643和PN708也都在80μM进行了测试。
如表21所示，非FITC标记的PN73(PN643)肽在10μM浓度获得了将近100％的siRNA摄取。但是，当使用FITC标签(PN690)来标记PN73肽时，其最大的细胞摄取活性被降至大约70％。PN708的siRNA细胞摄取活性显示出剂量依赖性的增加。PN708在80μM获得的最大siRNA细胞摄取活性为95％。对于全长PN73肽而言，细胞生存力随着肽浓度的增加而增加。相反，与PN708肽一起孵育的细胞在所有测试浓度情况下保持高于90％的细胞生存力。在本实施例中，截短的肽PN708与全长PN73(PN690)肽相比，有大约两倍量的Cy5-siRNA被递送入细胞中。
表21 PN708促进siRNA递送特征的概述
通过测定多肽PN708对siRNA介导的靶基因表达减少的影响来对其进行表征。在评价PN708肽与siRNA络合时促进靶基因表达减少的能力之前，除去PN708肽的C端FITC标记物。在缺少FITC标记物的情况下，截短的示例性促进多核苷酸递送的多肽被命名为PN766(参考实施例12中的表19)。对siRNA/肽络合物调节人肿瘤坏死因子-α(hTNF-α)基因表达的能力进行评估(试验方案的细节可在实施例3中找到)。在本实施例中，将随机siRNA序列Qneg用作阴性对照，并且siRNA LC20和LC17被用来靶向人单核细胞中的hTNF-αmRKA。siRNA与受试肽的摩尔比为1∶5、1∶10、1∶25、1∶50、1∶75和1∶100。LC20和LC17以20nM的浓度使用。
敲低结果为LC20/PN766和LC17/PN766siRNA/肽络合物在1∶5、1∶10和1∶25时使hTNF-αmRNA水平降低至Qneg siRNA阴性对照的大约70％-80％(即，与Qneg阴性对照相比，mRNA水平降低20％-30％)。与Qneg对照相比，siRNA/肽比值为1∶50、1∶75和1∶100时对hTNF-αmRNA水平无显著影响。在PN766肽存在下，未观察到人单核细胞的细胞毒性效应。
实施例16 肽介导的siRNA细胞摄取活性 siRNA细胞摄取试验和MFI测量如先前在实施例2和3中所描述的进行。数据概括于表22。各种肽在0.63μM、1.25μM、2.5μM和5μM浓度进行测试。
表22 PN73突变体介导的siRNA递送特征概况
实施例17 促进多核苷酸递送的多肽 对示于表23的促进多核苷酸递送多肽的递送siRNA进入小鼠尾部成纤维(MTF)细胞的能力进行筛选。
表23 筛选促进递送的多肽的siRNA细胞摄取活性 与siRNA络合的促进多核苷酸递送多肽的siRNA细胞摄取活性列于表23中。表24概括了每种多肽的siRNA细胞摄取数据、平均荧光强度(MFI)测量值和细胞生存力数据。达到75％或更高siRNA细胞摄取百分数的多肽在“处理”列中以灰色突出显示。这些突出显示的siRNA/肽络合物中每一种的具体siRNA细胞摄取百分数在“％siRNA细胞摄取”列中也以灰色突出显示。
LC20是用于siRNA靶向人肿瘤坏死因子-α(hTNF-α)mRNA的寡基，并由以下核糖核苷酸序列表示 (SEQ ID NO96) UAGGGUCGGAACCCAAGCUUA 通过流式细胞仪来评估细胞的siRNA摄取(细节参考实施例2)。摄取以百分数表示，其如下计算含有Cy5-轭合的siRNA的细胞数目除以培养物中转染细胞和未转染细胞的总数。平均荧光强度(MFI)由流式细胞仪测量，并且其确定了存在于细胞内的Cy5-轭合的siRNA的量。MFI值与细胞内Cy5-轭合的siRNA的量直接相关，因此，MFI值越高表明细胞内的Cy5-轭合的siRNA的数目越多。
数据显示，当与siRNA络合时，PN680、PN681、PN709、PN760、PN759和PN682递送siRNA进入细胞中。表23中显示的多肽的筛选结果示于表24中。
表24 多肽介导的siRNA递送筛选数据(NT＝未检测)
如表24题为“％siRNA细胞摄取”的列中所显示的，“未处理”的阴性对照显示无siRNA细胞摄取，而阳性对照肽达到了95％的siRNA细胞摄取活性百分数。与促进多核苷酸递送的多肽PN680、PN681、PN709、PN760、PN759或PN682络合的Cy5轭合的LC20siRNA达到了超过75％或更高的siRNA细胞摄取活性百分数。多肽PN694和PN714分别表现出54％和43％的适度siRNA细胞摄取活性。多肽PN665和PN734经证明没有显著的siRNA细胞摄取活性(小于5％)。
通过分析平均荧光强度(MFI)来进一步表征多肽转染siRNA进入细胞的能力。当细胞摄取试验测定含有Cy5轭合的siRNA的细胞百分数的同时，MFI测量测定了进入细胞的Cy5轭合的siRNA的相对平均量。如表24题为“siRNA Cy5MFI”的列中所显示的，由阳性对照肽PN643递送的Cy5轭合的siRNA达到约7个单位的MFI。如所预期的，“未处理”的阴性对照没有可测量的MFI。未检测促进多核苷酸递送的多肽PN665的MFI。PN743、PN694和PN714的MFI测量值显著低于阳性对照的MFI测量值。促进多核苷酸递送的多肽PN680、PN709和PN682显示的MFI测量值与PN643阳性对照的测量值相当，而PN681的MFI是阳性对照的两倍。PN760和PN759的MFI测量值比阳性对照的测量值分别高约13倍和6倍。
以下的规程用来测试表23中列出的促进多核苷酸递送的多肽。在完全培养基中转染的前一天，将大约80,000个/孔的小鼠尾部成纤维(MTF)细胞平铺于24孔平板中。除阳性对照之外，每种递送肽在0.5μM Cy5轭合的siRNA存在下，以0.63μM、2.5μM、10μM和40μM的浓度进行测试。对于siRNA/肽络合物而言，Cy5轭合的siRNA和肽分别以终浓度的两倍在Opti-

培养基(Invitrogen)中进行稀释。混合相同体积的siRNA和肽，并允许其在室温络合5分钟。将siRNA/肽络合物添加至事先用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤的细胞。细胞在37℃，5％CO2下转染3小时。用PBS洗涤细胞，胰蛋白酶进行处理，然后通过流式细胞仪分析。通过细胞内的Cy5荧光强度来测量siRNA细胞摄取。使用碘化丙啶摄取或AnnexinV-PE(BD Biosciences)染色来测定细胞生存力。为了区别细胞摄取和被标记的siRNA(或荧光素标记的肽)的膜插入，使用锥虫蓝猝灭细胞膜表面的任何荧光。向细胞添加锥虫蓝(Sigma)至0.04％的终浓度，并在流式细胞仪上再次运行以评估是否具有指示荧光定位于细胞膜的任何荧光强度变化。
实施例18 siRNA和多肽的敲低活性 评估了siRNA/肽络合物调节人肿瘤坏死因子-α(hTNF-α)基因表达的能力。
将人单核细胞用作模型系统，以测定siRNA/肽络合物对hTNF-α基因表达的作用。Qneg代表随机siRNA序列并起阴性对照的作用。将观察到的Qneg敲低活性标准化至100％(100％基因表达水平)，并且下列siRNA中每种的敲低活性表示为阴性对照的相对百分数A19S21MD8，21/21MD8和LC20。A19S21MD8，21/21MD8和LC20是靶向hTNF-αmRNA的siRNA。
多肽PN602是先前实施例中使用的阳性对照的乙酰化形式，在本实施例中，其作为阳性对照用于有效递送siRNA进入人单核细胞并允许hTNF-αmRNA的敲低活性水平由siRNA介导。
数据显示，促进多核苷酸递送的多肽PN680递送siRNA进入细胞，并准许有效的siRNA介导的基因沉默。PN602、PN680和PN681的敲低活性示于表25。符号“+”表示肽/siRNA络合物的敲低活性为Qneg阴性对照siRNA的80％(与Qneg阴性对照相比，mRNA水平降低20％)。“+/-”表示肽/siRNA络合物的敲低活性为Qneg阴性对照siRNA的大约90％(与Qneg阴性对照相比，mRNA水平降低10％)。最后，“-”表示肽/siRNA络合物与Qneg阴性对照相比无显著的敲低活性。
表25 与多肽络合的siRNA的siRNA敲低活性
表25中显示的结果表明，全部三种siRNA与促进多核苷酸递送的多肽(阳性对照PN602)以1∶5至1∶10的比值络合时，和与相同多肽络合的Qneg阴性对照相比，适度降低了hTNF-α基因表达水平。但是，相同的siRNA与促进多核苷酸递送的多肽PN681以1∶5至1∶10络合时，与Qneg阴性对照siRNA/PN681络合物相比，几乎未显示敲低活性。相反，促进多核苷酸递送的多肽PN680与任何hTNF-α特异性siRNA以1∶5的比值络合时，与Qneg/PN680对照络合物相比，表现出显著的hTNF-αmRNA敲低活性。此外，LC20/PN680络合物比值为1∶10时，与Qneg/PN680对照络合物相比，经证实也具有显著的敲低活性。
健康人血从Golden West Biologicals(CA)购买，外周血单核细胞(PBMC)使用Ficoll-Pague plus(Amersham)梯度从血液中纯化。然后使用由Miltenyi Biotech获得的磁微珠从PBMC部分纯化人单核细胞。将分离的人单核细胞重新悬浮于添加有4mM谷氨酰胺、10％FBS、1x非必需氨基酸和1x pen-strep的IMDM中，并在4℃贮存直至使用。
在96孔平底平板中，将人单核细胞以100K/孔/100μl接种于OptiMEM培养基(Invitrogen)。在室温下，促进多核苷酸递送的多肽与20nM siRNA以1∶5或1∶10的摩尔比于OptiMEM培养基中混合5分钟。在孵育结束时，向混合物添加FBS(最终为3％)，并将50μl的混合物添加至细胞。细胞在37℃孵育3小时。在孵育之后，将细胞转移至V底平板，并以1500rpm持续5分钟以使其沉淀。细胞重新悬浮于生长培养基(含有谷氨酰胺、非必需氨基酸和pen-strep的IMDM)。在孵育过夜后，通过应用1ng/ml的LPS(Sigma)3小时来刺激单核细胞，以提高TNF-α表达的表达水平。在通过LPS诱导之后，如上收集细胞用于mRNA定量，如果需要，保存上清液用于蛋白质定量。
对于mRNA测量而言，根据制造商的说明书来使用从Genospectra(CA)获得的分支DNA技术。为了量化细胞中的mRNA水平，测量了看家基因(cypB)和靶基因(TNF-α)mRNA，并使用cypB标准化TNF-α读数以获得相对的发光单位。
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<212>PRT
<213>人免疫缺陷病毒
<400>1
Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5
<210>2
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<212>PRT
<213>未知有机体
<220>
<223>未知有机体的描述未知穿透素PTD肽
<400>2
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
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<212>PRT
<213>单纯疱疹病毒
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Asp Ala Ala Thr Ala Thr Arg Gly Arg Ser Ala Ala Ser Arg Pro Thr
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Glu Arg Pro Arg Ala Pro Ala Arg Ser Ala Ser Arg Pro Arg Arg Pro
20 25 30
Val Asp
<210>4
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<213>人类
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Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro
1 5 10 15
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<211>16
<212>PRT
<213>人类
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Ala Ala Val Leu Leu Pro Val Leu Leu Pro Val Leu Leu Ala Ala Pro
1 5 10 15
<210>6
<211>15
<212>PRT
<213>人类
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Val Thr Val Leu Ala Leu Gly Ala Leu Ala Gly Val Gly Val Gly
1 5 10 15
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述gp41融合肽
<400>7
Gly Ala Leu Phe Leu Gly Trp Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly
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Ala
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<211>17
<212>PRT
<213>窄吻凯门鳄
<400>8
Met Gly Leu Gly Leu His Leu Leu Val Leu Ala Ala Ala Leu Gln Gly
1 5 10 15
Ala
<210>9
<211>24
<212>PRT
<213>未知有机体
<220>
<223>未知有机体的描述hCT-衍生肽
<400>9
Leu Gly Thr Tyr Thr Gln Asp Phe Asn Lys Phe His Thr Phe Pro Gln
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Thr Ala Ile Gly Val Gly Ala Pro
20
<210>10
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<212>PRT
<213>未知有机体
<220>
<223>未知有机体的描述未知转运体肽
<400>10
Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Lys Ile Asn Leu Lys
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Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu
20 25
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<211>16
<212>PRT
<213>未知有机体
<220>
<223>未知有机体的描述未知寡聚物肽
<400>11
Thr Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Glu Asp Pro Lys Lys Lys Lys
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<210>12
<211>7
<212>PRT
<213>未知有机体
<220>
<223>未知有机体的描述未知精氨酸肽
<400>12
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1 5
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述两亲性模型肽
<400>13
Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys
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Leu Ala
<210>14
<211>16
<212>PRT
<213>流感病毒
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Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly
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<213>仙台病毒
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Phe Phe Gly Ala Val Ile Gly Thr Ile Ala Leu Gly Val Ala Thr Ala
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<210>16
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<212>PRT
<213>呼吸道合胞病毒
<400>16
Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val
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<211>16
<212>PRT
<213>人免疫缺陷病毒
<400>17
Gly Val Phe Val Leu Gly Phe Leu Gly Phe Leu Ala Thr Ala Gly Ser
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<211>16
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<213>埃博拉病毒
<400>18
Gly Ala Ala Ile Gly Leu Ala Trp Ile Pro Tyr Phe Gly Pro Ala Ala
1 5 10 15
<210>19
<211>56
<212>PRT
<213>未知有机体
<220>
<223>未知有机体的描述示例性的锌指基序
<400>19
Ala Cys Thr Cys Pro Tyr Cys Lys Asp Ser Glu Gly Arg Gly Ser Gly
1 5 10 15
Asp Pro Gly Lys Lys Lys Gln His Ile Cys His Ile Gln Gly Cys Gly
20 25 30
Lys Val Tyr Gly Lys Thr Ser His Leu Arg Ala His Leu Arg Trp His
35 40 45
Thr Gly Glu Arg Pro Phe Met Cys
50 55
<210>20
<211>54
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<213>未知有机体
<220>
<223>未知有机体的描述示例性的锌指基序
<400>20
Ala Cys Thr Cys Pro Asn Cys Lys Asp Gly Glu Lys Arg Ser Gly Glu
1 5 10 15
Gln Gly Lys Lys Lys His Val Cys His Ile Pro Asp Cys Gly Lys Thr
20 25 30
Phe Arg Lys Thr Ser Leu Leu Arg Ala His Val Arg Leu His Thr Gly
35 40 45
Glu Arg Pro Phe Val Cys
50
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<211>55
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<213>未知有机体
<220>
<223>未知有机体的描述示例性的锌指基序
<400>21
Ala Cys Thr Cys Pro Asn Cys Lys Glu Gly Gly Gly Arg Gly Thr Asn
1 5 10 15
Leu Gly Lys Lys Lys Gln His Ile Cys His Ile Pro Gly Cys Gly Lys
20 25 30
Val Tyr Gly Lys Thr Ser His Leu Arg Ala His Leu Arg Trp His Ser
35 40 45
Gly Glu Arg Pro Phe Val Cys
50 55
<210>22
<211>56
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<213>未知有机体
<220>
<223>未知有机体的描述示例性的锌指基序
<400>22
Ala Cys Ser Cys Pro Asn Cys Arg Glu Gly Glu Gly Arg Gly Ser Asn
1 5 10 15
Glu Pro Gly Lys Lys Lys Gln His Ile Cys His Ile Glu Gly Cys Gly
20 25 30
Lys Val Tyr Gly Lys Thr Ser His Leu Arg Ala His Leu Arg Trp His
35 40 45
Thr Gly Glu Arg Pro Phe Ile Cys
50 55
<210>23
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<213>未知有机体
<220>
<223>未知有机体的描述示例性的锌指基序
<400>23
Arg Cys Thr Cys Pro Asn Cys Thr Asn Glu Met Ser Gly Leu Pro Pro
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Ile Val Gly Pro Asp Glu Arg Gly Arg Lys Gln His Ile Cys His Ile
20 25 30
Pro Gly Cys Glu Arg Leu Tyr Gly Lys Ala Ser His Leu Lys Thr His
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Leu Arg Trp His Thr Gly Glu Arg Pro Phe Leu Cys
50 55 60
<210>24
<211>58
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<213>未知有机体
<220>
<223>未知有机体的描述示例性的锌指基序
<400>24
Thr Cys Asp Cys Pro Asn Cys Gln Glu Ala Glu Arg Leu Gly Pro Ala
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Gly Val His Ile Arg Lys Lys Asn Ile His Ser Cys His Ile Pro Gly
20 25 30
Cys Gly Lys Val Tyr Gly Lys Thr Ser His Leu Lys Ala His Leu Arg
35 40 45
Trp His Thr Gly Glu Arg Pro Phe Val Cys
50 55
<210>25
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<212>PRT
<213>未知有机体
<220>
<223>未知有机体的描述示例性的锌指基序
<400>25
Arg Cys Thr Cys Pro Asn Cys Lys Ala Ile Lys His Gly Asp Arg Gly
1 5 10 15
Ser Gln His Thr His Leu Cys Ser Val Pro Gly Cys Gly Lys Thr Tyr
20 25 30
Lys Lys Thr Ser His Leu Arg Ala His Leu Arg Lys His Thr Gly Asp
35 40 45
Arg Pro Phe Val Cys
50
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<213>未知有机体
<220>
<223>未知有机体的描述示例性的锌指基序
<400>26
Pro Gln Ile Ser Leu Lys Lys Lys Ile Phe Phe Phe Ile Phe Ser Asn
1 5 10 15
Phe Arg Gly Asp Gly Lys Ser Arg Ile His Ile Cys His Leu Cys Asn
20 25 30
Lys Thr Tyr Gly Lys Thr Ser His Leu Arg Ala His Leu Arg Gly His
35 40 45
Ala Gly Asn Lys Pro Phe Ala Cys
50 55
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<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成的通式肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(2)..(5)
<223>该区可包括2个或4个可变的残基
<220>
<221>MOD_RES
<222>(7)..(18)
<223>可变的残基
<220>
<221>MOD_RES
<222>(20)..(22)
<223>可变的残基
<400>27
Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa His Xaa Xaa Xaa His
20
<210>28
<211>28
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<213>未知有机体
<220>
<223>未知有机体的描述示例性的肽
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Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Gly
1 5 10 15
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln
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<211>28
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<213>未知有机体
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<223>未知有机体的描述示例性的肽
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Trp Trp Thr Trp Trp Trp Trp Trp Trp Trp Glu Trp Ser Gln Pro Lys
1 5 10 15
Lys Lys Lys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Pro Pro Gln
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<213>未知有机体
<220>
<223>未知有机体的描述示例性的肽
<400>30
Trp Trp Trp Trp Trp Trp Trp Trp Trp Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys
1 5 10 15
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
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<211>23
<212>PRT
<213>未知有机体
<220>
<223>未知有机体的描述示例性的肽
<400>31
Trp Trp Trp Trp Trp Trp Trp Trp Trp Trp Ser Gln Pro Arg Arg Arg
1 5 10 15
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
20
<210>32
<211>28
<212>PRT
<213>未知有机体
<220>
<223>未知有机体的描述示例性的肽
<400>32
Lys Trp Trp Trp Trp Trp Trp Trp Trp Trp Glu Trp Ser Gln Pro Lys
1 5 10 15
Lys Lys Lys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Lys Lys Lys
20 25
<210>33
<211>20
<212>PRT
<213>未知有机体
<220>
<223>未知有机体的描述示例性的肽
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Lys His Lys His Lys His Lys His Lys His Lys His Lys His Lys His
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Lys His Lys His
20
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<213>未知有机体
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<223>未知有机体的描述示例性的肽
<400>34
Lys His Lys His Lys His Lys His Lys His Lys His Lys His Lys His
1 5 10 15
Lys His Lys His
20
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<223>未知有机体的描述示例性的肽
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<400>35
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1 5 10 15
Arg Arg Arg Gly Gly Cys Tyr Lys Cys Thr Xaa Arg Pro Tyr
20 25 30
<210>36
<211>29
<212>PRT
<213>未知有机体
<220>
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<220>
<221>MOD_RES
<222>(21)
<223>可变的残基
<400>36
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala
1 5 10 15
Gly Phe Ile Glu Xaa Gly Trp Glu Gly Met Ile Asp Gly
20 25
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<212>PRT
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<223>未知有机体的描述示例性的肽
<400>37
Lys Gly Ser Lys Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Glu Gly Lys
1 5 10 15
Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys
20 25 30
Val Leu Lys Gln
35
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<212>PRT
<213>未知有机体
<220>
<223>未知有机体的描述示例性的肽
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Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1 5
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<213>未知有机体
<220>
<223>未知有机体的描述示例性的肽
<400>39
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
1 5 10 15
Lys Lys Lys Lys
20
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<212>PRT
<213>未知有机体
<220>
<223>未知有机体的描述示例性的肽
<400>40
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1 5 10 15
Arg Arg
<210>41
<211>30
<212>PRT
<213>未知有机体
<220>
<223>未知有机体的描述示例性的肽
<400>41
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
1 5 10 15
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
20 25 30
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<211>36
<212>PRT
<213>未知有机体
<220>
<223>未知有机体的描述示例性的肽
<400>42
Lys Gly Ser Lys Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys
1 5 10 15
Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys
20 25 30
Val Leu Lys Gln
35
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<212>PRT
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<220>
<223>未知有机体的描述示例性的肽
<400>43
Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys
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Leu Ala
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<220>
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<220>
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cuccgaagaa auaagaucct t 21
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cuacacaaau cagcgauuut t 21
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<212>DNA
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<212>PRT
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<220>
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<400>66
Met Pro Glu Pro Ala Lys Ser Ala Pro Ala Pro Lys Lys Gly Ser Lys
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Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Ser Lys Lys Arg Lys Arg
20 25 30
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35 40 45
His Pro Asp Thr Gly Ile Ser Ser Lys Ala Met Gly Ile Met Asn Ser
50 55 60
Phe Val Asn Asp Ile Phe Glu Arg Ile Ala Gly Glu Ala Ser Arg Leu
65 70 75 80
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<212>PRT
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<220>
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<400>67
Lys Gly Ser Lys Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys
1 5 10 15
Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Trp Val Tyr Val Tyr Lys
20 25 30
Val Leu Lys Gln
35
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<211>36
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成的肽
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Lys Gly Ser Lys Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys
1 5 10 15
Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Trp Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys
20 25 30
Val Leu Lys Gln
35
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<211>36
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成的肽
<400>69
Lys Gly Ser Lys Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys
1 5 10 15
Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Phe Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys
20 25 30
Val Leu Lys Gln
35
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<211>36
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成的肽
<400>70
Lys Gly Ser Phe Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys
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Lys Arg Lys Arg Ser Phe Lys Phe Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys
20 25 30
Val Leu Lys Gln
35
<210>71
<211>35
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成的肽
<400>71
Lys Gly Ser Phe Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Phe Gly Lys
1 5 10 15
Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Ser Phe Ser Val Tyr Val Tyr Lys Val
20 25 30
Leu Lys Gln
35
<210>72
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成的肽
<400>72
Lys Gly Ser Lys Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys
1 5 10 15
Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys
20
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<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成的肽
<400>73
Lys Lys Asp Gly Lys Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser
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Val Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys Gln
20 25
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<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成的肽
<400>74
Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys Gln
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<210>75
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成的肽
<400>75
Lys Gly Ser Lys Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys
1 5 10 15
Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys
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Val Leu Lys Gln
35
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成的肽
<400>76
Lys Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys Lys Arg Lys
1 5 10 15
Arg Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys
20 25 30
Gln
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<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成的肽
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Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys Lys Arg Lys Arg Ser Arg
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20 25 30
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<211>27
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成的肽
<400>78
Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Glu Ser
1 5 10 15
Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys Gln
20 25
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<211>24
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成的肽
<400>79
Lys Asp Gly Lys Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val
1 5 10 15
Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys Gln
20
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<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成的肽
<400>80
Lys Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr
1 5 10 15
Lys Val Leu Lys Gln
20
<210>81
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成的肽
<400>81
Lys Arg Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys Val Leu
1 5 10 15
Lys Gln
<210>82
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成的肽
<400>82
Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys Gln
1 5 10 15
<210>83
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成的肽
<400>83
Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys Gln
1 5 10
<210>84
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成的肽
<400>84
Val Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys Gln
1 5
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<211>6
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<220>
<223>人工序列的描述合成的肽
<400>85
Tyr Lys Val Leu Lys Gln
1 5
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成的肽
<400>86
Lys Val Leu Lys Gln
1 5
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成的肽
<400>87
Arg Ser Val Cys Arg Gln Ile Lys Ile Cys Arg Arg Arg Gly Gly Cys
1 5 10 15
Tyr Tyr Lys Cys Thr Asn Arg Pro Tyr
20 25
<210>88
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成的肽
<400>88
Gly Phe Phe Ala Leu Ile Pro Lys Ile Ile Ser Ser Pro Leu Phe Lys
1 5 10 15
Thr Leu Leu Ser Ala Val Gly Ser Ala Leu Ser Ser Ser Gly Asp Gln
20 25 30
Glu
<210>89
<211>24
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成的肽
<400>89
Gly Thr Ala Met Arg Ile Leu Gly Gly Val Ile Pro Arg Lys Lys Arg
1 5 10 15
Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln
20
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<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成的肽
<400>90
Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys Leu Ser
1 5 10 15
Gly Phe Ser Phe Lys Lys Asn Lys Lys
20 25
<210>91
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成的肽
<400>91
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1 5 10 15
<210>92
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成的肽
<400>92
Arg Gln Ile Arg Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Arg Trp Arg Arg
1 5 10 15
<210>93
<211>41
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成的肽
<400>93
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Val Ala Tyr Ile Ser
1 5 10 15
Arg Gly Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe
20 25 30
Thr Arg Gln Lys Tyr Asn Lys Arg Ala
35 40
<210>94
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成的肽
<400>94
Leu Gly Leu Leu Leu Arg His Leu Arg His His Ser Asn Leu Leu Ala
1 5 10 15
Asn Ile Pro Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro
20 25 30
<210>95
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成的肽
<400>95
Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys
1 5 10 15
Lys Lys Arg Lys Val
20
<210>96
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成的siRNA
<400>96
uagggucgga acccaagcuu a 21
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种复合物，其包括缩合粒子，每个粒子包括一个或多个短干扰RNA(siRNA)和一个或多个肽，其中所述粒子的直径小于1000nm并且每个肽含有选自SEQ ID NO28-37、42-43和67-95的序列。
2.根据权利要求1所述的复合物，其中所述直径为0.5-400nm。
3.根据权利要求1所述的复合物，其中所述直径为10-300nm。
4.根据权利要求1所述的复合物，其中所述直径为40-100nm。
5.根据权利要求1所述的复合物，其中所述肽为所述粒子质量的5-99％。
6.根据权利要求1所述的复合物，其中所述肽为所述粒子质量的5-50％。
7.根据权利要求1所述的复合物，其中所述肽为所述粒子质量的50-99％。
8.根据权利要求1所述的复合物，其中所述粒子的至少30％的直径小于1000nm。
9.根据权利要求1所述的复合物，其中所述粒子的至少30％的直径小于400nm。
10.根据权利要求1所述的复合物，其中所述粒子的ζ电位值为至少20mV。
11.根据权利要求1所述的复合物，其中所述粒子的ζ电位值为至少30mV。
12.根据权利要求1所述的复合物，其中所述直径为10-300nm，所述siRNA靶向流感病毒。
13.根据权利要求1所述的复合物，其中所述直径为10-300nm，所述siRNA靶向人TNF-α。
14.根据权利要求1所述的复合物，其中所述粒子是交联的。
15.根据权利要求1所述的复合物，其中所述粒子通过喷雾干燥制备。
16.一种复合物，其由包括以下步骤的方法制备
提供一个或多个短干扰双链核糖核酸(siRNA)和一个或多个肽，其中每个肽含有选自SEQ ID NO28-37、42-43和67-95的序列；和
使所述siRNA与所述肽在含水溶液中缩合，由此形成直径小于1000nm的粒子。
17.根据权利要求16所述的复合物，其中每个肽的配料比N/P为0.2至50。
18.根据权利要求16所述的复合物，其中每个肽的配料比N/P为0.5至20。
19.根据权利要求16所述的复合物，其中每个肽的配料比N/P为0.5至7。
20.根据权利要求16所述的复合物，其中每个肽的配料比N/P为0.5至2.5。
21.根据权利要求16所述的复合物，其中所述直径为10-300nm，所述siRNA靶向流感。
22.根据权利要求16所述的复合物，其中所述粒子的ζ电位值为至少20mV。
23.根据权利要求16所述的复合物，其中所述含水溶液的pH小于或约等于11。
24.根据权利要求16所述的复合物，其中所述含水溶液的pH小于或约等于9。
25.根据权利要求16所述的复合物，其中所述含水溶液的pH为约7.4。
26.根据权利要求16所述的复合物，其中所述含水溶液被涡旋。
27.根据权利要求16所述的复合物，其中所述缩合通过向所述dsRNA分子的含水溶液添加所述肽来进行。
28.根据权利要求16所述的复合物，其中所述含水溶液含有盐。
29.根据权利要求28所述的复合物，其中所述含水溶液具有浓度小于或等于约1M的氯化钠。
30.根据权利要求28所述的复合物，其中所述含水溶液具有浓度小于或等于约0.5M的氯化钠。
31.根据权利要求28所述的复合物，其中所述含水溶液具有浓度小于或等于约0.25M的氯化钠。
32.根据权利要求1所述的复合物，其中所述siRNA靶向流感。
33.根据权利要求1所述的复合物，其中所述siRNA靶向TNF-α。
34.根据权利要求1所述的复合物，其中所述siRNA选自G1498 SEQID NO62和63、G8286 SEQ ID NO60和61、G8282 SEQ ID NO58和59、G6129 SEQ ID NO56和57、G6124 SEQ ID NO54和55、G3817 SEQ ID NO52和53、G3807 SEQ ID NO50和51、G3789 SEQ ID NO48和49及其组合。
35.根据权利要求1所述的复合物，其中所述核糖核酸物质为G1498SEQ ID NO62和63。
36.根据权利要求1所述的复合物，其中所述复合物与单独的siRNA相比，使流感病毒的病毒生长减少1/2。
37.根据权利要求1所述的复合物，其中每个肽的质量小于120kDa。
38.根据权利要求1所述的复合物，其中每个肽的质量小于60kDa。
39.根据权利要求1所述的复合物，其中每个肽的质量小于30kDa。
40.根据权利要求1所述的复合物，其中肽在pH 7.4时的正电荷数目为1至100。
41.根据权利要求1所述的复合物，其中肽在pH 7.4时的正电荷数目为5至30。
42.根据权利要求1所述的复合物，其中肽在pH 7.4时的正电荷数目为9至15。
43.根据权利要求1所述的复合物，其中所述肽中的至少一个含有蛋白质转导域。
44.根据权利要求1所述的复合物，其中所述肽中的至少一个为粘膜渗透性调节剂。
45.根据权利要求1所述的复合物，其中所述肽中的至少一个是聚乙二醇化的。
46.根据权利要求1所述的复合物，其中所述肽中的至少一个选自PN183 SEQ ID NO28、PN826 SEQ ID NO37、PN861 SEQ ID NO38、PN924 SEQ ID NO39、PN939 SEQ ID NO34及其变体。
47.根据权利要求1所述的复合物，其中所述肽的至少一个为PN183SEQ ID NO28。
48.一种制备复合物的方法，其包括以下步骤
提供一个或多个短干扰双链核糖核酸(siRNA)和一个或多个肽，其中每个肽含有选自SEQ ID NO28-37、42-43和67-95的序列；和
使所述dsRNA与所述肽在含水溶液中缩合，由此形成直径小于1000nm的粒子。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述粒子是交联的。
50.一种制备复合物的方法，其包括以下步骤
(a)提供一个或多个短干扰双链核糖核酸(siRNA)和一个或多个肽，其中每个肽含有选自SEQ ID NO28-37、42-43和67-95的序列；
(b)将所述siRNA溶解于含水溶液中；和
(c)向所述含水溶液添加所述肽，由此缩合成直径小于1000nm的粒子。
51.一种制备复合物的方法，其包括以下步骤
(a)提供一个或多个短干扰双链核糖核酸(siRNA)和一个或多个肽，其中每个肽含有选自SEQ ID NO28-37、42-43和67-95的序列；
(b)将所述肽溶解于含水溶液中；和
(c)向所述含水溶液添加所述siRNA，由此缩合成直径小于1000nm的粒子。
52.一种药物组合物，其包括权利要求1-47任一项所述的复合物和载体基质。
53.一种治疗流感的方法，其包括对需要的受治疗者施用治疗有效量的含有权利要求1-47任一项所述的复合物的药物组合物，其中所述siRNA靶向流感。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述siRNA为G1498 SEQ IDNO62和63。
55.权利要求1-47任一项所述的复合物作为治疗人类疾病或病症的体征和症状的药剂的用途，所述人类疾病或病症的体征和症状包括流感和类风湿性关节炎。
56.权利要求1-47任一项所述的复合物用于制备治疗人类疾病或病症的体征和症状的药剂的用途，所述人类疾病或病症的体征和症状包括流感和类风湿性关节炎。
57.包括直径小于1000nm的缩合粒子的复合物用于制备治疗人类疾病或病症的体征和症状的药剂的用途，其中所述粒子包括一个或多个短干扰核糖核酸(siRNA)和一个或多个肽，所述人类疾病或病症的体征和症状包括流感和类风湿性关节炎，其中每个肽含有选自SEQ ID NO28-37、42-43和67-95的序列。
58.根据权利要求57所述的用途，其中所述直径为10-300nm，所述siRNA靶向流感病毒。
权利要求
1.一种复合物，其包括直径小于1000nm的缩合粒子，其中所述粒子包括一个或多个双链核糖核酸(dsRNA)和一个或多个肽。
2.根据权利要求1所述的复合物，其中所述直径为0.5-400nm。
3.根据权利要求1所述的复合物，其中所述直径为10-300nm。
4.根据权利要求1所述的复合物，其中所述直径为40-100nm。
5.根据权利要求1所述的复合物，其中所述肽为所述粒子质量的5-99％。
6.根据权利要求1所述的复合物，其中所述肽为所述粒子质量的5-50％。
7.根据权利要求1所述的复合物，其中所述肽为所述粒子质量的50-99％。
8.根据权利要求1所述的复合物，其中所述粒子是均匀的。
9.根据权利要求1所述的复合物，其中所述粒子为直径均匀的球形。
10.根据权利要求1所述的复合物，其中所述粒子的ζ电位值为至少20mV。
11.根据权利要求1所述的复合物，其中所述粒子的ζ电位值为至少30mV。
12.根据权利要求1所述的复合物，其中所述直径为10-300nm，所述dsRNA为靶向流感病毒的siNA。
13.根据权利要求1所述的复合物，其中所述直径为10-300nm，所述dsRNA为靶向人TNF-α的siNA。
14.根据权利要求1所述的复合物，其中所述复合物在细胞内释放dsRNA以抑制细胞中的基因表达。
15.根据权利要求1所述的复合物，其中所述粒子是交联的。
16.根据权利要求1所述的复合物，其中所述粒子通过喷雾干燥制备。
17.一种复合物，其由包括以下步骤的方法制备
提供一个或多个双链核糖核酸(dsRNA)和一个或多个肽；和
使所述dsRNA与所述肽在含水溶液中缩合，由此形成直径小于1000nm的粒子。
18.根据权利要求17所述的复合物，其中每个肽的配料比N/P为0.2至50。
19.根据权利要求17所述的复合物，其中每个肽的配料比N/P为0.5至20。
20.根据权利要求17所述的复合物，其中每个肽的配料比N/P为0.5至7。
21.根据权利要求17所述的复合物，其中每个肽的配料比N/P为0.5至2.5。
22.根据权利要求17所述的复合物，其中所述直径为10-300nm，所述dsRNA为靶向流感的siNA。
23.根据权利要求17所述的复合物，其中所述粒子的ζ电位值为至少20mV。
24.根据权利要求17所述的复合物，其中所述含水溶液的pH小于或约等于11。
25.根据权利要求17所述的复合物，其中所述含水溶液的pH小于或约等于9。
26.根据权利要求17所述的复合物，其中所述含水溶液的pH小于或约等于8。
27.根据权利要求17所述的复合物，其中所述含水溶液被涡旋。
28.根据权利要求17所述的复合物，其中所述缩合通过向所述dsRNA分子的含水溶液添加所述肽来进行。
29.根据权利要求17所述的复合物，其中所述含水溶液含有盐。
30.根据权利要求29所述的复合物，其中所述含水溶液具有浓度小于或等于约1M的氯化钠。
31.根据权利要求29所述的复合物，其中所述含水溶液具有浓度小于或等于约0.5M的氯化钠。
32.根据权利要求29所述的复合物，其中所述含水溶液具有浓度小于或等于约0.25M的氯化钠。
33.根据权利要求1所述的复合物，其中所述核糖核酸物质为siNA。
34.根据权利要求1所述的复合物，其中所述核糖核酸物质为靶向流感或TNF-α的siNA。
35.根据权利要求1所述的复合物，其中所述核糖核酸物质选自G1498、G8286、G8282、G6129、G6124、G3817、G3807、G3789及其组合。
36.根据权利要求1所述的复合物，其中所述核糖核酸物质为G1498。
37.根据权利要求1所述的复合物，其中所述复合物与单独的dsRNA相比，使流感病毒的病毒生长减少1/2。
38.根据权利要求1所述的复合物，其中每个肽的质量小于120kDa。
39.根据权利要求1所述的复合物，其中每个肽的质量小于60kDa。
40.根据权利要求1所述的复合物，其中每个肽的质量小于30kDa。
41.根据权利要求1所述的复合物，其中肽的正电荷数目为1至100。
42.根据权利要求1所述的复合物，其中肽的正电荷数目为5至30。
43.根据权利要求1所述的复合物，其中肽的正电荷数目为9至15。
44.根据权利要求1所述的复合物，其中所述肽中的至少一个含有蛋白质转导域。
45.根据权利要求1所述的复合物，其中所述肽中的至少一个为粘膜渗透性调节剂。
46.根据权利要求1所述的复合物，其中所述肽中的至少一个是聚乙二醇化的。
47.根据权利要求1所述的复合物，其中所述肽中的至少一个选自PN183、PN826、PN861、PN924、PN939及其变体。
48.根据权利要求1所述的复合物，其中所述肽的至少一个为PN183。
49.一种制备复合物的方法，其包括以下步骤
提供一个或多个双链核糖核酸(dsRNA)和一个或多个肽；和
使所述dsRNA与所述肽在含水溶液中缩合，由此形成直径小于1000nm的粒子。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述粒子是交联的。
51.一种制备复合物的方法，其包括以下步骤
(a)提供一个或多个双链核糖核酸(dsRNA)和一个或多个肽；
(b)将所述dsRNA溶解于含水溶液中；和
(c)向所述含水溶液添加所述肽，由此缩合成直径小于1000nm的粒子。
52.一种制备复合物的方法，其包括以下步骤
(a)提供一个或多个双链核糖核酸(dsRNA)和一个或多个肽；
(b)将所述肽溶解于含水溶液中；和
(c)向所述含水溶液添加所述dsRNA，由此缩合成直径小于1000nm的粒子。
53.一种药物组合物，其包括权利要求1的复合物和载体基质。
54.一种治疗流感的方法，其包括对需要的受治疗者施用治疗有效量的含有权利要求1复合物的药物组合物，其中所述核糖核酸物质为靶向流感的siNA。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述siNA为G1498。
56.权利要求1-48任一项所述的复合物作为治疗人类疾病或病症的体征和症状的药剂的用途，所述人类疾病或病症的体征和症状包括流感和类风湿性关节炎。
57.权利要求1-48任一项所述的复合物用于制备治疗人类疾病或病症的体征和症状的药剂的用途，所述人类疾病或病症的体征和症状包括流感和类风湿性关节炎。
58.包括直径小于1000nm的缩合粒子的复合物用于制备治疗人类疾病或病症的体征和症状的药剂的用途，其中所述粒子包括一个或多个双链核糖核酸(dsRNA)和一个或多个肽，所述人类疾病或病症的体征和症状包括流感和类风湿性关节炎。
59.根据权利要求58所述的用途，其中所述直径为10-300nm，所述dsRNA为靶向流感病毒的siNA。
60.根据权利要求58所述的用途，其中所述复合物在细胞内释放dsRNA以抑制细胞中的基因表达。
全文摘要
含有直径小于1000nm缩合粒子的复合物，其中所述粒子包括一个或多个双链核糖核酸(dsKNA)和一个或多个肽。该复合物、组合物和方法用于通过RNA干扰调节基因表达。
文档编号C12N15/113GK101331231SQ200680046865
公开日2008年12月24日 申请日期2006年10月13日 优先权日2005年10月14日
发明者罗杰·C·阿达米, 朱恬英, 崔坤元, 小迈克尔·E·休斯顿, 陈力山, 陈郁静 申请人:纳斯泰克制药公司