专利名称：细胞展示抗体文库的制作方法
细胞展示抗体文库 发明领域本发明提供了在细胞膜表面上展示抗体或抗体片段的方法；产生在细胞表 面上展示的抗体或抗体片段文库的方法；在细胞表面上表达抗体或抗体片段文 库的细胞；在细胞膜上表达抗体或抗体片段文库的病毒载体文库；筛选结合于 具体抗原的抗体或抗体片段的方法;筛选结合特性改进和/或改变的抗体或抗体 片段的方法；筛选在其细胞表面上表达和展示结合于具体抗原的抗体或抗体片 段的细胞的方法;筛选在其细胞表面上表达和展示结合特性改进和/或改变的抗 体或抗体片段的细胞的方法；和相关试剂盒。本发明还提供了配体结合(如FcYR 结合)改变和/或效应物功能(如ADCC活性)改变的Fc变体。发明背景抗体是结合特定抗原的免疫蛋白。在大多数哺乳动物，包括人和小鼠中， 由成对的重链和轻链多肽构建抗体。各链由两个不同区域组成，称为可变区(Fv) 和恒定区(Fc)。轻链和重链Fv区含有该分子的抗原结合决定簇，负责结合耙抗 原。Fc区确定了抗体类型(或同种型)(如IgG)，并负责结合许多Fc受体和其它 Fc配体，赋予一系列重要功能，称为效应物功能。抗体的几种关键特征包括但 不限于对靶点的特异性、介导免疫效应物机制的能力和长血清半衰期、使抗 体具有更好的疗效。开发了用于分离具有所需结合特异性的抗体的重组筛选 法。例如，可能用组合的重组DNA技术产生结合分子的大型表达文库。在抗 体工程领域尤其如此，在此领域重组抗体文库通常含有超过109个独立克隆。 大型结合分子文库的可用性为大多数配体提供了结合物来源。通过对展示结合分子的生物体(如噬菌体和酵母)进行连续选择(如淘选； 综述参见，7Vewfe所ofec/wo/ 9: 408-414; Coomber等，2002， Af"/zoc^ Mo/ 扁178: 133-45， Kretzschmar等,2002， C群Qp/"胸ec/zo/ 13: 598-602; Fernandez-Gacio等，2003， Med C7zem 13:213-216; Lee等，2003， 7>ewA 5,otec/mo/ 21: 45-52;禾卩Kondo等，2004， j; p/ Af/craWo/ Ao加/z"o/64: 28-40)，能够用表面展示文库富集特定结合克隆。具体说，噬菌 体展示抗体文库的进展使它们成为筛选常规杂交瘤衍生的单克隆抗体的吸引 人的替代技术。由于单个噬菌体展示文库中可含有多种不同多肽(一般超过109 种)，所以噬菌体展示文库筛选优于其它一些筛选方法。这便能够在一个筛选 步骤中筛选高度复杂的文库。噬菌体上展示小肽或单链蛋白可能有利，只要不一定需要或不需要胞内加 工或翻译后修饰(噬菌体或原核宿主不能进行这些功能)。例如，有效展示异源 多肽可能需要各种翻译后修饰、胞内结构、以及将展示多肽适当地运输、糖基 化、构型、组装和锚定到宿主细胞表面上所需要的侣伴蛋白和专用酶的一套补 充物(complement);然而，这些过程均无法通过噬菌体或原核细胞过程实现。 而且，原核细胞不总是有效地表达功能性真核蛋白。细菌和噬菌体展示系统也受限于展示系统的小容量，因此，更适合展示小 肽，如最近开发的在哺乳动物细胞上进行小肽表面展示的方法(参见例如 Wolkowicz等，2005，丄5/o/. CTzem. ， 280: 15195-15201)。结果是，噬菌体和 哺乳动物抗体展示文库和方法需要在表面上只展示抗体片段。如果目的是发现 "完整"抗体，那么必须将抗体片段克隆到完整抗体中。这不仅增加了一个额外 步骤，而且当转变为完整抗体和这类文库时，许多抗体片段对抗原的亲和力降 低。而且，无法使用这类方法检测其它抗体结构域如Fc区与抗体受体(如Fc 受体)或其它Fc配体的结合。已经开发了一些真核细胞如酵母的完整抗体细胞表面展示系统(参见例如 Boder和Wittrup， 2000， M"Ao必/"五raymo/ogy， 328:430-444)，但在哺乳动 物细胞上进行完整抗体展示的开发滞后。而且，这些系统中可以产生的文库大 小有限。因为用所需结合特性从抗体文库中分离抗体的概率与文库的大小和多 样性成正比，所以需要一种方法产生大型多样化的文库。如果想要从未免疫的 供体建立用于抗体发现的天然抗体文库，这一点特别重要。目前，通过釆用常 规转染工具如瞬时转染或电穿孔的真核细胞展示技术建立大于108个成员的文 库是个挑战。因此，需要用于真核细胞，特别是哺乳动物细胞的抗体细胞表面 展示文库和文库筛选方法，该文库能保持大量不同信息，但消除了上述问题。这一系统对于鉴定可变区外区域如FC区域中的抗体变异特别有用。已证明， Fc区修饰，包括氨基酸缺失、取代和添加能改变Fc区与其配体和/或受体的结 合，导致效应物功能伴随性改变(参见例如(Shields等，2001, /所o/ C&m 276:6591-6604和Presta等，2002， Soc 7>aw 30:487-490和美国专利公开2004/0132101)。因此，可通过修饰Fc区提高含Fc分子的治疗有效性。在 哺乳动物细胞上进行完整抗体细胞表面展示的系统能促进快速鉴定含有效应 物功能改变的修饰Fc区的抗体。引用或讨论本文引用的参考文献不应被认为是承认该文献是本发明的现 有技术。发明概述本发明涉及在细胞膜胞外表面上展示的重组抗体或其片段，本文中称为 "本发明抗体"和类似术语。在某些实施方式中，本发明重组抗体包含重链或其 片段，和任选的轻链或其片段，其中重链或轻链还包含使抗体或其片段耙向细 胞表面的氨基酸序列。在一个实施方式中，本发明重组抗体包含具有使抗体靶 向细胞表面的氨基酸序列的全长重链，其中所述氨基酸序列融合于所述重链的 C末端，还可包含全长轻链。在另一实施方式中，本发明重组抗体包含具有使 抗体耙向细胞表面的氨基酸序列的一部分重链，其中所述氨基酸序列融合于所 述重链部分的c末端，还可包含轻链或其片段。在一个具体实施方式
中，使抗体靶向细胞表面的所述氨基酸序列是跨膜域。在另一实施方式中，使抗体靶向细胞表面的所述氨基酸序列是GPI锚定信号序列。本发明还涉及包含编码细胞膜外表面上展示的重组抗体或其片段的多核 苷酸的载体，在本文中称为"本发明载体"。在一个实施方式中，本发明载体是 病毒载体。在一个具体实施方式
中，本发明载体是腺病毒载体。本发明也涉及包含在细胞膜外表面上展示的重组抗体或其片段的文库，在 本文中称为"本发明文库"。在一个实施方式中，本发明文库包含重链可变区文 库；它还可包含轻链可变区文库；它还可包含变异Fc区的文库。在一个实施 方式中，本发明文库是包含编码在细胞膜外表面上展示的重组抗体或其片段的 多核苷酸的细胞文库。本发明也提供了筛选包含在细胞膜外表面上展示的重组抗体或其片段的 本发明文库的方法。在一个实施方式中，文库筛选方法能够鉴定结合于特定抗 原的抗体或其片段。在一个实施方式中，文库筛选方法能够鉴定对特定抗原结 合特性改变的抗体或其片段。在一个实施方式中，文库筛选方法能够鉴定与效 应物分子(如FcyRs和/或Clq)结合特性改变的抗体或其片段。本发明提供了与效应物分子(如FcYRs和/或Clq)结合特性改变的变异Fc 区。本发明还提供了效应物功能改变的变异Fc区。在一个实施方式中，本发 明变异Fc区的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)降低。附图简要说明为了说明本发明的示范性实施方式，本文提供了附图。
图1A-C.可用于细胞表面展示抗体或其片段的表达盒(I-VI)的非限制性例子的示意图。图2.表达含有跨膜域或GPI锚定信号的抗体融合多肽的染色HEK-293T 细胞的荧光强度概况。用FITC偶联的抗-人IgG或生物素化EphA2-Fc融合蛋 白/FITC偶联的抗生物素抗体对表达含重链的抗EphA2抗体的HEK-293T细胞 进行染色，所述重链融合于i)羧基肽酶M的GPI锚定信号(CM GPI)， ii)DAF 的移码突变型GPI锚定信号(DAF mutGPI)， iii)DAF的变异GPI锚定信号(DAF vGPI)，或iv)血栓调节蛋白的跨膜域(TM;所分析的两种独立分离的克隆)，然 后用流式细胞仪分析。经类似染色(293T+FITC)以及未染色(293T)的HEK-293T 细胞用作阴性对照。表达CM GPI、 DAF vGPI或TM融合的抗EphA2抗体的 细胞荧光强度显著高于对照细胞。表达DAF mutGPI融合的抗EphA2抗体的细 胞荧光强度与对照HEK-293T细胞基本相同。图3.用不同量编码含有DAF vGPI的抗EphA2融合抗体的质粒DNA转 染的HEK-293T细胞经亲和染色后的荧光强度图。用不同量(0.05、 0.1、 0.5、 1.0、2.0、4和10吗)的质粒DNA转染HEK-293T细胞。转染细胞先接触FcYRI^A-链霉亲和素融合蛋白，然后用FITC偶联的抗链霉亲和素抗体染色。随后用流 式细胞仪分析细胞。非转染HEK-293T细胞用作阴性对照。所有转染细胞群体 的流式细胞图显示出，与对照细胞相比平均荧光强度发生显著改变。图4.表达含DAF vGPI的抗EphA2融合抗体的HEK-293T细胞经亲和染 色后的荧光强度图。用10吗编码含DAF vGPI的抗EphA2融合抗体的质粒 DNA转染HEK-293T细胞。将转染细胞分成等份，用不同稀释度的FcYRIIIA-链霉亲和素融合蛋白(1:500、 1:1000、 1:2000、 1:3000、 1:4000和l:5000)培育。 然后用FITC偶联的抗链霉亲和素抗体染色细胞，流式细胞术分析。流式细胞 图显示，FcYRIIIA-链霉亲和素融合蛋白用量降低时，导致荧光强度降低。图5.用于分离对FcyRIIIA结合亲和力低的Fc变体的分选参数。用Fc变 体插入文库(Fc-IL)瞬时转染HEK-293细胞，并用FcYRIIIA-链霉亲和素融合蛋 白/FITC偶联的抗链霉亲和素抗体染色。(A)用门R2分离荧光强度低(约为Ml 标记物总量的10%)的细胞。(B)分离的细胞群体显示出均一的低荧光强度。图6.表达含有DAF vGPI的抗EphA2融合抗体的Fc变体的HEK-293细 胞经染色的荧光强度图形。用流式细胞术分析表达含有DAF vGPI的抗EphA2 融合抗体的野生型(A和D)、 K246E Fc变体(B和E)或InR236/237 Fc变体(C和 F)的HEK-293细胞。细胞用FITC偶联抗人IgG抗体(A-C)或用FcYRIIIA-链霉 亲和素融合蛋白/FITC偶联抗链霉亲和素抗体染色。各图包含表达抗体(黑线) 和对照(灰线)的HEK-293细胞的流式细胞图。用FITC偶联抗人IgG抗体染色 的所有三种细胞群体的荧光强度水平相似，与对照细胞的观察值显著不同。用 FcYRIIIA-链霉亲和素融合蛋白/FITC偶联抗链霉亲和素抗体染色时，只有表达 野生型或K246E Fc变体抗体的细胞的荧光强度显著高于对照HEK-293细胞的 观察值。图7. Fc变体InR236/237、 InN238/239和InV238/239的基于ELISA的 FcYRIIIA结合曲线。用标准ELISA方法建立FcyRIIIA与野生型或Fc变体 InR236/237、 InN238/239和InV238/239抗EphA2抗体相互作用的结合曲线。 抗原特异性相同的IgG4同种型抗体用作阴性对照。结合曲线显示，FcYRIIIA 与InR236/237、 InN238/239或InV238/239 Fc变体之间的相互作用比FcyRIIIA 与IgG4阴性对照抗体Fc区之间的相互作用弱。FcYRIIIA能与含有野生型Fc 区的阳性对照抗体强烈结合。图8. Fc变体InG240/241、InR234/235、InL238/239、InE238/239、InS239/240、 InR237/238和K246R/L251E/T260R的基于ELISA的Clq结合曲线。用标准ELISA方法建立Clq与野生型或Fc变体InG240/241 、 InR234/235 、 InL238/239、 InE238/239、 InS239/240、 InR237/238和K246R/L251E/T260R抗 EphA2抗体相互作用的结合曲线。抗原特异性相同的IgG4同种型抗体用作阴 性对照。与野生型抗体相比，各Fc变体与Clq的结合减少。图9. Fc变体K246R/L251E/T260R 、 InR236/237 、 InN238/239 、 InV238/239、 InG240/241、 InR234/235、 InL238/239、 InE238/239、 InS239/240 和InR237/238与THP-1细胞的结合百分数。使表达FcyRI和Fc7Ri1、但不表 达FcyRIIIA的THP-1单核细胞接触野生型或Fc变体K246R/L251E/T260R、 InR236/237 、 函238/239 、 InV238/239 、 InG240/241 、 InR234/235 、 InL238/239、 InE238/239、 InS239/240和InR237/238抗EphA2抗体。用FITC 偶联抗人IgG Fab进行细胞染色来测定各抗体结合的THP-1单核细胞的百分 数，并用流式细胞仪分析。得到的结果显示，与野生型抗体相比，各测试Fc 变体与FcyRI和FcyRII的结合降低。图10. Fc变体InR236/237、 InN238/239和InV238/239与NK细胞的结合 百分数。使表达Fc/RIIIA的NK细胞与野生型或Fc变体InR236/237、InN238/239 和InV238/239抗EphA2抗体相接触。通过FITC偶联抗人IgG Fab进行细胞染 色来测定各抗体结合的NK细胞的百分数，并用流式细胞仪进行分析。抗原特 异性相同的IgG4同种型抗体用作阴性对照。得到的结果显示，与野生型抗体 相比，各测试Fc变体与FcyRIIIA的结合降低。图11. Fc变体InR236/237、 InN238/239、 InV235/236和InG238/239的基 于ELISA的EphA2结合曲线。用标准ELISA方法测定野生型和Fc变体 InR236/237、 InN238/239、 InV235/236和lnG238/239抗EphA2抗体与人EphA2 的结合。本实验中将维他辛(Vitaxin)⑥(抗-avP3整联蛋白抗体)和抗-HMGBl抗 体用作阴性对照。结果证明，各测试Fc变体与人EphA2结合的亲和力类似于 野生型抗体。图12.Fc变体InR236/237、 InN238/239、 InV238/239的体外ADCC活性。 用标准方法以50:1(左图)或25:1(右图)的效应物:靶细胞比测定Fc变体 InR236/237、 InN238/239、 InV238/239的ADCC活性。野生型抗EphA2抗体 和抗-CD4抗体(R347)分别用作阳性和阴性对照。表达EphA2的A549细胞用作靶点。纯化的人外周血单核细胞用作效应物。在0.1-10000 ng/ml的抗体浓度 下测定细胞毒性。各测试Fc变体显示的ADCC活性类似于阴性对照抗体。在 相同条件下野生型抗EphA2抗体显示出强烈的ADCC活性。图13.原理选择实验I的证据的流式细胞图。用aVp3-生物素培育细胞， 然后用FITC偶联的抗人IgG-Fc和APC偶联的链霉亲和素染色。展示样品如 下(A)阴性对照293A细胞，(B)用编码在细胞表面展示的3F2抗EphA2抗体 的ts369突变腺病毒感染的293A细胞，(C)用编码细胞表面展示的Abegrin抗 -aVp3整联蛋白ScFvFc的ts369突变腺病毒感染的293A细胞，(D)在进行磁珠 介导的选择之前用人工文库感染的293A细胞，(E)经过磁珠介导的选择后，用 人工文库感染的293A细胞。采用门P6分选双阳性细胞。图14.原理选择实验II的证据的流式细胞图。用生物素化EphA2培育细 胞，然后用FITC偶联的抗人IgG-Fc和APC偶联的链霉亲和素染色。展示样 品如下(A)阴性对照293A细胞，(B)用编码细胞表面展示的Abegrin抗-aVp3 整联蛋白抗体的ts369突变腺病毒感染的293A细胞，(C)用编码细胞表面展示 3F2抗-EphA2 ScFvFc的ts369突变腺病毒感染的293A细胞，(D)在进行磁珠 介导的选择之前用人工文库感染的293A细胞，(E)经过磁珠介导的选择后，用 人工文库感染的293A细胞。采用门P6分选双阳性细胞。图中显示了门P6覆 盖的细胞百分数。图15.原理选择实验III的证据的流式细胞图。用生物素化EphA2培育细 胞，然后用FITC偶联的抗人IgG-Fc和APC偶联的链霉亲和素染色。展示样 品如下(A)阴性对照293A细胞，(B)用编码细胞表面展示的抗-PCDGF抗体的 ts369突变腺病毒感染的293A细胞，(C)用编码细胞表面展示的10C12抗-EphA2 ScFvFc的ts369突变腺病毒感染的293A细胞，(D)在进行磁珠介导的选择之前 用人工文库感染的293A细胞，(E)经过磁珠介导的选择后，用人工文库感染的 293A细胞。采用门P6分选双阳性细胞。图中显示了门P6覆盖的细胞百分数。定义本文所用术语"抗体"指单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、 camelised抗体、嵌合抗体、单链Fv(scFv)、 二硫键连接的Fv(sdFv)、 Fab片段、F(ab，)片段和抗-独特型(抗-Id)抗体(包括例如，本发明抗体的抗Id抗体)和上述 抗体的表位结合片段。具体说，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子， 即含有抗原结合位点的分子的免疫活性片段，这些片段可以或可以不融合于另 一免疫球蛋白结构域，包括但不限于fc区或其片段。本文所用术语"抗体"和"抗体"也包括Fc变体、全长抗体和含有Fc区或其片段的Fc变体融合物。 Fc变体-融合物包括但不限于scFv-Fc融合物、可变区(如叭和VH)-Fc融合物、 scFv-scFv-Fc融合物。抗体可以是任何类型(如IgG、 IgE、 IgM、 IgD、 IgA和 IgY)、类别(如IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgAl和IgA2)或亚类。本文提到的互补决定区(CDR)残基编号是Kabat等(1991， NIH公告(NIH Publication) 91-3242，国家技术信息服务中心(National Technical Information Service),弗吉尼亚州斯普林菲尔德(Springfield， VA))所述的编号。具体说，轻 链可变区的残基24-34(CDRl)、 50-56(CDR2)和89-97(CDR3)和重链可变区的 31-35(CDR1)、 50-65(CDR2)和95-102(CDR3)。需要注意，不同抗体之间的CDR 明显不同(根据定义与Kabat共有序列没有同源性)。构架残基的最大比对常常 需要在编号系统中插入"间隔物"残基，以用于Fv区。应理解，本文中提到的 CDR是Kabat等同上所述的CDR。此外，由于种间或等位基因差异，在不同 抗体链之间，任何给定的Kabat位点编号上某些单独残基的种类可能不同。本文所用的"Fc区"包括含有除第一恒定区免疫球蛋白结构域以外的抗体 恒定区的多肽。因此，Fc指IgA、 IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结 构域和IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域以及这些结构域N末 端方向上的弹性绞链区。就IgA和IgM而言，Fc可包括J链。就IgG而言， Fc包含免疫球蛋白结构域Cy2和Cy3以及Cy1和CY2之间的绞链区。虽然Fc 区的界限可能不同，但人IgG重链Fc区的羧基端通常会包含残基C226或P230 ， 其中编号方式遵照Kabat等(1991， NIH公告91-3242，国家技术信息服务中心， 弗吉尼亚州斯普林菲尔德)所述的EU索引。"如Kabat所述EU索引"指Kabat 等同上所述的人IgGl EU抗体的残基编号方法。Fc可能指分离的这一区域， 或者在抗体、抗体片段或Fc融合蛋白中的这一区域。Fc变体蛋白可能是抗体、 Fc融合物、或者包含Fc区的蛋白质或蛋白质结构域。特别优选包含变异Fc 区(非天然产生的Fc区变体)的蛋白质。与野生型氨基酸序列相比，非天然产生的Fc区(本文中也称为"变异Fc区")的氨基酸序列包括至少一个氨基酸残基的 取代、插入和/或缺失。由于插入或取代，变异Fc区序列中任何新出现的氨基 酸残基都可称作非天然产生的氨基酸残基。需要注意已经在许多FC位置上观察到多态性，包括但不限于Kabat270、 272、 312、 315、 356和358，因此所 述序列和现有技术中的序列之间可能略有差异。本文所用术语"跨膜区"指能够跨越细胞质膜的肽、多肽或蛋白质的结构 域。可釆用这些结构域将抗体锚定在细胞膜上。"嵌合抗体"是抗体不同部分衍生自不同免疫球蛋白分子的分子，如含有衍 生自非人抗体和人免疫球蛋白恒定区的抗体。本领域知道产生嵌合抗体的方 法。参见例如，Morrison, 1985，肠"ce 229:1202; Oi等，1986， 5/。rec/m—:y 4:214; Gillies等，1989， /mmw"o/. M"Ao^ 125:191-202;和美国专利号 5,807,715、 4,816,567和4,816,397， CDR-嫁接(EP 239,400; PCT
发明者H·吴, 高长寿 申请人:米迪缪尼有限公司