抗体多肽文库筛选和选择的抗体多肽类的制作方法

专利名称：：抗体多肽文库筛选和选择的抗体多肽类的制作方法抗体多肽文库筛选和选择的抗体多肽类本发明进一步提供了筛选抗体多肽文库中的动态。本发明还提供了可提供本发明方法获得的新的分离的抗体多肽类。指定为本申请人的WO99/20749中描述了使用一般配体，例如抗体或抗体片段或包含来自抗体的一种或多种特异性结合位点的任意物质筛选抗体文库(例如抗体重链可变域文库)的方法。将"抗体"定义为使用这类抗体的结合(可变)区的构建。将WO99/20749披露的内容引入本文作为参考，特别是文库生成("本发明文库的构建")，从文库中选择多肽类("本发明多肽类的选择")，配体选择("用作多肽选择中的配体的抗体")和工业化应用("按照本发明选择的多肽类的应用")中披露的内容。明确地将所有这些部分引入本申请以便提供可用于本发明的特征的披露，并且本领域技术人员易于认识到-在本申请权利要求的上下文中-那些可以用于本发明的特征。文献中已经描述了非常规抗体类型-重链抗体。已经在具有重链疾病的患者，EBV转化的B-细胞的血清，且更重要的是在骆驼科(Camelidae)(骆驼，美洲驼羊)的血清中发现了这些高滴度的抗体。这些重链抗体不含重链，但仅含单一对的相同重链。这些重链与常用的IgGs的中的那些不同之处在于它们缺乏在介导重链上轻链配对中起作用的恒定域l(CHl)。因此，所得重链抗体不含轻链可变域，而仅含两个未配对的重链可变域。有关免疫接种骆驼科血清的研究已经证实，尽管不存在轻链，但是这些重链抗体确实特异性结合具有中度到高度亲和力的抗原。未配对的重链可变域(称作VHH)在进化的自始至终进行了遗传适应许多氨基酸取代在通常与VL结构域发生相互作用的部分中发生(甚至在种系水平上)在VHs中保守的L45被Arg取代。其它位置通常发生突变V37突变成Phe,G44突变成Glu且W47突变成Gly。最终，来自骆驼(但不限于美洲驼羊)的VHHs的CDR3平均而言比鼠和人VHS的那些(分别为9和12个氨基酸)长(16-17个氨基酸)，由此补偿了不存在的VL结构域以便结合抗原。参照WO05044858Al，WO04062551A2,WO04041867A2,WO04041865A2,WO04041863A2,WO04041862A2,WO03050531A2和EP0656946中有关CamelidVHH结构域的描述。自从1989以来，已经认识到抗体的单一可变域具有治疗潜能。由于其小尺寸，所以它们停靠在难以接近的常规抗体的抗原部位上(裂，峡谷，活性位点)。这些结构域还可以形成根据需要制成的一定范围的产物例如可以使它们多聚化(通过化学或遗传方式)以便增加亲和力，同时保持相对小的总体尺寸。可以通过聚乙二醇化(以便增加流体大小)或通过与血清蛋白质，诸如展示出延长半衰期(在人体内达19天)的血清清蛋白共价或非共价结合调节血清中的持久性。最终，可以使单一可变域重新形成IgG以便得益于Fc-效应子功能。在所有情况中，有权使用的抗原特异性抗体可变域的遗传信息为对所有上述提及的策略而言绝对必须具备的条件。已经研发了几种方法来分离编码抗原-特异性抗体的抗体可变域的基因。这些方法之一基于早期的观察结果，即在其研发过程中，B-淋巴细胞各自表达其细胞表面上单一类型的抗体(由与膜锚定肽的遗传融合体介导结合)。结合抗原(和T辅助细胞参与)介导B-淋巴细胞的抗原-特异性增殖，在随后阶段发育成熟为血浆细胞。这些细胞不表达表面-结合的抗体，而是大量分泌它们。因此，在其发育过程中，可以将B-淋巴细胞视为遗传展示包装，其中表型(抗体)与基因型连接(抗体基因)。因此，为了分离编码抗原-特异性抗体的基因，已经研发了方法，其中(i)使B-淋巴细胞采集物(分离自免疫接种的动物)接触抗原(可以在细胞或固相上免疫接种或可以用染料标记)；(ii)抗原-特异性B-淋巴细胞结合抗原；(iii)从未结合的B-淋巴细胞中分离结合的抗原-特异性B-淋巴细胞；(iv)将结合的抗原-特异性B-淋巴细胞回收入贮器。试管，孔或平亚；和(v)从分离的B-淋巴细胞中回收编码抗原-特异性抗体可变域的基因(可以作为单克隆或多克隆群体储存)。使用该方案的方法的实例为下列文献中描述的那些(i)Babcook等(1996)爿cadOSL493，7843-7848。SLAM通过能够从任意种类中分离在体内免疫应答过程中生成的高亲和力抗体克服了杂交瘤技术和细菌表达的抗体文库的局限。SLAM能够使单一淋巴细胞产生具有所需特异性或功能的抗体以便在淋巴样细胞大群体和编码从该淋巴细胞中恢复的抗体特异性的遗传信息内得以鉴定，例如能够将所述遗传信息克隆入表达载体，以便能够表达大量的抗体。在一个实施方案中，产生抗体的细胞结合选择的抗原并且使用适合的溶血菌斑试马t法检测(Jerne和Nordin(1963)Sc/ewce140，405)。在该试-睑中，使用选择的抗原包^皮红细胞并且将其与产生抗体的细胞群和补体源一起孵育。根据溶血菌噬菌斑的形成鉴定产生单一抗体的细胞。使用倒置显微镜鉴定裂解的红细胞噬菌斑，并且使用显微操作技术取出在噬菌斑的中心上关注的产生单一抗体的细胞，然后用于接种包被了EL4-B5T细胞的单一孔(提供有活力的细胞-细胞相互作用和用于B-细胞表达的可溶性因子)。平均而言，给每个孔接种0.3B-细胞以确保克隆分布。然后通过逆转录抗体PCR克隆来自这些克隆平展的B细胞中的基因。用于检测产生单一抗体的具有所需功能的细胞的其它方法已经描述在国际专利说明书WO92/02551中。(ii)deWildt等(1997)丄/mmw"o/.Me^oA2073，61-67。所述方法包括下列步骤(i)从人供体中采集B-淋巴细胞；(ii)用安装了自动细胞分配部件的荧光活化的流式细胞仪(FACS仪器)检测CD19+ZCD20+细胞；(iii)将CD19+/CD20+B细胞各自调配在包被了EL4-B5T细胞的单一孔中，所述EL4-B5T细胞提供细胞-细胞相互作用(CD40-CD40L)和可溶性生长因子；(iv)使单一B-细胞各自扩充以便增加mRNA的量；和(v)通过RT-PCR回收抗体基因。应注意步骤4(B-细胞扩充)为任选的，只要可以将PCR方法设计成可有效地对来自单一细胞的抗体基因进行PCR扩增。(iii)Lawson等WO2004106377。在该专利申请中，作者已经通过流式细胞计量术(deWildt等(1997)丄/www"o/.M"/oA,2073,61画67)或生物淘选(Lagerkvist等(1995)肠&c—腦18,862-869)分离了抗原-特异性B-细胞。与这两种手段相反，Lawson等的方法无需分离各B细胞。每孔中B细胞的数量在100-20,000的范围-仍然是在B-细胞扩充后，抗体可变基因的RT-PCR揭示出在大部分孔中的单克隆抗体序列。所有这些方法均使用了抗原来分离呈递抗体的B-细胞亚群。这种手段未考虑到，在抗原-特异性B-细胞群内，展示的抗体在未直接涉及抗原结合的区中可以不同。例如，常用抗体由K或X轻链构成。仅基于抗原的选择由此不能分选不同的B-细胞亚群。然后必须测试各抗原-选择的B-淋巴细胞，以便随后用于轻链同种型。根据对免疫接种的骆驼科的观察结果指定了更重要的实例在骆驼中，认为20。/o的B-淋巴细胞在其表面上表达和/或分泌重链抗体。剩余的B-淋巴细胞展示/表达常规的四-链抗体。因此，基于抗原的选择无法在那些表达重链抗体的那些B-细胞之间进行区分，所述重链抗体来自那些表达常规抗体的B-细胞。使用本发明可以解决这一问题。还参照以Celltech名义的下列公开文献WO04051268A1:ASSAYFORIDENTIFYINGANTIBODYPRODUCINGCELL,该文献披露了用于鉴定产生结合选择的抗原的抗体的细胞的同源性测定，该方法包括将产生抗体的细胞与抗原和标记的抗-抗体抗体一起孵育。WO04106377A1:METHODSFORPRODUCINGANTIBODY,该文献披露了通过下列步骤获得具有所需功能的抗体使B细胞接触俘获试剂，分离俘获的B细胞并且培养和筛选俘获的B细胞以便鉴定产生抗体的细胞以便获得所需的抗体。WO05019823A1:METHODSFOROBTAININGANTOBODY,该文献披露了富集B细胞群，该B细胞群用于产生通过接触细胞识别所关注的抗原的抗体，所关注的抗原和抗体-颗粒复合物的细胞，其中抗体识别所关注的抗原。WO05019824A1:METHODSFOROBTAININGANTIBODY,该文献披露了在产生识别所关注的抗原的抗体的细胞中富集B细胞群，该方法包括使用对B细胞标记和抗原具有特异性的抗体标记细胞并且分离双重标记的细胞。抗体的抗原结合结构域包含两个单独的区可以为Vk或V人)的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)。抗原结合部位自身由6个多肽环构成3个来自VH结构域(基因片段的1重排。VH基因由重组Hl,H2和H3产生)且3个来自VL结构域(L1、L2和L3)。编码VH和VL结构域的V基因的不同的初级所有组成成分(repertoire)通过合并三种基因片段VH，D和JH产生。在人中，存在约51个功能性VH片段(Cook和Tomlinson(1995)7b&》16:237),25个功能性D片段(Corbett等(1997)J.Afo/.Ao/.,268:69)和6个功能性Jh片段(Ravetch等(1981)细胞，27:583),这取决于单元型。VH片段编码构成VH结构域(Hl和H2)的笫一或第二抗原结合环的多肽链区，而vh，D和Jh片段合17并成VH结构域(H3)的第三抗原结合环。VL基因通过重组仅两种基因片段VL和JL产生。在人中，存在约40个功能性VK片段(Schable和Zachau(1993)C/zem.//0//7e-Sey/w,374:1001),31个功能性V入片段(Williams等(1996)M/.,264:220;Kawasaki等(1997)Ge"ome"仏，7:250)，5个功能性Jic片段(Hieter等(1982)J.5/。/.C/ze肌，257:1516)和4个功能性J人片段(Vasicek和Leder(1990)Ex/.，172:609)，这取决于单元型。VL片l殳编码构成VL结构域(L1和L2)的第一或第二抗原结合环的多肽链区，而VL和JL片段合并成VL结构域(L3)的第三抗原结合环。认为这一初级所有组成成分中选择的抗体足以不同地结合几乎所有具有至少中度亲和力的抗原。通过重排基因的"亲和力成熟"产生高亲和力抗体，其中基于改善的结合由免疫系统生成并且选择点突变。对抗体结构和序列的分析已经证实6个抗原结合环(H1、H2、Ll、L2和L3)中的5个具有有限数量的主链构象或规范结构(Chothia和Lesk(1987)丄編.編.,196:901;Chothia等(1989)淑騰，342:877)。根据如下条件确定主链构象(i)抗原结合环的长度；和(ii)在抗原结合环和抗体构架中的某些关键位置上的特定残基或残基类型。对环长度和关键残基的分析能够使我们预测由大部分人抗体序列编码的Hl，H2,Ll,L2和L3的主链构象(Chothia辨1992)丄Mo/.历o/.,227:799;Tomlinson等(1995)￡A^(9丄，14:4628;Williams等(1996)J.Mo/.Ao/.，264:220)。尽管H3区在序列，长度和结构方面远不同(因使用D片段)，但使它还构成有限量的短环长度的主链构象，这取决于长度和环和抗体构架上关键位置上存在的特定残基或残基类型(Martin爭(1996)丄A/o/.263:800;Shimi等(1996)F￡^S399:1)。对人抗体序列中侧链多样性的类似分析能够从通过体细胞高度突变生成的模式中分离初级所有组成成分中的序列多样性模式。发现两种模式互补在初级所有组成成分中的多样性集中在抗原结合中心，而体细胞高度突变将多样性传递给在初级所有组成成分中高度保守的周边区(Tomlinson等(1996)丄編.Ao/.,256:813;Ignatovich等(1997)Mo/.Sz'o/，268:69)。这种互补性看起来作为查询序列空间的有效策略发展，从而获得了可在任意指定时间可利用于选择的有限数量的B细胞。因此，首先基于结合位点中心上的多样性从初级所有组成成分中选择抗体。然后保持体细胞高度突变以便在不破坏初级应答过程中建立的有利相互作用的情况下优化周边上的残基。噬菌体展示技术的出现(Sm池(1985)5"c/e"ce,228:1315;Scott和Smith(1990)&,e"ce,249:386;McCafferty等(1990)A^we,348:552)使得在体外从"单罐"文库中选择针对广泛靶抗原的抗体。可以将这些噬菌体-抗体文库分成两类使用采集自人B细胞的重排V基因的天然文库(Marks等(1991)J.M/.5/。/.,222:581;Vaughan等(1996)淑脏AoMc/z.,14:309)或种系V基因片段为体外'重排'(Hoogenboom&Winter(1992)丄A/o/.历o/.,227:381;Nissim等(1994)EA^(9丄，13:692;Griffiths等(1994)五A/5(9丄，13:3245;DeKruif等(1995)丄Mo/.Ao/.,248:97)或合成CDRs掺入单一重排V基因(Barbas等(1992)尸rac.A^/.Jcad.Sc/.L/"&4，89:4457)的合成文库。尽管合成文库有助于克服可能限制由重排V基因构建的噬菌体文库有效大小的天然所有组成成分的内在偏性，但是它们需要使用通常将碱基-对缺失导入装配的V基因的长简并PCR引物。这种高度随机化还可能导致不能正确折叠且由此也为非功能性的抗体生成。此外，从这些文库中选择的抗体难以表达，并且在许多情况中，这些抗体包含构架突变，这些突变在用于人疗法时可以影响抗体免疫原性。在合成文库手段的扩展中，提示(WO97/08320,Morphosys)可以通过合成一组'主基因'预优化人抗体构架，该组'主基因'具有共有构架序列并且掺入显示出可改善折叠和表达的氨基酸取代。然后使用寡核苷酸掺入CDRs的多样性。由于需要产生不会由人免疫系统识别为外源性的人工人抗体，所以在大部分情况中并非相当于任何天然构架的共有构架的应用是这一手段的缺点。此外，由于可能的情况是，CDR多样性也对折叠和/或表达具有作用，所以优选在V基因完全装配后优化折叠和/或表达(并且除去任何移码或终止密码子)。为了这一目的，需要选择系统，它可以消除文库中非功能性或难以折叠/表达的成员，此后使用耙抗原进行筛选。使用现有技术的文库的额外问题在于，因为主链构象为异源性的，所以三维结构模型化是困难的，这是因为合适的高分辨率晶体学数据无法利用。这是H3区的特定问题，其中大部分；来源于天然或合成抗体文库的抗体具有中等长度或长环且由此不能模型化。发明概述本发明的第一个方面提供了从多肽类的所有组成成分中选择结合第一个结合位点上的耙配体和第二个结合位点上的一般配体的功能性多肽类群体的方法，所述一般配体能够结合所有组成成分的结合功能性成员，但与靶配体的特异性无关，该方法包括下列步骤a)使所有组成成分接触一般配体并且选择与之结合的功能性多肽类；和b)使选择的功能性多肽类接触靶配体并且选择结合耙配体的多肽类群体。本发明由此提供了方法，通过该方法，按照如结合一般配体的能力测定的预选择多肽类的所有组成成分，且然后按照结合靶配体的能力用于额外的选择周期。在一个优选的实施方案中，尽管首先使用一般配体选择所有组成成分，但是本领域技术人员显而易见，可以使所有组成成分以相反的顺序接触配体，即在接触一般配体前接触耙配体。本发明允许本领域技术人员从选择的多肽类的所有组成成分中除去那些为非功能性的多肽类，例如，作为导入移码突变，终止密码子，折叠突变体或表达突变体的结果，它们可能基本上不能或不能结合任意的靶配体。这类非-功能性突变体通过用于构建多肽所有组成成分的正常随机化和可变操作步骤产生。同时，本发明允许本领域技术人员为那些属于功能性的，充分折叠的和高度表达的多肽类富集选择的多肽类所有组成成分。优选多肽类的两个或多个亚组通过本发明的方法获自所有组成成分，例如通过使用两种或多种一般配体预筛选所有组成成分或通过使所有组成成分在不同条件下接触一般配体。有利的是，由此获得的多肽类亚组合并成额外的多肽类所有组成成分，可以通过接触靶和/或一般配体对其进一步筛选。优选本发明的文库包含免疫球蛋白超家族的多肽类，诸如抗体多肽类或T-细胞受体多肽类。有利的是，该文库可以包含各免疫球蛋白结构域，诸如抗体的VH或VL结构域或T-细胞受体的Vp或Va结构域。因此，在一个优选的实施方案中，例如，可以使用一般配体各自预筛选VH和VL多肽类的所有组成成分，且然后合并而产生包含VH和VL多肽类的功能性所有组成成分。然后使用靶配体筛选这类所有组成成分，以便分离包含VH和VL结构域和并且具有所需结合特异性的多肽类。在一个有利的实施方案中，为用于免疫球蛋白所有组成成分选择的一般配体为超抗原。超抗原能够结合功能性免疫球蛋白分子或其包含特定主链构象的亚组，而与靶配体特异性无关。或者一般配体可以选自能够结合多肽类一般结构的任意配体，所述多肽类构成任意指定的所有组成成分，诸如抗体自身，金属离子基质，有机化合物，包括蛋白质或肽类等。本发明在第二个方面中提供了文库，其中功能性成员具有一般和靶配体的结合位点。为该目的通过下列方式设计文库例如，构建具有由指定超抗原识别的主链构象的抗体文库，或构建文库，其中基本上所有可能的功能性成员具有可由抗体配体识别的结构。本发明在第三个方面中提供了检测，固定，纯化或免疫沉淀预先按照本发明选择的多肽类所有组成成分中的一个或多个成员的方法，包含使该成员结合一般配体。本发明在第四个方面中提供了包含免疫球蛋白超家族的多肽类所有组成成分的文库，其中所有组成成分中的成员具有已知的主链构象。本发明在第五个方面中提供了从多肽类所有组成成分中选择具有所需一般和/或靶配体结合位点的多肽的方法，包含下列步骤a)表达本发明上述方面的文库；b)使多肽类接触一般和/或靶配体并且选择结合一般和/或耙配体的那些；和c)任选扩增结合一般和/或靶配体的选择的多肽；d)任选重复步骤a)陽c)。有利地生成和维持核酸文库形式的多肽类的所有组成成分。因此，本发明在第六个方面中提供了编码多肽类所有组成成分的核酸文库。本发明在第七个方面中提供了从抗体多肽类的所有组成成分中选择结合靶配体和一般配体的功能性可变域群体的方法，该一般配体能够结合所有组成成分中的结合功能性成员，而与靶配体的特异性无关，该方法包括下列步骤a)使所有组成成分接触所述一般配体并且选择与之结合的功能性可变域；和b)使选择的功能性可变域接触靶配体并且选择结合靶配体的可变域；其中，(i)可变域为重链可变域且一般配体为抗体轻链可变域；或(ii)可变域为轻链可变域且一般配体为抗体重链可变域；且其中任选在(i)中，重链可变域为Camelid可变域(VHH)或来源于Camelid重链抗体(H2抗体)；或任选在(i)和(ii)中，可变域各自为人可变域或来源于人。优选首先使抗体多肽类的所有组成成分接触靶配体且然后接触一般配体。优选一般配体结合可变域所有组成成分的亚组。优选两个或多个亚组选自多肽类的所有组成成分。优选使用两种或多种一般配体，任选两种或多种轻链可变域(就选项i)而言)或两种或多种重链可变域(就选项(ii)而言)进行选择。优选在选择后合并两个或多个亚组以便产生额外的多肽类所有组成成分。优选使多肽类的两种或多种所有组成成分接触一般配体且然后合并由此获得的多肽类亚组。在笫七个方面的一个实施方案中，选择抗体重链可变域群体并且选择抗体轻链可变域群体，且然后合并由此获得的群体。本发明在第八个方面中还提供了从多肽类的所有组成成分中选择结合靶配体和一般配体的功能性T-细胞受体结构域群体的方法，该一般配体能够结合所有组成成分中的功能性成员，而与靶配体的特异性无关，该方法包括下列步骤a)使所有组成成分接触所述一般配体并且选择与之结合的功能性T-细胞受体结构域；和b)使选择的功能性T-细胞受体结构域接触靶配体并且选择结合耙配体的T-细胞受体结构域群体；其中，(i)T-细胞受体结构域为Va结构域且一般配体为T-细胞受体V卩结构域；或(ii)T-细胞结构域为T-细胞受体Vp结构域且一般配体为T-细胞受体Va结构域；且其中任选在(i)中，T-细胞受体Va结构域为来源于Camelid的Camelid结构域；或任选在(i)和(ii)中，T-细胞受体结构域各自为人结构域或来源于人。在第八个方面的一个实施方案中，选择T-细胞受体Va结构域群体并且选择T-细胞受体Vp结构域群体，且然后合并由此获得的群体。本发明在第九个方面中还提供了从抗体多肽类群体中选择至少一种抗体重链可变域的方法，该方法包括a)使所述群体接触抗体轻链可变域；和b)选择至少一种结合轻链可变域的抗体重链可变域。在一个实施方案中，粑抗原用于对抗体多肽类的起始群体进行SLAM(选择的淋巴细胞抗体方法)，以便选择结合靶抗原的抗体多肽类群体；并且将选择的群体用作接触轻链可变域的步骤a)中的抗体多肽类群体。优选在步骤a)前，存在使抗体多肽类接触耙配体并且选择结合靶配体的抗体多肽类的步骤，由此提供步骤a)中使用的所述抗体多肽类群体。优选在步骤b)后，存在使在步骤b)中选择的抗体重链可变域接触把配体并且选择结合耙配体的重链可变域的步骤。优选在步骤b)中选择的重链结构域各自来自下组来源于Camelid的重链可变域；VHH结构域；Nanobody;在44位上具有甘氨酸的VHH;在45位上具有亮氨酸的VHH;在47位上具有色氨酸的VHH;在44位上具有甘氨酸并且在45位上具有亮氨酸的VHH;在44位上具有甘氨酸并且在47位上具有色氨酸的VHH;在45位上具有亮氨酸并且在47位上具有色氨酸的VHH;在44位上具有甘氨酸，在45位上具有亮氨酸并且在47位上具有色氨酸的VH;在103位上具有色氨酸或精氨酸的VHH。优选在步骤b)中选择的重链结构域各自为人源化Camelid或鼠重链可变域或人源化NanobodyTM。优选在步骤b)中选择的重链结构域各自为人重链可变域。链可变域，所述FW2序列与由种系基因序列DPK9编码的FW2相同。优选轻链可变域为Camelid轻链可变域或来源于Camelid。优选步骤a)中的群体由B-细胞群提供。优选B-细胞为外周血淋巴细胞。优选B-细胞分离自已经免疫接种靶抗原的动物。优选B-细胞分离自未免疫接种耙抗原的动物。优选步骤a)中使用的群体由以合成方式重排的抗体基因编码的抗体多肽类的所有组成成分提供。优选步骤a)中使用的群体由包含展示所述抗体多肽类的噬菌体的噬菌体展示文库体。优选步骤a)中使用的群体包含(i)各自包含至少一种未与轻链可变域配对的重链可变域的抗体多肽类；和(ii)各自包含与轻链可变域配对的重链可变域的抗体多肽类。优选步骤a)中使用的群体包含Camelid重链单一可变域(VHH)或NanobodiesTM。优选步骤a)中使用的群体由包含人重链单一可变域(VH)。优选在步骤b)中，选择的抗体重链可变域中的至少一种与蛋白质部分融合或缀合。优选蛋白质部分选自噬菌体外被蛋白、一种或多种抗体结构域、抗体Fc结构域、酶、毒素、标记和效应基团。优选在步骤b)中，选择的抗体重链可变域中的至少一种为抗体部分或抗体片l殳，其选自IgG、Fab、Fab，、F(ab)2、F(ab,)2、scFv、Fv和二硫键键合的Fv。本发明的第九个方面的特别优选的实施方案在该实施方案中，步骤a)中使用的群体由B-细胞群，优选已经分离自免疫接种靶抗原的Camelid(例如美洲驼羊或骆驼)的外周血淋巴细胞提供。在该实施方案中，优选靶抗原选自TNFa、血清清蛋白、冯维勒布兰德因子(vWF)、IgE、干扰素y、EGFR、IgE、MMP12、PDK1和淀粉样蛋白(3(A-(3)的靶配体或附录1中所列的靶标中的任意一种。步骤b)中使用的轻链可变域为人轻链可变域；来源于人；具有FW2序列的轻链可变域，所述FW2序列与由种系基因序列DPK9编码的FW2相同；或Camelid、家兔或小鼠轻链可变域。因此，该实施方案关注来自外周血淋巴细胞群在步骤a)中的应用，其来自使用人轻链可变域(或至少具有人界面区(按照Kabat该区包括44-47位氨基酸)的轻链结构域，即该区通常与人VH/VL配对中的VH结构域分界面)选择的免疫接种的Camelid。本发明的一个方面提供了从Camelid抗体多肽类群体中选择至少一种Camelid抗体VHH结构域的方法，所述Camelid抗体多肽类群体由分离自已经免疫接种耙抗原的Camelid的B-细胞提供，该方法包括a)使所述群体基础抗体轻链可变域；和b)选择至少一种结合轻链可变域的VHH结构域。优选轻链可变域为人轻链可变域。优选将B-细胞提供在多个孔或储器中，其中各孔或储器平均包含一种B-细胞类型。优选在步骤b)中，选择的抗体重链可变域中的至少一种与蛋白质部分融合或缀合。优选蛋白质部分选自噬菌体外被蛋白、一种或多种抗体结构域、抗体Fc结构域、酶、毒素、标记和效应基团。优选在步骤b)中，选择的抗体重链可变域中的至少一种为抗体部分或抗体片段，其选自IgG、Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab，)2、scFv、Fv和二硫键键合的Fv。本发明在第十各方面中提供了分离的抗体多肽，其包含抗体重链可变域或由抗体重链可变域组成，其中多肽可通过本发明第九个方面的方法获得，其中在该方法中的轻链可变域为人轻链可变域且重链可变域来自非-人的哺乳动物。优选抗体多肽的重链可变域来自下组来源于Camelid的重链可变域；VHH结构域；NanobodyTM;在44位上具有甘氨酸的VHH;在45位上具有亮氨酸的VHH;在47位上具有色氨酸的VHH;在44位上具有甘氨酸并且在45位上具有亮氨酸的VHH;在44位上具有甘氨酸并且在47位上具有色氨酸的VHH;在45位上具有亮氨酸并且在47位上具有色氨酸的VHH;在44位上具有甘氨酸，在45位上具有亮氨酸并且在47位上具有色氨酸的VH;在103位上具有色氨酸或精氨酸的VHH。优选将抗体多肽的重链可变域作为CamelidIgG的部分或来源于Camelid的IgG提供。优选将抗体多肽的重链可变域作为人IgG的部分或来源于人的IgG体，并且其中重链可变域在IgG中与不同于用于本发明第九个方面的方法的轻链可变域配对。本发明还提供了抗体多肽的衍生物，其中该衍生物与第十个方面的抗体多肽可变域的CDR3相比具有CDR3突变。本发明还提供了通过第十个方面的抗体多肽的亲和力成熟产生的衍生物。在一个实施方案中的本发明抗体多肽(例如第10或第12个方面)作为药物使用或用于人疾病或疾患的治疗和/或预防。在本发明的方法，应用或抗体多肽的一个实施方案中，重链可变域结合选自下组的靶配体TNFa、血清清蛋白、冯维勒布兰德因子(vWF)、IgE、干扰素Y、EGFR、IgE、MMP12、PDK1和淀粉样蛋白(3(A-卩)的耙配体或附录1中所列的粑标中的任意一种。本发明在第十一个方面中提供了从抗体多肽类群体中选择至少一种抗体轻链可变域的方法，该方法包括a)使所述群体接触抗体重链可变域；和b)选择至少一种结合重链可变域的抗体轻链可变域。优选在步骤a)前，存在使抗体多肽类接触耙配体并且选择结合靶配体的抗体多肽类的步骤，由此提供步骤a)中使用的所述抗体多肽类群体。优选在步骤b)后，存在使在步骤b)中选择的抗体轻链可变域接触耙配体并且选择结合粑配体的轻链可变域的步骤。优选在步骤b)中选择的轻链结构域各自来源于Camelid。优选在步骤b)中选择的轻链结构域为人轻链可变域。优选重链可变域为人重链可变域；来源于人；具有FW2序列的重链可变域，所述FW2序列与种系基因序列DP47编码的FW2相同；或具有与种系基因序列DP47编码的44，45和47位相同的44,45和47位的重链可变域。优选重链可变域为Camelid重链可变域(VHH或VH)或来源于Camelid。优选在步骤a)中的群体由B-细胞群提供。优选B-细胞为外周血淋巴细胞。优选B-细胞分离自已经免疫接种了靶抗原的动物。优选B-细胞分离自未免疫接种靶抗原的动物。优选步骤a)中使用的群体由以合成方式重排的抗体基因编码的抗体多肽类的所有组成成分提供。优选步骤a)中使用的群体由包含展示所述抗体多肽类的噬菌体的噬菌体展示文库提供。优选步骤a)中使用的群体包含(i)各自包含未与重链可变域配对的至少一种轻链可变域的抗体多肽类；和(ii)各自包含与重链可变域配对的轻链可变域的抗体多肽类。优选步骤a)中使用的群体包含人轻链单一可变域(VL)。优选在步骤b)中，选择的抗体轻链可变域中的至少一种与蛋白质部分融合或缀合。优选蛋白质部分选自噬菌体外被蛋白、一种或多种抗体结构域、抗体Fc结构域、酶、毒素、标记和效应基团。优选在步骤b)中，选择的抗体重链可变域中的至少一种为抗体部分或抗体片l殳，其选自IgG、Fab、Fab，、F(ab)2、F(ab，)2、scFv、Fv和二硫键键合的Fv。在第十一个方面的一个实施方案中，靶抗原用于对起始抗体多肽类进行SLAM(选择的淋巴细胞抗体方法)，以便选择结合革巴抗原的抗体多肽类群体；并且将选择的群体用作与重链可变域接触的步骤a)中的抗体多肽类群体。本发明在第十二个方面中提供了分离的抗体多肽，其包含抗体轻链可变域或由抗体轻链可变域组成，其中多肽可通过本发明第十一个方面的方法获得，其中在该方法中的重链可变域为人重链可变域且轻链可变域来自非-人的哺乳动物。优选抗体多肽的轻链可变域来自Camelid。优选将抗体多肽的轻链可变域作为CamelidIgG的部分或来源于Camelid的IgG提供。优选将抗体多肽的轻链可变域作为人IgG的部分或来源于人的IgG提供，并且其中使轻链可变域在IgG中与不同于用于本发明第十一个方面的重链可变域的重链可变域配对。本发明还提供了第十二个方面的抗体多肽的衍生物，其中该衍生物与第十二个方面的多肽可变域的CDR3相比具有CDR3突变。本发明还提供了通过第十二个方面的抗体多肽的亲和力成熟产生的衍生物。本发明在一个方面中提供了多肽，其包含与第10或第12个方面的抗体多肽连接的半衰期延长的部分或衍生物,其中该部分选自PEG;抗体恒定域；抗体Fc区；蛋白或其片段；结合清蛋白的肽或抗体片段、清蛋白片段；新生儿Fc受体；转运；或转运受体。优选多肽为药物或用于人疾病或疾患的治疗和/或预防。优选抗体多肽的可变域结合选自下组的靶配体TNFoc、血清清蛋白、冯维勒布兰德因子(vWF)、IgE、千扰素Y、EGFR、IgE、MMP12、PDK1和淀粉样蛋白(3(A-卩)的耙配体或附录1中所列的把标中的任意一种。在本发明的一个实施方案中，该方法进一步包含产生选择的可变域的突变体或衍生物的步骤。在本发明的一个实施方案中，其中使用B-细胞群，将B-细胞群提供在多个孔或储器中，其中各孔或储器包含单一B-细胞类型。在本发明的一个实施方案中，其中使用B-细胞群，将B-细胞群提供在多个孔或储器中，其中各孔或储器平均包含一种B-细胞类型。在本发明的一个方面中，提供了从包含单一可变域和IgG的抗体多肽类的群体中的抗体单一可变域中分离IgG的方法，该方法包括a)使所述群体接触一般配体；和b)选择结合一般配体的亚群，由此从单一可变域中分离IgG;其中一般配体基因对抗体CH1结构域，轻链恒定域(CL),IgG绞链或抗体轻链可变域的结合特异性。优选一般配体选自蛋白质L,蛋白质L结构域或结合轻链可变域的蛋白质L衍生物；蛋白质G;蛋白质G结构域或结合CH1的蛋白质G衍生物；抗体和抗体片段；affibody;LDL受体结构域；和EGF结构域。优选一般配体选自dAb、NanobodyTM、scFv、Fab、Fab，、F(ab)2、F(ab，)2、scFv、Fv或二硫键键合的Fv。优选可变域为人单一可变域且IgG为人IgG。轻链恒定域(CL)、IgG绞链或抗体轻链可变域。优选一般配体以1微摩尔或1微摩尔以下的亲和力结合抗体CH1结构域、轻链恒定域(CL)、IgG绞链或抗体轻链可变域。优选一般配体以100nM或100nM以下的亲和力结合抗体CHl结构域、轻链恒定域(CL)、IgG绞链或抗体轻链可变域。本发明在第十三各方面中提供了从包含CamelidVHH结构域和IgG的抗体多肽类的群体中的IgG中分离CamelidVHH单一可变域的方法，该方法包4舌a)使所述群体接触一般配体；和b)选择结合一般配体的亚群，由此从IgG中分离单一可变域。优选一般配体选自抗体轻链可变域，抗体和抗体片段。优选一般配体选自dAb、NanobodyTM、scFv、Fab、Fab，、F(ab)2、F(ab')2、scFv、Fv或二硫键键合的Fv。优选一^:配体以lmM或lmM以下的亲和力结合VHH或重链抗体CH2)绞链。优选一般配体以1微摩尔或1微摩尔以下的结合VHH或重链抗体(H2)绞链。优选一般配体以100nM或100nM以下的亲和力结合VHH或重链抗体(H2)绞链。优选抗体多肽群体由B细胞提供。优选可变域为CamelidVHH且IgG为CamelidIgG。优选可变域由Camelid重链(H2)抗体提供。优选标记(labelled)或标记(tagged)—4殳配体。在本发明的方法，抗体多肽，衍生物或应用的一个实施方案中，一般配体为选自附录2a),c),d)或e)的抗体可变域。本发明在第十四个方面中提供了从抗体多肽类的所有组成成分中选择结合耙配体和一般配体的单一可变域的方法，该方法包括下列步骤域^和b)使选择的可变域接触一般配体并且选择结合一般配体的可变域；其中一般配体为选自附录2(c)或(e)的抗体可变域；且其中(i),当选择的可变域为重链可变域时，一般配体为轻链可变域；或(ii)当选择的可变域为轻链可变域时，一般配体为重链可变域。优选抗体多肽类的所有组成成分为重链可变域的所有组成成分,一般配体为轻链可变域。优选抗体多肽类的所有组成成分为轻链可变域的所有组成成分，一般配体为重链可变域。优选该方法包括产生选择的可变域的突变体或衍生物的步骤。优选一般配体结合与选择的可变域相同的耙配体种类。优选一般配体结合与选择的可变域不同的靶配体种类。优选该方法包括下列步骤合并选择的可变域与和一般配体相同的抗体可变域或其衍生物，以便产生基因耙配体结合特异性的产物。29本发明在第十五个方面中提供了生产附录2(c)(i)-(iv)中结合靶配体的抗体或抗体片段衍生物的方法，该方法包括a)使用所述抗体或片段的重链可变域或相同的可变域作为第14个方面的方法中的一般配体，并且其中用于步骤a)中的靶配体为抗体或片段结合的靶配体，由此选择结合靶配体和重链可变域的轻链单一可变结构域；和b)用选择的轻链可变域；相同的轻链可变域或其衍生物取代抗体或片段轻链可变域中的至少一种。本发明在第十六个方面中提供了生产附录2(c)(i)-(iv)中任意相中的多特异性抗体或抗体片段衍生物的方法，该方法包括a)使用所述抗体或片段的重链可变域(或相同的可变域)作为第14个方面方法中的一般配体，并且其中用于步骤a)中的靶配体为不同于抗体或片段结合的耙配体的耙配体，由此选择结合不同靶配体和重链可变域的轻链单一可变域；和b)用选择的轻链可变域；相同的轻链可变域或其衍生物取代抗体或片段轻链可变域中的至少一种，由此产生多特异性产物。优选在第15和第16个方面中，轻链可变域选自人轻链可变域；来源于人的轻链可变域；具有FW2序列的轻链可变域，所述FW2序列与由种系基因序列DPK9编码的FW2相同；Camelid轻链可变域；来源于Camelid的轻链可变域；和人源化Camelid或鼠轻链可变域。本发明在第十七个方面中提供了生产附录2(c)(i)-(iv)中的任意项中结合華巴配体的抗体或抗体片段衍生物的方法，该方法包括a)使用所述抗体或片段的轻链可变域(或相同可变域)作为第14个方面的方法中的一般配体，并且其中用于步骤a)中的耙配体为抗体或片段结合的草巴配体，由此选择结合耙配体和轻链可变域的重链单一可变域；和b)用选择的重链可变域；相同重链可变域或其衍生物取代抗体或片段重链可变域中的至少一种。本发明在笫十八个方面中提供了生产附录2(c)(i)-(iv)中的任意项中的抗体或抗体片段度特异性衍生物的方法，该方法包括a)使用所述抗体或片段的轻链可变域(或相同可变域)作为权利要求94的方法中的一般配体，并且其中用于步骤a)中的靶配体为不同于抗体或片l殳结合的靶配体的靶配体，由此选4奪结合不同耙配体和轻链可变域的重链单一可变域；和b)用选择的重链可变域；相同重链可变域或其衍生物取代抗体或片段重链可变域中的至少一种，由此产生多特异性产物。优选在第17和第18个方面中，重链可变域选自来源于Camelid的重链可变域；VHH结构域；NanobodyTM;在44位上具有甘氨酸的VHH;在45位上具有亮氨酸的VHH;在47位上具有色氨酸的VHH;在44位上具有甘氨酸并且在45位上具有亮氨酸的VHH;在44位上具有甘氨酸并且在47位上具有色氨酸的VHH;在45位上具有亮氨酸并且在47位上具有色氨酸的VHH;在44位上具有甘氨酸，在45位上具有亮氨酸并且在47位上具有色氨酸的VH;在103位上具有色氨酸或精氨酸的VHH;人源化Camelid或鼠重链可变域；人源化NanobodyTM;人重链可变域；来源于人的重链可变域；具有FW2序列的重链可变域，所述FW2序列与种系基因序列DP47编码的FW2相同；或具有与种系基因序列DP47编码的44、45和47位相同的44、45和47位的重链可变域。优选在笫15-18个方面中，a)选择的可变域为重链可变域且抗体或片段的重链可变域各自被选择的重链可变域；相同的重链可变域或其衍生物取代；或b)选择的可变域为轻链可变域且抗体或片段的轻链可变域各自被选择的轻链可变域；相同的轻链可变域或其衍生物取代。本发明还提供了可提供第15-第18个方面中任意一项的方法获得的4汙生物。本发明在第十九个方面中提供了抗体或抗体片段的衍生物，其选自PanorexTM;RituxinTM;ZevalinTM;MylotargTM;CampathTM;Herceptin;ReoPro;Synagis;Xolair;Remicade;Simulect;OKT3TM;Orthoclone;Zenapax;Humira;Bexxar;Raptiva;Antegren;ErbituxTM;和Avastin,它可提供本发明第15-第18个方面中的任意一项获得。本发明在第二十个方面中提供了所述衍生物或产物在人疾病或疾患的治疗和/或预防中的应用。本发明在第二十一个方面中提供了所述衍生物或产物在人疾病或疾患的治疗和/或预防中的应用。本发明在第二十二个方面中提供了所述衍生物或产物在人疾病或疾患的治疗和/或预防中的应用，其中所述疾患为对附录2(c)(i)中抗体或抗体片段所列的疾患。如果本发明涉及VH或VHH—般配体在选择VL结构域或反之亦然中的应用，那么可以通过这类结构域经界面区内在配对有利于选择，例如，相关界面区可以包含VH和VHH结构域(和VL结构域的等效区)的44、45和47位，这类编号遵循Kabat。因此，具有人界面的VL(例如44G、45L和47W)的应用可以用于从文库中选择CamelidVHH结构因此，这选择了VHH结构域中的人-类特征，由此为我们提供了人中有用的VHH产品(例如用于疾病疗法)和/或用于人的相容性产品的进一步研发的有用的主导。附图简述图1:表示表现出广泛天然多样性并且能够接触抗原的人抗体所有组成成分vh和vk区中的位置的棒形图(参见Tomlinson等(1996)/.tWo/.Ao/.,256:813)。在该示意图中显示了H3和L3末端，不过，它们也是高度不同的并且能够接触抗原。尽管人X基因中的序列多样性已经得到充分表征(参见Ignatovich等(1997)丄A/o/.Ao/,268:69)，但是就三维入结构而言，目前几乎没有有关抗原接触的数据存在。图2:构成本发明文库基础的scFv序列。目前存在两种形式的文库"初级"文库，其中18个位置发生改变；和"体细胞"文库，其中12个位置发生改变。显示了6个环区H1，H2,H3,Ll,L2和L3。给根据Kabat定义的CDR区(Kabat等(1991)'Se《we"c^o//rato'朋o//mwwwo/og/ca//她reW,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices)加下划线。图3:使用一般配体蛋白质A和蛋白质选择前后本发明文库中的功能性分析。此处的蛋白质L位于ELISA平板上，scFv上清液与之结合并且使用蛋白质A-HRP检测scFv结合。因此，仅那些能够结合蛋白质A和蛋白质L的scFv产生ELISA信号。图4:在使用牛遍在蛋白，大鼠BIP,牛组蛋白，NIP-BSA,FITC-BSA,人瘦蛋白，人甲状腺球蛋白，BSA,鸡卵溶菌酶，小鼠IgG32和人IgG淘选后选自本发明文库的克隆的序列。在序列上加的下划线表示在相应文库中改变的位置。图5:5a:宿主细胞中由未选择和预选择的"初级，，DVT文库产生的scFv浓度的比较。5b:作为根据已知标准品测定的ELISA标准曲线。图6:来自预选择和未选择的"初级"DVT文库的噬菌体的蛋白质印迹，使用抗-噬菌体pIII抗体探测所述文库以便测定具有scFv的噬菌体百分比。发明详述定义所有组成成分(repertoire)所有组成成分为不同变体的群体，例如在核苷酸序列上不同的核酸变体或在氨基酸序列方面不同的多肽变体。本发明的文库包括多肽类或核酸的所有组成成分。按照本发明设计多肽类的所有组成成分，以便具有一般配体的结合位点和靶配体的结合位点。结合位点可以在分子的相同区内重叠或位于其中，但其特异性不同。生物体本文所用的术语"生物体"意旨所有的细胞生命形式，诸如原核细胞和真核细胞；以及非-细胞的含核酸的本，诸如噬菌体和病毒。功能性本文所用的术语"功能性"意旨具有天然产生的其类型的蛋白质的天然生物活性或任意特异性所需活性的多肽，例如根据下文定义的其结合配体分子的能力判定。"那些"多肽类的实例包括通过其抗原结合部位特异性结合抗原的抗体，结合其特征配体的受体分子(例如T-细胞受体)和结合其底物的酶。为了按照将多肽分类为本发明的功能性，遵循首先必须对其进行适当加工处理和折叠以便保持其总体结构完整性，正如根据也如下文定义的其结合一般配体的能力判定的。为避免疑问，功能性并非与结合靶配体的能力等效。例如，功能性抗-CEA单克隆抗体不能特异性结合靶配体，诸如细菌LPS。然而，因为它能够结合靶配体(即它能够结合CEA,只要CEA为靶配体)，所以将其分类为"功能性"抗体分子并且可以如下所述根据结合一般配体选择。一般而言，非-功能性抗体分子不能结合任何靶配体。一般配体一般配体为结合指定所有组成成分中的大部分功能性成员的配体。因此，相同的一般配体可以结合所有组成成分中的许多成员，而与其靶配体特异性无关(参见下文)。一般而言，存在功能性一般配体结合位点表明所有组成成分成员得到正确表达和折叠。因此，一般配体与其结合位点结合提供了从多肽类的所有组成成分中预选择功能性多肽类的方法。把配体耙配体为所有组成成分中的特异性结合成员或多个成员得以鉴定的配体。如果所有组成成分中的成员为抗体分子，那么靶配体可以为抗原，并且如果所有组成成分中的成员为酶，那么靶配体可以为底物。结合耙配体依赖于如上文一疾痴傳中所述所有组成成分中成员为功能性的，并且依赖于靶配体的结合位点的精确特异性。亚组亚组为所有组成成分的组成部分。就本发明而言，通常的情况是，仅所有组成成分的亚组为功能性的且由此具有功能性一般配体结合位点。此外，还可能的是，仅所有组成成分的功能性成员的部分(明显超过结合指定的耙配体)结合一般配体。能够按照本发明选择这些亚组。可以合并或集合文库亚组以便产生新的按照所需标准预选择的所有组成成分。合并或集合的所有组成成分可以为通过一般配体结合预选择的多肽成员的单一混合物，或可以操作以便合并两个多肽亚组。例如，可以各自预筛选VH和VL多肽类且随后在遗传水平上在单一载体上合并，使得它们作为合并的VH-VL二聚体，诸如scFv得以表达。文库术语文库意旨异源多肽类或核酸的混合物。该文库由具有单一多肽或核酸序列的成员组成。就这一程度而言，义岸与摩^"逸^成为、为同义词。文库成员之间序列差异导致文库中存在的多样性。该文库采用可多肽类或核酸的单一混合物或可以为使用核酸文库转化的生物体或相同的形式，例如细菌、病毒、动物或才直物细月包等。优选各生物体或相同各自仅包含该文库中的一个成员。有利的是，将核酸掺入表达载体，以便能够表达由所述核酸编码的多肽类。因此，在一个优选的方面中，文库可以采用宿主生物体群体的形式，各生物体包含表达载体的一个或多个拷贝，所述表达载体包含可以表达以便产生其相应的多肽成员的核酸形式的文库中的单一成员。因此，宿主生物体群体具有编码遗传上不同的多肽变体的大量所有组成成分的潜能。免疫球蛋白超家族其意旨保持免疫球蛋白(抗体)分子的免疫球蛋白折叠特性的多肽类家族，其包含两个P折叠和通常保守的二硫键。免疫球蛋白超家族中的成员涉及体内细胞和非-细胞相互作用的许多方面，包括在免疫系统中的广泛作用(例如抗体，T-细胞受体分子等)，涉及细胞黏着(例如ICAM分子)和胞内信号传导(例如受体分子，诸如PDGF受体)。本发明适合于所有免疫球蛋白超家族分子，因为其中的变化以类似的方式实现。优选本发明涉及免疫球蛋白(抗体)。主链构象主链构象意旨三维形式的结构的C口骨架痕迹。当考虑到抗体或TCR分子的各高变环时，主链构象与规范结构为同义词。诸如Chothia和Lesk(1987)丄A/o/.S,o/.，196:901和Chothia等(1989)A^we,342:877所述，抗体展示出有限数量的规范结构，其6各高变环中有5个(H1,H2，Ll,L2和L3),不过，在环自身中存在相当的侧链多样性。显示出的精确的规范结构依赖于环的长度和涉及其包装的某些关键残基的个性。更不用说第6个环(H3)在长度和序列方面具有的不同，且由此仅表现出某些短环长度的规范结构(Martin爭(1996)丄Mo/.5/o/.，263:800;Shirai等n996)FE^S丄e"eM,399:1)。在本发明中，所有6个环优选具有规范结构且由此已知完整抗体分子的主链构象。抗体多肽抗体为由B细胞产生并且构成脊推动物宿主免疫防御系统的中心组成部分的免疫球蛋白。本文所用的抗体多肽为多肽，其为修饰或未修饰的抗体或抗体部分。因此，术语抗体多肽包括重链轻链，重链-轻链二聚体，Fab片段，F(ab')2片段，Dab片段或Fv片段，包括单链Fv(scFv)。构建这类抗体分子的方法为本领域众所周知的。超抗原超抗原为大部分为在细菌中表达的毒素形式的抗原，它们在这些分子的常用配体结合位点外部与免疫球蛋白超家族中的成员发生相互作用。葡萄球菌属(Staphylococcal)肠毒素类与T-细胞受体发生相互作用并且具有刺激CD4+T-细胞的作用。抗体的超抗原包括结合IgG恒定区的分子蛋白质G(Bjorck和Kronvall(1984)丄/附mw"o/,133:969;Reis等(1984)丄/mmw"o/.,132:3091),IgG恒定区和VH结构域的蛋白质A(Forsgren和Sjoquist(1966)/mmw"o/.,97:822)和结合VL结构域的蛋白质L(Bjorck(1988)丄/mm柳o/.,140:1994)。本发明的优选实施方案本发明提供了消除多肽文库中的非-功能性或难以折叠/表达的成员(或显著减少其比例)，同时在对"靶配体"的特异性进行选择前富集功能性的，折叠的和充分表达的成员的选择系统。使多肽分子的所有组成成分接触"一般配体"，即具有对所有功能性常见的结构特征的亲和力的蛋白质，例如完全和/或正确折叠的相关类型的蛋白质。注意术语"配体"在涉及用于本发明的分子时广泛术语。本文所用的术语"配体"意旨结合多肽文库中的成员或被它们所结合的任意本体。存在于最初所有组成成分中的缺陷蛋白质中的大量成员难以结合一般配体且由此被消除。这种从文库中选择性除去非-功能性多肽类导致其实际大小明显减小，同时其功能性大小得以维持，其中其质量相应提高。通过结合一般配体保持的多肽类构成了原始所有组成成分的'首先选择的集合，或'亚组'。因此，富集这一'亚组，的最初所有组成成分中功能性的，充分折叠和充分表达的的成员。随后使首先选择的集合或亚组多肽类接触至少一种"粑配体"，该耙配体结合具有指定功能特异性的多肽类。这类靶配体包括，但不限于半数受体/配体对(例如激素或其它细胞-信号传导分子，诸如神经递质及其关连受体)中的各自，细胞黏着分子结合对中的各自，由针对定向于的特定抗体的酶、蛋白质、肽或小有机化合物乃至抗体自身。因此，这类文库的应用在时间和材料方面比常规的文库劳动强度更低并且更经济。此外，与未使用一般配体选择的所有组成成分相比，因为首先选择的集合包含远高于那些不能结合靶配体的比例的能够结合耙配体的分子，所以在使用"靶配体"选择过程中的背景显著降低。本发明还关注组合选择方案。可以使用不同一般和/或靶配体平行或串连相同最初多肽所有组成成分的多重选择。因此，可以首先使用单——般配体选择所有组成成分，且然后随即使用不同靶配体进行平行选择。然后单独或组合使用所得亚组，其中该组合的亚组具有一定范围的靶配体特异性，并且具有单——般配体特异性。或者，可以首先使用单一靶配体选择所有组成成分，且然后随即使用不同一般配体进行平行选择。然后单独或组合使用所得亚组，其中该组合的亚组具有一定范围的一般配体特异性，并且具有单一靶配体特异性。还关注更^r细方案的应用。例如，可以^使用两种不同的一^:配体对最初所有组成成分进行两个循环的选择，随后使用靶配体进行选择。该过程产生一个亚组，其中所有成员既结合一般配体，又结合靶配体。或者，如果使用两种一般配体对最初所有组成成分进行平行选择并且合并所得亚组且然后使用耙配体进行选择，那么所得亚组结合两种一般配体和耙配体中的至少一种。合并或集合的所有组成成分可以为所述亚组的单一混合物或可以才乘作以{更以物理方式连接亚组。例如，可以通过结合两种不同的一般配体平行地各自选择VH和VL多肽类，且随后以遗传水平合并在单一载体上，使得它们作为合并的VH-VL得以表达。然后可以对耙配体选择这种所有组成成分，使得选择的成员既能够结合一般配体，又能够结合靶配体。本发明包括通过上文广泛描述的方法选择的或可通过上述方法选择的功能性多肽类的文库，以及编码可以用于按照这些方法进行的选择的多肽分子(优选包含第一耙配体结合位点和第二一般配体结合位点的分子)的核酸文库。此外，本发明提供了检测，固定，纯化或免疫沉淀使用本发明的一般或靶配体选择的功能性多肽类所有组成成分中的一个或多个成员的方法。本发明特别适合于富集免疫球蛋白超家族中的分子文库。这在有关生成抗体和T-细胞受体群体方面是特别确切的，所述抗体和T-细胞受体为功能性的并且具有所需的特异性，因为这是用于诊断，治疗或预防操作所需的。为了达到这一目的，本发明提供了抗体和T-细胞受体文库，其中所有的成员均具有天然构架和已知主链构象的环，并且本发明提供了起始序列的有用诱变和由此生成的功能性变体的随后选择的策略。这类多肽文库可以包含VH或Vp结构域，或可选择的是，它可以包含VL或Va结构域乃至两种VH或Vp和VL或Va结构域。在本领域中存在对改善的抗体或T-细胞受体分子文库的需求。例如，尽管在生成"单罐"噬菌体-抗体文库中存在进展，但是仍然存在几个问题。使用采集自人B细胞的重排V基因的天然文库(Marks等(1991)7.A/o/.5/o/.，222:581;Vaughan等(1996)A^m^Ao&c/z.,14:309)因体内B细胞的正和负选择而高度偏移。这一结果可以限制由重排V基因构建的噬菌体文库的有效大小。此外，来源于天然文库的克隆不变地包含构架突变，在用于人疗法时，这些突变可以影响抗体免疫原性。合成文库0^00经6111300111&Winter(1992)丄M/.Ao/.,227:381;Barbas等(1992)尸rac.Ato/.爿cm/.Sc.t/&4,89:4457;Nissim等(1994)EA^(9J.,13:692;Griffiths等(1994)EMB(9J.，13:3245;DeKruif等(1995)J.Mo/.Ao/.,248:97)可以克服偏性问题，但它们需要使用长的简并PCR引物，这些引物通常将碱基-对导入装配的V基因。这种高度的随机化还可以导致不能正确折叠且由此还为非功能性的抗体生成。在许多情况中，可能的情况是，这些非-功能性成员在数目上超过文库中的功能性成员。尽管可以通过使用共有构架序列合成一组'主基因'并且通过掺入所示的氨基酸取代来改善折叠和表达而预优化构架的折叠和/或表达(W097/08320,Morphosys)，但是仍然存在免疫原性的问题，因为在大部分情况中，共有序列并不相当于任何天然构架。此外，由于CDR多样性也基因折叠和/或表达作用是可能的，所以在完全装配V基因后可优先优化折叠和/或表达(并且除去任何移码或终止密码子)。使用现存文库的另一个问题在于，因为主链构象为异源的，所以三维结构的模型化是困难的，因为无法获得合适的高分辨率晶体学数据。这是H3区的具体问题，其中大部分来源于天然或合成抗体文库的抗体具有中等长度或长环且由此不能模型化。使用现存文库的另一个问题在于对用于检测表达的抗体片段的附加表位(诸如myc、FLAG或HIS标记)的依赖。因为它们通常位于抗体片段的N或C末端上，所以它们趋向易于发生蛋白酶剪切。超抗原，诸如蛋白质A和蛋白质可以用于通过结合折叠结构域自身而检测表达的抗体片段，但因为它们为VH和VL家族特异性所以在任何现存抗体文库中，仅相对少量成员会结合这些试剂之一且甚至较少比例结合它们两者。为了这一目的，需要拥有选择系统，该系统可以消除文库中非-功能性或难以折叠/表达的成员(或减少其比例)，此后对靶可以进行选择，同时富集其中能够结合一般配体，诸如超抗原蛋白质A和蛋白质L的功能性的，折叠的和充分表达的所有成员。此外，有利的是构建抗体文库，其中所有成员具有天然构架并且具有具备已知主链构象的环。本发明由此提供了方法，通过该方法可以选择多肽所有组成成分以便除去非-功能性成员。这导致实际的文库大小显著减小(且文库质量相应增加)，但不会减小功能性文库大小。本发明还提供了生成新的多肽所有组成成分的方法，其中所有功能性成员能够结合指定的一般配体。相同的一般配体可以用于随后所有组成成分中的任意一个或多个成员的检测、固定、纯化或免疫沉淀。任意'纯的，或'免疫，抗体所有组成成分可以用于本发明，以便富集功能性成员和/或富集结合指定的一般配体或多种配体的成员。实际上，由于仅较小百分比的所有人种系VH片段以高亲和力结合蛋白质A，并且仅较小百分比的所有人种系VL片段以高亲和力结合蛋白质L,这些超抗原是高度有利的。或者，通过使用附加表位预选择能够从合成文库中除去非-功能性变体。易于预选择的文库包括，但不限于由Marks等(1991)J.Mo/.,222:581和Vaughan等(1996)A^we，14:309所述类型的体内重排的V基因组成的文库；合成文库，其中种系V基因片段在体外'重排'(Hoogenboom&Winter(1992)丄A/o/.AW.,227:381;Nissim等(1994)￡A^OJ.,13:692;Griffiths等(1994)五Affi(9J.,13:3245;DeKruif等(1995)A^/.Ao/.,248:97)或将其中合成CDRs掺入单一重排的V基因(Barbas等(1992)尸rac.A^/.jcat/.Scz.89:4457)或掺入多个主构架(W097/08320,Morphosys)。本发明多肽类的选择一旦生成了变体的多肽类集合，就施用本发明的选择。两种广泛的选择操作步骤基于一般和靶配体所施用的顺序；有关这些方案的组合变化形式包括在指定选择步骤中使用多个一般和/或靶配体。当使用组合方案时，例如，可以使多肽分子即刻或各自单独串连地集合接触几种耙配体；在后一种情况中，可以单独保存所得的选择的多肽类集合，或收集它们自身。可以将这些选择方案概括如下a.选择搡作l-.使用一般配体的初级多肽选择39为了除去文库中的非-功能性成员，选择一般配体，使得一般配体仅由功能性分子结合。例如，一般配体可以为金属离子，抗体(单克隆抗体或抗体多克隆混合物形式)，半数酶/配体复合物或有机物；注意这些类型中的任意种的配体另外或可选择地用作本发明的靶配体。在下文中详细讨论了抗体产生和金属亲和色谱法。实际上，在文库成员上的这些配体结合位点(例如肽标记或超抗原结合位点)具有恒定结构或序列，该结构在非-功能性成员中易于不存在或改变。就抗体文库而言，该方法具有从仅那些具有指定超抗原或单克隆抗体的结合位点的功能性成员的文库中选择的应用；这类手段用于从天然和合成集合中选择功能性抗体多肽类。超抗原蛋白质A和/或蛋白质L在本发明中具有作为选择抗体所有组成成分的一般配体的应用，因为它们分别正确结合折叠的VH和VL结构域(属于某些VH和VL家族)，而与靶配体结合位点的序列和结构无关。此外，蛋白质A或另一种超抗原蛋白质G具有作为一般配体的应用，所述一般配体可通过结合抗体的重链恒定域选择折叠和/或表达。抗-k和抗-X抗体也具有在选择轻链恒定域中的应用。抗体或其它结合蛋白，诸如蛋白质A的小有机分子才莫拟物(Li等(1998)A^w^Ao&c/z.,16:190)也是有用的。当使用这一选择操作时，一般配体因其确切的性质而能够结合预选择的所有组成成分中的所有功能性成员；因此，该一般配体(或其某些缀合物)可以用于检测，固定，纯化或免疫沉淀来自所有组成成分的任意成员或成员群体(无论是否通过结合指定靶配体选择，如下所述)。可以通过下文讨论的有关测试抗体选择配体在本发明中的应用的技术进行通过免疫测定技术的蛋白质检测和对本发明所有组成成分的成员多肽类的免疫沉淀(参见"Antibodyforuseasligandsinpolypeptideselection")。通过所有组成成分多肽成员与本发明一般或靶配体的特异性结合进行固定，所述本发明一般或靶配体自身与固相或半固相支持体连接，诸如滤膜(例如硝化纤维或尼龙滤膜)或色谱支持体(包括，但不限于纤维素，聚合物，树脂或二氧化硅支持体)；可以使用本领域技术人员公知的化学交联剂中的任意成员使成员多肽与一般或靶配体进行共价结合。在技术亲和色语支持体上的固定如下所述(参见"Metallicligandsasusefortheselectionofpolypeptides")。纯化可以包含这些技术中的任意种或其组合，特别是免疫沉淀和通过本领域技术人员众所周知方法进4亍的色i普。使用这一手段，可以使用多种一般配体交替进行选择，以便生成所有组成成分，其中所有成员单独平行地结合两种或多种一般配体，以便随后可以合并亚组(就此而言，预选择的所有组成成分中的成员结合一般配中的至少一种)或随后被分别掺入相同的多肽链，由此在大功能性文库中，所有成员能够结合预选择过程中使用的所有一般配体。例如，可以使用结合抗体分子的重链和轻链的不同一般配体(参见下文)从一种或多种文库中选择亚组，且任何合并成重链/轻链文库，其中，例如通过使用单链Fv背景中的VH和VL结构域使重链和轻链非-共价结合或共价结合。使用耙配体的二次多肽选择在使用一般配体的选择步骤后，筛选文库以便鉴定结合靶配体的成员。因为在使用一般配体选择后富集功能性多肽类，所以有利的是在使用靶配体选择过程中减少非特异性("背景")。此外，由于使用一般配体的选择使实际文库大小产生显著减小(和相应的文库质量提高)，而不会减小功能性文库大小，所以较小的所有组成成分应引起与较大起始所有组成成分(包含许多非-功能性和难以折叠/表达的成员)相同的靶配体特异性和亲和力多样性。一种或多种耙配体可以用于从使用一般配体生成的首次选择的多肽集合中选择多肽类。在两种或多种靶配体用于生成许多不同亚组的情况中，可以将这些亚中的两种或多种合并成单一的更复杂的亚组。单——般配体能够结合所得合并亚组中的每一成员；然而，指定的靶配体仅结合亚组的文库成员。b.选择操作2:使用耙配体的所有组成成分成员的最初选择此处，在使用一般配体选择;i:进行使用靶配体的选择。显然，相同组的多肽类可以由任一方案产生，只要这类结果是理想的。使用这一手段，可以平行或通过混合用于选择的靶配体进行使用多种靶配体的选择。如果平行进行，那么，如果需要，可以合并所得亚组。使用一般配体的二次多肽选择然后可以使用一种或多种一般配体进行随后的靶配体结合亚组选择。尽管这并非功能的选择，但是由于能够结合靶配体的所有组成成分成员具有确定的功能性，所以它能够成为结合分离的不同一般配体的亚组。因此，可以用一种一般配体或用两种或多种一^1配体选择耙配体选择的群体。在此情况中，可以交替使用一般配体以便生成所有组成成分，其中所以成员结合或单独平行地结合靶配体和两种或多种一般配体，以便生成不同的(单可能是重叠)结合靶配体和不同一般配体的亚组。然后可以合并它们(就此而言，成员结合一般配体中的至少一种)。免疫球蛋白-家族多肽文库成员的选择蛋白超家族分子，特别是抗体多肽^或T-细胞受体多肽类。就^体而言，预计本发明的方法可以适合于本领域中公知的现存抗体文库中的任意种(无论是天然的还是合成的)或适合于使用一般配体具体设计的抗体文库(参见下文)。本发明文库的构建a.主链构象的选择免疫球蛋白超家族中的成员均共有其多肽链的类似折叠。例如，尽管抗体在其基本序列方面非常不同，但是序列对比和晶体结构已经揭示出，与预计的相反，抗体的6个抗原结合环中的5个(H1，H2，Ll,L2和L3)采用了有限数量的主链构象或规范结构(Chothia和Lesk(1987),参见上文；Chothia等(1989),参见上文)。对环长度和关键残基的分析由此能够预测在大部分人抗体中发现的HI,H2,Ll,L2和L3的主链构象(Chothia等(1992)，参见上文；Tomlinson等(1995),参见上文；Williams等(1996),参见上文)。尽管H3区在序列，长度和结构方面远不同(因D片段的应用所致)，但是它也形成用于短环长度的有限数量的主链构象，这取决于特定残基或残基类型的长度和存在，在环上的关键位置和抗体构架(Martin等(1996),参见上文；Shirai等(1996),参见上文)。按照本发明设计抗体多肽类文库，其中选择一定的环长度和关键残基以确保已知成员的主链构象。有利的是，它们为实际发现的免疫球蛋白超家族分子的确切构象，从而将它们为如上所述非功能性的机会降至最低限度。种系V基因片段用作构建抗体或T-细胞受体文库的一种合适的基础构架；其它序列也是有用的。变化可以以低频率发生，使得少量功能性成员可以具有改变的主链构象，但这不会影响其功能。规范结构原理也应用于本发明，以便评价由抗体编码的不同主链构象中的成员，从而预测基于抗体序列的主链构象并且选择用于不影响规范结构的多样化的残基。目前已知，在人VK结构域中，Ll环可以采用4种规范结构之一，L2环具有单一规范结构且90%的人Vk結枸域采用4或5种用于L3环的规范结构之一(Tomlinson等(1995),参见上文)；因此，在单独的VK结构域中，不同规范结构可以合并成一定范围的不同主链构象。由于V、结构域编码不同范围的Ll,L2和L3环的规范构象且Vk和V、结构域可以与可编码Hl和H2环的几种规范结构的任意VH结构域配对，所以度这5种环观察到的规范结构组合数量极大。这意味着主链构象中产生多样性对产生广泛的结合特异性而言可能是必不可少的。然而，与预测的相反，通过构建基于单一已知主链构象的抗体文库，发现在主链构象中的多样性并非生成可主要靶向所有抗原的足够多样性所需的。甚至更令人意外的是，单一主链构象不必为共有结构-单一天然存在的构象可以用作完整文库的基础。因此，本发明在一个优选的方面中提供了文库，其中的成员编码单一已知的主链构象。然而，应理解可以发生偶然的变化，使得少量功能性成员可以具有可选择的可能是未知的主链构象。选择的单一主链构象优选在所述免疫球蛋白超家族类型分子中是常规的。构象在观察到大量天然存在的分子采用它时为常规的。因此，在本发明的一个优选的方面中，单独考虑天然存在的免疫球蛋白超家族分子的各结合环的不同主链构象，且然后选择具有用于不同环的所需主链构象组合的天然存在的免疫球蛋白超家族。如果无一可利用，那么可以选择最接近的等效物。因为现有技术的免疫球蛋白-家族多肽文库的缺陷在于许多成员具有非天然构架或包含构架突变(参见上文)，所以就抗体或T-细胞受体而言，优选通过选择编码所需主链构象的种系基因片段生成用于不同环的主链构象的所需组合。更优选频繁表达选择的种系基因片段并且最优选它们为最频繁表达的。因此。在设计抗体文库中，可以单独考虑6个抗原结合环各自的不同主链构象的发生率。就H1、H2、Ll、L2和L3而言，选择由天然存在分子的20%-100%的抗原结合环采用的指定构象。一般而言，其观察到的发生率高于35%(即35%-100%),并且实际上，高于50%乃至高于65%。因为大部分H3环不具有规范结构，所以优先选择在确实展示出规范结构的那些环中为常规的主链构象。就各环而言，由此选择大部分通常在天然所有组成成分中观察到的构象。在人抗体中，各环的最常见的规范结构(CS)如下Hl-CS1(79%的表达的所有组成成分)；H2画CS3(46%);VJ勺Ll画CS2(39%);L2-CS1(100%);Vk的L3-CS1(36%),计算推定K:人之比为70:30，Hood等(1967)CoW印n"g//a^or0^"A48:133)。就具有规范结构的H3环而言，具有残基94到残基101的盐-桥的7个残基的CDR3长度(Kabat等(1991)iS^wewceso//rc^e/;wo//wmwwo/og/ca//爐reW,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices)显然最为常见。在EMBL数据文库中存在至少16种具有所需H3长度和关键残基的人抗体序列以便构成这种构象，并且在蛋白质数据库中存在至少两种可以用作抗体模型化基础的晶体结构(2cgr和ltet)。最频繁表达的种系基因片段，即这种规范结构的组合为VH片段3-23(DP-47),JH片段JH4b，Vk片段02/012(DPK9)和JK片段JK1。这些片段由此可以作为构建具有所需单一主链构象的文库的基础组合使用。或者，将天然存在的主链构象组合用作选择单一主链构象的基础，而不是基于分离中结合环各自的天然存在的不同主链构象选择单一主链构象。就抗体而言，例如，可以确定抗原结合环中任意两种，三种，四种，五种或所有6种的天然存在的规范结构组合。此处，优选选择的构象为天然存在的抗体中常见的并且最优选在天然所有组成成分中最频繁观察到的。因此，在人抗体中，例如，当考虑到五种抗原结合环Hl,H2,Ll,L2和L3的天然组合时，确定最频繁的规范结构的组合且然后与H3环的最常见构象合并，作为选择单一主链构象的基础。b.规范序列的多样化由于选择了几种已知的主链构象，或优选单一已知的主链构象，所以通过改变分子的结合位点以便生成具有结构和/或功能多样性的所有组成成分来构建本发明的文库。这意味着生成变体，使得它们在其结构和/或其功能方面具有足够的多样性，使得它们能够提供一定范围的活性。例如，如果所述多肽类细胞-表面受体，那么它们可以具有多样的靶配体结合特异性。一般通过在一个或多个位置上改变选择的分子产生所需的多样性。可以随机选择或优先选择改变的位置。然后可以通过随机化进行改变，在此过程中，用天然或合成的氨基酸或其类似物取代固有的氨基酸，从而产生大量变体或通过用确定亚组的氨基酸取代固有的氨基酸，从而产生更有限数量的变体。已经报导了引入这类多样性的各种方法。易错PCR(Hawkins等(1992)M/.編.,226:889),化学诱变(Deng等(1994)丄C/z缀,269:9533)或细菌增变抹(Low等(1996)丄Mo/.Ao/.,260:359)可以用于将随机突变导入编码分子的基因。使选择的位置突变的方法也为本领域众所周知的并且包括使用错配的寡核苷酸或简并寡核普酸，其中使用或不使用PCR。例如，已经通过使突变靶向抗原结合环生成了几种合成抗体文库。已经使人破伤风类毒素-结合Fab的H3区随机化而产生了一定范围的新结合特异性(Barbas等(1992),参见上文)。已经使随机或半-随机H3和L3区附加于种系V基因片段上而产生具有未突变的构架区的大文库(Hoogenboom和Winter(1992)，参见上文；Nissim等(1994)，参见上文；Griffiths等(1994),参见上文；DeKruif等(1995),参见上文)。已经使这类多样化扩展以便包括某些或全部其它抗原结合环(Crameri等(1996)Mm^eA^ed，2:100;Riechmann等(1995)5/o/7fec/mo/ogy,13:475;Morphosys,WO97/08320,参见上文)。由于环随机化具有生成约10"个以上单独的H3结构和类似大量的其它五种环的变体的潜能，所以使用目前的转化技术乃至通过使用不含细胞的相同产生代表所有可能组合的文库并非切实可行。例如，在迄今为止构建的最大文库之一中，产生了6x101()个不同的抗体，这仅为这种设计的文库的可能多样性的部分(Griffiths等(1994)，参见上文)。除了除去非-功能性成员和使用单一已知的主链构象外，本发明还通过仅使那些直接设计产生或改变分子的所需功能的残基多样化而解决了这些限制。就许多分子而言，功能为结合靶配体且由此多样性应集中于耙配体结合位点，同时避免改变对分子总体包装或维持选择的主链构象而言决定性的残基；因此，本发明提供了文库，其中改变的选择位置可以为那些构成靶配体结合位点的位置。在应用于抗体时规范序列的多样化就抗体文库而言，靶配体的结合位点最常见的为抗原结合部位。因此，在非常优选的方面中，本发明提供了抗体文库，其中仅那些抗原结合部位上的残基改变。这些残基在人抗体所有组成成分中极其不同，并且已知允许接触高分辨率抗体/抗原复合物。例如，在L2中已知50和53位在天然存在的抗体中不同并且观察到允许接触抗原。相反，常规的手段使相应的Kabat等定义的互补决定区(CDR1)中的所有残基多样化(1991,参见上文)，本发明文库中两种多样化相比有约七种残基。这代表了产生一定范围的抗原结合特异性所需的功能多样性方面的显著改善。实际上，抗体多样性为两种过程的结果种系V,D和J基因片段的体细胞重组而生成纯的初级所有组成成分(所谓的种系和体细胞重组)；和所得重排V基因的体细胞高度突变。分析人抗体序列已经证实初级所有组成成分中的多样性集中在抗原结合部位的中心上，而体细胞高度突变将多样性传递至在初级所有组成成分中高度保守的抗原结合部位的周边上的区(参见Tomlinson等(1996),参见上文)。这种互补性可能作为查询序列空间的有效策略发展，并且尽管对抗体而言显而易见是唯一的，但是它易于适合于本发明的其它多肽所有组成成分。按照本发明，改变的残基为构成靶配体的结合位点的那些的亚组。如果需要，靶配体结合位点中不同(包括重叠)亚组的残基在选择构成中的不同阶段多样化。就抗体所有组成成分而言，本发明的两-步法于人免疫系统中抗体成熟类似。产生最初的'纯，的所有组成成分，而抗原结合部位中残基中的某些，但并非全部多样化。在本文上下文中使用的术语"纯"意旨不具有预定靶配体的抗体分子。这些分子类似于由未进行免疫多样化的个体免疫球蛋白基因编码的那些，就此而言，使用胎儿和新生儿个体，其免疫系统尚未受到各种抗原刺激物的攻击。然后对一定范围的抗原46选择该所有组成成分。如果需要，随后在最初所有组成成分中多样化的区外部导入额外的多样性。可以选择改变功能，特异性或亲和力的这种成熟的所有组成成分。本发明提供了抗体的两种不同的纯所有组成成分，其中抗原结合部位中的残基中的某些或全部发生改变。"初级"文库模拟天然初级所有组成成分，其中多样性限于在抗原结合部位中心上的残基，它们在种系V基因片段中不同(种系多样性)或在重组过程中多样化(连接多样性)。那些多样化的残基包括，但不限于H50,H52,H52a,H53,H55,H56,H58,H95,H96，H97，H98,L50,L53,L91,L92，L93，L94和L96。在"体细胞"文库中，多样性限于在重组过程中多样化(连接多样性)或发生高度体细胞突变的残基)。那些多样化的残基包括，但不限于H31，H33,H35,H95,H96,H97,H98,L30，L31,L32,L34和L96。已知上述作为适合于这些文库中多样化的所有残基可接触一种或多种抗体-抗原复合物。由于在两种文库中，并非所有的抗原结合部位中的残基改变，所以在选择过程中，通过改变剩余的残基掺入额外的多样性，只要需要如此。对本领域技术人员而言显而易见的是任意这些残基的任意亚组(或包含抗原结合部位的额外残基)可以用于最初和/或随后的抗原结合部位多样化。在构建本发明文库中，一般通过改变指定多肽序列的编码序列在核酸水平上实现选择位置的多样化，使得可以将可能的氨基酸数量(所有20种或其亚组)引入该位置。使用IUPAC命名法，最通用的密码子为编码所有的氨基酸的NNK以及TAG终止密码子。优选使用NNK密码子，以便引入所需的多样性。实现同一目的的其它密码子也是有用的，包括NNN密码子，它产生额外的终止密码子TGA和TAA。人抗体抗原结合部位中的侧链多样性特征为有利于某些氨基酸残基的显著偏性。如果总计VH，Vk和V、区各自中的10个最具变化的位置的氨基酸组成，那么76%以上的侧链多样性仅来源于7种不同的残基，它们是丝氨酸(24%)，酪氨酸(14%),天冬酰胺(11%)，甘氨酸(9%)，丙氨酸(7°/。)，天冬氨酸(6%)和苏氨酸(6%)。这种对亲水性残基和少量可以提供主链灵活性的偏性可能反映出表面的进化，所述表面易于结合广泛的抗原并且有助于解释初级所有组成成分中抗体的所需混杂性。由于优选模拟这种氨基酸分布，所以本发明提供了文库，其中在改变位置上的氨基酸分布模拟在抗体抗原结合部位中观察到的氨基酸分布。这类在允许对一定范围靶配体选择某些多肽类(并非只是抗体多肽类)的氨基酸取代中的偏性易于应用于本发明任意的多肽所有组成成分。存在各种用于使改变位置上的氨基酸分布偏移的方法(包括使用三核苦酸诱变，WO97/08320,Morphosys,参见上文)，其中因合成的便利性而优选的方法为使用成员的简并密码子。通过比较由所以简并密码子组合编码的氨基酸分布型(使用在每一位置上等比例的单，双，三和四重简并性)与天然氨基酸的应用，能够计算最具代表性的密码子。密码子(AGT)(AGC)T,(AGT)(AGC)C和(AGT)(AGC)(CT)—即分别使用IUPAC命名法的DVT,DVC和DVY-为最接近所需氨基酸分布型它们编码22%的丝氨酸和11%的酪氨酸，天冬酰胺，甘氨酸，丙氨酸，天冬氨酸，苏氨酸和半胱氨酸。因此，优选使用多样化位置各自上的DVT,DVC或DVY密码子构建文库。如上所述，构成本发明抗体文库的多肽类可以为完整的抗体或其片段，诸如Fab、F(ab')2、Fv或scFv片段或单独的VH或VL结构域，其中的任意种为修饰或未修饰的。其中单链Fv片段或scFvs具有特定的应用。ScFv片段和其它抗体多肽类可靠地通过本领域众所周知的抗体改造方法生成。通过使用编码适当设计的连接肽，诸如(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3或等效的连接肽的寡核苷酸连接VH和VL基因构成scFv。接头按照VH-接头-VL或VL-接头-VH的次序桥连第一个V区的C-末端和第二个V区的N-末端。scFv的结合位点主要可以可靠地再现相应完整抗体的特异性，并且反之亦然。构建Fv,Fab和F(ab')2片段和嵌合抗体分子的类似技术未本领域众所周知的。当表达Fv片段时，应谨慎考虑以确保正确的链折叠和连接。就Fab和F(ab')2片段而言，将VH和VL多肽类与可以分离自重排基因，种系C基因或由有关V区片段的抗体序列数据合成的恒定区片段合并。本发明的文库可以未VH或VL文库。因此，可以构建包含单一VH和VL结构域的单独文库，并且它们任选分别包括CH或Cl結枸域，/人而生成Dab分子。c.本发明的文库载体系统本发明的文库可以用于使一般和/或靶配体直接筛选或用于包括遗传展示包装的选择方案。可以如上所述直接将细菌噬菌体入表达系统作为噬斑筛选或作为溶素原菌落直接筛选Huse等(1989jS"ewce,246:1275;Caton和Koprowski(1990)尸rac.Ato/.」c^f."S.A，87;Mullinax等(1990)A^/.爿c"d".S.爿二，87:8095;Persson等(1991)尸rac.Ato/.爿cat/."S.A，88:2432)并且它们在本发明中是有用的。尽管这类表达系统可以用于筛选达106个不同成员的文库，^f旦是它们实际上并不适合于筛选较大的数量(大于106个成员)。其它筛选系统依赖于例如文库成员的直接化学合成。一种早期的方法包括一组针或杆形肽类，诸如WO84/03564中所述。涉及在珠上的肽合成的类似方法描述在美国专利US4,631,211中，该方法形成肽文库，其中珠各自为各文库成员，并且相关的方法描述在WO92/00091中。基于珠的方法的显著改进包括使用唯一的鉴定标记，诸如寡核苷酸标记每一珠，以便有利于各文库成员的氨基酸序列的鉴定。这些改进的基于珠的方法描述下WO93/06121中。另一种化学合成方法包括按照将不同文库成员(例如唯一的肽序列)置于阵列中分散的预定位置上的方式在表面上合成肽(或素拟肽)的阵列。根据阵列中的空间位置确定各文库成员的身份。测定预定分子(例此基于i间位置鉴定反应性文库成员的序列。这些方法描述在美国专利US5,143,854;WO90/15070和WO92/10092;Fodor等(1991)Sc/e"ce，251:767;Dower和Fodor(199i;M肌她t/.CTz，.，26:271中。在本发明文库构建中特别有用的是选择展示系统，它们能够使核酸与它所表达的多肽连接。本文所用的选择展示系统为允许通过适当展示方式根据结合一般和/或靶配体选择文库中各成员的系统。任意的选择展示系统可以与本发明文库联用。用于分离大文库中所需成员的选择方案为本领域中公知的，以通过噬菌体展示技术为典型。已经证实这类系统，其中不同肽序列展示在丝状噬菌体表面上(Scott和Smith(1990),参见上文)，可用于生成抗体片段(和编码它们的核苷酸序列)的文库，以便结合靶抗原的特异性抗体片段的体外选择和扩增。编码VH和VL区的核苷酸序列与编码前导信号的基因片段连接，所述49前导信号使它们定向于大肠杆菌(五.CO/0周质空间，且作为结果，所得抗体片段展示在噬菌体表面上,一般作为与噬菌体外被蛋白(例如pin或pvm)的融合体。或者，抗体片段展示入噬菌体衣壳(噬菌体)夕卜部上。基于噬菌体的展示系统的优点在于，因为它们为生物系统，所以可以单纯通过使在细菌细胞中包含选择的文库成员的噬菌体生长扩增选择的文库成员。此外，由于表面多肽文库成员的核苷酸序列包含在噬菌体或噬菌粒载体上，所以测序，表达和随后的遗传操作相对直接。构建噬菌体抗体展示文库和入噬菌体表达文库的方法为本领域众所周知的(McCafferty等(1990)，参见上文；Kang等(1991)淑/.」cat/."S丄88:4363;Clackson等(1991)胸訓，352:624;Lowman等(1991)Aoc/ze加W^,30:10832;Burton等(1991)尸rac.iVa".爿cat/.Sc/88:10134;Hoogenboom等(1991)NucleicAcidsRes.,19:4133;Chang等(1991)丄/mmw朋/.，147:3610;Breitling等(1991)104:147;Marks等(1991),参见上文；Barbas等(1992),参见上文；Hawkins和Winter(1992)丄/mmw"o/.,22:867;Marks等，1992，J.Ao/.CAem.,267:16007;Lerner等(1992)258:1313,将这些文献引入本文作为参考)。一种特别有利的手段为使用scFv噬菌体-文库(Huston等.，1988,Proc.Natl.Acad.SciU.S.A.,85:5879-5883;Chaudhary等(1990)Proc.Natl.Acad.SciU.S.A.,87:1066-1070;McCafferty等(1990),参见上文；Clackson等(1991),参见上文；Marks等(1991),参见上文；Chiswell等(1992)TrendsBiotech.,10:80;Marks等(1992),参见上文)。已经描述了在噬菌体外被蛋白上展示的scFv文库的各种实施方案。例如，噬菌体展示手段的精华如WO96/06213和WO92/01047(MedicalResearchCouncil等)和WO97/08320(Morphosys,参见上文)中所述，将这些文献引入本文作为参考。用于生成多肽类或核苷酸文库的其它系统包括使用不含细胞的用于体外合成文库成员的酶促器。在一种方法中，通过对靶配体选择的交替循环和PCR扩增选择RNA分子(Tuerk和Gold(1990)Scze"ce,249:505;Ellington和Szostak(1990)A^we,346:818)。类似的技术可以用于鉴定结合预定的人转录因子的DNA序列(Thiesen和Bach(1990)M/c/e/cfAi^y.，18:3203;Beaudry和Joyce(1992)257:635;WO92/05258和W092/14843)。按照类似的发方式，体外翻译可以用于合成多肽类作为生成大文库的方法。这些一般包含稳定的聚核糖体复合物的方法进一步描述在WO88/08453,WO90/05785,WO90/07003,WO91/02076,WO91/05058和WO92/02536中。并非基于噬菌体的交替展示系统，诸如披露在W095/22625和W095/11922(Affymax)中的那些使用聚核糖体展示用于选择的多肽类。另外将这些和所有上述对比文件《I入本文作为参考。本发明由此提供了从多肽类的所有组成成分中选择具有所需一般和/或粑配体结合位点的多肽的方法，该方法包括下列步骤a)表达本发明上述方面的文库；b)使所述多肽类与一般和/或靶配体接触并且选择结合一般和/或耙配体的那些；和c)任选扩增结合一般和/或靶配体的选择的多肽(类)；d)任选重复步骤a)-c)。优选使用噬菌体展示系统进行步骤a)-d)。由于本发明提供了对一般和靶配体均具有结合位点的多肽类的文库，所以上述选择方法可以适合于使用一般配体或耙配体的选择。因此，可以使用一i&配体，且然后4吏用耙配体或4吏用草巴配体，且然后l吏用一般配体选择最初的文库。本发明还提供了在使用耙配体选择前或之后平行或串连使用不同一般配体的多重选择。优选本发明的方法进一步包含使选择的多肽(类)进行额外的变化(如本文所述)和重复步骤a)-d)的步骤。由于一般配体根据其确切的性质能够结合使用一般配体选择的所有文库成员，所以本发明的方法进一步包含使用一般配体(或其某些缀合物)检测，固定，纯化或免疫沉淀来自所述文库的任意功能性成员或成员群体(无论是否通过结合粑配体选择的)。由于本发明提供了文库，其中成员具有已知的主链构象，所以本发明的方法进一步包含产生文库中的任意功能性成员的三维结构模型(无论是否通过结合靶配体选择的)。优选这类模型的构建包括同源性模型化和/或分子置换。可以通过用二级结构预测或通过筛选结构文库比较多肽序列与已知三维结构的序列而生成主链构象的初步模型。还可以将计算软件由于预测多肽的二级结构。为了预测可变位置上的側链构象，可以使用侧链旋转异构体文库。一般而言，用于实施本发明所需的核酸分子和载体构建体为本领域中可利用的并且可以如标准实-验室手册，诸如Sambrook等(1989」Mo/ecw/arC7om'"g.'J丄a6orato^yAfowwa/,ColdSpringHarbor,USA中所述构建和操作。一般在重组载体中进行本发明中的核酸操作。本文所用的载体意旨用于将异源DNA导入细胞以便其表达和/或复制的分散元件。选择或构建且随后使用这类载体的方法为本领域技术人员众所周知的。大量载体为公众可利用的，包括细菌质粒，噬菌体，人工染色体和附加型载体。这类载体可以用于单纯克隆和诱变；或者，作为载体的典型，其中携带本发明的所有组成成分(或前-所有组成成分)成员，使用基因表达载。可以选择适应所需大小的多肽编码序列的本发明使用的载体，所需的大小一般为0.25千碱基(kb)-40kb长度。在体外克隆操作后使用所述载体转化合适的宿主。各载体包含不同的功能性成分，它们一般包括克隆(或"多接头")位点，复制起点和至少一种可选择的标记基因。如果指定的载体为表达载体，那么它还具有如下中的一种或多种增强子元件；启动子；转录终止和信号序列，它们各自位于克隆位点附近，使得它们可操作地与编码本发明多肽所有组成成分成员的基因连接。克隆和表达载体一般均包含能够使该载体在一种或多种选择的宿主细胞中复制的核酸序列。一般在克隆载体中，该序列为能够使载体独立于宿主染色体DNA复制的序列并且包括复制起点或自主复制序列。众所周知这类序列用于各种细菌，酵母和病毒。来自质粒pBR322的复制起点适合于大部分革兰氏阴性菌，2微米质粒起点适合于酵母，且各种病毒起点(例如SV40，腺病毒)用于哺乳动物细胞中的克隆载体。一般而言，复制起点并非哺乳动物表达载体所需的，除非它们用于能够复制高水平DNA的哺乳动物细胞，诸如COS细胞。有利的是，克隆或表达载体可以包含也称作可选标记的选择基因。该基因编码在选择培养基中生长的转化的宿主细胞存活或生长所必需的蛋白质。典型的选择基因编码赋予抗生素和其它毒素抗性的蛋白质，所述抗生素和其它毒素例如为氨千西林、新霉素、曱氨蝶呤或四环素；补充营养缺陷型缺乏或提供生长培养基中无法获得的关键营养物。由于本发明载体的复制最便利地在大肠杆菌中进行，所以大肠杆菌-可选标记，例如，赋予抗生素氨千西林抗性的(3-内酰胺酶基因是有用的。它们可以获自大肠杆菌质粒，诸如pBR322或pUC质粒，诸如pUC18或pUC19。表达载体通常包含由宿主生物体识别并且可操作地与所关注的编码序列连接的启动子。这类启动子可以为诱导型或组成型的。术语"可操作地连接"意旨并列，其中所述成分为相关性的，允许它们按照其指定方式起作用。按照在与控制序列相容的条件下进行编码序列表达这类方式连接"可操作地连接"编码序列的控制序列。适用于真核宿主的启动子包括，例如，(3-内酰胺酶和乳糖启动子系统；碱性磷酸酶；色氨酸(trp)启动子系统；和杂合启动子，诸如tac启动子。用于细菌系统的启动子一般也包含可操作地与编码序列连接的SD序列。在本发明的文库中，优选的载体为能够表达相当于多肽文库成员的核普酸序列的表达载体。因此，可以通过表达多肽文库成员的单一克隆的单独增殖和表达或通过使用任意选择展示系统进行使用一般和/或靶配体的选择。如上所述，优选的选择展示系统为噬菌体展示。因此，可以使用噬菌体或噬菌粒载体。优选的载体为具有大肠杆菌复制起点(用于双链复制)和另外的噬菌体复制起点(用于产生单链DNA)的噬菌粒载体。这类载体的操作和表达为本领域众所周知的(Hoogenboom和Winter(1992),参见上文；Nissim等(1994),参见上文)。简言之，该载体包含在噬菌粒上赋予选择性的(3-内酰胺酶基因和表达弹夹的lac启动子下游，该表达弹夹由pe旧前导序列(使表达的多肽定向于周质空间)，多克隆位点(用于克隆文库成员的核苷酸形式)，任选一种或多种肽标记(用于检测)，任选一种或多种TAG终止密码子和噬菌体蛋白质pIII组成(N-C末端)。因此，使用大肠杆菌的不同抑制和非-抑制菌抹并且添加葡萄糖，异丙基硫代-(3-D-半乳糖苦(IPTG)或辅助噬菌体，诸如VCSM13,所述载体能够在不表达的情况下作为质粒复制，仅产生大量多肽文库成员或产生噬菌体，其中的某些包含在其表面上的多肽-pIII融合体的至少一种拷贝。本发明载体的构建使用了常规的连接技术。裂解分离的载体或DNA片段，构成并且连接成产生所需载体所需的形式。如果需要，可以按照已知方式进行证实正确序列存在于构建的载体中的分析。用于构建表达载体，制备体外转录物，将DNA导入宿主细胞和进行评价表达和功能的分析的合适的方法为本领域技术人员所公知的。检测样品中操作的基因序列或通过常规方法定量的其扩增和/或表达，所述常规方法诸如DNA或RNA分析，蛋白质印迹，DNA、RNA或蛋白质的斑点印迹，原位杂交，免疫细胞化学或核酸或蛋白质分子的序列分析。如果需要，本领域技术人员易于预计如何改进这些方法。使用聚合酶链反应(PCR)的诱变一旦选择载体系统并且将编码所关注的和多肽类的一种或多种核酸序列克隆入文库载体，就可以通过在表达前采取诱变在克隆的分子内产生多样性；或者，如上所述，可以在诱变前表达和选择编码的蛋白质并且进行额外的选择循环。如上所述，通过标准分子方法进行编码结构优化的多肽类的核酸序列的诱变。特别有用的是聚合酶反应或PCR(Mullis和Faloona(1987)她fW""z戸o/.,155:335，将该文献引入本文作为参考)。使用热稳定性DNA-依赖性DNA聚合酶催化的多个DNA复制循环扩增所关注的靶序列的PCR为本领域众所周知的。用于本发明的寡核苷酸引物为单链DNA或RNA分子，它们与核酸模板杂交以便引起第二链核酸的酶促合成。该引物与存在于用于制备本发明阵列组的核酸分子库中的靶分子的部分互补。关注通过合成方法制备这类分子，无论是化学方法还是酶促方法。或者，这类分子或其片段天然存在并且分离自其天然来源或购自商品供应商。尽管不同长度的寡核苷酸是有用的，但是诱变寡核苷酸引物为15-100个核苷酸长度，理想的是20-40个核苷酸。一般而言，在两种核酸序列基本上互补(在至少14-25个核香酸的一段序列内至少约65%为互补的，优选至少约75%,更优选至少约90%为互补的)时，发生选择性杂交。参见Kanehisa(1984)A^c/e/c爿"'AA"12:203,将该文献引入本文作为参考。作为结果，预计在引发位点上的一定程度的错配是可接受的。这类错配可以为小的，诸如一-,二-或三-核苷酸。或者，它可以包含核苦酸环，我们定义为区，其中错配包括4个或4个以上核苷酸的连续串。总之，5个因素影响引物与第二种核酸分子杂交的有效性和选择性。这些因素为(i)引物长度；(ii)核苷酸序列和/或组成；(iii)杂交温度；(iv)緩沖剂化学；和(v)需要引物所杂交的区中位阻的可能性，这些因素在设计非随机引发序列时相当重要的。性；较长的序列;有高于^交短序列的解链温度(TM),并且在指定靶序列内重复的可能性较低，由此将杂乱的杂交减少至最低限度。具有高G-C含量或包含回文序列的引物序列趋向于自我杂交，如其趋向于指定的耙位点，因为单分子而非双分子杂交动力学一般在溶液中是有利的；同时，重要的是设计引物，其包含足够数量的G-C核苷酸配对以便紧密结合靶序列，因为这类对各自通过三个氢键，而非两个在A和T碱基配对时发现的氬键结合。杂交温度与引物退化效率成反比改变，如同可以包括在杂交混合物中的有机溶剂，例如曱酰胺的浓度一样，而盐浓度的杂交有利于结合。在严格杂交条件下，较长的探针比较短的探针在更为许可的条件下充分的杂交效率高。严格的杂交条件一般包括低于约1M,更通常的是低于约500mM且优选低于约200mM的盐浓度。杂交温度低至0°C-高于22。C,高于约30°C且(最通常的是)超过约37°C。较长的片段可能需要较高的杂交温度以便进行特异性杂交。作为影响杂交严格性的几个因素，参数的组合比任意一种单独的绝对测量值更为重要。使用这些思维中的考虑设计引物。尽管本领域技术人员可以开动脑筋对大量序列的相对优劣性进行评估，但是已经设计了计算机程序辅助评价这几个参数并且优化引物序列。这类程序的实例为DNAStarTM软件包的"PrimerSelect"(DNAStar,Inc.;Madison,WI)和OLIGO4.0(NationalBiosciences,Inc.)。一旦进4亍了i殳计，就通过合适的方法制备寡核苦酸，例如Beaucage和Carruthers(1981)7^ra/zet/ra"丄e".，22:1859)所述石舞酰胺酸法或Matteucci和Caruthers(1981)J.爿m.C/ew.Soc.,103:3185的三酯法，将这两篇文献引入本文作为参考；或通过使用商购自动化寡核苷酸合成仪的其它化学方法或VLSIPSTM技术。使用模板DNA(至少lfg;更有用的是1-1000ng)和至少25pmol寡核苷酸引物进行PCR;有利的是在引物库明显为异源的时使用大量引物，因为序列各自仅由库中的少部分分子表示，并且量在随后的扩增循环中变得有限。典型的反应混合物包括2^1DNA,25pmol寡核苷酸引物，2.5(ilofIOXPCR緩冲液l(Perkin國Elmer,FosterCity,CA),0.4(il1.25dNTP,0.15jal(或2.5个单位)TaqDNA聚合酶(PerkinElmer,FosterCity，CA)和去离子水至25pi总体积。覆盖矿物油并且使用程序可控的热循环仪进行PCR。实际上按照严格性的要求调整PCR循环各步骤中的长度和温度以及循环次数。根据预计引物退火至模板的效率和可接受的错配程度确定退火温度和时限；显然，当同时扩增和诱变核酸分子时，至少在第一个合成循环中需要错配。在尝试使用诱变引物的混合库扩增分子群体的过程中，对引物至非靶位点的序列的混杂退火称重在严格性(高温)退火条件下仅可能因低解链温度产生的可能突变产物损耗。优化引物退火条件的严格性的能力充分属于本领域技术人员的知识范围。使用30C-72。C的退火温度。模板分子的起始变性通常在92°C-99°C下发生4分钟，随后是由变性(94-99。C下15秒-1分钟)，退火(确定的温度如上所述；1-2分钟)和伸展(72。C下1-5分钟，这取决于扩增产物的长度)组成的20-40个循环。最终的伸展一般为在72°C下4分钟且随后可以为在4°C下的不确定的(0-24小时)步骤。所有组成成分成员的结构分析由于本发明提供了已知主链构象的所有组成成分，所以易于生成所有组成成分中的任意成员的三维结构模型。一般而言，这类模型的构建包括同源性模型化和/或分子置换。通过比较多肽序列于已知三维结构的类似序列，通过二级结构预测或通过筛选结构文库生成主链构象的预备模型。分子模型化软件包为商购的并且用于预测多肽二级结构。为了预测可变位置上侧链的构象，可以使用侧链旋转异构体文库。用作多肽选择中的配体的抗体用于本发明多肽选择的一般或靶配体自身可以为抗体。这对一般配体而言特别确切，它们结合在为包含本发明所有组成成分选择的功能性多肽类中基本上为保守的结构特征。如果合适的抗体并非为公众可得到，那么可以通过噬菌体展示方法(参见上文)或如下生产它重组蛋白或那些来源于天然来源的蛋白可以用于使用本领域中那些众所周知的标准技术生成抗体。例如，给予蛋白质(或"免疫原")以便攻击哺乳动物，诸如猴子，山羊，家兔或小鼠。可以将所得抗体收集为多克隆血清，或可以使来自攻击的动物的产生抗体的细胞无限增殖化(例如通过与无限增殖化融合配偶体融合以便产生杂交瘤)，该细胞随后产生单克隆抗体。a.多克隆抗体抗原蛋白质可以单独使用或与常用载体缀合以便增加其免疫原性，并且如上所述使对该肽-载体缀合物的抗血清在动物中增加。可以如所述进行肽与载体蛋白偶联并且免疫接种(Dymecki等(1992)J.S/o/.C7zem.,267:4815)。通过ELISA，或可选择的通过斑渍或点迹对蛋白质抗原滴定血清(Boersma和VanLeeuwen(1994)/A^wtos"'.A/"/ot^，51:317)。通过ELISA,例如，按照Green等的操作步骤(1982)Cell,28:477证实血清与合适的肽类发生强烈反应。b.单克隆抗体制备单克隆抗体的技术为众所周知的，并且可以使用任意候选抗原，优选与载体结合的抗原，如Arnheiter等(1981)A^we,294,278所述制备单克隆抗体。单克隆抗体一般获自杂交瘤组织培养物或来自获自导入杂交瘤组织的动物腹水流体。然而，可以将单克隆抗体描述为"对蛋白质增加"或"由蛋白质诱导"。在增加后，通过许多方式中的任意种测试单克隆抗体的功能和特异性。类似的操作步骤也可以用于测试通过噬菌体展示或其它体外选择技术产生的重组抗体。同样可以筛选产生单克隆抗体的杂交瘤(或多克隆血清)的与免疫原结合的抗体。特别优选的免疫试验包括酶联免疫测定(ELISA),免疫印迹和免疫沉淀(参见Voller,(1978)D&g"o加c//on'zows，2:1,A/z'cra6/o/og/ca/A卵c/"to^w"/Yer(y尸w結ca〃'ow,Walkersville，MD;Voller等(1978)丄C/z".尸W/zo/.,31:507;U.S.ReissuePat,No.31,006;UKPatent2,019,408;Butler(1981)A^Ws五w矽腳/.，73:482;Maggio,E.(ed.),(1980)EVz，e/w膽"oos，，CRCPress,BocaRaton,FL)或radioimmunoassays(RIA)(Weintraub,B.,Principlesofradioimmunoassays,SeventhTrainingCourseonRadioligandAssayTechniques,TheEndocrineSociety,March1986,pp.1-5,46-49和68-78),所有这些方法仅检测了抗体与使其增加的免疫原的结合。本领域技术于标记抗体分子的技术对本领域技术人员而言众所周知(参见Harlour和Lane(1989y)爿油力oJ^，ColdSpringHarborLaboratory,pp.1-726)。或者，其它技术可以用于检测与免疫原的结合，由此证实用作本发明一般抗原或靶抗原的抗体的完整性。它们包括色谱法，诸如SDSPAGE,等电聚焦，蛋白质印迹，HPLC和毛细管电泳。将"抗体"在本文中定义为使用这类抗体的结合(可变)区的构建体和其它抗体修饰物。因此，用于本发明的抗体可以包含完整抗体，抗体片段，多功能性抗体聚集物或一般而言为包含，来自抗体的一个或多个特异性结合位点的任意物质。抗体片段可以为片段，诸如Fv,Fab和F(ab')2片段或其任意的衍生物，诸如单链Fv片段。抗体或抗体片段可以为非-重组，重组或人源化的。该抗体可以具有任意的免疫球蛋白同种型，例如IgG,IgM等。此外，如果合适，可以-使用免疫球蛋白的聚集物，聚合物，衍生物和缀合物或其片段。在下列实施例中进一步描述本发明，目的仅在于解释。作为用于多肽类选择的配体的金属离子如上所述，非抗体的配体在本发明多肽类选择中是有用的。一种这类配体为金属离子。例如，希望使用Ni-NTA基质对存在的功能性组氨酸(HIS)标记预选择所有组成成分。固定化的金属亲和色谱(IMAC;Hubert和Porath(1980,丄CTzramWograp/^,98:247)利用了在暴露的大量蛋白质表面上，组氨酸和半胱氨酸氨基酸残基以及其它可以结合金属的氨基酸残基的金属结合特性。它使用树脂，一般为琼脂糖，其包含配位金属离子的二齿金属螯合剂(例如亚氨基二乙酸，IDA，二羧酸基团)，以便生成本发明的具有金属-离子的树脂，将琼脂糖/IDA与金属盐(例如，CuCl22H20)混合，IDA螯合来自其中的二价阳离子。一种商购的琼脂糖/IDA制品为"CHELATINGSEPHAROSE6B，，(PharmaciaFineChemicals;Piscataway,NJ)。有用的金属离子包括，但不限于二价阳离子Ni2+,Cu2+,Zn"和Co2+。用主要由0.1-1.0M浓度的盐(一般为NaCl或KCl)和弱配体(诸如Tris或氨)组成的结合緩沖液制备多肽分子库，在结合緩冲液中的后者对树脂的金属离子具有亲和力，但程度低于本发明选择的多肽。弱配体在结合緩沖液中的有用浓度在0.01-0.1M的范围。使多肽库在允许具有金属结合域(参见下文)的多肽类结合的条件下接触树脂；在洗涤掉杂质后，使用緩冲液洗脱选择的多肽类，在緩冲液中，弱配体以高于在结合緩冲液中的浓度存在，特别地，尽管对金属离子的结合亲和力较低，但是其浓度对弱配体而言足以取代选择的多肽类。弱配体在洗脱緩沖液中的有用浓度高于在结合緩冲液中10--50-倍，一般为0.1-0.3M;注意盐在洗脱緩冲液中的浓度等于在结合緩冲液中的浓度。按照本发明的方法，树脂的金属离子一般用作一般配体；然而，关注它们也可以用作靶配体。使用标准色谱装置(柱，通过它由重力抽吸緩冲液，通过真空吸引或通过压力驱动)进行IMAC;或者，使用大批量操作，其中将具有金属的树脂域来自选择本发明所有组成成分成员的多肽库混合成淤浆形式。已经描述了通过IMAC部分纯化血清T4蛋白质(Staples等，美国专利US5,169,936);然而，包含表面暴露的金属结合域的广谱蛋白质还包括其它可溶性T4蛋白，人血清蛋白(例如IgG,结合球蛋白，血液结合素，Gc-球蛋白,Clq,C3,C4)，人desmoplasmin,Z)o"c/zo"i/o層凝集素，锌-抑制的Tyr(P)磷酸酶，酚酶，羧肽酶同工酶，Cu,Zn超氧化物歧化酶(包括人和所有其它真核生物的那些)，二磷酸核苦酶，白细胞干扰素，乳铁蛋白，人血浆ot2-SH糖蛋白，(32-巨球蛋白，ot广抗胰蛋白酶，纤溶酶原激活物，胃肠道多肽类，胃蛋白酶，人和牛血清清蛋白，来自粒细胞的颗粒蛋白，溶菌酶，非组蛋白质，人血纤蛋白原，人血清运铁蛋白，人淋巴毒素，钓调蛋白，蛋白质A,抗生物素蛋白，肌球蛋白，生长调节素类，人生长激素，转化生长因子，血小板衍生生长因子，a-人心房钠尿多肽，心舒血管素等。此外，可以使用IMAC纯化膜结合蛋白的胞外结构域序列。注意可以按照本发明的非生产包含上述蛋白质中的^i种或其金属结合变体的所有组成成分。在洗脱后，从金属结合緩冲液中取出选择的多肽类并且放入适合于其下一步应用的緩冲液。如果金属离子用于生成本发明首先选择的多肽库，那么将该库中的分子放入为结合用于选择功能性多肽所有组成成分成员的第二种配体的緩冲液。而如果将金属用于第二选择步骤，那么将所有组成成分的多肽类转入适合于储存的緩冲液(例如0.5%甘氨酸緩冲液)或指定它们的应用。这类緩沖液包括，但不限于水，有机溶剂，水与水易于溶混的有机溶剂的混合物，生理盐水緩冲液和蛋白质/核酸或蛋白质/蛋白质结合緩沖液。或者，可以使多肽分子脱水(即通过冻干)或固定在固体或半固体支持物，诸如硝化纤维或尼龙滤膜或凝胶基质(即琼脂糖或聚丙烯酰胺基质)上或与色谱树脂交联。可以通过本领域中许多公知的方法从洗脱緩冲液中取出多肽分子。可以对水或另一种选择的溶液透析多肽洗脱液；如果冻干多肽类，那么使用加入了蛋白酶抑制剂(例如胃酶抑素，抑肽酶，亮抑蛋白酶肽等)的水。或者，可以使样品进行本领域众所周知的硫酸铵沉淀，此后在在的介质中重新悬浮。本发明选择的多肽类的应用按照本发明方法选择的多肽类可以用于基本上任意的方法，其包括配体-多肽结合，包括体内治疗和预防应用，体外和体内诊断应用，体外测定和试剂应用等。例如，就抗体而言，按照本领域技术人员公知的方法，抗体分子可以用于基于抗体的测定技术，诸如ELISA技术。如上所述，本发明选择的分子具有诊断，预防和治疗操作中的应用。例如，可以4吏用本领域众所周知的技术在体外或体内测定通过这些方法生成和选择的酶变体的活性，通过这些方法，将它们与候选底物分子孵育并且分析底物到产物的转化。可以在培养的细胞中表达选择的细胞-表面受体或黏着分子，且然后测试其对生化刺激的反应的能力或它们与其它细胞类型的亲和力，所述其它细胞类型表达可以预计未多样化黏着分子所分别结合的细胞-表面分子。本发明选择的抗体多肽类在通过标准免疫组织化学操作的蛋白质印迹分析和原位蛋白质检测中具有诊断应用；为了用于这些应用，可以按照本领域公知的技术标记选择的所有组成成分的抗体。此外，当与色谱支持物，诸如树脂复合时，可以按照亲和力色谱操作步骤以制备方式使用这类抗体多肽类。所有这类技术均为本领域技术人员众所周知的。本发明制备的蛋白质的治疗和预防应用包括对接受者哺乳动物，诸如人给予本发明选择的多肽类。在这方面具体应用的有抗体；其它受体(包括，但不限于T-细胞受体)，并且就此而言，其中抗体或受体用作一般或耙配体；结合它们的蛋白质。优选具有至少90-95%同质性的基本上纯的抗体或结合蛋白给予哺乳动物，且最优选98-99%或99%以上同质性用于药物应用，尤其是当哺乳动物为人时。一旦根据需要部分纯化或至同质性，就可以在诊断或治疗(包括体外)中或在研发和进行测定操作，免疫荧光染色等中使用选择的多肽类(Lefkovite和Pernis,(1979和1981)ImmunologicalMethods,VolumesI和II，AcademicPress,NY)。本发明选择的抗体或其结合蛋白一般应用于预防，抑制或治疗炎症状态，过敏性超敏反应，癌症，细菌或病毒感染和自身免疫疾病(包括，但不限于I型糖尿病，多发性硬化，类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮，克罗恩病和重症肌无力)。在本申请中，术语"预防"包括在诱发疾病前给予预防性组合物。"抑制"意旨在诱发情况后，但在疾病的临床表现前给予组合物。"治疗"包括在疾病症状变得明显后给予预防性组合物。可利用可以用于筛选抗体或其结合蛋白在预防或治疗疾病的动物模型系统。用于测试易感小鼠中系统性红斑狼疮(SLE)的方法为本领域公知的(Knight等(1978)丄￡"平她么147:1653;Rei訓ten等(1978)脸wE"g.丄A/W.,299:515)。通过使用来自另一种类的可溶性AchR蛋白质诱发疾病测试SJL/J雌性小鼠的重症肌无力(MG)(Lindstrom等(1988)爿A./mmwo/.,42:233)。通过注射II型胶原蛋白在易感小鼠品系中诱发关节炎(Stuart等(1984)/附mw"o/.,42..233)。已经描述了通过注射分支杆菌热激蛋白在易感大鼠中诱发佐剂性关节炎模型(VanEden等(1988)淑匿,331:171)。通过如所述给予甲状腺球蛋白在小鼠中诱发甲状腺炎(Maron等(1980)丄Exp.A^A,152:1115)。胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)自然发生或可以在某些品系的小鼠中诱发，诸如Kanasawa等所述那些(1984)D,a6"o/og/a，27:113。小鼠和大鼠中的EAE用作人MS的模型。在该模型中，通过给予髓磷脂碱性蛋白诱发脱骨逸革肖病(参见Paterson(1986)re;c^ooA:o//mww"o;^^/zo/ogy,Mischer等.，eds.,Grune和Stratton,NewYork，pp.179-213;McFarlin等(1973)S"e"ce,179:478:和Satoh等(1987)J./mmw"o/.,138:179)。本发明选择的抗体，受体(包括，但不限于T-细胞受体)或其结合蛋白还可以与其它抗体联用，特别是与导致疾病的人细胞上的其它标记反应的单克隆抗体(MAbs)。例如，合适的T-细胞标记可以包括分类成所谓的"分化簇"的那些，根据FirstInternationalLeukocyteDifferentiationWorkshop命名(Bernhard等(1984)7)^/wg,SpringerVerlag,NY》一般而言，本发明选择的抗体，受体或结合蛋白以纯化形式与药理学合适的载体一起使用。一般而言，这些载体包括水或醇/水溶液，乳剂或混悬液，任意包括盐水和/或緩沖介质。非肠道媒介物包括氯化钠溶液，林-f各葡萄糖液，葡萄糖和氯化钠以及乳酸林;格。如果为将多肽复合物保持在混悬液中所必要，那么合适的生理学可接受的佐剂可以选自增稠剂，诸如羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶和藻酸盐。静脉内J某介物包括流体和营养补充物和电解质补充物，诸如基于林格葡萄糖液的那些。还可以存在防腐剂和其它添加剂，诸如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体(Mack(1982)Ae脂"g^wSScrees,16Edition)。可以将本发明选择的多肽类作为单独的给药组合物使用或与其它活性剂联用。它们可以包括各种免疫治疗药，诸如环孢菌素、曱氨蝶呤、阿霉素或顺柏和免疫毒素类。药物组合物可以包括各种细胞毒性剂或其它活性剂与本发明选择的抗体，受体或其结合蛋白，乃至本发明具有不同特异性的选择的多肽类，诸如使用不同靶配体选择的多肽类的组合的"混合物"，无论是否在给药前收集它们。本发明药物组合物的给药途径可以为本领域技术人员通常公知的那些。就疗法而言，包括，但不限于免疫疗法，可以按照标准技术对任意的患者给予本发明选择的抗体，受体或其结合蛋白。给药可以通过任意合适的方式，包括非肠道，静脉内，肌肉，腹膜内，透皮，通过肺部途经，或也可以通过使用导管直接输注。给药剂量和频率取决于患者的年龄，性别和情况，同时给予的其它药物，禁忌症和临床医师所考虑到的其它参数。可以为储存将本发明选择的多肽类冻干并且在使用前再溶解。已经证实这种技术在使用常规的免疫球蛋白和公认的冻干法时是有效的并且可以使用再溶解技术。本领域技术人员可以理解冻干和再溶解可以导致不同程度的抗体活性缺失(例如使用常用的免疫球蛋白，IgM抗62体趋向于具有大于IgG抗体的活性缺失)并且必须向上调整应用水平以便补偿。可以为预防和/或预防性治疗给予包含本发明选择的多肽类或其混合物的组合物。在选择的细胞群的某些治疗应用中，进行至少并非抑制，阻滞，调节，杀伤或某些其它可测定的参数的足够量定义为"治疗有效剂量"。达到这一剂量所需的量取决于疾病的严重性和患者自身免疫系统的一般状况，但一般在0.005-5.0mg选择的抗体，受体(例如T-细胞受体)或其结合蛋白/千克体重的范围，更常用的剂量为0.05-2.0mg/kg/剂量。为了进行预防性应用，还可以以类似或适度降低的剂量给予包含本发明选择的多肽类或其混合物的组合物。可以将包含本发明选择的多肽的组合物用于预防和治疗环境，以便辅助改变哺乳动物中选择的耙细胞群，使其失活，杀伤或除去它们。此外，可以在体外使用本文所述多肽类中选择的所有组成成分或选择在体外杀伤，耗尽乃至从异源细胞群中有效除去靶细胞群。可以在体外将来自哺乳动物的血液与选择的抗体，细胞-表面受体或其结合蛋白合并，由此按照标准技术杀伤不需要的细胞乃至从血液中除去它们以使哺乳动物恢复。在下列实施例中进一步描述本发明，目的仅在于解释。实施例1抗体文库设计A.主链构象就人抗体的6种抗原结合环中的5种(L1、L2、L3、Hl和H2)而言，存在有限数量的主链构象或规范结构((Chothia爭(1992)丄Mo/.S,力/.，227:799;Tomlinson等(1995)EAffi(9丄，14:4628;Williams等(1996)丄A'o/.,264:220)。这些环各自的最常见的主链构象用于提供本发明单一已知的主链构象。它们为Hl-CS1(79%表达的所有组成成分)，H2國CS3(46%),Vk的Ll-CS2(39%)，L2画CS1(100%)，Vk的L3-CS1(36%)。H3环构成有限数量的短环长度的主链构象(Martin辨1996)J.Mo/.263:800;Shirai等(1996)FESS丄e"e^，399:1)。因此，如果H3具有7个残基的CDR3长度(如Kabat等(1991)所定义的。Se《wewceso//rafe/7wo/z'mmwwo/og/ca//w/e^s"U.S.DepartmentofHealthandHumanServices)并且在H94位上具有赖氨酸或精氨酸残基和在H101位上具有天冬氨酸残基，那么在这两种残基之间形成盐桥，并且在大部分情况中，能够产生单一主链构象。在EMBL数据文库中至少存在16种具有所需H3长度和关键残基的构成该构象的人抗体序列，且在蛋白质数据库中至少存在两种可以用作抗体模型化基础的晶体结构(2cgr和ltet)。在这种情况中，最频繁表达的编码所需环长度和关键残基以便产生所需的规范结构组合的种系基因片段为VH片段3-23(DP-47),JH片段JH4b,Vk片段02/012(DPK9)和Jk片段JK1。这些片段由此可以组合使用以便作为构建具有所需单一主链构象的文库的基础。VK片段02/012(DPK9)为VK1家族中的成员且由此结合超抗原蛋白质L。VH片段3-23(DP-47)为VH3家族中的成员且由此应结合超抗原蛋白质A,然后可以用作一般配体。B.变体位置的选择人VH和VK序列分析显示在成熟所有组成成分中大部分不同的位置为允许最广泛地接触抗原的那些(参见Tomlinson等.，(1996)丄Mo/.AW.，256:813;图1)。这些位置构成了功能性抗原结合位点且由此为侧链多样化选择(图2)。H54为远离选择的H2规范结构3中抗原结合部位的关键的残基和点(在该位置上观察到的多样性是因规范结构1,2和4所致，其中H54点指向结合位点)。在这种情况中，而H55(指向结合位点)多样化。在这些位置上的多样性因在初级所有组成成分中的种系或连接多样性或体细胞高度突变而产生(Tomlinson等.，(1996)丄AA/.历o/.，256:813;图1)。由此抗原结合部位中的两个不同残基亚组改变成两种不同的文库形式。在"初级"文库中，为变化选择的残基来自H2,H3,L2和L3(这些环中的多样性主要是种系或连接多样性的结果)。在该文库中改变的位置为H50,H52，H52a,H53,H55,H56,H58，H95,H96,H97,H98,L50,L53，L91,L92,L93,L94和L96(总计18个残基，图2)。在"体细胞"文库中，为变化选择的残基来自HI,H3，Ll和L3的末端(此处的多样性主要是体细胞高度突变或连接多样性的结果)。在该文库中改变的位置为H31,H33,H35，H95,H96,H97，H98,L30,L31,L32,L34和L96(总计12个残基，图2)。C.改变位置上的氨基酸应用的选择通过掺入密码子NNK(编码所有的20种氨基酸，包括TAG终止密码子，但非TGA和TAA终止密码子)或密码子DVT(编码22%的丝氨酸和11%的酪氨酸，天冬酰胺，甘氨酸，丙氨酸，天冬氨酸，苏氨酸和半胱氨酸并且在各位置上使用等比例的单，双重，三重和四重简并性，最接近地模拟天然人抗体抗原结合部位中的氨基酸残基分布)将侧链多样性引入"初级，，和"体细胞，，文库。实施例2文库构建和使用一般配体的选择通过表1中所列寡核苷酸和种系V基因片段DPK9的PCR装配"初级"和"体细胞"文库(Cox等(1994)丄/画画/.,24:827)和DP-47(Tomlinson等(1992)J.Mo/.Ao/.,227:7768)。简言之，使用5'(反向)引物与NNK或DVT3'(正向)引物对与相应的种系V基因片段作为模板进行第一个循环的扩增(参见表1)。这一过程产生8个单独的各自用于NNK和DVT文库中的DNA片段。然后使用表1中所示的5'(反向)引物与和3'(正向)引物与来自笫一个扩增循环的纯化片段中的两个进行第二个循环的扩增。这一过程产生4个单独的各自用于NNK和DVT文库中的DNA片段("初级"VH片段，5A;"初級"Vk片段，6A;"细胞"VH片段，5B;和"体细胞"VK片段，6B)。切割这些片段中的每一种且然后连入pCLEANVH(就VH片段而言)或pCLEANVK(就Vk片段而言)，其包含相应的不含任何TAG密码子或肽标记的pHENl形式的虛拟VH和VK结构域(Hoogenboom&Winter(1992)丄Mo/.S/o/.，227:381)。然后将这种连接电穿孔入非抑制剂的大肠杆菌菌抹HB2151。产生来自这些文库中的每一种的噬菌体并且单独使用免疫管(immunotubes)选择，所述免疫管包被了分别用于VH和Vk文庠的10itig/ml—般配体蛋白质A和蛋白质L。然后由感染了选择的噬菌体的大肠杆菌制备DNA并且切割，以便用相应的VK文库取代虚拟的Vk插入片段。这些文库的电传机产生如下插入片段文库大小9.21x1()8("初级"NNK),5.57x1()8("初级"DVT)，1.00xl()9("体细胞"NNK)和2.38x108("体细胞"DVT)。作为预选择的对照组，生成4种额外文库，但不使用一般配体蛋白质A和蛋白质L选择这些文库的插入片段文库大小为1.29x109("初级"NNK),2.40x1()8("初级"DVT),1.16x109("体细胞"NNK)和2.17x1()8("体细胞"DVT)。为了验证预选择步骤的成功，将来自选择和未选择的"初级"NNK文库的DNA克隆入基于pUC的表达载体并且电穿孔入HB2151。以随机方式从各再克隆的文库中挑选96个克隆并且诱导它们以便表达可溶性scFv片段。通过使用蛋白质L的ELISA测定功能性scFv的产生以便俘获scFv和随后的蛋白质A-HRP缀合物以便检测结合。仅表达功能性VH和Vk結枸域的scFv(无移码，终止密码子，折叠或表达突变)产生使用该测定法的信号。各文库中功能性抗体的成员(高于背景的ELISA信号)在使用未选择的"初级"NNK文库时为5°/。且使用相同的选择形式时为75%(图3)。在本测定法中为阴性的克隆的测序证实存在移码，终止密码子，在抗原结合部位中关键构架残基和氨基酸上必须防止折叠和/或表达的PCR突变。实施例3对耙配体的文库选择使用不同浓度的包被在免疫管上的5种抗原(牛遍在蛋白，大鼠BIP,牛组蛋白，NIP-BSA和鸡卵溶菌酶)单独选择"初级"和"体细胞"NNK文库(无预选择)。在2-4个选择循环后，获得针对除鸡卵溶菌酶外的所有抗原的高度特异性的抗体。随机选择克隆以便测序，从而证实对各抗原的抗体范围(图4)。在二期中，将来自预选择的NNK和DVT文库的噬菌体按照1:1混合以便生成单一"初级"文库和单一"体细胞"文库。然后使用不同浓度的包被在免疫管上的7种抗原(FITC-BSA，人瘦蛋白，人曱状腺球蛋白，BSA,鸡卵溶菌酶，小鼠IgG和人IgG)单独选择这些文库。在2-4个选择循环后，获得所有抗原的高度特异性的抗体，所述所有抗原包括在早期选择中难以产生阳性的鸡卵溶菌酶，其中早期选择使用的文库未使用一般配体进行预选择。随才几选择克隆以便测序，从而证实对各抗原的不同抗体范围(图4)。实施例4预选择对scFv表达和具有scFv的噬菌体产生的作用为了进一步验证预选择的结果，将来自未选择的和预-选择的"初级"DVT文库的DNA克隆入基于pUC的表达载体并且电穿孔入HB2151,在两种情况中均产生105个克隆。以随机方式从各再克隆的文库中挑选96个克隆并且诱导它们以便表达可溶性scFv片段。使用蛋白质L在测测定功能性scFv的产生以便俘获scFv，随后使用蛋白质A-HRP检测结合的scFv。功能性抗体在各文库中的百分比为35.4%(未选择的)和84.4%(预-选择的)，表明作为使用蛋白质A和蛋白质L预-选择的结果，功能性成员的数量增加了2.4倍(这种增加明显低于等效的NNK文库，因为DVT密码子不编码TAG终止密码子。在未选择的NNK文库中，在非抑制的菌林，诸如HB2151中存在TAG终止密码子导致终止且由此防止功能性scFv表达。NNK文库的预选择除去了包含TAG终止密码子的克隆而产生文库，其中高比例的成员表达可溶性scFv)。为了评价"初级"DVT文库预选择对总体scFv表达的作用，诱导再克隆的未选择的和预-选择的文库(在基于pUC的表达载体中各自包含105个克隆)以便进行scFv片段的多克隆表达。然后通过在蛋白质L包被的ELISA平板上孵育上清液的2倍稀释液(图5a中的1-12栏)，随后使用蛋白质A-HRP检测测定表达的scFv在上清液中的浓度，平行检测已知浓度的ScFvs以便对scFv在未选择的和预-选择的DVT文库中的表达水平定量。将它们用于绘制标准曲线(图5b)并且从其中将未选择的和预-选择的"初级，，DVT文库中的表达水平分别计算为12.9|ug/ml和67.1pg/ml，即因使用蛋白质A和蛋白质L预选择而导致表达增加5.2倍。为了评价具有scFv的噬菌体的量，使未选择的和预-选择的"初级"DVT文库生长并且产生多克隆噬菌体。在使用MES电泳緩冲液的4-12%Bis-TrisNuPAGE凝胶上和变性条件下运行来自两个文库的等体积的噬菌体。将所得凝胶进行蛋白质印迹，使用抗-pIII抗体探测并且在X光片曝光(图6)。在每种情况中下面的带相当于单独的pIII蛋白质，而较高处的带包含pIII-scFv融合蛋白。使用软件包NIH影像对带强度的定量表示预-选择导致存在于噬菌体中的融合蛋白的量增加11.8倍。实际上，在预-选择的噬菌体中总pIII中的43%作为pIII-scFv融合体存在，从而提示大部分噬菌体颗粒具有至少一种在表面上展示的scFV。因此，不仅使用一般配体预-选择能够从所有组成成分中富集功能性成员，而且导致对那些充分表达的成员优先选择且(如果需要)能够在噬菌体表面上引起高水平的展示，但不被细菌蛋白酶裂解。<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCCTGGAGCCTGGCGGACCCAMNNCATMNNATAMNNGCTAAAGGTGAATCCAGAGCTGGAGCCTGGCGGACCCAABHCATABHATAABHGCTAAAGGTGAATCCAGAG2BDP-47W服3丫j2场參TGGGTCCGCCAGGCTCCAGTCCCTGGCCCCAGTAGTCAAAMNNMNNMNNMNNTTTCGCACAGTAATATACGGTCCCTGGCCCCAGTAGTCAAAABHABHABHABHTTTCGCACAGTAATATACGG3BDPK95V^向//^GACATCCAGATGACCCAGTCCTGGTTTCTGCTGATACCAMNNTAAMNNMNNMNNAATGCTCTGACTTGCCCGGCTGGTTTCTGCTGATACCAABHTAAABHABHABHAATGCTCTGACTTGCCCGG4BDPK95丫《场//參TGGTATCAGCAGAAACCAGGGCTTGGTCCCTTGGCCGAACGTMNNAGGGGTACTGTAACTCTGTTGACAGTAGTAAGTTGCCTTGGTCCCTTGGCCGAACGTABHAGGGGTACTGTAACTCTGTTGACAGTAGTAAGTTGC200680037900.7势溢1被57/101:a;每/妄尝a謹as舉/i發5"WV￡V9有利的是能够选择未配对或松散配对的来自抗体多肽类群体的抗体单一可变域。还能够选择未配对或松散配对的来自T-细胞受体多肽类群体的T-细胞受体结构域(Va或Vp)。本发明满足了这些需求。在本文所述本发明的所有实施方案和方面中，其中提及了靶配体，该耙配体选自TNFa血清清蛋白、冯维勒布兰德因子(vWF)、IgE、干扰素Y、EGFR、IgE、MMP12、PDK1和淀粉样蛋白(3(A-p)或附录1中所列的耙标中的任意一种。参照WO05044858A1,WO04062551A2，WO04041867A2，WO04041865A2,WO04041863A2，WO04041862A2,WO03050531A2和EP0656946中有关CamelidVHH结构域和Nanobodies的描述。特别将VHH和Nanobodies的这些披露内容和定义以及披露的序列和实例引入本文作为参考。就本发明的方法而言，在一个实施方案中，多肽类(例如抗体多肽类)群体由B细胞(例如外周血淋巴细胞)提供，其中将B-细胞群提供在多个孔或储器中，各孔或储器包含单一B-细胞类型或平均包含一种B-细胞类型。参照deWildt等(1997)j.Immunol.Methods2073，61-67和Babcook等(7996」尸rac.A^/.爿c^/.t/&47S43-7WS中有关如何控制B细胞平均值的披露内容。将这些参考文献完整地引入本文作为参考。本发明选择例如来自Camelids的B细胞群的具体应用本发明在一个方面中提供了选择系统，它可消除抗原-特异性B-细胞(作为亚群)(或显著减少它们的比例)，所述抗原-特异性B-细胞(作为亚群)不会展示出优选的抗体类型，同时富集那些确实展示出优选抗体类型的抗原-特异性B-细胞(作为亚群)。使用一般配体进行这种富集方法，所述一般配体即蛋白质或小化学分子，它们对常见于所有确实展示出优选的抗体类型的抗原-特异性B-细胞和并非常见于所有未展示出优选抗体类型的所有抗原-特异性B-细胞具有亲和力。例如，一般配体可以对抗体结构域或抗体表面斑具有亲和力，所述抗体结构域或抗体表面斑常见于所有确实展示出优选抗体类型的抗原-特异性B-细胞且并非常见于所有未展示出优选抗体类型的抗原-特异性B-细胞。显然，在选择抗原结合活性前，过程中或之后进行使用一般配体的选择，最终的结果在于表达具有所需类型的抗体的抗原-特异性B-细胞亚群。在有关展示出常用抗体或重链抗体的骆驼科B-细胞的上下文中，可以预计富集两种亚群之一的两种方法在第一种手段中，超抗原蛋白质G在本发明中用作一般配体。蛋白质G结合重链中的CH1恒定域。已经证实(Hamers-Casterman等(1993)A^^",363,446-448)较大比例的重链抗体不会结合蛋白质G(也不会结合蛋白质A),并且这种差异用于在分析动物血清时通过色谱方式从重链骆驼抗体中分离常用的骆驼抗体。显然，重链抗体中的CH1结构域中的缺失导致不存在结合固定化蛋白质G。在本发明中，蛋白质G(优选固定在固相支持体上)可以用于富集表达常用的抗体的B-细胞(这些细胞结合蛋白质G)或富集表达重链抗体的B-细胞(这些细胞不结合蛋白质G)。或者，可以用荧光染料(诸如荧光素，Cy3,Cy5,得克萨斯红等)标记蛋白质G并且与B-细胞群一起孵育。然后可以通过使用荧光活化的细胞分选仪(FACS)分选不同亚群从表达重链抗体的B-细胞中分离表达常用抗体的B-细胞。显然，可以使用对駱驼科抗体CH1结构域增加的单克隆抗体或多克隆抗血清而非蛋白质G。通过扩展这一手段，对抗体轻链(轻链可变域，轻链恒定域或它们两者)增加的单克隆抗体或多克隆抗血清也能够从表达重链抗体的B-细胞亚群中分离表达常规结构域的B-细胞亚群。在第二种手段中，轻链可变域在本发明中是有用的。正如本发明引言部分中所述，始终在常用抗体中发现作为与重链可变域配对的可变轻链结构域。相反，重链抗体不具有轻链可变域。因此，在一方面-常用抗体—VH结构域上的VL结合位点被VL结构域占据，而在重链抗体中，VHH结构域上的VL结合位点仍然未被占据。骆驼科重链的VHH可变域已经在认为防止VL结合的VL-结合位点上获得。然而，值得指出的是在VHH结构域，这些突变(在37,44,45和47位上-Kabat编号)并非始终相同且更重要的是，并非始终同时存在于所有位置上。这种变异性程度提示尽管这种标记对生物物理学特性，，诸如在溶液中的溶解度和单体状态而言是有益的，但是它可以有利地被其它特征替代，诸如长CDR3，在W103位(Kabat编号)上的突变且还有CDRs内的氨基酸组成。这类骆驼VHH序列的实例可以在专利中找到(WO2004041862的表1，4，5,6;WO2004041865—表4;WO2004041863-表4,5,7,8)。因此，较大比例的camelid重链可变域提供了与常用抗体重链可变域VL-界面类似的上述VL-界面。这就产生了如下结论可以通过接触固定化分离的VL结构域(来自骆驼科或来自其它哺乳动物)或染料标记的VL结构域从表达常用抗体的B-细胞中分离这类B-细胞亚群。VL和VH结构域根据其组合性质而言是混杂的，能够通过链改组使常用抗体亲和力成熟(Marks等(1992)Biotechnology(NY)10,779-783)。因此，对这类选择而言发现混杂的轻链可变域的可能性是相对良好的。还应注意，尽管VL结构域与单体重链VHH的单体相互作用低于VL结构域与常用VH结构域的相互作用，但是提出的选择方案可以緩解这一问题。实际上，通过固定VL结构域和通过使其接触B-细胞，较大的亲和力作用会因在B-细胞表面上展示出许多相同的抗体拷贝而出现。本发明的一个有意义的实施方案在于使用VL结构域也可以在B-细胞表面上不同类型的常用抗体之间区分。VL结构域对VH结构域的亲和力可以改变(解离常数为10-9M-IO-6M-由Pliickthun(1992)/mww"o/.Aev.130，151-188综述)。因此，可以预计，甚至在常用抗体内也存在具有不同程度的VL与VH结构域配对的亚群。通过用固定化VL结构域选择展示出常用抗体的B-细胞，可以分离那些表达常用抗体的B-细胞，其中抗体内VL与VH结构域之间的配对较弱，而-由于固定化VL结构域大量过量，VH结构域与固定化VL结构域配对会得以促进，由此导致B-细胞固定。这种手段特别有意义，因为它有助于选择表达具有非常混杂的VH结构域的常用抗体的B-细胞亚群，这在认为单一可变域格式变换时具有重要性。I.使用抗体轻链可变域的选择本发明在一个实施方案这提供了用于从抗体多肽类的所有组成成分中选择结合靶配体和一般配体的功能性可变域群体的方法，所述一般配体能够结合所有组成成分中的功能性成员，而与靶配体特异性无关，该方法包括下列步骤a)使所有组成成分接触所述一般配体并且选择与之结合的功能性可变域；和b)使选择的功能性可变域接触靶配体并且选择结合靶配体的可变域；其中可变域为重链可变域且一般配体为抗体轻链可变域。本发明关注选择的重链可变域可以存在于IgG,Fab,Fab，，F(ab)2,F(ab，)2,scFv,Fv和二石危键键合的Fv,即具有至少一种重链和轻链可变域配对的抗体或抗体片段上。不希望受到任何理论约束，认为在这些配对的某些实例中，可变域配对为+〉散互补的，即结构域可以-f又通过抗原结合主要衔接抗原或主要衔接可变域之一，但并非衔接配对中的另一个至任何突出的程度。例如，在某些VH/VL配对中，例如在某些人或Camelid4-链IgG中，重链可变域可以提供主要的/唯一的与抗原的结合接触。因此，本申请具有从抗体多肽群体中选择本说明书中的抗体或抗体片段的应用，因为用于步骤a)中的轻链可变域结合至少一种具有疏松VH/VL互补性的抗体或片段(IgG,Fab,Fab，，F(ab)2,F(ab，)2,scFv,Fv或二硫键键合的Fv)提供的VH。这提供了选择VH的有用的方式，所述VH可以用作单一可变域(dAb或NanobodyTM)诊断，治疗和/或预防产品或研发它们的起点。选择的抗体或抗体片段自身可以具有这类产品的用途，例如找到抗原，其中"存活能力或疏松VH/VL配对可能有利的。因此，例如，本发明用于能够进行这类作为来自IgG群体的亚组的理想的IgG的这类选择，所述IgG群体例如一膝驼或人IgG或人源化或嵌合IgG群体。作为这一概念的延伸，本文在I和II部分中所述本发明可以用于选择抗体或抗体片段(例如IgG,Fab，Fab，，F(ab)2，F(ab，)2,双特异抗体，scFv配对二聚体)，其包含如WO03002609A2,WO04003019A2和WO04058821A2中任意一篇中才皮露的双特异性配体，其中该双特异性配体具有至少一种VH/VL或VH/VH或VL/VL配对，其中配对中的可变域各自结合相应的抗原。抗原种类可以相同(例如均结合TNFa,vWF,血清清蛋白的VH和VL或本文披露的任意其它靶抗原)或可变域可以结合不同抗原种类，例如结合血清清蛋白和其它TNFa的抗原或任意其它耙抗原。在一个实施方案中，抗体多肽类群体为抗体单一可变域群体。因此，该群体可以为Camelid或人抗体重链可变域群体。在一个实施方案中，其为VHH结构域或NanobodiesTM群体。任选步骤b)中的重链可变域为Camelid可变域(VHH)，Nanobodiestm或来源于Camelid重链抗体(H2抗体)；或任选重链可变域各自为人可变域或来源于人。优选首先使抗体多肽类的所有组成成分接触靶配体且然后接触一般配体。或者，使抗体多肽类接触一般配体且然后接触靶配体。优选一般配体结合所有组成成分中的可变域亚组。在一个实例中，重链可变域的两个或多个亚组选自多肽类的所有组成成分。在这种情况中的选择可以使用两种或多种一般配体，即两种或多种不同的轻链可变域进行。优选在选择后合并两个或多个亚组以便产生多肽类的额外所有组成成分，然后按照本发明对轻链可变域选择。在一个实施方案中，使多肽类中的两种或多种所有组成成分接触一般配体(相同或不同的一般配体)且然后合并由此获得的多肽类亚组。在本发明的另一个方面中提供了从抗体多肽类群体中选择至少一种抗体重链可变域的方法，该方法包括a)使所述群体接触抗体轻链可变域；和b)选择至少一种结合轻链可变域的抗体重链可变域。与上述实施方案一样，关注选择的重链可变域可以存在于IgG,Fab,Fab，，F(ab)2，F(ab，)2,scFv，Fv和二石危键键合的Fv，即具有至少一种重链和轻链可变域配对的抗体或抗体片段上。上述有关从疏松VH/VL配对中选择VH的讨论在此处也是适合的。优选在步骤a)前，存在使抗体多肽类接触靶配体和选择结合靶配体的抗体多肽类的步骤，由此提供所述用于步骤a)的抗体多肽类群体。优选在步骤b)后，存在使步骤b)中选择的抗体重链可变域接触靶配体和选择结合耙配体的重链可变域的步骤。优选步骤b)中选择的重链结构域各自来自下组来源于Camelid的重链可变域；VHH结构域；Nanobody;在44位上具有甘氨酸的VHH;在45位上具有亮氨酸的VHH;在47位上具有色氨酸的VHH;在44位上具有甘氨酸并且在45位上具有亮氨酸的VHH;在44位上具有甘氨酸并且在47位上具有色氨酸的VHH;在45位上具有亮氨酸并且在47位上具有色氨酸的VHH;在44位上具有甘氨酸，在45位上具有亮氨酸并且在47位上具有色氨酸的VH;在103位上具有色氨酸或精氨酸的VHH。编号按照Kabat编号规则进行(Kabat等.，1991,SequencesofImmunologicalInterest,5thed.U.S.Dept.Health&人Services,Washington,D.C.)。优选步骤b)中选择的重链结构域各自为人源化Camelid或鼠重链可变域或人源化NanobodyTM。优选步骤b)中选择的重链结构域各自为人重链可变域；来源于人的重链可变域；和人源化重链可变域(例如人源化Camelid或鼠可变域)。优选轻链可变域为人轻链可变域；来源于人；具有FW2序列的轻链可变域，所述FW2序列与种系基因序列DPK9编码的FW2相同；或具有人界面区(即通常与人VH/VL配对的VH结构域分界面的区)的轻链结构域(例如Camelid-衍生的VL)。在另一个实例中，轻链可变域为Camelid轻链可变域或来源于Camelid。优选步骤a)中的群体由B-细胞群，例如外周血淋巴细胞提供。在一个实例中，B-细胞分离自已经免疫接种靶抗原的哺乳动物(例如小鼠或Camelid,例如美洲驼羊或骆驼)。在另一个实例中，B-细胞分离自尚未免疫接种靶抗原的哺乳动物(例如小鼠或Camelid,例如美洲驼羊或骆驼)。在一种选择中，步骤a)中使用的群体由通过合成方式重排的抗体基因编码的抗体多肽类的所有组成成分提供。在一个实施方案中，步骤a)中使用的群体由包含展示所述抗体多肽类的噬菌体的噬菌体展示文库提供。这类文库的实例披露在WO99/20749中。还参照WO04003019A2，WO05044858A1，WO04062551A2,WO04041867A2，WO04041865A2,WO04041863A2和WO04041862A2中有关噬菌体展示文库的实例。在一个实施方案中，步骤a)中是使用的群体包含(i)各自包含不与轻链可变域配对的至少一种重链可变域的抗体多肽类；和(ii)各自包含与轻链可变域配对的抗体多肽类。因此，例如，本发明的方法用于从还包含例如IgG形式的配对V结构域的混合群体中选出抗体单一可变域(即未配对的V结构域)。因此，本发明应用于从还包含Camelid4-链IgG(具有配对的VH/VL结构域)的混合群体(例如由B-细胞，诸如外周血淋巴细胞提供)中选择VHH单一可变域。类似地，存在从还包含人4-链IgG的混合群体中选择人VH的应用。如果选择单一可变域与IgG,其中VH/VL配对为如上所述"有活力的"，那么在步骤b)后可以存在额外的步骤，其中从选择的IgG中分离单一可变域(例如基于大小或通过任意其它常规技术)。可以从B-细胞或噬菌体(或酵母或任意其它用于连接表型与基因型的文库的系统)中分离使用本发明任意实施方案的编码选择的单一可变域的核普酸序列并且插入表达可变域的表达载体。任选可以使核苷酸序列突变(例如在CDR3和/或FW中引入一种或多种突变)和/或可操作地与一种或多种抗体结构域(例如另一种单一可变域)，抗体Fc结构域，标记或效应基团连接，此后从表达载体中表达。优选用于步骤a)的群体包含camelid重链单一可变域(VHH)或NanobodiesTM。优选用于步骤a)的群体包含包含人重链单一可变域(VH)。在一个特别优选的实施方案中，提供了从Camelid抗体多肽类群体中选择至少一种Camelid抗体VHH结构域的方法，所述Camelid抗体多肽类由分离自已经免疫接种靶抗原的Camelid的B-细胞提供，该方法包括a)使所述群体接触抗体轻链可变域；和b)选择至少一种结合轻链可变结构域的VHH结构域。在该优选的实施方案中，优选轻链可变域为人轻链可变域。在该优选的实施方案中，优选将B-细胞提供在多个孔或储器中，其中各孔或储器中平均包含一种B-细胞类型。本发明还提供了方法，包含(i)使用靶抗原对抗体多肽类的起始抗体多肽类群体；和(ii)使用选择的群体作为用于本发明方i步骤a、)中的抗体多肽类群体。在本发明的方法中，在步骤b)中，优选使选择的抗体重链可变域中的至少一种与蛋白质部分融合或与之缀合。优选蛋白质部分选自噬菌体外被蛋白、一种或多种抗体结构域、抗体Fc结构域、酶、毒素、标^己和步支应基团。优选在步骤b)中，选择的抗体重链可变域中的至少一种为抗体部分或抗体片段，其选自IgG、Fab、Fab，、F(ab)2、F(ab，)2、scFv、Fv和二硫键键合的Fv。本发明还提供了包含抗体重链可变域或由其组成的分离的抗体多肽，其中多肽可通过包含步骤a)和b)的方法获得，其中该方法中的轻链可变域为人轻链可变域且重链可变域来自非人的哺乳动物，例如Camelid。优选重链可变域来自下组来源于Camelid的重链可变域；VHH结构域；Nanobody;在44位上具有甘氨酸的VHH;在45位上具有亮氨酸的VHH;在47位上具有色氨酸的VHH;在44位上具有甘氨酸并且在45位上具有亮氨酸的VHH;在44位上具有甘氨酸并且在47位上具有色氨酸的VHH;在45位上具有亮氨酸并且在47位上具有色氨酸的VHH;在44位上具有甘氨酸，在45位上具有亮氨酸并且在47位上具有色氨酸的VH;在103位上具有色氨酸或精氨酸的VHH。优选将重链可变域作为CamelidIgG或来源于Camelid的IgG的组成部分提供。优选将重链可变域作为人IgG或来源于人的IgG的组成部分提供，并且其中使重链可变域在IgG中与不同于该方法步骤a)中使用的轻链可变域的轻链可变域配对。本发明还提供了这类抗体多肽作为药物的应用。本发明还提供了这类抗体多肽在人疾病或疾患治疗和/或预防中的应用。可适合的疾患和疾病披露在WO04003019A2，WO05044858A1,WO04062551A2,WO04041867A2,WO04041865A2,WO04041863A2和WO04041862A2中，如递送，给药和制剂途径。将所有这些具体的披露内容明确地引入本说明书作为应用于本发明的适当的实例参考。II.使用抗体重链可变域的选择在一个实施方案中，本发明提供了从抗体多肽类的所有组成成分中选择结合靶配体和一般配体的功能性可变域群体的方法，所述一般配体能够结合所有组成成分中的功能性成员，而与靶配体特异性无关，该方法包括下列步骤a)使所有组成成分接触所述一般配体并且选择与之结合的功能性可变域；和b)使选择的功能性可变域接触靶配体并且选择结合靶配体的可变域群体；其中可变域为轻链可变域且一般配体为抗体重链可变域。本发明关注选择的轻链可变域可以存在于IgG，Fab,Fab，，F(ab)2，F(ab，)2,scFv,Fv和二硫键键合的Fv，即具有至少一种重链和轻链可变域配对的抗体或抗体片段上。不希望受到任何理论约束，认为在这79些配对的某些实例中，可变域配对为矛〉散互补的，即结构域可以仅通过抗原结合主要衔接抗原或主要衔接可变域之一，但并非衔接配对中的另一个至任何突出的程度。例如，在某些VH/VL配对中，例如在某些人或Camelid4-链IgG中，轻链可变域可以提供主要的/唯一的与抗原的结合接触。因此，本申请具有从抗体多肽群体中选择本说明书中的抗体或抗体片段的应用，因为用于步骤a)中的重链可变域结合至少一种具有疏松VH/VL互补性的抗体或片段(IgG,Fab,Fab，，F(ab)2,F(ab，)2,scFv，Fv或二硫键键合的Fv)提供的VL。这提供了选择VL的有用的方式，所述VL可以用作单一可变域(dAb或NanobodyTM)诊断，治疗和/或预防产品或研发它们的起点。选择的抗体或抗体片段自身可以具有这类产品的用途，例如找到抗原，其中"活力或疏松VH/VL配对可能有利的。因此，例如，本发明用于能够进行这类作为来自IgG群体的亚组的理想的IgG的这类选择，所述IgG群体例如骆驼或人IgG或人源化或嵌合IgG群体。作为这一概念的延伸，本文在I和II部分F(ab)2,F(ab，):，、艰特异抗体f'scFv配对二聚体)，其包含如WO03002609A2,WO04003019A2和WO04058821A2中任意一篇中才皮露的双特异性配体，其中该双特异性配体具有至少一种VH/VL或VH/VH或VL/VL配对，其中配对中的可变域各自结合相应的抗原。抗原种类可以相同(例如均结合TNFa,vWF,血清清蛋白的VH和VL或本文披露的任意其它耙抗原)或可变域可以结合不同抗原种类，例如结合血清清蛋白和其它TNFa的抗原或任意其它粑抗原。在一个实施方案中，抗体多肽类群体为抗体单一可变域群体。因此，该群体可以为Camelid或人抗体轻链可变域群体。任选步骤b)中的轻链可变域为Camelid轻链可变域(VHH)或来源于Camelid;或任选轻链可变域各自为人可变域或来源于人。优选首先使抗体多肽类的所有组成成分接触靶配体且然后接触一般配体。或者，使抗体多肽类接触一般配体且然后接触粑配体。优选一^:配体结合所有组成成分中的可变域亚组。在一个实例中，重链可变域的两个或多个亚组选自多肽类的所有组成成分。在这种情况中的选择可以使用两种或多种一般配体，即两种或多种不同的重链可变域进行。优选在选择后合并两个或多个亚组以便产生多肽类的额外所有组成成分，然后按照本发明对重链可变域选择。在一个实施方案中，使多肽类中的两种或多种所有组成成分接触一般配体(相同或不同的一般配体)且然后合并由此获得的多肽类亚组。在本发明的另一个方面中提供了从抗体多肽类群体中选择至少一种抗体轻链可变域的方法，该方法包括a)使所述群体接触抗体重链可变域；和b)选择至少一种结合重链可变域的抗体轻链可变域。与上述实施方案一样，关注选择的轻链可变域可以存在于IgG,Fab，Fab，，F(ab)2，F(ab，)2,scFv,Fv和二硫键键合的Fv,即具有至少一种重链和轻链可变域配对的抗体或抗体片段上。上述有关从疏松VH/VL配对中选择VL的讨论在此处也是适合的。优选在步骤a)前，存在使抗体多肽类接触耙配体和选择结合靶配体的抗体多肽类的步骤，由此提供所述用于步骤a)的抗体多肽类群体。优选在步骤b)后，存在使步骤b)中选择的抗体轻链可变域接触靶配体和选择结合耙配体的轻链可变域的步骤。优选步骤b)中选择的轻链结构域为人源化Camelid或鼠轻链可变域。优选步骤b)中选择的轻链结构域各自为人轻链可变域；来源于人的轻链可变域；或人源化轻链可变域(例如人源化Camelid或鼠可变域)。优选重链可变域为人重链可变域；来源于人；具有FW2序列的轻链可变域，所述FW2序列与种系基因序列DP47编码的FW2相同；或具有与种系基因序列DP47编码的44,45和47位相同的44,45和47位的重链可变域；或具有人界面区(即通常与人VH/VL配对重的VL结构域分界面的区)的重链结构域(例如Camelid-衍生的VH)。在另一个实例重，重链可变域为Camelid重链可变域或来源于Camelid。优选步骤a)中的群体由B-细胞群，例如外周血淋巴细胞提供。在一个实例中，B-细胞分离自已经免疫接种靶抗原的哺乳动物(例如小鼠或Camelid,例如美洲驼羊或骆驼)。在另一个实例中，B-细胞分离自尚未免疫接种耙抗原的哺乳动物(例如小鼠或Camelid,例如美洲驼羊或骆驼)。在一种选择中，步骤a)中使用的群体由通过合成方式重排的抗体基因编码的抗体多肽类的所有组成成分提供。在一个实施方案中，步骤a)中使用的群体由包含展示所述抗体多肽类的噬菌体的噬菌体展示文库提供。这类文库的实例披露在WO99/20749中。还参照WO04003019A2,WO05044858A1,WO04062551A2,WO04041867A2,WO04041865A2,WO04041863A2和WO04041862A2中有关噬菌体展示文库的实例。在一个实施方案中，步骤a)中是使用的群体包含(i)各自包含不与重链可变域配对的至少一种轻链可变域的抗体多肽类；和(ii)各自包含与轻链可变域配对的重链可变域的抗体多肽类。因此，例如，本发明的方法用于从还包含例如IgG形式的配对V结构域的混合群体中选出抗体单一可变域(即未配对的V结构域)。因此，本发明应用于从还包含Camelid4-链IgG(具有配对的VH/VL结构域)的混合群体(例如由B-细胞，诸如外周血淋巴细胞提供)中选择VL单一可变域。如果选择单一可变域与IgG,其中VH/VL配对为如上所述"有活力的"，那么在步骤b)后可以存在额外的步骤，其中从选择的IgG中分离单一可变域(例如基于大小或通过任意其它常规技术)。可以从B-细胞或噬菌体(或酵母或任意其它用于连接表型与基因型的文库的系统)中分离使用本发明任意实施方案的编码选择的单一可变域的核苦酸序列并且插入表达可变域的表达载体。任选可以使核苷酸序列突变(例如在CDR3和/或FW中引入一种或多种突变)和/或可操作地与一种或多种抗体结构域(例如另一种单一可变域)，抗体Fc结构域，标记或效应基团连接，此后从表达载体中表达。优选步骤a)中使用的群体包含camelid轻链单一可变域。优选步骤a)中使用的群体包含人轻链单一可变域(VL)。本发明还提供了方法，包含(i)使用靶抗原对抗体多肽类的起始抗体多肽类群体；和(ii)使用选择的群体作为用于本发明方法步骤、a)中的抗体多肽类群体。在本发明的方法中，在步骤b)中，优选使选择的抗体轻链可变域中的至少一种与蛋白质部分融合或与之缀合。优选蛋白质部分选自噬菌体外被蛋白、一种或多种抗体结构域、抗体Fc结构域、酶、毒素、标记和-丈应基团。优选在步骤b)中，选择的抗体轻链可变域中的至少一种为抗体部分或抗体片l殳，其选自IgG、Fab、Fab，、F(ab)2、F(ab，)2、scFv、Fv和二硫键键合的Fv。本发明还提供了包含抗体轻链可变域或由其组成的分离的抗体多肽，其中多肽可通过包含步骤a)和b)的方法获得，其中该方法中的重链可变域为人重链可变域且重链可变域来自非人的哺乳动物，例如Camelid。优选轻链可变域来源于Camelid。优选将轻链可变域作为CamelidIgG或来源于Camelid的IgG组成部分提供。优选将轻链可变域作为人IgG或来源于人的IgG的组成部分提供，且其中使轻链可变域在IgG中与不同于该方法步骤a)中使用的重链可变域的重链可变域配对。本发明还提供了这类抗体多肽作为药物的应用。本发明还提供了这类抗体多肽在人疾病或疾患的治疗和/或预防中的应用。本发明还提供了这类抗体多肽在人疾病或疾患治疗和/或预防中的应用。可适合的疾患和疾病4皮露在WO04003019A2,WO05044858A1,WO04062551A2，WO04041867A2，WO04041865A2,WO04041863A2和WO04041862A2中，如递送，给药和制剂途径。将所有这些具体的披露内容明确地引入本说明书作为应用于本发明的适当的实例参考。在一个实施方案中，按照I部分中所列的方法选择抗体重链可变域群体，并且按照II部分中所列的方法选择抗体轻链可变域，且然后合并由此获得的群体。III.使用T-细胞受体结构域的选择本发明提供了从多肽类的所有组成成分中选择结合靶配体和一般配体的功能性T-细胞受体结构域群体的方法，所述一般配体能够结合所有组成成分中的功能性成员，而与靶配体的特异性无关，该方法包括下列步骤a)使所有组成成分接触所述一般配体并且选择与之结合的功能性T-细胞受体结构域；和b)使选择的功能性T-细胞受体结构域接触耙配体并且选择结合靶配体的T-细胞受体结构域群体；其中a)T-细胞受体结构域为Va结构域且一般配体为T-细胞受体Vp结构域；或b)T-细胞结构域为T-细胞受体Vp结构域且一般配体为T-细胞受体Va结构域。任选在a)中，T-细胞受体Va结构域为来源于Camelid的Camelid结构域；或任选在a)和b)中，T-细胞受体结构域各自为人结构域或来源于人。优选按照该方法选择T-细胞受体Va结构域群体并且按照该方法选择T-细胞受体Vp结构域，且然后合并由此获得的群体。其它实施例,滋辨」/;4丙个^參淘^磁豕^双^;^凝#^^;_^游#诈为、岸戎^-挣#^重遂^傳^^^:鍵在第0,7,14,21,28,35，42，49和54天时给1只成年美洲驼羊注射1mg人破伤风类毒素(TT)。在每次注射前采集血清，随后发生对免疫原的免疫应答。从免疫接种动物中采集抗凝血(150ml)并且使用Unisep(WAKChemie,Germany)制备外周血淋巴细胞(PBLs)。使用蛋白质G包被无菌ELISA平板(在4°C下10(xg/ml过夜)，然后用无菌PBS洗涤，用无菌PBS-10%IgG-耗尽的FCS(胎牛血清)封闭且然后再用PBS洗涤。使用TT包被无菌ELISA平板(在4°C下10pg/ml过夜)，然后用无菌PBS洗涤，用无菌PBS-10%IgG-耗尽的FCS(胎牛血清)封闭且然后再用PBS洗涤。首先将纯化的PBLs(在PBS中)加入到蛋白质G-包被的孔中并且使其在37。C下结合至少1小时。从蛋白质G-包被的各孔中谨慎取出上清液中未结合的细胞(主要展示重链抗体或无抗体)并且合并。将表达重链的B-细胞中富集的细胞群加入到TT-包被的孔(以300个细胞/孔和1,500个细胞/孔的密度)中并且使其在37°C下结合至少1小时。通过用培养基洗涤10次除去上清液中未结合的细胞。在有包被抗原，T细胞条件培养基(3%)和EL-4细胞(5xIOV孔)存在下将表达抗原-特异性重链抗体的细胞培养7天。通过使用蛋白质A-辣才艮过氧化物酶缀合物和TMB底物的ELISA分析新鲜TT-包被的孔中小体积的培养物上清液中的抗体结合鉴定分泌抗原-特异性抗体的阳性孔。选择阳性B-细胞孔用于进一步处理使B-细胞沉淀，除去上清液并且将细胞沉淀重新悬浮于10pl新鲜培养基(含有1-6%丁-细胞条件培养基的DMEM或RPMI)。取等分部分(各2pl)用于使用MJResearchRobusRT-PCR试剂盒(CatalogueNo.F-580L)的PCR，其中使用下列混合物/管来分离重链可变域35.55^11W2.5|tilDEPC水lOx緩沖液dNTPS10%NP-40RNAsinRT聚合酶2pl引物混合物(*)lpl(各IO^iM)MgC121.5PCR程序在50°C下30分钟，随后在94°C下2分钟且然后是[94°C/1分钟，55。C/1分钟，72°C/1分钟]的40个循环。组织伸展72。C/5分钟。*:该混合物包含下列两种引物寡-dT引物和单一变性的FR1引物5，誦GAGGTBCARCTGCAGGASTCYGG國3，，其编码尸Wl限制位点。用尸Wl和5wEII切割1,300bp片段。后一种酶通常在编码重链抗体的构架4的DNA片段中切割。在电泳和UV照射后从琼脂糖凝胶中分离消化产物并且连入克隆载体的相应位点，所述克隆载体可以在用于生长的选择性抗生素条件下在大肠杆菌中增殖。连接载体用于转化大肠杆菌细胞并且对尸W7/SWMI插入片段测序以^f更揭示出重链可变域的DNA序列。#滋辨S;遞《^游淘这和^4勿/^##^^^瘦凝#^^^厶叙#f#链拔沐的Tf械在第0,7,14,21，28，35,42,49和54天时给1只成年美洲驼羊注射1mg人破伤风类毒素(TT)。在每次注射前采集血清，随后发生对免疫原的免疫应答。从免疫接种动物中采集抗凝血(150ml)并且使用Unisep(WAKChemie,Germany)制备外周血淋巴细胞(PBLs)。使用VL结构域VL结构域(例如Conrath等(2005)丄A/o/350，112-25所述VL结构域)包被无菌ELISA平板(在4°C下10pg/ml过夜)，然后用无菌PBS洗涂，用无菌PBS-10%IgG-耗尽的FCS(胎牛血清)封闭且然后再用PBS洗涤。使用应用对暴露的赖氨酸残基具有特异性的N-羟基琥珀酰亚胺基(NHS)的德克萨斯红或异疏氰酸荧光素(FITC)标记破伤风类毒素。通过使标记的TT通过PD10柱(AmershamBiosciences)除去过量的荧光标记。通过质谱(MALDI-TOF)评价使用德克萨斯红或FITC标记的程度。首先在室温下将纯化的PBLs与标记的TT一起孵育30分钟(就106个细胞而言使用1ug标记的TT)。遞^"岸心5为、#产沉淀勿^敏#^重新,者孕于(Um/尸SS哞。然后用安装了自动细胞存放部件的流式细胞仪(例如来自Coulter,Florida,USA的CoulterEpicsElite流式细胞仪)分选细胞中的TT-阳性细胞。将所有TT-结合的阳性细胞收集在单一储器中。在该阶段，抗原-特异性B-细胞表达细胞表面上的常规抗体或重链抗体。如下进行对表达抗原-特异性重链抗体的B-细胞亚群的进一步分离。将合并的B-细胞中富集的细胞群加入到蛋白质L-包被的孔中并且使其在37°C下结合至少1小时。通过用培养基洗涤10次除去上清液中未结合的细胞(主要展示常用抗体或无抗体)。取出结合的细胞(表达抗原-特异性重链抗体)，计数并且用于在有T细胞条件培养基(3%)存在下以0.3细胞/孔的接种比例接种新鲜的EL4-B5T-细胞包被的孔(5x104/孔)。将细胞培养7天，此后通过使用蛋白质A-辣根过氧化物酶缀合物和TMB底物的ELISA分析新鲜TT-包被的孔中小体积的培养物上清液中的抗体结合鉴定分泌抗原-特异性重链抗体的阳性孔。选择阳性B-细胞孔用于进一步处理使B-细胞沉淀，除去上清液并且将细胞沉淀重新悬浮于10pl新鲜培养基(含有1-6%丁-细胞条件培养基的DMEM或RPMI)。取等分部分(各2pl)用于使用MJResearchRobusRT-PCR试剂盒(CatalogueNo.F-580L)的PCR,其中使用下列混合物/管来分离重链可变域DEPC水35.5pl10x緩冲液dNTPS1W10%NP-402.5(li1RNAsin0.5(^1RTlpl聚合酶2pl引物混合物("lpl(各10|iiM)MgC121.5PCR程序在50°C下30分钟，随后在94°C下2分钟且然后是[94。C/1分钟，55。C/1分钟，72°C/1分钟]的40个循环。组织伸展72。C/5分钟。*:该混合物包含下列两种引物寡-dT引物和单一变性的FR1引物5，-GAGGTBCARCTGCAGGASTCYGG-3，，其编码尸Wl限制位点。用尸WI和切割1,300bp片段。后一种酶通常在编码重链抗体的构架4的DNA片段中切割。在电泳和UV照射后从琼脂糖凝胶中分离消化产物并且连入克隆载体的相应位点，所述克隆载体可以在用于生长的选择性抗生素条件下在大肠杆菌中增殖。连接载体用于转化大肠杆菌细胞并且对尸W//^^11插入片段测序以^f更揭示出重链可变域的DNA序列。附录1a)细胞因子，细胞因子受体，酶等，包括细胞因子，细胞因子受体，酶，酶辅因子或DNA结合蛋白。合适的细胞因子和生长因子包括，但不限于ApoE,Apo-SAA,BDNF,心脏营养素-1，EGF,EGF受体，ENA-78,嗜酸细胞活化趋化因子，嗜酸细胞活化趋化因子-2，Exodus-2，FGF-酸性，FGF-石咸性，成纤维细胞生长因子-10,FLT3配体，趋化骨分子(CX3C)，GDNF,G陽CSF，GM-CSF，GF國卩1,胰岛素，IFN画y，IGF-I,IGF-II,IL画la,IL隱1卩，IL-2,IL画3，IL國4，IL-5,IL國6，IL國7，IL-8(72a.a.)，IL画8(77a.a.)，IL-9,IL-10,IL-11,IL-12,IL-13,IL-15,IL-16,IL-17,IL-18(IGIF),抑制素a,抑制素p,IP-10,角质化细胞生长因子-2(KGF-2),KGF，瘦蛋白，LIF,淋巴细胞趋化蛋白，穆勒抑制物，单核细胞集落抑制因子，单核细胞引诱蛋白，M-CSF,MDC(67a.a.),MDC(69a.a.)，MCP國1(MCAF),MCP-2,MCP画3，MCP-4,MDC(67a.a.),MDC(69a.a.)，MIG,MIP-la,MIP-1卩，MlP陽3a,MIP-3卩，MIP國4，骨髓先祖细胞抑制因子-l(MPIF-l),NAP-2,Neurturin,神经生长因子，|3-NGF,NT國3，NT-4,制癌蛋白M,PDGF画AA,PDGF-AB，PDGF國BB，PF-4,RANTES,SDFla,SDF1卩，SCF，SCGF，干细胞因子(SCF),TARC,TACE识别位点，TGF-a,TGF-卩，TGF國卩2，TGF画卩3，肿瘤坏死因子(TNF),TNF-a,TNF陽卩，TNF受体I(p55)，TNF受体II,TNIL画l,TPO,VEGF,VEGF受体l,VEGF受体2，VEGF受体3，GCP-2,GRO/MGSA,GRO-|3,GRO誦y,HCC1,1-309,HER1,HER2,HER3和HER4。细胞因子受体包括上述细胞因子各自的受体，例如IL-1R,IL-6R,IL-10R，IL陽18R等。可以理解该清单绝非穷尽。本发明优选的抗原单一可变域多肽类的耙标披露在WO04/041867中(将该文献的内容完整地引入本文作为参考)，并且包括，但不限于TNFa,IgE,IFNy,MMP-12,EGFR,CEA,幽门螺杆菌(H.pylori),TB,流感，PDK-1,GSK1,Bad，胱天蛋白酶，Forkhead和冯维勒布兰德因子(vWF)。靶标还可以为上述靶标的片段。因此，靶标还为能够引起免疫应道的上述靶标的片段。靶标还为能够结合对全长靶标增加的抗体单一可变域多肽的上述靶标的片段。b)能够增加部分半衰期的抗原(后面的部分为，例如治疗或成像蛋白质部分，例如抗体或抗体片段，例如抗体可变域，诸如人VH或VL结构域或CamelidVHH)。a-1糖蛋白(血清类粘蛋白)(AAG)a-l抗月夷凝乳蛋白酶(Antichyromotrypsin)(ACT)a-l抗胰蛋白酶(AAT)a-l微球蛋白(蛋白质HC)(AIM)a-2巨3求蛋白(A2M)抗凝血酶m(ATIII)载脂蛋白A-l(ApoA-l)载脂蛋白B(ApoB)(3-2-微球蛋白(B2M)血浆铜蓝蛋白(Cp)补体成分(C3)补体成分(C4)Cl酯酶抑制剂(C1腿)C-反应蛋白(CRP)半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(CysC)铁蛋白(FER)血纤蛋白原(FIB)纤连蛋白(FN)结合球蛋白(Hp)血液结合素(HPX)免疫球蛋白A(IgA)免疫球蛋白D(IgD)免疫球蛋白E(IgE)免疫球蛋白G(IgG)免疫球蛋白M(IgM)免疫球蛋白轻链(K/入)脂蛋白)[Lpa]]甘露糖-结合蛋白(MBP)月几J求蛋白(Myo)纤溶酶原(PSM)前白蛋白(转甲状腺素蛋白)(PAL)视黄醇-结合蛋白(RBP)Rheomatoid因子(RF)血清淀粉样蛋白A(SAA)可溶性运4失蛋白(Tranferrin)受体(sTfR)运铁蛋白(Tf)G:能够增加配体半衰期的抗原来自胞外基质的蛋白质，例如胶原蛋白，层粘连蛋白，整联蛋白和纤连蛋白。胶原蛋白为胞外基质中的主要蛋白质。目前已知在身体的不同部位中发现的约15个类型的胶原蛋白分子，例如在骨、皮肤、腱、韧带、角膜、内脏器官中发现的I型胶原蛋白(占身体胶原蛋白的90%)或在软骨、推间盘、脊索、眼的玻璃体液中发现的II型胶原蛋白。在血液中发现的蛋白质包括血浆蛋白，诸如血纤蛋白，a-2巨球蛋白，血清清蛋白，血纤蛋白原A,血纤蛋白原B,血清淀粉样蛋白蛋白质A,heptaglobulin,蛋白质，遍在蛋白，子宫球蛋白和p-2-微球蛋白；酶和抑制剂，诸如纤溶酶原，溶菌酶，胱蛋白酶抑制剂C,a-l-抗胰蛋白酶和胰kypsin抑制剂。纤溶酶原为胰蛋白酶-样2s丝氨酸蛋白酶纤维蛋白溶酶的无活性前体。一般发现它通过血流循环。当纤溶酶原变活化并且转化成纤维蛋白溶酶时，它不折叠有效酶结构域，该结构域溶解掺入血块中血细胞的血纤蛋白原纤维。这称作纤维蛋白溶解；免疫系统蛋白，诸如IgE,IgG，IgM;转运蛋白，诸如视黄醇结合蛋白，o-l微球蛋白；防御素，诸如P-防御素l,嗜中性粒细胞防御素l,2和3;在血脑屏障或神经组织上发现的蛋白质，诸如黑皮质素受体，髓磷脂，抗坏血酸盐转运蛋白；运铁蛋白受体特异性配体-神经药物活性剂融合蛋白(参见US5977307);脑毛细血管内皮细胞受体，运铁蛋白受体，胰岛素，胰岛素-样生长因子l(IGFl)受体，胰岛素-样生长因子2(IGF2)受体，胰岛素受体；位于肾的蛋白质，诸如多嚢蛋白，IV类胶原蛋白，有机阴离子运4失蛋白Kl,Heymann抗原。位于肝的蛋白质，例如醇脱氬酶，G250;凝血因子X;al抗胰蛋白酶；HNFla;位于肺的蛋白质，诸如分泌成分(结合IgA);位于心脏的蛋白质，例如HSP27,它与扩张型心肌病相关；位于皮肤的蛋白质，例如角蛋白；骨特异性蛋白，诸如骨形态发生蛋白(BMPs),其为显示成骨活性的转化生长因子卩超家族亚组，实例包括BMP-2、-4、-5、-6、-7(也称作成骨蛋白(OP-1)和-8(OP-2);胂瘤特异性蛋白，包括人滋养层抗原，赫赛汀受体，雌二醇受体，组织蛋白酶，例如组织蛋白酶B(在肝和脾中发现)；疾病-特异性蛋白，诸如仅在活化的T-细胞上表达的抗原包括LAG-3(淋巴细胞活化基因)，骨保护素配体(OPGL),参见A^w^402，304-309;1999,OX40(TNF受体家族成员，在活化的T细胞上表达且已知仅共刺激T细胞分子在产生人T细胞白血病病毒I型(HTLV-I)的细胞中特异性增量调节)，参见J/mmw"o/.2卯0JW/，/65(7」,2<53-70;金属蛋白酶(与关节炎/癌症相关)，包括CG6512果蝇属(Drosophila)，人截瘫蛋白，人FtsH,人AFG3L2,鼠ftsH;生成血管的生长因子，包括酸性成纤维细胞生长因子(FGF-1),碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)，血管内皮生长因子/血管渗透因子(VEGF/VPF),转化生长因子-a(TGFa),肿瘤坏死因子-a(TNF-a),血管生成素，白细胞介素-3(IL-3),白细胞介素-8(IL-8),血小板衍生内皮细胞生长因子(PD-ECGF),胎盘生长因子(P1GF)，中期因子血小板衍生生长因子-BB(PDGF),CXXXX趋化分子；应激蛋白(热激蛋白)；HSPs—般在胞内分析。当发现它们在胞外时，其为细胞死亡和发散出其内含物的指示剂。这种非程序性细胞死亡(坏死)仅在作为创伤，疾病或损伤结果是发生，且由此在体内胞外HSPs引起来自抗感染和疾病的免疫系统的反应。结合胞外HSP的双重特异性可以局限于疾病部位；涉及Fc转运的蛋白质；Brambell受体(也称作FcRB);这种Fc受体具有两种功能，这两者均能够用于递送；这些功能为1)IgG通过胎盘从母体转运给儿童；2)防止IgG降解，由此延长其IgG的血清半衰期。认为受体使来自内体的IgG再循环。参见Holliger等，NatBiotechno11997Jul;15(7):632-6。c)耙抗原还可以为下表中的任意一种，而与该抗原是否如表中所示配对无关-<table>tableseeoriginaldocumentpage92</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table>TNFa/IL-11细胞因子以协同作用方式诱导破骨细胞分化由无限增殖化或正常颅盖细胞支持。Jm/尸/z，Zo/Ce〃尸/^wo/.2002Sep;283(3):C679-87。(骨丢失)TNFa/IL-12TNFa/IL-13TNF-a与IL-4或IL-13组合通过增加的mRNA稳定性实现VCAM-1在培养的成纤维细胞样滑膜细胞中的持续升高水平。AmJPathol.1999Apr;154(4):1149-58。白细胞介素-13和胂瘤坏死因子-a以协同作用方式诱导人鼻成纤维细胞中的嗜酸细胞活化趋化因子产生。ClinExpAllergy.2000Mar;30(3):348-55。白细胞介素-13和肺瘤坏死因子-a以协同作用方式诱导人鼻成纤维细胞中嗜酸细胞活化趋化因子产生。C/,"Ex/j〃ergy.2000Mar;30(3):348-55(过敏性炎症)血清TNF-P和IL-13涉及治疗儿童期肾病综合征反应。Cyoh"e.2003Feb7;21(3):155-9。TNFa/IL-14吸入的肺瘤坏死因子a在具有轻度哮喘的受试者中的作用。T7zora;c.2002Sep;57(9):774-8。TNFa/IL-15吸入的肿瘤坏死因子a在具有轻度。孝喘的受试者中的作用。T72画jc.2002Sep;57(9):774-8。TNFa/IL-16胂瘤坏死因子-a-诱导的白细胞介素-16在气道上皮细胞的合成引发5-羟色胺刺激。爿mJAm/^Ce〃Mo/说o/.2003Mar;28(3):354-62.(气道炎症)患有类风湿性关节炎的患者的循环白细胞介素16与促炎细胞因子相关。脸w應fo/，(Oxford).2001Apr;40(4):474-5。无可利用的摘要。白细胞介素16在克罗恩病中增量调节并且参94<table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage97</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage98</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage99</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage100</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage101</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage102</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage103</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage104</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage106</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage107</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage108</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage109</column></row><table>a)公布的单一可变域披露在WO030020609,WO2004101790,WO2005035572,WO2004081026,WO2004003019和WO2004058821中的任意的可变域，将披露的这些可变域，其序列和生产和选择方法明确地引入本文作为参考，以便为本领域技术人员提供用于本发明的一般配体的实例。才皮露在WO9404678,WO9748905,W09933221,W09937681,WO0024884,WO0043507,WO0065057,WO0140310,WO03035694,WO03053531,WO03054015,WO0305527,WO2004015425，WO2004041862,WO2004041863,WO20040401865,WO2004062551，WO2005044858和EP1134231中的任意VHH结构域或任意其它可变域，将4皮露的这些可变域，其序列和生产和选择方法明确地引入本文作为参考，以便为本领域技术人员提供用于本发明的一般配体的实例。b)(i)来源于图7a)中的3-23位基因座或任意其它基因座的种系VH片段的人VH。(ii)具有FW1氨基酸序列的人VH,所述FW1氨基酸序列与来自图7a)中的3-23位基因座或任意其它基因座的种系VH片段的相应FW的氨基酸序列相同或具有达5种来自所述相应FW的氨基酸差异。(iii)具有FW2氨基酸序列的人VH，所述FW2氨基酸序列与来自图7a)中的3-23位基因座或任意其它基因座的种系VH片段的相应FW的氨基酸序列相同或具有达5种来自所述相应FW的氨基酸差异。(iv)具有FW3氨基酸序列的人VH,所述FW3氨基酸序列与来自图7a)中的3-23位基因座或任意其它基因座的种系VH片段的相应FW的氨基酸序列相同或具有达5种来自所述相应FW的氨基酸差异。(v)具有FW4氨基酸序列的人VH,所述FW4氨基酸序列与来自图7a)中的3-23位基因座或任意其它基因座的种系VH片段的相应FW的氨基酸序列相同或具有达5种来自所述相应FW的氨基酸差异。(vi)具有FW1，2,3和4氨基酸序列的人VH,所述FWl,2,3和4氨基酸序列与来自图7a)中的3-23位基因座或任意其它基因座的种系VH片段的相应FW的氨基酸序列相同或其中FW1,2，3和4氨基酸序列共同具有达IO种来自所述相应FWs的氨基酸差异。(vii)来源于图7b)中的DPK9基因座或任意基因组的的人Vk。(viii)具有FW1氨基酸序列的人Vk,所述FW1氨基酸序列与来自图7b)中的DPK9基因座或任意基因座的种系Vk片段的相应FW的氨基酸序列相同或具有达5种来自所述相应FW的氨基酸差异。(ix)具有FW2氨基酸序列的人Vk,所述FW2氨基酸序列与来自图7b)中的DPK9基因座或任意基因座的种系Vk片段的相应FW的氨基酸序列相同或具有达5种来自所述相应FW的氨基酸差异。(x)具有FW3氨基酸序列的人Vk,所述FW3氨基酸序列与来自图7b)中的DPK9基因座或任意基因座的种系Vk片段的相应FW的氨基酸序列相同或具有达5种来自所述相应FW的氨基酸差异。(xi)具有FW4氨基酸序列的人Vk,所述FW1氨基酸序列与来自图7b)中的DPK9基因座或任意基因座的种系Vk片段的相应FW的氨基酸序列相同或具有达5种来自所述相应FW的氨基酸差异。(xii)具有FWl,2,3和4氨基酸序列的人Vk,所述FW1，2,3和4氨基酸序列与来自图7b)中的DPK9基因座或任意基因座的种系Vk片段的相应FW的氨基酸序列相同或其中FW1,2,3和4氨基酸序列共同具有达IO种来自所述相应FWs的氨基酸差异。(xiii)来源于图7c)中的任意种系V人片段的人V人。(xiv)具有FW1氨基酸序列的人所述FW1氨基酸序列与来自图7c)中的任意种系VX的相应FW的氨基酸序列相同或具有达5种来自所述相应FW的氨基酸差异。(xv)具有FW2氨基酸序列的人V入，所述FW2氨基酸序列与来自图7c)中的任意种系VX的相应FW的氨基酸序列相同或具有达5种来自所述相应FW的氨基酸差异。(xvi)具有FW3氨基酸序列的人所述FW3氨基酸序列与来自图7c)中的任意种系VX的相应FW的氨基酸序列相同或具有达5种来自所述相应FW的氨基酸差异。(xvii)具有FW4氨基酸序列的人VX,所述FW4氨基酸序列与来自图7c)中的任意种系V入的相应FW的氨基酸序列相同或具有达5种来自所述相应FW的氨基酸差异。(xviii)具有FWl,2,3和4氨基酸序列的人所述FW1氨基酸序列与来自图7c)中的任意种系VX的相应FWs的氨基酸序列相同或其中FW1，2，3和4氨基酸序列共同具有达10种来自所述相应FWs的氨基酸差异。(xix)来源于图7d)或披露在Nguyen等，EMBOJ,2000,Vol19,No.5,pp921-930的图2(924页)(将特别披露VHH种系序列的该文献引入作为参考)中的任意种系片段的CamelidVHH或Nanobody;(xx)具有FW1氨基酸序列的CamelidVHH或Nanobody,所迷FW1氨基酸序列与披露在来自Nguyen等，EMBOJ,2000,Vol19,No.5,pp921-930的图2(924页)中的任意种系VHH片l殳的相应FW的氨基酸序列相同或具有达5种来自所述相应FW的氨基酸差异。(xxi)具有FW2氨基酸序列的CamelidVHH或Nanobody,所m述FW2氨基酸序列与披露在来自Nguyen等，EMBOJ,2000,Vol19,No.5,pp921-930的图2(924页)中的任意种系VHH片段的相应FW的氨基酸序列相同或具有达5种来自所述相应FW的氨基酸差异。(xxii)具有FW3氨基酸序列的CamelidVHH或Nanobody,所述FW3氨基酸序列与披露在来自Nguyen等，EMBOJ,2000,Vol19,No.5,pp921-930的图2(924页)中的任意种系VHH片段的相应FW的氨基酸序列相同或具有达5种来自所述相应FW的氨基酸差异。(xxiii)具有FW4氨基酸序列的CamelidVHH或Nanobody,所述FW4氨基酸序列与披露在来自Nguyen等，EMBOJ,2000,Vol19,No.5,pp921-930的图2(924页)中的任意种系VHH片l殳的相应FW的氨基酸序列相同或具有达5种来自所述相应FW的氨基酸差异。(xxiv)具有FWl,2,3和4氨基酸序列的CamelidVHH或Nanobody,所述FWl,2,3和4氨基酸序列与披露在来自Nguyen等，EMBOJ,2000，Vol19,No.5,pp921-930的图2(924页)中的任意种系VHH片段的相应FW的氨基酸序列相同或其中FWl，2,3和4氨基酸序列共同具有达10种来自所述相应FW的氨基酸差异。c)(D来自下列抗体产品中的任意种的VH或VL:靶标a口广口口Ab类疾患EpCAMPanorex鼠结肠癌CD20Rituxin嵌合IgGl非霍奇金淋巴瘤(NHL)CD20泽娃灵鼠90Y人源化IgG4NHLCD33麦罗塔毒素药物缀AML(急性髓性白血病)CD52Campath-IH人源化IgGlB-C1XHer-2/neu赫赛汀人源化IgGl乳腺癌GPIIb/IIIa阿昔单抗嵌合Fab绞痛RSVSynagis人源化IgGl呼吸道合胞病毒(RSV)IgEXolair人源化IgGl哮喘，过敏性鼻炎TNF國a类克嵌合IgGl类风湿性关节炎(RA),CD25CD3CD25TNF-aCD20CDllaa4B3EGFRVEGF舒莱OKT3,Orthoclonc赛尼哌HumiraBexxarRaptivaAntcgrsn爱必妥阿伐他汀嵌合IgGl鼠IgG2a人源化IgGl人IgGl克罗恩病，银屑病，强直性脊推炎，牛皮癣性关节炎，溃疡性结肠炎移植物排斥移植物排斥肾移植RA，克罗恩病，银屑病，强直性脊柱炎，牛皮癣性关节炎，溃疡性结肠炎NHL银屑病多发性硬化结肠直肠癌结肠直肠癌，肾癌(ii)4皮露在US6090382,US20030235585A1,US20040166111A1,EP1500329A2，US20040131613A1,US20030144484A1,US5698195,EP1159003A1,US20020119152A1,EP0871641A4,EP0710121B1,US5702705,EP0487610B1中的抗-TNF抗体或抗体片段的可变域(VH或VL),特别将其中披露的内容(特别是其中披露的抗体和片段的生成，序列和应用)引入作为参考，以便为本领域技术人员提供用于本发明的这类信息。(iii)以通过表面等离振子共振测定的lxi(T8M或lxlCT8M以下的Kd从靶配体中解离的抗体重或轻链可变域(例如VH,VL或VHH)。在一个优选的实施方案中，靶配体为附录1中所述靶配体。为了指导表面等离振子共振，本领域技术人员参照US6090382或WO04003019A2。(iv)以通过表面等离振子共振测定的lxl(T3s"或bio-3s"以下的K。ff速度常数从靶配体中解离的抗体重或轻链可变域(例如VH,VL或VHH)。在一个优选的实施方案中，耙配体为附录1中所述靶配体。为了指导表面等离振子共振，本领域技术人员参照US6090382或WO04003019A2。(v)以通过表面等离振子共振测定的lxl(T8M或lxlO-8M以下的Kd和lxl(T3s"或lxl(T3s"以下的K。ff速度常数从耙配体中解离的抗体重或轻链可变域(例如VH,VL或VHH)。在一个优选的实施方案中，靶配体为附录1中所述耙配体。为了指导表面等离振子共振，本领域技术人员参照US6090382或WO04003019A2。(vi)以均通过表面等离振子共振测定的lxl(T8M或lxl(T8M以下的Kd和1x10-3s"或1x1(T3s"以下的K。ff速度常数从耙配体中解离的抗体重或轻链可变域(例如VH，VL或VHH)，并且它们在标准测定中以lxl(T7M或lxl(T7M以下的IC5o中和耙配体细胞毒性。在一个优选的实施方案中，靶配体为附录1中所述靶配体。为了指导表面等离振子共振，本领域技术人员参照US6090382或WO04003019A2。在一个实施方案中，靶配体为TNFa且标准测定为如US6090382中所述L929测定。在上述实施方案中，优选一般配体以lxlO"M或lxl(T9M以下，lxl(T9M或1x10-9M以下，lx10-11M或lxl(T11M以下，lxlO"M或lxl(T12M以下的BQ结合。优选K。ff速度常数为lxl(T4s"或lxl(T4s"以下，lxl(T5s"或lxl。-5S"以下，lxl(T6S"或lxlO-6S"以下，lxlO-7S"或lxl(T7S"以下，lxlO-8S"或lxl(T8S"以下。优选ICso为lxlO-SM或1x10-Sm以下，1x10^M或1x10力M以下，5xl(T10M或5xl(T1。M以下，lxl(T10M或lxl(T10M以下，5xl(T"M或5xl(T11M以下。d)具有与附录2(a)中的序列至少90%同源性的序列的抗体可变域。具有与附录2(c)中的序列至少90%同源性的序列的抗体可变域。权利要求1.从抗体多肽类的所有组成成分中选择功能性可变域群体的方法，所述功能性可变域结合靶配体和一般配体，该一般配体能够结合所有组成成分中的功能性成员，但与靶配体的特异性无关，该方法包括下列步骤a)使所有组成成分与所述一般配体接触并且选择与之结合的功能性可变域；和b)使选择的功能性可变域接触靶配体并且选择结合靶配体的可变域群体；其中(i)可变域为重链可变域且一般配体为抗体轻链可变域；或(ii)可变域为轻链可变域且一般配体为抗体重链可变域；且其中任选在(i)中，重链可变域为Camelid可变域(VHH)或来源于Camelid重链抗体(H2抗体)；或任选在(i)和(ii)中，可变域各自为人可变域或来源于人。2.权利要求1的方法，其中首先使抗体多肽类的所有组成成分接触靶配体，且然后接触一般配体。3.权利要求1或2的方法，其中一般配体结合可变域所有组成成分的亚组。4.权利要求3的方法，其中两个或多个亚组选自多肽类的所有组成成分。5.权利要求4的方法，其中使用两种或多种一般配体，任选两种或多种轻链可变域(就任选的(i)而言)或两种或多种重链可变域(就任选的(ii)而言)进行选择。6.权利要求4或5的方法，其中在选择后合并两个或多个亚组以便产生多肽类的其它所有组成成分。7.任意上述权利要求的方法，其中使多肽类的两种或多种所有组成成分接触一般配体且然后合并由此获得的多肽类亚组。8.从多肽类的所有组成成分中选择功能性T-细胞受体结构域群体的方法，所述功能性T-细胞受体结构域结合耙配体和一般配体，该一般配体能够结合所有组成成分中的功能性成员，但与靶配体的特异性无关，该方法包括下列步骤a)使所有组成成分与所述一般配体接触并且选择与之结合的功能性T-细胞受体结构域；和b)使选择的功能性T-细胞受体结构域接触靶配体并且选择结合耙配体的T-细胞受体结构域群体；其中(i)T-细胞受体结构域为Va结构域且一般配体为T-细胞受体V(3结构域；或(ii)T-细胞结构域为T-细胞受体Vp结构域且一般配体为T-细胞受体Va结构域；且任选在(i)中，T-细胞受体Va结构域为来源于Camelid的Camelid结构域；或任选在(i)和(ii)中，T-细胞受体结构域各自为人结构域或来源于人。9.一种方法，其中按照权利要求1选择抗体重链可变域群体，并且按照权利要求1选择抗体轻链可变域群体，且然后合并由此获得的群体。10.—种方法，其中按照权利要求8选择T-细胞受体Va结构域群体，并且按照权利要求8选择T-细胞受体Vp结构域群体，且然后合并由此获得的群体。11.从抗体多肽类群体中选择至少一种抗体重链可变域的方法，该方法包括a)使所述群体接触抗体轻链可变域；和b)选择至少一种结合轻链可变域的抗体重链可变域。12.权利要求11所述方法，所述方法包括在步骤a)前，使抗体多肽类接触靶配体并且选择结合靶配体的抗体多肽类的步骤，由此提供用于步骤a)的所述抗体多肽类的群体。13.权利要求11所述方法，所述方法包括在步骤b)后，使在步骤b)中选择的抗体重链可变域接触靶配体并且选择结合靶配体的重链可变域的步骤。14.权利要求11-13中任意一项所述方法，其中在步骤b)中选择的重链结构域各自来自下组来源于Camelid的重链可变域；VHH结构域；Nanobody;在44位上具有甘氨酸的VHH;在45位上具有亮氨酸的VHH;在47位上具有色氨酸的VHH;在44位上具有甘氨酸并且在45位上具有亮氨酸的VHH;在44位上具有甘氨酸并且在47位上具有色氨酸的VHH;在45位上具有亮氨酸并且在47位上具有色氨酸的VHH;在44位上具有甘氨酸，在45位上具有亮氨酸并且在47位上具有色氨酸的VH;在103位上具有色氨酸或精氨酸的VHH。15.权利要求11-13中任意一项所述方法，其中在步骤b)中选择的重链结构域各自为人源化Camelid或鼠重链可变域或人源化NanobodyTM。16.权利要求11-13中任意一项所述方法，其中在步骤b)中选择的重链结构域各自为人重链可变域。17.权利要求11-16中任意一项所述方法，其中轻链可变域为人轻链可变域或来源于人或具有FW2序列的轻链可变域，所述FW2序列与种系基因序列DPK9编码的FW2相同。18.权利要求11-16中任意一项所述方法，其中轻链可变域为Camelid轻链可变域或来源于Camelid。19.权利要求11-18中任意一项所述方法，其中在步骤a)中的群体由B-细胞群提供。20.权利要求19所述方法，其中B-细胞为外周血淋巴细胞。21.权利要求19或20所述方法，其中从使用靶抗原免疫接种的动物中分离B-细月包。22.权利要求19或20所述方法，其中从未使用靶抗原免疫接种的动物中分离B-细胞。23.权利要求11-16中任意一项所述方法，其中在步骤a)中使用的群体由以合成方式重排的抗体基因编码的抗体多肽类的所有组成成分提供。24.权利要求11-16中任意一项所述方法，其中在步骤a)中使用的群体由包含展示所述抗体多肽类的噬菌体的噬菌体展示文库提供。25.权利要求11-24中任意一项所述方法，其中在步骤a)中使用的群体包含(i)各自包含至少一种不与轻链可变域配对的重链可变域的抗体多肽类；和(ii)各自包含与轻链可变域配对的重链可变域的抗体多肽类。26.权利要求11-25中任意一项所述方法，其中在步骤a)中使用的群体包含camelid重链单一可变域(VHH)或NanobodiesTM。27.权利要求11-25中任意一项所述方法，其中在步骤a)中使用的群体包含人重链单一可变域(VH)。28.从Camelid抗体多肽类群体中选择至少一种Camelid抗体VHH结构域的方法，所述Camelid抗体多肽类群体由分离自已经免疫接种把抗原的Camelid的B-细胞提供，该方法包括a)使所述群体接触抗体轻链可变域；和b)选择至少一种结合轻链可变域的VHH结构域。29.权利要求28所述方法，其中轻链可变域为人轻链可变域。30.权利要求28或29所述方法，其中在多个孔或塞孔内提供B-细胞，其中各孔或塞孔包含平均一种B-细胞类型。31.—种方法，所述方法包括a)对抗体多肽类的起始群体使用靶抗原进行SLAM(选择的淋巴细胞抗体方法)以便选择结合耙抗原的抗体多肽类群体；和b)使用选择的群体作为用于权利要求11-30中任意一项所述方法的抗体多肽类群体。32.权利要求11-31中任意一项所述方法，其中在步骤b)中，使选择的抗体重链可变域中的至少一种与蛋白质部分融合或与之缀合。33.权利要求32所述方法，其中蛋白质部分选自噬菌体外被蛋白、一种或多种抗体结构域、抗体Fc结构域、酶、毒素、标记和效应基团。34.权利要求11-31中任意一项所述方法，其中在步骤b)中，选择的抗体重链可变域中的至少一种为选自IgG、Fab、Fab，、F(ab)2、F(ab')2、scFv、Fv和二石危键键合的Fv的抗体部分或抗体片段。35.分离的抗体多肽，其包含抗体重链可变域或由其组成，其中该多肽可通过权利要求11所述方法获得，其中该方法中的轻链可变域为人轻链可变域且重链可变域来自非-人的哺乳动物。36.权利要求35所述抗体多肽，其中重链可变域来自来源于Camelid的重链可变域；VHH结构域；NanobodyTM;在44位上具有甘氨酸的VHH;在45位上具有亮氨酸的VHH;在47位上具有色氨酸的VHH;在44位上具有甘氨酸并且在45位上具有亮氨酸的VHH;在44位上具有甘氨酸并且在47位上具有色氨酸的VHH;在45位上具有亮氨酸并且在47位上具有色氨酸的VHH;在44位上具有甘氨酸，在45位上具有亮氨酸并且在47位上具有色氨酸的VH;在103位上具有色氨酸或精氨酸的VHH。37.权利要求36所述抗体多肽，其中重链可变域作为CamelidIgG或来源于Camelid的IgG的组成部分提供。38.权利要求36所述抗体多肽，其中重链可变域作为人IgG或来源于人的IgG的组成部分提供，并且其中重链可变域在IgG中与不同于权利要求11中所述轻链可变域的轻链可变域配对。39.权利要求35-38中任意一项的抗体多肽作为药物的应用。40.权利要求35-38中任意一项的抗体多肽在人疾病或疾患的治疗和/或预防中的应用。41.权利要求11-34中任意一项所述方法或权利要求35-38中任意一项所述抗体或权利要求39或40中所述应用，其中重链可变域结合选自TNFa、血清清蛋白、冯维勒布兰德因子(vWF)、IgE、干扰素Y、EGFR、IgE、MMP12、PDK1和淀粉样蛋白(3(A-(3)的耙配体或附录1中所列的耙标中的任意一种。42.从抗体多肽类群体中选择至少一种抗体轻链可变域的方法，该方法包括a)使所述群体接触抗体重链可变域；和b)选择至少一种结合重链可变域的抗体轻链可变域。43.权利要求42所述方法，所述方法包含在步骤a)前，使抗体多肽类接触靶配体并且选择结合靶配体的抗体多肽类的步骤，由此提供用于步骤a)的抗体多肽类的所述群体。44.权利要求42所述方法，所述方法包含在步骤b)后，使步骤b)中选择的抗体轻链可变域接触靶配体并且选择结合靶配体的轻链可变域的步骤。45.权利要求42-44中任意一项所述方法，其中步骤b)中选择的轻链结构域各自来源于Camelid。46.权利要求42-44中任意一项所述方法，其中步骤b)中选择的轻链结构域各自为人轻链可变域。47.权利要求42-44中任意一项所述方法，其中重链可变域为人重链可变域；来源于人；具有FW2序列的重链可变域，所述FW2序列与种系基因序列DP47编码的FW2相同；或具有与种系基因序列DP47编码的44、45和47位相同的44、45和47位的重链可变i或。48.权利要求42-44中任意一项所述方法，其中重链可变域为Camelid重链可变域(VHH或VH)或来源于Camelid。49.权利要求42-48中任意一项所述方法，其中步骤a)中的群体由B-细胞群提供。50.权利要求49所述方法，其中B-细胞为外周血淋巴细胞。51.权利要求49或50所述方法，其中B-细胞分离自已经免疫接种耙抗原的动物。52.权利要求49或50所述方法，其中B-细胞分离自未免疫接种革巴抗原的动物。53.权利要求42-48中任意一项所述方法，其中步骤a)中使用的群体由以合成方式重排的抗体基因编码的抗体多肽类的所有组成成分提供。54.权利要求42-48中任意一项所述方法，其中步骤a)中的群体由包含展示所述抗体多肽类的噬菌体的噬菌体展示文库提供。55.权利要求42-54中任意一项所述方法，其中步骤a)中使用的群体包含(i)各自包含至少一种不与重链可变域配对的轻链可变域的抗体多肽类；和(ii)各自包含与重链可变域配对的轻链可变域的抗体多肽类。56.权利要求42-54中任意一项所述方法，其中步骤a)中使用的群体包含人轻链单一可变域(VL)。57.—种方法，所述方法包括a)对抗体多肽类的起始群体使用耙抗原进行SLAM(选择的淋巴细胞抗体方法)以便选择结合耙抗原的抗体多肽类群体；和b)使用选择的群体作为用于权利要求42-56中任意一项所述方法的抗体多肽类群体。58.权利要求42-57中任意一项所述方法，其中在步骤b)中，选择的抗体轻链可变域中的至少一种与蛋白质部分融合或与之缀合。59.权利要求58所述方法，其中所述蛋白质部分选自噬菌体外被蛋白、一种或多种抗体结构域、抗体Fc结构域、酶、毒素、标记和效应基团。60.权利要求42-59中任意一项所述方法，其中在步骤b)中，选择的抗体重链可变域中的至少一种为选自IgG、Fab、Fab，、F(ab)2、F(ab，)2、scFv、Fv和二硫键键合的Fv的抗体或抗体片段。61.分离的抗体多肽，其包含抗体轻链可变域或由其组成，其中该多肽可通过权利要求42所述方法获得，其中该方法中的重链可变域为人重链可变域且轻链可变域来自非-人的哺乳动物。62.权利要求61所述抗体多肽，其中轻链可变域来自Camelid。63.权利要求61所述抗体多肽，其中轻链可变域作为CamelidlgG或来源于Camelid的IgG的组成部分提供。64.权利要求61所述抗体多肽，其中轻链可变域作为人IgG或来源于人的IgG的组成部分提供，并且其中轻链可变域在IgG中与不同于权利要求42中所述重链可变域的重链可变域配对。65.权利要求35-38和61-64中任意一项的抗体多肽衍生物，其中该衍生物具有与权利要求35-38和61-64中任意一项所述多肽的可变域CDR3相比的CDR3突变。66.通过权利要求35-38和61-64中任意一项的抗体多肽的亲和力成熟产生的抗体多肽衍生物。67.多肽，其包含与权利要求35-38和61-64中任意一项的抗体多肽或权利要求65或67的衍生物连接的半衰期延长部分，其中该部分选自PEG;抗体恒定域；抗体Fc区；清蛋白或其片段；结合清蛋白的肽或抗体片段；清蛋白片段；新生儿Fc受体；转移；或转移受体。68.权利要求61-67中任意一项的抗体多肽作为药物的应用。69.权利要求61-67中任意一项的抗体多肽在人疾病或疾患的治疗和/或预防中的应用。70.权利要求42-66中任意一项所述方法或权利要求61-67中任意一项所述抗体或权利要求68或69所述应用，其中轻链可变域或抗体多肽的可变域结合选自TNFot、血清清蛋白、冯维勒布兰德因子(vWF)、IgE、干扰素丫、EGFR、IgE、MMP12、PDK1和淀粉样蛋白(3(A-(3)的耙配体或附录l中所列的耙标中的任意一种。71.权利要求l、11或42所述方法，所述方法包括产生选择的可变域的突变体或衍生物的步骤。72.权利要求19-22和49-52中任意一项所述方法，其中将B-细胞群提供在多个孔或塞孔中，其中各孔或塞孔包含单一B-细胞类型。73.权利要求19-22和49-52中任意一项所述方法，其中将B-细胞群提供在多个孔或塞孔中，其中各孔或塞孔包含平均一种B-细胞类型。74.从包含单一可变域和IgG的抗体多肽类群体中的抗体单一可变域中分离IgG的方法，该方法包括a)使所述群体接触一般配体；和b)选择结合一般配体的亚群，由此从单一可变域中分离IgG;其中一般配体对抗体CH1结构域、轻链恒定域(CL)、IgG绞链或抗体轻链可变域具有结合特异性。75.权利要求74所述方法，其中一般配体选自蛋白质L、蛋白质L结构域或结合轻链可变域的蛋白质L的衍生物；蛋白质G、蛋白质G的结构域或结合CH1的蛋白质G的衍生物；抗体和抗体片段、affibody、LDL受体结构域和EGF结构域。76.权利要求75所述方法，其中一般配体选自dAb、NanobodyTM、scFv、Fab、Fab，、F(ab)2、F(ab，)2、scFv、Fv或二石危4建4建合的Fv。77.权利要求74-76中任意一项所述方法，可变域为人单一可变域，且IgG为人IgG。78.权利要求74-77中任意一项所述方法，其中一般配体以lmM或lmM以下的亲和力结合抗体CH1结构域、轻链恒定域(CL)、IgG绞链或抗体轻链可变域。79.权利要求74-77中任意一项所述方法，其中一般配体以1微摩尔或1微摩尔以下的亲和力结合抗体CH1结构域、轻链恒定域(CL)、IgG绞链或抗体轻链可变域。80.权利要求74-77中任意一项所述方法，其中一般配体以100nM或低于100nM的亲和力结合抗体CH1结构域、轻链恒定域(CL)、IgG绞链或抗体轻链可变域。81.从包含CamelidVHH结构域和IgG的抗体多肽类群体中的IgG中分离CamelidVHH单一可变域的方法，该方法包括a)使所述群体接触一般配体；和b)选择结合一般配体的亚群，由此从IgG中分离单一可变域；其中一般配体对(i)VHH而非对VH;或(ii)重链抗体(H2)绞链具有结合特异性。82.权利要求81所述方法，其中一般配体选自抗体轻链可变域、抗体和抗体片段。83.权利要求82所述方法，其中一般配体选自dAb、Nanobody1M、scFv、Fab、Fab，、F(ab)2、F(ab，)2、scFv、Fv或二碌u键4建合的Fv。84.权利要求81-83中任意一项所述方法，其中一^:配体以lmM或lmM以下的亲和力结合VHH或重链抗体(H2)绞链。85.权利要求81-33中任意一项所述方法，其中一般配体以1微摩尔或1微摩尔以下的亲和力结合VHH或重链抗体(H2)绞链。86.权利要求81-83中任意一项所述方法，其中一般配体以100nM或100nM以下的亲和力结合VHH或重链抗体(H2)绞链。87.权利要求74-86中任意一项所述方法，其中抗体多肽群体由B细胞提供。88.权利要求74-87中任意一项所述方法，其中可变域为CamelidVHH,且IgG为CamelidIgG。89.权利要求74-88中任意一项所述方法，其中可变域由Camelid重链(H2)抗体提供。90.权利要求74-89中任意一项所述方法，其中标记一般配体或纟会^力口才示i己。91.权利要求1-7和11-90中任意一项所述方法、抗体多肽、衍生物或应用，其中一般配体为选自附录2a)、c)、d)或e)的抗体可变域。92.从抗体多肽类的所有组成成分中选择结合耙配体和一般配体的单一可变域的方法，所述方法包括下列步骤a)使所有组成成分接触靶配体并且选择与之结合的单一可变域；和b)使选择的可变域接触一般配体并且选择结合一般配体的可变域；其中一般配体为选自附录2c)或e)的抗体可变域；且其中，(O当选择的可变域为重链可变域时，一般配体为轻链可变域；或(ii)当选择的可变域为轻链可变域时，一般配体为重链可变域。93.权利要求92所述方法，其中抗体多肽类的所有组成成分为重链可变域的所有组成成分，一般配体为轻链可变域。94.权利要求92所述方法，其中抗体多肽类的所有组成成分为轻链可变域的所有组成成分，一般配体为重链可变域。95.权利要求92-94中任意一项所述方法，所述方法包括产生选择的可变域的突变体或衍生物的步骤。96.权利要求92-94中任意一项所述方法，其中一般配体结合与选择的可变域相同的耙配体种类。97.权利要求92-94中任意一项所述方法，其中一般配体结合与选择的可变域不同的靶配体种类。98.权利要求92-97中任意一项所述方法，所述方法包括将选择的可变域与和一般配体或其衍生物相同的抗体可变域合并，以便产生具有耙配体结合特异性的产物。99.生产结合耙配体的附录2c)(i)-(iv)中任意项的抗体或抗体片段的衍生物的方法，该方法包括a)使用所述抗体或片段的重链可变域或与权利要求94所述方法中的一般配体相同的可变域，并且其中步骤a)中使用的靶配体为所述抗体或片段结合的耙配体，由此选择结合耙配体和重链可变域的轻链单一可变域；和b)用选择的轻链可变域；相同的轻链可变域或其衍生物取代所述抗体或片段的轻链可变域中的至少一种。100.生产附录2c)(i)-(iv)中任意项中的抗体或抗体片段的多特异性4汙生物的方法，该方法包括a)使用所述抗体或片段的重链可变域或与权利要求94所述方法中的一般配体相同的可变域，并且其中步骤a)中使用的耙配体是不同于所述抗体或片段结合的耙配体的耙配体，由此选择结合不同靶配体和重链的可变域的轻链单一可变域；和b)用选择的轻链可变域；相同的轻链可变域或其衍生物取代所述抗体或片段轻链可变域中的至少一种，由此产生的多特异性产物。101.生产附录2c)(i)-(iv)中任意项中的抗体或抗体片段的衍生物的方法，该方法包4舌a)使用所述抗体或片段的轻链可变域或与权利要求94所述方法中的一般配体相同的可变域，并且其中步骤a)中使用的靶配体为所述抗体或片段结合的耙配体，由此选择结合耙配体和轻链可变域的重链单一可变域；和b)用选择的重链可变域；相同的重链可变域或其衍生物取代所述抗体或片段的重链可变域中的至少一种。102.生产附录2c)(i)-(iv)中任意项中的抗体或抗体片段的多特异性衍生物的方法，该方法包括a)使用所述抗体或片段的轻链可变域或与权利要求94所述方法中的一般配体相同的可变域，并且其中步骤a)中使用的靶配体是不同于所述抗体或片段结合的靶配体的靶配体，由此选择结合不同靶配体和轻链可变域的重链单一可变域；和b)用选择的重链可变域；相同的重链可变域或其衍生物取代所述抗体或片段的重链可变域中的至少一种，由此产生多特异性产物。103.权利要求100至102所述方法，其中重链可变域选自来源于Camelid的重链可变域；VHH结构域；Nanobody;在44位上具有甘氨酸的VHH;在45位上具有亮氨酸的VHH;在47位上具有色氨酸的VHH;在44位上具有甘氨酸并且在45位上具有亮氨酸的VHH;在44位上具有甘氨酸并且在47位上具有色氨酸的VHH;在45位上具有亮氨酸并且在47位上具有色氨酸的VHH;在44位上具有甘氨酸，在45位上具有亮氨酸并且在47位上具有色氨酸的VH;在103位上具有色氨酸或精氨酸的VHH;人源化Camelid或鼠重链可变域；人源化NanobodyTM;人重链可变域；来源于人的重链可变域；具有FW2序列的重链可变域，所述FW2序列与种系基因序列DP47编码的FW2相同；或具有与种系基因序列DP47编码的44、45和47位相同的44、45和47位的重链可变域。104.权利要求99或101所述方法，其中轻链可变域选自人轻链可变域；来源于人的轻链可变域；具有FW2序列的轻链可变域，所述FW2序列与种系基因序列DPK9编码的FW2相同；Camelid轻链可变域；来源于Camelid的轻链可变域；和人源化Camelid或鼠轻链可变域。105.权利要求99-104中任意一项所述方法，其中a)选择的可变域为重链可变域，且抗体或片段的重链可变域各自被选择的重链可变域；相同的重链可变域或其衍生物取代；或b)选择的可变域为轻链可变域，且抗体或片段的轻链可变域各自被选择的轻链可变域；相同的轻链可变域或其衍生物取代。106.可通过权利要求99-105中任意一项所述方法获得的书t生物。107.抗体或抗体片段衍生物，其选自Panorex;Rituxin;Zevalin;Mylotarg;Campath;Herceptin;ReoPro;Synagis;Xolair;Remicade;Simulect;OKT3TM;Orthoclone;Zenapax;HumiraTM;BexxarTM;Raptiva;Antegren;Erbitux;和AvastinTM,其中该衍生物可通过权利要求99-105中任意一项所述方法获得。108.权利要求100所述方法，其中一关殳配体为来自抗体或抗体片段的抗体可变域，所述抗体或抗体片段选自Panorex、RituxinTM、ZevalinTM、MylotargTM、Campath、HerceptinTM、ReoProTM、SynagisTM、Xolair、Remicade、Simulect、OKT3TM、Orthoclone、Zenapax、HumiraTM、BexxarTM、RaptivaTM、AntegrenTM、ErbituxTM和AvastinTM109.具有靶配体结合特异性的产物，其中该产物可通过权利要求108所述方法获得。110.权利要求106-107和109中任意一项所述衍生物或产物作为药物的应用。111.权利要求106-107和109中任意一项所述衍生物或产物在人疾病或疾患的治疗和/或预防中的应用。112.权利要求106或109中任意一项所述衍生物或产物在人疾病或疾患的治疗和/或预防中的应用，其中所述疾患为附录2c)(i)中对抗体或抗体片段所列的疾患。全文摘要本发明提供了在抗体多肽文库筛选征的进一步动态。本发明还提供了可通过本发明方法获得的新分离的抗体多肽类。文档编号C07K16/00GK101312988SQ200680037900公开日2008年11月26日申请日期2006年10月11日优先权日2005年10月11日发明者J·克拉布,L·耶斯佩斯申请人:杜门蒂斯有限公司