专利名称：一种双粒子复合的c-反应蛋白检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学免疫体外诊断领域，具体涉及一种双粒子复合的C-反应蛋白检测试剂盒。
背景技术：
C反应蛋白，1930年Tillet和Francis在急性大叶性肺炎患者血清中发现能在隹丐离子存在时与肺炎球菌C多糖起沉 淀反应而得名，是人类重要的急性期反应蛋白，急性期浓度可升高上千倍，循环中的CRP半衰期为19小时。人类CRP是由肝脏产生，由五个相同的亚基依靠非共价键形成的环状五聚体，这一特征性结构使其归类于五聚素(一组具有免疫防御特性的钙结合蛋白)家族。低等动物同样存在CRP，如在鲎、河蛘等中也发现过，但并不一定起急性期反应蛋白的作用。CRP特征反应是能在钙离子存在的条件下特异性结合磷酸胆喊基团。胶乳颗粒增强比浊法是近年来出现的一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法。PETIA法大体分为两种。一种是散射比浊检测法；另一种是透射比浊检测法。这两种方法的基本原理非常相似，都是在高分子胶乳微球的表面交联单克隆抗体，当交联有抗体的微球与抗原结合后，在短时间内会迅速聚集在一起，改变了反应液的散光性能或透光性能。而且，反应液散光性能或透光性能(即吸光度)的改变与被测抗原的浓度有较强的相关性，在一定范围内可以反映被测抗原的浓度。PETIA检测方法是在均相反应体系中进行抗原、抗体反应及结果的测定。由于血清CRP的含量分布差异较大从零点几毫克每升到几百毫克每升，其测定方法需要较高的灵敏度和特异性。目前，免疫比浊法是最为普遍通用的方法，但是免疫比浊法最高检测限只能达到8mg/l，线性只能达到150mg/l，在临床应用上存在着局限性。
发明内容
本发明的目的是提供一种双粒子复合的C-反应蛋白检测试剂盒，它采用复合胶乳颗粒包被抗体，灵敏度高，能够检测到O. 2mg/l样本，提高了线性值，同时大大提高了抗体的纯度和效价，最大限度避免了非特异反应，使结果准确性有了较大提高。为了解决背景技术所存在的问题，本发明是采用以下技术方案它由Rl试剂、R2试剂及校准品三部分组成，Rl试剂为磷酸盐缓冲体系，其质量比组成为PH = 7. 0-7. 6的磷酸盐缓冲液30-80mmol/l、聚乙二醇6000-1000060-120mm/l和乙二胺四乙酸二钠10-20mmol/L;R2试剂为抗体致敏颗粒悬浮液，其组成为复合CRP抗体致敏颗粒，PH=7. 0-7.6的磷酸盐缓冲液和乙二胺四乙酸二钠等；校准品为牛血清基质，包括叠氮钠O. 2-2. 2 %、吐温-201-10 %、牛血清白蛋白1-3 %，上述的百分比为人血清基质体积用量的百分比。所述的试剂R2中2种复合CRP抗体致敏颗粒，特征为小粒径胶乳颗粒直径在40-100nm之间，大粒径胶乳颗粒直径在150_190nm之间；
所述的试剂R2抗体包被过程中，大粒径胶乳与小粒径胶乳以1/3-1/6的比例混合，羊抗人CRP多克隆抗体和聚苯乙烯胶乳包被质量比为1/10-6/10。所述的试剂R2的制备方法为将156nm的聚苯乙烯胶乳粒子与61nm的聚苯乙烯胶乳粒子按照I : 5的比例混合，羊抗人CRP多克隆抗体和混合后的聚苯乙烯胶乳以50 100的质量比混合，缓冲液采用O. 02M的磷酸缓冲液，将两者混匀后37°C吸附8小时，之后透析除去未连接上的抗体，加入封闭液O. I %脱脂奶粉、O. 2mm的甘氨酸，封闭2小时，离心去上清，用PH7. 4磷酸盐缓冲液45mmol/l，乙二胺四乙酸二钠10. 2mmol/l,0. 05%脱脂奶粉，O. 9% NaN3稀释至O. 18%。所述的校准品制备方法为将经过处理的牛血清，加入BAS 0.1%, NaN3 O. 9%得到校准品稀释液，用重组CRP蛋白溶于制备的类似人血清基质的溶液，制备不同浓度的标准品。
本发明具有以下有益效果它采用复合胶乳颗粒包被抗体，灵敏度高，能够检测到O. 2mg/l样本，提高了线性值，同时大大提高了抗体的纯度和效价，最大限度避免了非特异反应，使结果准确性有了较大提高。
图I为本发明中实施例的结构示意图。
具体实施例方式本具体实施方式
采取以下技术方案它由Rl试剂、R2试剂及校准品三部分组成，Rl试剂为磷酸盐缓冲体系，其质量比组成为PH = 7. 0-7. 6的磷酸盐缓冲液30-80mmol/l、聚乙二醇6000-1000060-120mm/l和乙二胺四乙酸二钠10-20mmol/L ；R2试剂为抗体致敏颗粒悬浮液，其组成为复合CRP抗体致敏颗粒，PH = 7. 0-7. 6的磷酸盐缓冲液和乙二胺四乙酸二钠等；校准品为牛血清基质，包括叠氮钠O. 2-2. 2 %、吐温-201-10%、牛血清白蛋白1-3%，上述的百分比为人血清基质体积用量的百分比。所述的试剂R2中2种复合CRP抗体致敏颗粒，特征为小粒径胶乳颗粒直径在40-100nm之间，大粒径胶乳颗粒直径在150_190nm之间；所述的试剂R2抗体包被过程中，大粒径胶乳与小粒径胶乳以1/3-1/6的比例混合，羊抗人CRP多克隆抗体和聚苯乙烯胶乳包被质量比为1/10-6/10。所述的试剂R2的制备方法为将156nm的聚苯乙烯胶乳粒子与61nm的聚苯乙烯胶乳粒子按照I : 5的比例混合，羊抗人CRP多克隆抗体和混合后的聚苯乙烯胶乳以50 100的质量比混合，缓冲液采用O. 02M的磷酸缓冲液，将两者混匀后37°C吸附8小时，之后透析除去未连接上的抗体，加入封闭液O. I %脱脂奶粉、O. 2mm的甘氨酸，封闭2小时，离心去上清，用PH7. 4磷酸盐缓冲液45mmol/l，乙二胺四乙酸二钠10. 2mmol/l,0. 05%脱脂奶粉，O. 9% NaN3稀释至O. 18%。所述的校准品制备方法为将经过处理的牛血清，加入BAS 0.1%, NaN3 O. 9%得到校准品稀释液，用重组CRP蛋白溶于制备的类似人血清基质的溶液，制备不同浓度的标准品。本具体实施方式
具有以下有益效果它采用复合胶乳颗粒包被抗体，灵敏度高，能够检测到O. 2mg/l样本，提高了线性值，同时大大提高了抗体的纯度和效价，最大限度避免了非特异反应，使结果准确性有了较大提高。实施例I :相关性试验，参照图I :使用本法发明试剂和对照试剂A公司的CRP胶乳增强型试剂，采用自动7170全自动生化分析仪对85份人血清按各自参数同时进行测定，对测定值进行相关性分析。按照与上述” CRP测定方法”中的参数进行测定，X，Y轴均为测定值(CRP的含量mg/L)。由图I的结果看出，两种试剂的相关系为R2 = O. 987，回归方程为y =O. 983X+4. 096，结果表明本试剂与进口试剂测定病人血清相关性良好，具有很好的特异性
和准确性。
权利要求
1.一种双粒子复合的C-反应蛋白检测试剂盒，其特征在于它由Rl试剂、R2试剂及校准品三部分组成，Rl试剂为磷酸盐缓冲体系，其质量比组成为PH = 7. 0-7. 6的磷酸盐缓冲液 30-80mmol/l、聚乙二醇 6000-1000060-120mm/1 和乙二胺四乙酸二钠 10-20mmol/L ；R2试剂为抗体致敏颗粒悬浮液，其组成为复合CRP抗体致敏颗粒，PH = 7. 0-7. 6的磷酸盐缓冲液和乙二胺四乙酸二钠等；校准品为牛血清基质，包括叠氮钠O. 2-2. 2%、吐温-201-10%、牛血清白蛋白1_3%，上述的百分比为人血清基质体积用量的百分比。
2.根据权利要求I所述的一种双粒子复合的C-反应蛋白检测试剂盒，其特征在于所述的试剂R2中2种复合CRP抗体致敏颗粒，特征为小粒径胶乳颗粒直径在40-100nm之间，大粒径胶乳颗粒直径在150-190nm之间。
3.根据权利要求I所述的一种双粒子复合的C-反应蛋白检测试剂盒，其特征在于所述的试剂R2抗体包被过程中，大粒径胶乳与小粒径胶乳以1/3-1/6的比例混合，羊抗人CRP多克隆抗体和聚苯乙烯胶乳包被质量比为1/10-6/10。
4.根据权利要求I所述的一种双粒子复合的C-反应蛋白检测试剂盒，其特征在于所述的试剂R2的制备方法为将156nm的聚苯乙烯胶乳粒子与61nm的聚苯乙烯胶乳粒子按照I 5的比例混合，羊抗人CRP多克隆抗体和混合后的聚苯乙烯胶乳以50 100的质量比混合，缓冲液采用O. 02M的磷酸缓冲液，将两者混匀后37°C吸附8小时，之后透析除去未连接上的抗体，加入封闭液O. I %脱脂奶粉、O. 2mm的甘氨酸，封闭2小时，离心去上清，用PH7. 4磷酸盐缓冲液45mmol/l，乙二胺四乙酸二钠10. 2mmol/l,0. 05%脱脂奶粉，O. 9% NaN3稀释至 O. 18%。
5.根据权利要求I所述的一种双粒子复合的C-反应蛋白检测试剂盒，其特征在于所述的校准品制备方法为将经过处理的牛血清，加入BAS O. 1%, NaN30.9%得到校准品稀释液，用重组CRP蛋白溶于制备的类似人血清基质的溶液，制备不同浓度的标准品。
全文摘要
一种双粒子复合的C-反应蛋白检测试剂盒，它涉及医学免疫体外诊断领域，它由R1试剂、R2试剂及校准品三部分组成，R1试剂为磷酸盐缓冲体系，其质量比组成为pH＝7.0-7.6的磷酸盐缓冲液30-80mmol/l、聚乙二醇6000-1000060-120mm/l和乙二胺四乙酸二钠10-20mmol/L；R2试剂为抗体致敏颗粒悬浮液，其组成为复合CRP抗体致敏颗粒，pH＝7.0-7.6的磷酸盐缓冲液和乙二胺四乙酸二钠等；校准品为牛血清基质，包括叠氮钠0.2-2.2％、吐温-20 1-10％、牛血清白蛋白1-3％，它采用复合胶乳颗粒包被抗体，灵敏度高，能够检测到0.2mg/l样本，提高了线性值。
文档编号G01N33/536GK102809654SQ20121030277
公开日2012年12月5日 申请日期2012年8月23日 优先权日2012年8月23日
发明者房君江, 李伟奇, 张秀文, 林清玉 申请人:上海睿康生物科技有限公司