细胞的重新编程和遗传修饰的制作方法

专利名称：：细胞的重新编程和遗传修饰的制作方法细胞的重新编程和遗传修饰发明领域本发明涉及细胞，具体说是待重新编程细胞的重新编程和遗传修饰。本发明特别涉及将细胞重新编程为多能状态和遗传修饰细胞，例如重新编程之前补偿这种细胞的遗传缺陷。发明背景在胚胎发育期间，多能细胞分化成许多不同类型的细胞，这些细胞由表观基因组中特定基因亚组被激活或被抑制而定。显然，分化的表观基因组通过核转移到去核卵母细胞中和通过与ES或EG细胞的融合可回复为多能性细胞。在ES与EG-T细胞杂交中，T细胞的失活X染色体、沉默的印记基因和沉默的0ct4-GFP报导转基因被重新激活(Tada等，1977和2001)。然而，ES与EG-T细胞杂交证明在体内对所有三个原始胚层都有影响，从而显示了其多能性(Tada等，1977和2001)。其它研究也证明，中枢神经系统、骨髓和脾细胞的核与ES细胞融合后显示有多能潜力(Matveeva等，1998;Terada等，2002;Ying等，2002)。而且，ES-分化的杂交细胞的体细胞基因组染色质状态分析显示获得了ES细胞基因组的性能(Kimura等，2004)。综合在一起，这些结果表明杂交细胞不单单是联合了二个基因组，而有可能是供体的体细胞基因组经历了全面的重新编程。虽然已通过将体细胞的核转移(SCNT)到去核卵母细胞中产生了活的动物，但成功率极低，大多数胚胎在发育早期即死亡(见Hochedlinger和Jaenisch，2003)。主要原因可能是供体基因组重新编程中的错误(Humpherys等，2001,2002;Kang等，2001,2002;Xue等，2002;Santos等，2003)。而且在一定比例例子中，早期克隆胚胎显示了多能性相关基因0ct4的不完全激活，提示大多数克隆的胚胎不能建立真正的多能胚胎细胞群(Bortvin等，2003)。支持此观点的是，若无包括从克隆的胚胎产生ES细胞的额外步骤，不可能从B细胞核产生成年小鼠(Hochedlinger和Jaenisch，2002)。因此，需要提高表观遗传重新编程的效率。基因组重编程也发生在体内。进入生殖嵴10.5dpc-11.5dpc处的原基胚细胞(PGC)经历了基因组的广泛脱甲基化，沉默的X染色体重新被激活和删除印记(Hajkova，2002;Sato等，2003;Tam等，1994)。近年来有报导说重新编程是早期胚胎的特征(Mak等，2004;Okamoto等，2004)。在这些研究中，证明X染色体被印记而失活发生在晚期桑椹胚和胚泡球的所有细胞中。在这些阶段，失活的X染色质显示与其它表观遗传标记都富含H3-K9二甲基化和H3-K27三甲基化。这是令人惊奇的，因为X染色体失活是细胞分化的一种标志，它的状态稳定可经遗传传递，仅在多能细胞中是可逆的(Wutz和Jaenisch，2000)。至关重要的是，失活的X显示消除了表观遗传标记，并且在外胚层母细胞(epiblast)中4.5dpc附近被重新激活(Mak等，2004;Okamoto等，2004)。出乎意料的是，对植入小鼠卵母细胞中的XX体细胞核中的X染色体进行表观遗传动力学分析，显示其显然能分化为正常胚胎(Bao等，2005)。卵母细胞不会删除失活X的表观遗传标记三甲基H3-K27，而持续存在直到发生X重新被激活时形成外胚层。这提示卵母细胞和外胚层在基因组重新编程上具有不同的性能。产生重新编程的因素不明。然而这些因素必然存在于将产生多能外胚层的胚泡细胞中以及负责ES-分化杂交细胞的X重新激活的ES细胞中。同样，这些因素也必然存在于迁移到生殖嵴的PGC中和ES细胞中。Nanog蛋白是哺乳动物多能细胞中存在的一种含独特同源结构域的蛋白质，为早期发育所必需。与胚泡中多能细胞的形成同时发生的是，雌性XX胚胎中先前已失活的亲代染色体被重新激活。重激活限于表达Nanog蛋白的那些细胞而在无Nano蛋白的胚胎中不会发生。早期胚胎表达Nanog蛋白可能细胞未来是多能外胚层细胞(epiblastcell),其在ES细胞分化和胚胎发育期间快速下调(Chambers等，2003;Mitsui等，2003)。此外，当ES细胞过度表达Nanog蛋白时其具有独特性能，在缺乏其它必须因子Lif和血清(BMP-4)时能自我更新(Chambers等，2003;Ying等，2003)。而且，Nanog蛋白在多能EG细胞中和PGC中表达时，这些细胞发生重编程(Chambers等，2003;Yamaguchi等，2005)。体外对无Nanog蛋白的ES细胞和分离的内细胞块(InnerCellMasses,ICMs)的特征鉴定显示这些细胞不能保持在非分化状态，而是分化成为内胚层样细胞(Mitsui等，2003)。WT和^Vfl"0g-/-4.5dpc及滞育雌性胚胎的比较研究显示X染色体重新被激活只发生在WT胚胎的Nanog表达细胞。WO03/064463描述了Nanog与LIF联用来重编程细胞或细胞核。然而，在本文所述的比较性实施例中，发现Nanog表达不足以诱导重新编程。出于细胞治疗的目的，需要遗传修饰细胞，特别是修饰多能细胞使其产生后代。与细胞核重编程相协调，已知可采用(例如)载体来遗传修饰细胞。例如，已采用SCNT产生的遗传修饰细胞来治疗免疫缺陷(Rideout等，2002)。但是这些方法可能在基因组中留下人造物质。细胞治疗的产品应是二倍体细胞，但是已知二倍体细胞融合将产生四倍体细胞，此细胞的染色体分离是不均匀的，可能产生各种不同的非整倍体类型细胞(Matveeva等，1998)。这对于管理当局将是不可接受的。因此需要提高细胞核重编程的效率。但如上所述目前的效率低下。也需要在重编程细胞中导入遗传修饰从而使其产生二倍体后代。本发明的一个目的是对上述问题进行改进或至少提供一种替代方法。本发明具体实施方式的一个目的是提供改进的重编程方法和用此法获得的细胞。本发明具体实施方式的另一个目的是提供遗传修饰细胞的方法，任选随后重编程该修饰的细胞和产生其后代。发明概述本发明利用Nanog蛋白的表达和/或MEK抑制剂来重编程细胞。发明详述本发明提供从分化的基因组获得多能基因组的方法，该方法包括使多能细胞与分化的细胞融合；和在融合的细胞中过度表达Nanog蛋白。可通过在融合步骤之前在多能细胞中过度表达Nanog蛋白，在融合步骤之前在分化细胞中过度表达Nanog蛋白，或即在融合步骤后在融合细胞中过度表达Nanog蛋白而过度表达Nanog蛋白。通过在细胞中导入表达Nanog蛋白的遗传构建物适当过度表达Nanog蛋白。也可通过在细胞中导入，在存在能提高Nanog蛋白在细胞中表达的培养基组分下培养该细胞来过度表达Nanog蛋白。在本发明一具体实施方式中，该方法包括使多能细胞与分化细胞融合形成融合细胞；其中用MEK抑制剂处理多能细胞、分化细胞和融合细胞的至少一种。或用MEK抑制剂处理多能细胞和分化细胞二者。已有益地发现利用Nanog蛋白，通过其直接过度表达，或通过利用(例如)MEK抑制剂使其过度表达，以此方式能提髙获得具有多能性质细胞的效率。据信用MEK抑制剂处理可导致上调Nanog蛋白的表达。本发明人也有益地发现进一步培养多能细胞后，可获得含分化细胞基因信息的二倍体细胞。在本发明的方法中，保持对融合细胞的培养使其自发性丢失染色体直到其染色体组减少和回复为二倍体。通常所产生的二倍体多能细胞中至少含有一条或多条分化细胞的染色体。因此，可获得多能细胞将其用于产生分化的后代，其包括来自含有所需基因或所需染色体或其它所需遗传物质的分化细胞的细胞和组织。适合的多能细胞是胚胎干(ES)细胞、胚胎癌(EC)细胞或胚胎生殖腺(EG)细胞，在以下更详细说明的本发明具体实施方式中，已成功融合了ES细胞与分化细胞导致产生多能基因组。所述的分化细胞可以是体细胞，通常认为基本上所有的体细胞都适合用于本文所述的应用。所述分化细胞也可以是干细胞，而且认为本发明的应用不限于任何具体干细胞，而一般可扩大到各种干细胞，特别是神经干细胞、造血干细胞等。在本发明的具体实施方式应用中，当所述分化细胞是神经干细胞时已成功地进行了重新编程。可通过各种不同方法提供Nanog蛋白。在一实施方式中，在多能细胞中过度表达Nanog蛋白来提供Nanog蛋白，在另一实施方式中，在分化细胞中表达Nanog蛋白来提供Nanog蛋白。任选地，通常也用含编码Nanog蛋白的核苷酸序列和适当启动子的载体转染一种或多种细胞，直接在多能细胞和分化细胞二者或之一中表达Nanog蛋白。优选地，本发明方法可导致Nanog蛋白在多能细胞中过度表达，认为其实际表达水平比ES细胞的内源性表达水平高2倍至15倍是适宜的，优选高3—10倍，在一个或多个实施例中采用高于正常水平5倍。认为本发明通常可用于哺乳动物细胞，包括小鼠、人、猪、绵羊、牛、山羊，在所有例子中，多能细胞和分化细胞优选来自同一种动物。优选的还有，多能细胞与分化细胞二者都是小鼠细胞或人细胞。迄今报导ES细胞融合后存在染色体分离不均匀(Matveva等，2005)。然而，按照本发明，重编程方法包括培养这种融合细胞以获得二倍体细胞。因此，有益地和令人惊奇地发现，按照本发明的技术，染色体的分离实际上不会不均匀，而可获得含二倍体染色体组的细胞。这些细胞的分析通常表明它们含有源自多能细胞的染色体和源自分化细胞的染色体的混合物，即混合的染色体。因此，在本发明的一优选实施方式中，使多能细胞与分化细胞融合产生四倍体细胞，所述方法包括获得该四倍体细胞的后代，和鉴定其后代是否有(例如)自发性染色体丢失而成为二倍体。实际上，获得的细胞群中二倍体细胞占很大比例。不想受任何理论的束缚，这二种情况下这些细胞都有高比例的细胞回复为二倍体状态，而且培养这些细胞时宜持续存在Nanog蛋白，真正二倍体细胞有存活优势。因此，获得了含有衍生自二种最初的原始细胞各自染色体的二倍体细胞群。因此本发明提供了通过实施所述的重编程步骤，从分化细胞产生体细胞或干细胞的机会，然后培养获得的作为该融合细胞后代的二倍体多能细胞，并从该二倍体多能细胞产生分化的细胞。本发明还提供遗传修饰细胞的方法，该方法包括提供含染色体的第一种细胞，提供含染色体的第二种细胞，使第一种细胞与第二种细胞融合形成融合细胞，和培养该融合细胞以获得含有第一种细胞至少一个染色体和第二种细胞至少一个染色体的二倍体细胞。任选在第一种细胞、第二种细胞和/或融合细胞中过度表达Nanog蛋白。例如，可用MEK抑制剂处理第一种细胞、第二种细胞和融合细胞的至少一种。第一种细胞和第二种细胞优选二者都是二倍体细胞，可以二者都是小鼠细胞或二者都是人细胞。如此获得的细胞含有源自第一种细胞和第二种细胞的染色体，因此可利用此方法来组合二种不同来源的遗传物质。获得所产生的二倍体细胞后，可对其检测以鉴定此二倍体细胞中最终染色体是何种具体组合，需要时可进行选择以鉴定含有特别需要的染色体组合的细胞。在此方法操作时，优选第一种细胞和第二种细胞之一是多能细胞。第一种细胞和第二种细胞之另一种任选是多能细胞，可以是体细胞，任选干细胞。在以下实施例中，另一种细胞是神经干细胞。按照本发明可实现对含有特定染色体组合细胞的选择。因此，本发明的一种实施方式包括鉴定含有所需基因拷贝和同一基因被修饰产生的不良拷贝的第一种细胞，鉴定含有不良基因修饰形式的第二种细胞，使第一种细胞与第二种细胞融合，培养该融合细胞，以及鉴定该融合细胞的含有所需基因拷贝和不良基因修饰形式的后代。以此方式，可将第一种细胞和第二种细胞的基因组合而产生没有遗传缺陷、没有不良基因的细胞。不难利用此技术鉴定和分离含或不含所需的染色体/基因组合的细胞，从而获得没有缺陷的工程改造的纯细胞群或分离细胞。本发明通常探索用于治愈第一种细胞的遗传缺陷，此种不良基因是具有缺陷的基因，第二种细胞中该基因的修饰形式能治愈(此缺陷)。本发明另一实施方式包括将经工程改造而改变了某正常内源性基因表达的第一种细胞，与含有该内源性基因正常拷贝的第二种细胞融合，培养该融合细胞，鉴定含有该基因正常拷贝和该基因工程改造形式二者的该融合细胞的后代。本发明通常通过对某基因表达的补偿性改变探索用于治疗疾病。对于治疗或修饰基因也任选将其经工程改造加入第二种细胞内，如果不能得到与第一种细胞融合产生正确基因组合的第二种细胞时，此法可能适用。因此本发明方法中，产生合适的第二种细胞可包括遗传修饰该第二种细胞，然后与第一种细胞融合将不良基因的修饰形式引入第二种细胞。如与本发明其它方面内容相关的说明中，已发现所产生的细胞，虽然最初或可能是非整倍体，一般是四倍体，可能以可接受的速率经过染色体分离成为二倍体细胞，产生的细胞可用于(例如)进一步培养，产生后代细胞和细胞治疗。本发明另一方面提供细胞融合的方法，该方法包括在存在MEK抑制剂时融合第一种细胞与第二种细胞。第一种细胞优选多能细胞，可以是ES、EC或EG细胞。第二种细胞也可以是多能细胞，但优选体细胞，更优选干细胞。如本文它处所述，可在第一种细胞和/或第二种细胞中表达Nanog蛋白来提供Nanog蛋白。也如本文它处所述，可在存在MEK抑制剂时培养第一种细胞、第二种细胞和/或融合细胞。理想的是采用本发明方法来获得二倍体细胞，实施此方法时发现，含有二种细胞初始合并染色体的最初细胞回复为二倍体状态的频率很高。本发明方法包括融合第一和第二种细胞产生非整倍体细胞，和培养该融合细胞获得其二倍体后代。本发明也提供按本发明任何一方面方法获得的细胞。本发明提供利用细胞进行细胞治疗的其它方法，和将本发明细胞用于制备进行治疗，优选细胞治疗的药物中的应用。本发明的治疗方法包括给予病人有效量的本发明细胞。另一种治疗方法包括给予患者有效量的经遗传修饰的本发明细胞。治疗可适当地包括鉴定需要遗传修饰的细胞的患者，鉴定治疗该患者所需的遗传修饰，和按本发明任何一种实施方式的方法制备遗传修饰的细胞。还有，本发明在重新编程通过多能细胞与体细胞融合获得的细胞中采用了Nanog蛋白。所述多能细胞通常是ES细胞，所述体细胞通常是干细胞，在一具体实施方式中是神经干细胞。本发明也提供利用Nanog蛋白来改进体细胞核转移获得多能细胞的方法。因此，本发明的核转移方法包括将体细胞的核转移到受体细胞中形成核转移细胞，并在此核转移细胞中过度表达Nanog蛋白。从而实现效率提高的供体体细胞核重新编程。在一实施方式中，本发明也提供利用MEK抑制剂来改进体细胞核转移获得多能细胞的方法。因此，本发明的核转移方法包括将体细胞的核转移到受体细胞中形成核转移细胞，和用MEK抑制剂处理该核转移细胞。从而实现效率提高的供体体细胞核重新编程。所述受体细胞通常是卵母细胞，优选去核卵母细胞，也优选与供体同种动物的卵母细胞。在本发明优选实施方式中，所述MEK抑制剂是MEK1抑制剂。本领域知道合适的MEK抑制剂例子，包括MEK1抑制剂PD184352和Davies等，2000所述的抑制剂。本发明的这些和其它方面内容所述的最终后代可包括克隆的非人动物(人的克隆形式不是本发明的一部分)和多能细胞培养物。因此，本发明的其它实施方式中提供了获得活的非人动物的方法，包括本发明的细胞融合或核转移方法，和包括用本发明的细胞融合或核转移方法获得多能干细胞培养物的方法。所述供体体细胞更优选干细胞，特别是神经干细胞。如本文所述通过在供体体细胞中表达来提供Nanog蛋白。也可如本文所述利用MEK抑制剂。如本文所述，MEK抑制剂能上调Nanog蛋白表达。优选在供体体细胞中过度表达Nanog蛋白，其表达水平要高于ES细胞中Nanog蛋白表达的正常内源水平，例如比ES细胞内源表达的Nanog蛋白水平高2—15倍。本发明的一实施方式核转移采用含基因缺陷的供体体细胞，用本领域己知方法纠正所得多能细胞中的基因缺陷而用于治疗疾病。认为此实施方式通常可用于哺乳动物细胞，包括小鼠、人、猪、绵羊、牛、山羊，在所有例子中，受体卵母细胞和供体体细胞细胞优选来自同一种动物。在本发明的优选实施方式中，所述细胞预先用MEK抑制剂处理。本文所述的Nanog蛋白指WO03/064463中所述的多肽家族，包括所述的优选多肽，因此指(例如)含有200-400个氨基酸的多能决定因子的多肽。具体说是，本文SEQIDNO:2代表的小鼠多能决定因子、本文SEQIDNO:4代表的人多能决定因子、本文SEQIDNO:6代表的大鼠多能决定因子和本文SEQIDNO:8代表的猕猴多能决定因子，全面参考了WO03/064463的内容并将其纳入本文。Nanog蛋白也指能将细胞维持于多能状态而在细胞内起作用的一种因子，它含有同源域，具体是与本文SEQIDNO:2、4、6或8的同源域序列至少有50%相同性的同源域，或与某给定种类动物细胞的因子相关，与该同种动物的多能决定因子同源域至少有50%序列相同性的同源域。通常，一个同源域长约60个氨基酸，该因子所含的同源域中任一20个氨基酸的片段与SEQIDNO;2、4、6或8同源域至少有35%序列相同。Nanog蛋白还指分离的多肽，其包含(a)含SEQIDNO:2、4、6或8所示氨基酸序列的多肽分子；(b)上述(a)肽分子的天然变体；(c)上述(a)或(b)的直向同源物，和(d)可用于诊断或治疗的它们的生物学活性片段、类似物和衍生物。Nanog蛋白还包括SEQIDNO:2、4、6或8多肽(特别是成熟多肽)以及与SEQIDNO:2、4、6或8多肽至少有50%相似性(优选至少50%相同性)的多肽，更优选与SEQIDNO:2、4、6或8多肽至少有90%相似性(优选至少90。/。相同性)，还要优选与SEQIDNO:2、4、6或8多肽至少有95%相似性(优选至少95%相同性)，也包括这类多肽的某部分，所述部分通常含至少30个氨基酸，更优选至少50个氨基酸。二条多肽之间的"相似性"可通过比较一条多肽的氨基酸序列及其保守性氨基酸取代物与另一条多肽的相应序列而确定。已知有多种不同方法可计算序列的相似性和相同性。通常，进行此种计算的合适方法利用程序如Smith-Waterman、BLAST或FASTA，并利用一张或优选二张或甚至三张相似性表格进行数据库检索。Blosum和PAM(PointAcceptedMutation)矩阵是适用于数据库检索和序列比对的氨基酸相似性矩阵。如果采用Smith-Waterman或FASTA，确保空格开放罚分足够大应是恰当的，如果最初进行的检索没有发现任何同源序列，那么可能需要尝试不同的算法，当开始时采用启发式算法BLAST或FASTA之一时尤其如此。在以下本发明更详细的实施例中，采用神经干细胞作为体细胞，即作为分化的表观基因组来源。神经干(NS)细胞是可扩展的细胞，可对其进行遗传操作(Conti等，2005)。这些细胞可衍生自胚胎、成人大脑和ES细胞。NS细胞可形成均一细胞群，以可重复方式表达放射状神经胶质细胞的形态和分子特征。此外，移植试验显示这些细胞不会转化，甚至在长期扩展后也不转化(Conti等，2005)。在ES细胞中过度表达Nanog蛋白能在ESxNS细胞融合后促进NS细胞基因组的重新编程。另外，Nanog蛋白表达是NS细胞重新编程所必需，如同A^m^-A&S细胞不能产生ES-NS杂交细胞所显示的那样。然而，在我们的试验中，通过在A^7ogV-五S共同细胞中导入转基因而表达Nanog蛋白拯救了这种性能，而在NS细胞中拯救的程度较低。比较了ES-ES与ES-NSFACS分选杂交细胞产生ES-样集落的能力，提示ES细胞的Nanog蛋白过度表达是重新编程NS细胞基因组所需的唯一因素。在此项研究中，我们分析了编程内容的结果，提供了一种依据Nanog蛋白从分化(细胞)基因组建立多能基因组的系统。在以下更详细描述的其它实施例中，在胚胎干细胞(ES)中表达的Nanog蛋白使得与神经干细胞(NS)融合后获得多能杂交细胞的频率提高200倍。这不可能用Nanog蛋白对细胞活力或克隆形成能力的作用来解释。强迫NS细胞表达Nanog蛋白不能使其转变为ES细胞表明，重新编程需要除Nanog蛋白以外的其它因素。然而，表达Nanog蛋白的ES细胞与NS细胞形成多能杂交细胞的效率与没有重新编程的ESxES相同。这意味着Nanog蛋白水平是将NS细胞表观基因组重新编程到多能杂交体的唯一限制因素。另外相对正常的但无Nanog蛋白的ES细胞与NS细胞融合后，不能产生任何多能杂交细胞。通过导入Nanog蛋白转基因完全恢复了它们的这种能力。这些发现证明，虽然Nanog蛋白对维持多能特性是非必需的，但它在原初早期胚胎细胞和分化细胞核的重新编程过程中协调形成多能表观基因组中起关键作用。以下也描述了利用MEK抑制剂来提高获得具有多能性质细胞和上调此种细胞表达Nanog蛋白的效率。业已证明如果用MEK抑制剂处理细胞可促进融合细胞的重新编程，效果与采用Nanog蛋白转基因相似。在本发明的另一实施方式中，在细胞重新编程中采用MEK抑制剂。所述细胞优选体细胞。在优选的实施方式中，所述细胞在体外重新编程。所述细胞优选不是融合细胞。还提供重新编程体细胞的方法，包括用MEK抑制剂处理细胞。在此方面内容中，能够重新编程体细胞使之回复为多能细胞，从而能够不通过细胞融合或核转移产生多能细胞。本文所述的MEK抑制剂指通用的MEK抑制剂。所述的也指MEK1抑制剂，例如PI84352(Davies等，2000)。已发现PI84352与其它已知MEK抑制剂相比具有更高的特异性和效力。现通过以下实施例和附图所述的具体实施方式说明本发明图1显示Nanog蛋白表达是体内X重新激活所必需的。图2显示Nanog蛋白提高了ES细胞产生ES-分化细胞杂交集落的能力。图3显示PEG在细胞活力和分化中的作用。图4显示对ES-NS杂交细胞中NS表观基因组的分析。图5显示对融合混合物的FACS分析。图6显示Nanog蛋白为产生ES样ES-NS杂交细胞集落所必需。图7(补充图1)显示杂交克隆的染色体计数。图8(补充图2)显示删除转基因Nanog后ES-NS杂交细胞表现出多能性。图9显示PD184352在形成多能ES-NS杂交细胞集落中的作用。更详细说，图1显示Nanog蛋白表达是体内X重新激活所必需的。(A-D)是Nanog杂合小鼠之间交配产生的雌鼠(XX)4.5dpc和滞育胚胎的Eed和Nanog蛋白的免疫荧光。分图(A，B)显示所分析胚胎的完整共聚焦投影图。箭头指出的为Nanog蛋白阳性细胞。(C，D)是A和BNanog蛋白阳性胚胎的高倍放大图。注意Nanog蛋白阳性细胞缺乏的Eed大焦点(白色箭头)。分图显示所分析胚胎的部分共聚焦投影图。红箭头指出细胞核有大的Eed焦点(失活X)的例子。胚胎的细胞核用Dapi复染。(E，F)表小结了对4.5(E)和滞育(F)胚胎Nanog蛋白阳性细胞中存在(有Xi)或不存在(无Xi)Eed大焦点的评分。图2显示Nanog蛋白提高了ES细胞产生ES-分化细胞杂交集落的能力。(A-F)说明含有用Leishmans染色的杂交集落的平板。包括RH和RHNES细胞与ES04GiP(A)、NS04GiP(胚胎)(B)、NSTGFP(D)、NS04GiP(成人)(E)和MEKTGFP(F)的融合物的评分集落呈现红绿荧光(见右侧的例子)。评分的EF4xNS04GiPGFPIH细胞(C)集落只呈现绿色荧光。所有评分的集落都显示ES的形态，评分是在细胞培养期间进行的。(G)是RH、RHN、EF4、EF4cre3、ES04GiP、NS04GiP(胚胎)禾口NSTGFP细胞中的Nanog、Oct4和Sox2蛋白水平的分析，a-微管蛋白用作加样对照。注意ES04GiP细胞在嘌呤霉素选择下培养，受Oct4调控序列的驱动，因此其代表了相对纯的ES细胞群。图3显示PEG在细胞活力和分化中的作用。(A)直方图表明RH和RHN细胞经PEG处理24小时后，贴附于100mm平板的ES细胞数。接种了106个细胞。(B)说明含有用碱性磷酸酶(AP)染色的RH和RHN细胞集落的96孔板。使PEG处理和不处理的细胞在培养板中静置4小时，然后用胰蛋白酶消化，将FACS分选的单个细胞移入96孔板。然后培养细胞12天。(C)表小结了96孔板的数据。图4显示对ES-NS杂交细胞中NS表观基因组的分析。(A-D)是XXNSTGFP、XYRH、XYRHN、XXXYRH-NSTGFP和XXXYRHN-NSTGFP细胞中的三甲基H3-K27(me3H3-K27)(A)、泛素化H2A(ubH2A)(B)、Xist的RNAFISH(C)和Oct4(D)的免疫荧光照片。黄色箭头指出XXNSTGFP细胞中存在me3H3-K27、ubH2A或XistRNA核小体。显示这些标记的细胞百分比以黄色标出。白色箭头表示存在Oct4或XistRNA的新生转录物。显示有预期等位基因表达的细胞百分比用白色标出。所有细胞核用Dapi复染。(E)是NSTGFP、NS04GiP、RH、RHN、RH-NSTGFP(克隆1禾卩2)禾口RHN-NSTGFP(克隆1禾卩2)细胞中Blbp、01ig2和Oct4的RT-PCR分析。Gapdh用作普遍表达的对照cl-克隆。图5显示对融合混合物的FACS分析。(A-C)说明检测RHxNSTGFP、RHNxNSTGFP、RHNxES04GiP、RHNxMEFTGFP禾口RHNxTTGFP细胞的红绿荧光的FACS散点图。(A)提供了对杂交细胞群的分析和FACS分选进行门控的模拟融合物；(B)PEG处理后24小时的融合混合物；(C)B门内的FACS分选杂交细胞的纯度核査。(D)接种B门内分选的杂交细胞，根据每一次接种的杂交细胞形成集落的百分率对形成的集落评分。这些评分说明了FACS分选细胞的纯度。(E)表示重复实验的评分。图6显示Nanog蛋白为产生ES样ES-NS杂交细胞集落所必需。(A，B)说明含有经碱性磷酸酶染色的RCxNS04GiP、RCAV-xNS04GiP、RCA-ANZxNS04GiP、RCA-/-xNS04GiPNP、RCB-AxNS04GiP、RCB-ANZxNS04GiP、RCB-AxNS04GiPNP细胞之间融合产生的杂交细胞集落的平板。各平板图下显示了评分。(D)ES04GiP、RC、RCA-A、RCB-/-、RCA-/-NZ、RCB-/-NZ、NS04GiP禾口NS04GiPNP细胞中的Nanog、Oct4和Sox2蛋白水平分析，采用a-微管蛋白作为加样对照。(E)ES04GiP、NS04GiPNP和NS04GiP细胞中Blbp、01ig2、GFP和Oct4的RT-PCR分析。Gapdh用作普遍表达的对照。(F)PEG在RC、RCB-A禾口RCB-/-NZ细胞活力中的作用。直方图表明经PEG处理24小时后贴附于100mm平板的ES细胞数。接种了2乂106个细胞。图7(补充图1)显示杂交克隆的染色体计数。实施例显示RH-NS04GiP(A)、RHN-NS04GiP(B)、RH-NSTGFP(C)和RHN-NSTGFP(C)的分裂中期(染色体)分散情况。计数了每个杂交细胞系3个克隆8—n个细胞的分裂中期染色体数，在各图下方示出。cl-克隆。图8(补充图2)显示删除转基因Nanog后ES-NS杂交细胞表现出多能性。(A)EF4和神经干细胞(NS)04GiPRB细胞的示意图。EF4细胞含有组成性表达的侧接loxP位点的Nanog蛋白转基因，可用cre重组酶删去Nanog而导致GFP组成性表达。NS04GiPRB含有受Oct4启动子序列驱动的GFP转基因和能组成性表达红色荧光素转基因。灰色框表示IRES序歹ij。(B)EF4-NSRB04GiP杂交细胞呈现绿(GFP)和红色(dsRED)荧光。这些标记是供体NS细胞基因组表达的。(C)cre删除Nanog基因后的EF4-NSRB04GiP细胞。注意GFP表达增加。(D)说明EF4-NSRB04GiPcre杂交细胞的胚胎样小体(EB)分化。(E)分化(diff)第3、5、7和8天时EF4-NS04GiPRBcreEB细胞中T-brachyury(短尾表型相关基因)表达的RT-PCR分析。也分析了未分化杂交细胞和亲代/供体细胞系。Gapdh用作普遍表达的对照。(F)接种的EBs细胞ot-肌动蛋白(蓝色)的免疫荧光照片。图9显示对PD184352在形成多能ES-NS杂交细胞集落中作用的分析。(A-C)RHxNSTGFP融合细胞红绿荧光的FACS分析。(A)PEG处理后24小时的融合混合物；(b)A门内的FACS分选杂交细胞的纯度核查。(C)接种A中分选的杂交细胞，根据每一次接种的杂交细胞形成集落的百分率对形成的集落评分。这些评分说明了FACS分选细胞的纯度。(D)数据小结。(E)杂交细胞集落形态的举例。实施例l早期胚胎中表达Nanog蛋白是必须的并且与渐进性X重新激活相关己知X-染色体的体内重激活发生在雌性胚胎外胚层母细胞的4.5dpc周围(Mak等，2004;Okamoto等，2004)。为了研究假定Nanog蛋白在体内参与重编程，我们用免疫荧光法检查了4.5dpcNanog-A胚胎的Eed和Nanog蛋白表达。Eed是胚胎植入前X染色体失活的标志(Silva等，2003;Mak等，2004;Okamoto等，2004)。Nanog-A之间交配产生的25只胚胎有6只缺乏Nanog蛋白染色，其中4只为雌性。Nanog蛋白阴性胚胎显示其所有的核存在一个大的Eed焦点，除去凋亡和Eed染色极差的细胞外(图1A)。雌性Nanog蛋白阳性胚胎显示有不同数量的Nanog蛋白阳性ICM细胞(图1E)。与此胚胎其余部分相反，一定比例的这些细胞不呈现Eed焦点，这与X重激活相一致(图1C，E)。Nanog-A胚胎一般较小。为确定这是否是因为发育迟缓所致我们分析了滞育的6.5dpc胚胎(图1B)。31只被检胚胎中8只缺乏Nanog蛋白染色，其中3只为雌性。如同4.5dpc胚胎，这些胚胎的所有细胞中也呈现存在Eed焦点。相反，雌性Nanog蛋白阳性胚胎的几乎所有Nanog蛋白阳性细胞不呈现Eed焦点(图1D-F)。结论，此数据表明Nan0g-/-雌性胚胎不能重激活沉默的X-染色体，提示Nanog蛋白在外胚层基因重编程中起作用。实施例2过度表达Nanog蛋白的ES细胞产生ES样ES-分化细胞杂交集落的能力增强为研究Nanog蛋白是否参与重编程，我们利用了ES细胞与其它ES、NS、小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)和胸腺细胞(T)的融合细胞，测定WT细胞和受Nanog操纵的细胞产生ES样ES-分化细胞杂交集落的能力。用三种不同的细胞融合方法，即电融合、聚乙二醇(PEG)介导的融合和共培养时细胞的自发融合(Matveeva等，1998;Terada等，2002;Ying等，2002)预先产生多能杂交细胞。我们用PEG诱导的融合产生杂交细胞时，起初用组成性表达红色荧光素和潮霉素抗性基因的RHES细胞，和过度表达Nanog蛋白的RHES衍生细胞RHN。使这些细胞与携带有含小鼠Oct4基因调控序列的转基因的ES和NS细胞二者融合(Yeom等，1996)，产生了GFP和嘌呤霉素抗性(04GiP)(Ying等，2002)。此转基因只在多能细胞中表达，因此ES-NS细胞融合后只有当NS细胞基因组重编程时才发生这种重激活。NS细胞衍生自14.5dpc胚胎的前脑。为了在不同的融合对中产生可比较的结果，采用同样的参数同时进行融合。ES细胞与ES或NS细胞融合成功后，培养平板中出现了耐药的红色和绿色荧光细胞集落。这些集落恒定地显示ES形态但核增大。独立于Nanog蛋白表达，ES细胞之间的融合产生了含有大量杂交集落的平板(图2A)。相反，ESxNS细胞融合结果不同。与RHxNS04GiP融合相比，RHNxNS04GiP融合显示产生了数量高得多的集落，相差约200倍(图2B)。为了验证表达Nanog蛋白的ES细胞产生ES-NS杂交细胞集落的能力增强，我们用固定的NanogES细胞(EF4)和cre删除的衍生EF4cre3细胞进行了实验(Chambers等，2003)。使这些细胞与携带有能赋予组成性潮霉素药物抗性的第二种转基因CAG-egfp-Ires-Hygro(GFPIH)的NS04GiP衍生细胞融合。EF4细胞系原先显示在缺乏LiF时能自我更新，而EF4cre3细胞系在胚泡注射后能产生嵌合体(Chambers等，2003)。与以上结果一致，EF4xNS细胞融合产生了大量的耐药性集落，而EF4cre3xNS细胞融合不能产生耐药性集落(图2C)。为了进一步鉴定此现象，我们采用了能组成性表达融合蛋白TAUGFP和嘌呤霉素抗性基因的独立NS细胞系TGFP(Pratt等，2000)。使这些细胞与RH和RHNES细胞融合。获得的结果仍然相反，与RHNxNSTGFP融合产生了大量的杂交集落，而RHxNSTGFP融合只产生了一个杂交集落(图2D)。此现象也见于ESxNS(ES和成年衍生的)融合物，以及较低程度见于ESxT禾口ESxMEF融合物(图2E，F)。为更详细检查此种相关性，我们比较了细胞系之间的Nanog、Oct4和Sox2水平(图2G)。在RHN和EF4ES细胞中测到高水平的Nanog蛋白，而发现其余的ES细胞系Nanog蛋白水平类似地较低。就EF4和EF4cre3细胞系而言，测得的Nanog蛋白水平相差5倍(Yates和Chambers,2005)。所用的所有ES细胞系之间多能标记物Oct4和Sox2没有差异。如期望的那样NS细胞显示表达了Sox2。综合这些结果表明，ES细胞过度表达Nanog蛋白显著提高了这些细胞产生ES-NS而非ES-ES杂交细胞集落的能力，这支持了Nanog蛋白在重编程中起到作用的观点。实施例3与RHnanogES细胞相比，PEG不能诱导RH细胞死亡和分化增加为了评估PEG处理可能对RH或RHNES细胞具有促分化作用，我们分析了细胞的存活和分化。细胞存活的评分为PEG处理后24小时贴附于100mm平板的ES细胞数。接种106个PEG处理的RH和RHNES细胞后第二天分别计数到6.6xl()S和5.3xl()S个细胞(图3A)。为了验证是否可能诱导分化和PEG处理的ES细胞生长和改变形成ES细胞集落能力，对经PEG处理和未处理的RH和RHNES细胞进行单细胞FACS分选。FACS分选后约12天，用碱性磷酸酶(AP)染色各孔作未分化状态ES细胞的鉴定。大多数接种的未处理的RH和RHNES细胞形成了未分化集落(图3B，C)，而PEG处理的细胞显示集落总数减少。RH的集落减少约50%，但对RHN集落形成的影响小得多。未观察到分化增加，39个RH集落只有4个，73个RHN集落有1个是AP阴性。综合这些数据表明，PEG能在一定程度上诱导RH和RHNES细胞死亡，但不诱导细胞分化。经过FACS和PEG处理后，RHN细胞的集落形成能力提高了2倍，这并不足以解释观察到的杂交体增加200倍。实施例4杂交细胞的染色体分离并以显著频率回复为二倍体细胞为确定ES-NS杂交细胞，我们观察了其染色体组成和NS细胞表观基因组的身份。为分析前者，我们观察了来源于RHxNS0ct4GiP、RHnanogxNSOct4GiP、RHxNSTGFP和RHnanogxNSTGFP之间融合产生的12种独立的ES-NS杂交细胞克隆。传代5次后，这些克隆在分裂中期大部分时间显示有80条染色体(补充图l)6个ES-NS克隆的分析(只对JS细胞基因组进行分析)显示，存在的二倍体细胞群随着传代数而增加。这可能是由于与四倍体细胞相比二倍体细胞有生长优势。12代时分析了这些克隆中的二个克隆，显示二倍体细胞(40条染色体)分别占30%和50%。此外，细胞群由二种不同细胞组成，一种有接近40条染色体，另一种有80条染色体，提示发生了一次染色体分离。需要进一步分析来评价这些新的重编程二倍体杂交细胞中的NS细胞基因组比例。然而，此数据意指，可通过细胞融合从分化细胞获得未分化的二倍体ES细胞。实施例5在ES-NS杂交细胞中NS基因组获得了ES细胞身份为评价ES-NS杂交细胞中NS细胞表观基因组身份，我们观察了失活X染色体的状态以及Oct4与神经干细胞基因Blbp和01ig2的等位基因表达。与XX多能细胞相反，XX分化细胞有一个失活的X染色体。在各种细胞学标记中，发现失活X染色体伴有XistRNA，而且富含三甲基化的H3-K27和泛素化的H2A(Brown等，1992;Napoles等，2004;Silva等，2003)。与NS细胞分化状态同时，共聚焦分析揭示有一个由XistRNA、三甲基化H3-K27和单一泛素化H2A组成的核小体(图4A-C)。此外，发现失活X的H3-K9乙酰化程度低，H3-K4甲基化程度低且富含组蛋白变体macroH2A(数据未显示)。因此如果XXXYES-NS杂交细胞中发生重编程，此失活的X应丢失这些沉默标记。这正是所观察到的，随着XistRNA核小体丢失和替代，检测到ES细胞的三个针尖Xist信号特征，它们对应于Xist的新生转录物(图4C)。另外，ES-NS杂交细胞染色质状态的免疫荧光分析显示丢失了三甲基H3-K27和单泛素化的H2A核小体(图4A，B)。XXXYES-NS杂交细胞Oct4表达的RNAFISH分析揭示每个细胞核存在3或4个针尖信号，证明NS细胞来源的Oct4等位基因重新激活(图4D)。XXXYES-NS杂交细胞的特征鉴定包括在NS细胞中表达但在ES细胞中沉默的01ig2和Blbp基因的表达分析(Conti等，2005)。与上述结果一致，RT-PCR分析揭示在ES-NS杂交细胞中Blbp和OHg2二基因都关闭了(图4E)。为研究多能活性，使过度表达Nanog蛋白的ES和NS细胞之间融合产生的杂交细胞分化，形成胚胎样小体，分析中胚层标记T-brachyury(短尾表型相关基因)的表达(补充图2)。考虑到Nanog蛋白过度表达会抑制分化(Chambers等，2003)，采用了EF4-NS04GiPRB杂交细胞。如前所述，EF4细胞含有固定的Nanog转基因使其可利用cre重组酶的活性被删除，而NS04GiPRB组成性表达红色荧光蛋白和灭菌素抗性基因(补充图2A)。因此，EF4-NS04GiPRB杂交细胞呈现NS来源的红绿荧光(补充图2B)。经cre重组酶处理后，观察到Nanog蛋白过度表达丧失，因为杂交细胞呈现的绿色荧光增强(补充图2C)。然后通过撤回Lif和形成胚胎小体(EB)使这些EF4-NS04GiPRBcre杂交细胞分化，并分析其T-brachyury(短尾表型相关基因)表达(补充图2D，E)。如预期的那样，在供体细胞或未分化杂交细胞中未检测到T-braehyury(短尾表型相关基因)表达。然而根据多能潜力，它应在分化的杂交细胞中表达。也接种了EB，每孔1一3个，分析是否存在收縮细胞。大约70%(24/35)的孔显示有搏动细胞，其骨骼肌和心肌细胞a-肌动蛋白的特异性标记染色阳性(补充图2F)。综合而言，此数据表明，就所有分析的标记而言，ES-NS杂交细胞中的NS基因组获得了ES细胞身份。此外，杂交保留了多能性。实施例6ES细胞中Nanog蛋白过度表达是细胞融合后NS细胞重新编程所需的唯一因素ES细胞过度表达Nanog蛋白可能比WTES细胞更具融合性。为说明此观点，融合后24小时用FACS分析了细胞群RHxNSTGFP和RHNxNSTGFP中是否存在呈现红绿双荧光的原代杂交细胞。如预期的那样，双阳性细胞数目较低。RHxNSTGFP禾PRHNxNSTGFP中双阳性细胞分别占0.17%和0.1%(图5B)。此外，我们检测了FACS分选的原代杂交细胞形成集落的能力。在此阶段，可能发生重新编程，但不可能完成，因为先前曾证明细胞融合后约48小时首先检测到Oct4调控序列驱动的GFP表达(Tada等，2001;Do和Scholer，2004)。所以除了考虑例如细胞周期的协调外，此阶段的杂交细胞必须克服表观基因组分化产生ES样细胞集落。FACS分选后3天用潮霉素和嘌呤霉素共同选择板中的原代杂交细胞。二次独立实验的结果显示分选的RHxNSTGFP融合的原代杂交细胞并不产生杂交集落(图5D，E)。相反，2000个和700个FACS分选细胞分别产生的34个和11个杂交集落分别获自RHNxNSTGFP融合物(图5D，E)。这些结果提出了重新编程中Nanog过度表达的相关性的问题。为了解决这一问题，将形成的RHN-NSTGFP集落数量与RHN-ES04GiP相比，后者被认为是每个接种的杂交体形成集落的参比单位。考虑到双阳性FACS分选细胞的总数中杂交集落所占的比例，RHN-NSTGFP和RHN-ES04GiP原代杂交体产生ES样集落的能力基本相同(图5D，E)。结论是，ES-NS杂交体的FACS分选和分析证明Nanog蛋白过度表达不能增强细胞融合，但证实它促进了ES样ES-NS杂交集落的产生。也表明Nanog蛋白可能是在产生ES-NS杂交集落中克服表观基因组差异所需的唯一限制因素。实施例7重新编程中作为供体细胞的神经细胞在体细胞核转移(SCNT)中，所用的供体细胞类型能影响胚泡的ES细胞衍生效率(Hoechedlinger禾tlJaenisch2002;Blelloch等，2004;Eggan等，2004;Inoue等，2005)。在这些研究中，ES细胞显示可获得最佳结果，提示供体细胞的分化状态是一个重要因素。NS细胞是体细胞中的多能干细胞(Conti等，2005)，含有某些可塑性表观基因组。在我们的实验中RHN-NS原代杂交细胞显示能产生ES样杂交细胞集落，效率与RHN-ES原代杂交细胞相同。为了解这是否是由于NS的表观基因组性能所致，或只是由于Nanog蛋白过度表达所致，我们分析了MEF和胸腺细胞(T)原代杂交细胞产生ES样集落的能力。使MEF和T细胞与RH和RHNES细胞融合。象RH-NS那样，RH-MEF和RH-T原代杂交细胞不能产生ES样集落(数据未显示)。RHN-MEF和RHN-T原代杂交细胞能产生ES样集落但效率比RHN-ES和RHN-NS原代杂交细胞低得多(分别为0.08%和0.33%)(图5A-E)。这些数据表明，与分化的对应细胞相比，NS细胞的表观基因组似乎更容易发生与Nanog过度表达的ES细胞融合而致的重新编程。实施例8(比较实施例)NS细胞中的Nanog蛋白表达不足以导致重新编程为了研究Nanog蛋白表达是否足以导致NS基因组重编程为ES细胞基因组，用Nanog(NS04GiPNP)转染了NS细胞。这些细胞稳定表达了Nanog，此蛋白的水平与ES细胞中的相似(图6D)。此外，细胞正常增殖，显示表达了NS细胞的标志Blbp和01ig2蛋白(图6E)。然而没有受Oct4调控序列驱动的内源性Oct4或GFP表达。当接种在标准的GMEM或N2B27ES培养基时，如先前报导的那样(Conti等，2005)，细胞分化成星形细胞类型的细胞。其它采用二种强效表观基因去稳定剂曲古柳菌素A和5-氮杂胞嘧啶核苷的实验也不能重编程表达Nanog蛋白的NS细胞(资料未显示)。综合在一起，这些结果提示ES细胞成分以外，Nanog蛋白表达不足以实施例9Nanog蛋白是产生ES样ES-NS杂交细胞集落所必需的培养无Nanog蛋白的分离的ICM和ES二种细胞不能使其维持在非分化状态(Mitsui等，2003)。这些结果的解释是，表明Nanog蛋白对维持多能状态具有重要作用。然而，采用条件性删除方法，我们产生的Nanog-/—ES样细胞(RC-/-)可表达多能标志，通过一系列传代仍维持多能能力。此方法包括将固定的Nanog转基因引入ES细胞然后耙向删除内源性Nanog基因和最后利用ere切除Nanog转基因。RC-A细胞是真正的ES细胞的进一步证据来自以下事实，即通过引入靶向载体后可选择到驱动G418和潮霉素抗性基因的内源性Nanog启动子。这得以选出纯的ES-样细胞群，其Oct4和Sox2水平与其它表达Nanog蛋白的ES细胞群相似(图6D)。为研究Nanog蛋白是否为重编程所必需，平行进行了RC-A或其亲代细胞系RC与NS04GiP细胞的融合。也使RC-A细胞与表达转基因Nanog的NS04GiP，即NS04GiPNP细胞融合。最后，将用表达Nanog蛋白转基因拯救的细胞(RC-/-NZ)与NS04GiP细胞融合。这些实验采用二个独立的靶向克隆11<:-/-八和8进行。为了获得杂交细胞集落数目的有意义读数，接种了2xl06:2xl(^个融合的混合细胞群。不出所料，亲代细胞系RC与NS04GiP融合产生了杂交集落(图6A，B)。相反，RC-A细胞则完全丧失了此种能力。用Nanog拯救RC-A细胞，RC-/-NZ不仅获得了产生杂交集落的能力而且进一步增强了与RC细胞的亲缘关系。此结果与RC-/-NZ细胞存在较高水平Nanog蛋白相关(图6D)。令人感兴趣的是，RC-Z-细胞当与表达Nanog蛋白的NS04GiPNP细胞融合后也能产生杂交集落。综合在一起，这些结果提示，存在Nanog蛋白表达是ESxNS细胞融合后NS基因组重编程所必需的。实施例10用MEK抑制剂提高Nanog蛋白的表达27已证明MEK抑制剂PD184352能提高ES细胞中的Nanog蛋白水平。也通过测定细胞融合使NS细胞转化为多能细胞研究了PD184352对重编程的作用。使组成性表达dsRed荧光蛋白和潮霉素抗性的RHES细胞与表达通过IRES与嘌呤霉素抗性连锁的融合蛋白TauGFP的胚胎衍生神经干细胞(NSTGFP)融合。融合前后3天用3uM的PD184352处理融合RH细胞之一。对照不加PDI84352。融合后24小时分选出处理和未处理的原代杂交细胞，接种平板(图9A—C)。3天后，向ES培养液中加入潮霉素和嘌呤霉素进行选择。给表达dsRed2和GFP荧光及显示ES细胞形态的集落评分(图9D，E)。结果显示PD184352使ES-NS杂交集落形成提高45倍。令人感兴趣的是，与表达Nanog蛋白的ES细胞相比，PD184352处理的RH细胞每平板杂交细胞形成的杂交集落的百分率正好低2倍(2.25%比4%)。此结果显示PD184352提高了融合细胞中的重编程。此种作用可能是由于处理的RH细胞中Nanog蛋白水平升高所致。因此，如果内源性表达Nanog蛋白，那么可用MEK抑制剂来上调Nanog蛋白而获得相关作用，如促进重新编程。参考文献BaoS，MiyoshiN，Okamotol，JenuweinT，HeardE，AzimS腦niM.InitiationofepigeneticreprogrammingoftheXchromosomeinsomaticnucleitransplantedtoamouseoocyte.(启动移植到小鼠卵母细胞中的体细胞核X染色体表观基因重编程)EMBORep.2005年8月；6(8):748-54。BortvinA，EgganK，SkaletskyH，AkutsuH，BerryDL，YanagimachiR，PageDC，JaenischR.IncompletereactivationofOct4-relatedgenesinmouseembryosclonedfromsomaticnuclei.(细胞核克隆的小鼠胚月台Oct4-相关基因的不完全重激活).Development.2003年4月;130(8):1673-80。BrownCJ，HendrichBD，RupertJL，LafreniereRG，XingY，LawrenceJ，WillardHF.ThehumanXISTgene:analysisofa17kbinactiveX-specificRNAthatcontainsconservedrepeatsandishighlylocalizedwithinthenucleus.(人XIST基因含保守性重复序列的17kb无活性X-特异性RNA的分析，其主要位于核中)Cell.1992年10月30日；71(3):527-42。ChambersI，ColbyD，RobertsonM，NicholsJ，LeeS,TweedieS，SmithA.Fun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