专利名称：一种双粒子复合的Lp-a检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学免疫体外诊断领域，具体涉及一种双粒子复合的Lp-a检测试剂盒。
背景技术：
1963年Berg在血楽；脂蛋白电泳时发现β -脂蛋白部分有一种新的抗原成分,并与LDL结合，将此抗原成分命名为脂蛋白(a)。其后证实，Lp-a核心部分由甘油三酯、磷脂、胆固醇、胆固醇脂等脂质和载脂蛋白B组成，结构类似LDL，但还含有一独特的Apo (a)，后者在其它任何脂蛋白中都不存在。研究表明，肝脏是合成Apo (a)的主要场所。Lp-a与LDL不一样，并不是由VLDL转化而来，也不能转化为其它脂蛋白，系一类独立的脂蛋白。人类Lp-a代谢的突出特征是，个体间Lp-a水平可相差100倍，但同一个体血浆Lp-a水平的变化则相 对较小。个体间LDL受体缺陷可影响Lp-a浓度，可能与体内Lp-a合成增加有关。Lp-a是冠心病的一个独立危险因素，而与吸烟、高血压、LDL-C和HDL-C以及ApoA-I与ApoB等均无关。与其它脂蛋白或载脂蛋白相比，Lp-a与男性冠心病的关系尤为密切。血浆Lp-a的危险性临界水平一般在O. 2 O. 3g/L，如超过> O. 30g/L则AS的危险性上升2倍，如同时伴有LDL-C上升，CHD的相对危险性上升5倍。且Lp-a水平越高，发生CHD则越早。Lp-a具有多基因遗传特性，有CHD家族史者，Lp-a阳性率明显高于无家族史者。胶乳颗粒增强比浊法是近年来出现的一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法。PETIA法大体分为两种。一种是散射比浊检测法；另一种是透射比浊检测法。这两种方法的基本原理非常相似，都是在高分子胶乳微球的表面交联单克隆抗体，当交联有抗体的微球与抗原结合后，在短时间内会迅速聚集在一起，改变了反应液的散光性能或透光性能。而且，反应液散光性能或透光性能(即吸光度)的改变与被测抗原的浓度有较强的相关性，在一定范围内可以反映被测抗原的浓度。PETIA检测方法是在均相反应体系中进行抗原、抗体反应及结果的测定。抗原、抗体反应后，直接测定反应液的吸光度值，省却了ELISA法反复孵育和洗板等烦琐操作步骤，几分钟就能获得结果，省时省力。此外，纳米免疫比浊法操作步骤的简化也相应地避免了许多人为操作因素和试剂、环境等外界因素的干扰，稳定性和重复性都较好，能较真实地反映被测物质的含量。免疫比浊法的灵敏度虽然比ELISA法差一些，但足于检测到健康人血浆中许多标志蛋白的下限值，可完全满足临床检测要求。由于血清Lp-a的含量低，其测定方法需要较高的灵敏度和特异性。由最初免疫电泳的定性检测，到放射免疫、荧光免疫和酶免疫的定量检测，以及到免疫比浊的自动化检测，发展十分迅速。单向免疫扩散(SRID)、放射免疫测定法(RIA)、荧光免疫测定发(FIA)、时间分辨荧光免疫测定法(TRFIA)、酶联免疫测定法(ELISA)、胶乳颗粒法、颗粒增强透射免疫比浊法(PETIA)、颗粒增强散射免疫比浊法(PENIA)。目前，免疫比浊法是最为普遍通用的方法，但是免疫比浊法最高检测限只能达到30mg/l，线性只能达到800mg/l，在临床应用上存在着局限性。
发明内容
本发明的目的是提供一种双粒子复合的LP-a检测试剂盒，它操作简便、快速、灵敏度高、特异性好，大大提高了抗体的纯度，最大限度避免了非特异反应，使结果准确性有了较大提闻。为了解决背景技术所存在的问题，本发明是采用以下技术方案它由Rl试剂、R2试剂及校准品三部分组成，Rl试剂的质量比组成为PH = 7. 0-7. 6的磷酸盐缓冲液30-80mmol/l、聚乙二醇 6000-1000060-120mm/l 和乙二胺四乙酸二钠 10-20mmol/L ；R2 试剂的组成为羊抗人Lp-a多克隆抗体、聚苯乙烯胶乳包被、PH = 7. 0-7. 6的磷酸盐缓冲液和乙二胺四乙酸二钠等，校准品的组成为0-10mg/l牛血清基质、叠氮钠O. 2-2. 2%、吐温-201-10%、牛血清白蛋白1_3%，上述百分比为牛血清基质体积用量的百分比。 所述的R2试剂中羊抗人Lp-a多克隆抗体和聚苯乙烯胶乳包被质量比为1/10-5/10。所述的R2试剂中抗体包被过程中，封闭液组分包括O. 5% -I. 5%脱脂奶粉、10-60mm的甘氨酸，胶乳稀释液组分包括PH7. 0-7. 6磷酸盐缓冲液30-80mmol/l，O. 5% -I. 5%脱脂奶粉，O. 9% NaN3。所述的R2试剂的制备过程为将190nm的聚苯乙烯胶乳粒子与45nm的聚苯乙烯胶乳粒子按照I : 4的比例混合，羊抗人Lp-a多克隆抗体和混合后的聚苯乙烯胶乳以30 100的质量比混合，缓冲液采用O. 02M的磷酸缓冲液，将两者混匀后37°C吸附8小时，之后透析除去未连接上的抗体，加入封闭液O. I %脱脂奶粉和O. 2mm的甘氨酸，封闭2小时，离心去上清，用PH7. 4磷酸盐缓冲液45mmol/l，乙二胺四乙酸二钠10. 2mmol/l,0. 05%脱脂奶粉，O. 9% NaN3稀释至O. 18% ；所述的校准品制备过程为将经过处理的牛血清，加入BAS 0.1%, NaN3 O. 9%得到校准品稀释液；本发明具有以下有益效果它操作简便、快速、灵敏度高、特异性好，大大提高了抗体的纯度，最大限度避免了非特异反应，使结果准确性有了较大提高。
图I为本发明中实施例I的结构示意图。
具体实施例方式本具体实施方式
采取以下技术方案它由Rl试剂、R2试剂及校准品三部分组成，Rl试剂的质量比组成为PH = 7. 0-7. 6的磷酸盐缓冲液30-80mmol/l、聚乙二醇6000-10000 60-120mm/l和乙二胺四乙酸二钠10-20mmol/L ;R2试剂的组成为羊抗人Lp-a多克隆抗体、聚苯乙烯胶乳包被、PH = 7. 0-7. 6的磷酸盐缓冲液和乙二胺四乙酸二钠等，校准品的组成为0-10mg/l牛血清基质、叠氮钠O. 2-2. 2%、吐温-201-10%、牛血清白蛋白1_3%，上述百分比为牛血清基质体积用量的百分比。所述的R2试剂中羊抗人Lp-a多克隆抗体和聚苯乙烯胶乳包被质量比为1/10-5/10。所述的R2试剂中抗体包被过程中，封闭液组分包括O. 5% -I. 5%脱脂奶粉、10-60mm的甘氨酸，胶乳稀释液组分包括PH7. 0-7. 6磷酸盐缓冲液30-80mmol/l，O. 5% -I. 5%脱脂奶粉，O. 9% NaN3。所述的R2试剂的制备过程为将190nm的聚苯乙烯胶乳粒子与45nm的聚苯乙烯胶乳粒子按照I : 4的比例混合，羊抗人Lp-a多克隆抗体和混合后的聚苯乙烯胶乳以30 100的质量比混合，缓冲液采用O. 02M的磷酸缓冲液，将两者混匀后37°C吸附8小时，之后透析除去未连接上的抗体，加入封闭液O. I %脱脂奶粉和O. 2mm的甘氨酸，封闭2小时，离心去上清，用PH7. 4磷酸盐缓冲液45mmol/l，乙二胺四乙酸二钠10. 2mmol/l,0. 05%脱脂奶粉，O. 9% NaN3稀释至O. 18% ；所述的校准品制备过程为将经过处理的牛血清，加入BAS 0.1%, NaN3 O. 9%得到校准品稀释液；
本具体实施方式
具有以下有益效果它操作简便、快速、灵敏度高、特异性好，大大提高了抗体的纯度，最大限度避免了非特异反应，使结果准确性有了较大提高。实施例I :相关性试验，使用本法发明试剂和对照试剂A公司的Lp-a胶乳增强型试剂，采用自动7170全自动生化分析仪对50份人血清按各自参数同时进行测定，对测定值进行相关性分析，按照与上述” Lp-a测定方法”中的参数进行测定测定结果见图1，X，Y轴均为测定值(Lp-a的含量mg/L)。由图I的结果看出，两种试剂的相关系为R2 = O. 985，回归方程为y =O. 978x+5. 896。结果表明本试剂与进口试剂测定病人血清相关性良好，具有很好的特异性和准确性。
权利要求
1.一种双粒子复合的Lp(a)检测试剂盒，其特征在于它由Rl试剂、R2试剂及校准品三部分组成，Rl试剂质量比的组成为PH = 7. 0-7. 6的磷酸盐缓冲液30-80mmol/l、聚乙二醇6000-1000060-120mm/l和乙二胺四乙酸二钠10-20mmol/L ；R2试剂的组成为羊抗人Lp_a多克隆抗体、聚苯乙烯胶乳包被、PH = 7. 0-7. 6的磷酸盐缓冲液和乙二胺四乙酸二钠等，校准品的组成为0-10mg/l牛血清基质、叠氮钠O. 2-2. 2%、吐温-20 1_10%、牛血清白蛋白1-3%，上述百分比为牛血清基质体积用量的百分比。
2.根据权利要求I所述的一种双粒子复合的Lp(a)检测试剂盒，其特征在于所述的R2试剂中羊抗人Lp-a多克隆抗体和聚苯乙烯胶乳包被质量比为1/10-5/10。
3.根据权利要求I所述的一种双粒子复合的Lp(a)检测试剂盒，其特征在于所述的R2试剂中抗体包被过程中，封闭液组分包括O. 5% -I. 5%脱脂奶粉、10-60_的甘氨酸，胶乳稀释液组分包括PH7. 0-7. 6磷酸盐缓冲液30-80mmOl/l，0. 5% -I. 5 %脱脂奶粉，O. 9 %NaN3。
4.根据权利要求I所述的一种双粒子复合的Lp(a)检测试剂盒，其特征在于所述的R2试剂的制备过程为将190nm的聚苯乙烯胶乳粒子与45nm的聚苯乙烯胶乳粒子按照I : 4的比例混合，羊抗人Lp-a多克隆抗体和混合后的聚苯乙烯胶乳以30 100的质量比混合，缓冲液采用O. 02M的磷酸缓冲液，将两者混匀后37°C吸附8小时，之后透析除去未连接上的抗体，加入封闭液O. I %脱脂奶粉和O. 2mm的甘氨酸，封闭2小时，离心去上清，用PH7. 4磷酸盐缓冲液45mmol/l，乙二胺四乙酸二钠10. 2mmol/l,0. 05%脱脂奶粉，O. 9% NaN3稀释至O.18%。
5.根据权利要求I所述的一种双粒子复合的Lp(a)检测试剂盒，其特征在于所述的校准品制备过程为将经过处理的牛血清，加入BAS O. l%,NaN3 O. 9%得到校准品稀释液。
全文摘要
一种双粒子复合的Lp-a检测试剂盒，它涉及医学免疫体外诊断领域，它由R1试剂、R2试剂及校准品三部分组成，R1试剂的组成为PH＝7.0-7.6的磷酸盐缓冲液30-80mmol/l、聚乙二醇6000-1000060-120mm/l和乙二胺四乙酸二钠10-20mmol/L；R2试剂的组成为羊抗人Lp-a多克隆抗体、聚苯乙烯胶乳包被、PH＝7.0-7.6的磷酸盐缓冲液和乙二胺四乙酸二钠等，校准品的组成为0-10mg/l牛血清基质、叠氮钠0.2-2.2％、吐温-201-10％、牛血清白蛋白1-3％。它操作简便、特异性好，大大提高了抗体的纯度，最大限度避免了非特异反应，使结果准确性有了较大提高。
文档编号G01N33/546GK102818903SQ201210302800
公开日2012年12月12日 申请日期2012年8月23日 优先权日2012年8月23日
发明者房君江, 李伟奇, 张秀文, 林清玉 申请人:上海睿康生物科技有限公司