专利名称：进行微阵列检测的方法
进行微阵列检测的方法
技术领域：
本发明涉及生物学液体中单个生物化合物的定量和/或定性分析或测 定。具体而言，本发明涉及一种用于进行微阵列检测的改进、廉价而有效 的方法。更具体而言，本发明涉及一种方法，其用于执行来自一个微阵列 检测中 一份或多份样品的几种生物化合物的差异标记。
含有一种或多种其他分子的生物样品中的多个特异靶生物化合物(例如
但不限于DNA、 RNA或蛋白质)的存在和浓度可以通过使用所谓的微阵列 技术在单个实验中进行测定。在该技术中， 一组特异的探针分子被固定化
在一块固相表面的特定位点，之所以选择其中每个特异探针分子是为了与 某个特定靶特异地相互作用。另一方面，靶生物化合物被可检测的分子(例 如荧光团或磁珠)标记。通过将生物样品与所述固相表面接触，靶生物化合 物将会被固定在对应于其特异探针的位点。然后通过定位和测量结合到靶 上的可检测分子所产生的信号强度，分别进行靶生物化合物的检测及其在 生物样品中浓度的测定。
例如WO03/004162公开了该方法，其中一块表面上排列了 3种不同的 寡核苷酸DNA探针，并与3种不同的互补DNA靶的样品库杂交。靶以荧 光标记物(异硫氰酸荧光素)修饰以允许直接在表面上检测。由于样品接触表 面，特异靶被探针从溶液中俘获到表面，并且以落射荧光显微镜进行检测。 WO03/004162公开了上述一般方法的几种改进之处，例如使用多孔基底以 允许样品通过流过所述基底(任选地可经反复使用抽吸系统)使样品接触探 针。该方法具有显著加固杂交的优点。另外一个改进是使用了用于控制样 品温度的热处理室。由于杂交是温度依赖性的现象，温度控制为例如核酸 分析提供了优点。
但是，该现有技术方法没有提供方法来同时对一份以上样品(例如健康 人血液与患病患者血液)或单次实验中的单份生物样品中存在的两种不同类 型的生物化合物(例如RNA和DNA)执行微阵列技术。这些局限导致了定量 和/或定性分析或测定数种生物液中单个生物化合物和/或属于不同类型生
物化合物的单个生物化合物所需时间大大增加，因此也大大增加了所需成 本。
因此技术领域需要一种改进的、更快速和更有效的方法来同时对一份 以上生物样品或对单个实验中一份生物样品中存在的两种或更多类型的生 物化合物执行微阵列技术。
正如本文所使用，除非另有说明，术语"类型"在应用于靶生物化合物时 系指一组分子结构相关的化合物。本发明涉及的靶生物化合物的例示性类
型包括但不限于DNA生物化合物、RNA生物化合物、多肽、酶、蛋白质 和抗体等。
正如本文所使用，除非另有说明，术语"微阵列"系指一种阵列，其中一 种包含靶生物化合物的样品，优选为生物学液体样品(任选地含有悬浮于其 中的少量固体或胶体颗粒)与一种在其表面上包括多个离散且隔离区域的基 底(例如膜)接触(例如通过)，每个所述区域具有一种施加于其上的探针(例如 通过点样)，而且之所以选择所述每一种探针是因为其与每一类型生物化合 物中最多一个靶生物化合物结合时具有一些特异性，优选地为在严格性条 件下的特异性，优选地为在高度严格性条件下的特异性。正如技术人员所 熟知，结合条件的严格性涉及一系列参数，例如温度、离子浓度和pH。
正如本文所使用，除非另有说明，术语"靶"系指固定作为分析目标或分 析点的分子化合物。它包括分子化合物，例如但不限于核酸和相关化合物(例 如DNA、 RNA、寡核苷酸或它们的类似物、PCR产物、基因组DNA、细 菌人工染色体、质粒等)、蛋白质和相关化合物(例如多肽、单克隆抗体、受 体和转录因子等)、抗原、配体、半抗原、糖类和相关化合物(例如多糖和寡 糖等)、细胞器、完整细胞等。
正如本文所使用，除非另有说明，术语"探针"系指被固定到基底表面上 和/或基底内并可与生物样品中的"耙"特异地相互作用的生物物质，其被用 于检测所述特异靶的存在。它包括分子化合物，例如但不限于核酸和相关 化合物(例如DNA、 RNA、寡核苷酸或它们的类似物、PCR产物、基因组 DNA、细菌人工染色体和质粒等)、蛋白质和相关化合物(例如多肽、单克隆 抗体、受体和转录因子等)、抗原、配体、半抗原、糖类和相关化合物(例如 多糖和寡糖等)、细胞器和完整细胞等。
正如本文所使用，除非另有说明，术语"标记物"系指其物理分布或/和 其发出的信号强度易于检测到的剂，例如但不限于发光分子(例如荧光剂、 磷光剂、化学发光剂和生物发光剂等)、有色分子、反应时产生颜色的分子、 酶、磁珠、放射性同位素、可特异结合的配体和可被声共振法检测的微泡 等。
正如本文所使用，除非另有说明，术语"标记"系指将标记物掺入探针的 动作。
概括来说，本发明第一方面涉及一种在单个微阵列检测中对源自一份 或多份样品的几种生物化合物同时进行差异标记的方法。本发明第二方面 还涉及在单个微阵列检测中对源自一份或多份样品的几种生物化合物进行 差异标记的方法中使用基底，例如但不限于无机晶片或有机膜。
概况而言，本发明涉及一种对包含靶生物化合物的一份或多份样品液 进行微阵列检测的方法，所述方法包括用标记物标记所述靶生物化合物， 将所述样品液与基底接触并检测所述基底的表面上所述标记物的存在，其 中所述方法适合于在一个微阵列中同时分析一份或多份样品液中的一种或 多种类型的耙生物化合物，以及其中
(i) 每一所述类型的生物化合物以不同的标记物进行标记，以使属
于不同样品液的靶生物化合物具有不同的标记物；
(ii) 耙生物化合物类型的数量和样品液的数量中的至少一个为至少
2，以及
(iii) 所述不同标记物在所述基底的表面上经检测可区分开来。 本发明的一个重要特点是在单次执行所述方法中同时使用了至少两种
不同的标记物。本发明的另外一个重要特点是通过标准的标记物检测方法 应可区分开至少两种不同的标记物。通过下面二者任一方法，该特点允许 实现分析方法中时间的大量节省。
-同时测定来自不同样品的分析物(例如在一次实验中分析血样和痰样 中的DNA含量)，或
-同时测定来自多个样品的分析物的差异表达(例如在单次执行所述方 法中分析来自健康患者的血样和来自患病患者的血样中的DNA含量)，例 如出于比较目的，或
-同时测量或分析来自相同样品的不同类型的靶生物化合物(例如在单
次执行所述方法中分析一份血样中的DNA含量和RNA含量)，或
-同时测量来自不同样品的不同类型的靶生物化合物(例如在单次实验 中分析一份血样和一份痰样中的DNA含量和RNA含量)。
当样品(优选为流体样品)中存在的待分析耙生物化合物为分子时，例如 但不限于下列分子时，本发明的方法特别有用
-具有约5个氨基酸单位到50个氨基酸单位的寡肽，
-具有50个以上氨基酸单位的多肽，
-包括酶在内的蛋白质，
-寡核苷酸和多核苷酸，
-抗体或抗体的片段，
-RNA，以及
國DNA。
对于某些靶生物化合物，变性步骤可能是有利的，例如双链DNA可以 分离成单链以允许单链DNA特异结合点样到膜上的俘获探针。该变性步骤 可以便利的方式进行，例如通过加热基底(晶片或膜)或样品或加热二者。当 在该变性步骤中加热样品时，可进行一个任选的冷却步骤以使链保持分离。 用于在所述方法第一步中标记所述靶生物化合物并最终允许在所述方 法的最后一步对它们进行检测的标记物可以是发光的(例如荧光、磷光或化 学发光)、放射性的、酶的、比色的，声的(例如微泡共振)或磁性的。可特 异结合的配体可以用于替代标记物。在最后一种情况下，所述配体将在下 一步结合一个带标记物的相容性剂。
合适的荧光或磷光标记物为例如但不限于荧光素、Cy3、 Cy5等。 合适的化学发光标记物为例如但不限于鲁米诺、赛卢姆(cyalume)等。 合适的放射性标记物为例如但不限于同位素如125I或32P。 合适的酶标记物为例如但不限于辣根过氧化物酶、P-半乳糖苷酶、荧光 素酶、碱性磷酸酶等。
合适的比色标记物为例如但不限于胶体金等。 合适的声标记物为包括但不限于微泡等。 合适的磁珠为例如但不限于免疫磁珠(Dynabeads)等。
每一靶生物化合物可用多达约300个相同的标记物进行标记(例如在一 个最终的PCR扩增步骤中)以增加敏感性。作为一个任选步骤，没有掺入靶 生物化合物中仍存在于样品液中未结合的标记物可通过化学和/或物理处理 (例如化学PCR纯化、透析或反相渗透)从样品液中除去以减少后续测量中 的背景信号。
样品液可来自工业或天然来源。适合于执行本发明所述方法的样品液 的实例可为但不限于来自包括哺乳动物(尤其是人类)、鸟类和鱼类在内的任 何动物的体液例如痰、血液、尿液、唾液、粪便或血浆。其他非限制性实 例包括来自植物、线虫和细菌等含有生物材料的液体。对于本发明所述方 法适宜执行的唯一要求是所述生物材料以基本上为流体、优选液体、例如 合适的溶解介质中的溶液的形式存在。用于本发明所述方法中的样品液的 体积可以取约5 nl到1 ml之间的任意值，优选地为约50 pi到400 之间 的任意值。
在许多情况下，直接将缓冲液(例如杂交缓冲液)掺入到待分析的样品液 中或将缓冲液作为检测单元的组成部分(例如以流体或冻干形式加入到基底 的上面或下面)是可取的，因此无需单独的杂交缓冲液储存区域。
探针施加(例如点样)于其上的基底不是本发明的限制性特点，因此可以 用技术领域已经描述的任何材料制造成用于微阵列检测的适宜基底。此类 材料的非限制性实例一般包括
-有机聚合物，例如聚酰胺同聚物或共聚物(例如尼龙)、热塑性氟化聚 合物(例如PVDF)、聚卤乙烯、聚砜、纤维素材料例如硝酸纤维素或醋酸纤 维素、聚烯烃或聚丙烯酰胺和
-无机材料，例如玻璃、石英、二氧化硅、其他含硅的陶瓷材料和金属 氧化物材料例如氧化铝等。
这些材料可以是活化的或未活化的。如果是活化的，可以通过化学或 物理处理进行活化。适宜的活化方法包括但不限于等离子、电晕、UV或火 焰处理和化学修饰。根据材料的种类，特别是有机聚合物材料的种类，适 宜的化学修饰包括但不限于引入季铵离子(例如引入到聚酰胺)、溶剂分解 (例如水解)、酰胺基衍生为脒基(例如在聚酰胺中)、羟基化、羧基化或硅垸 化。对于本发明所述方法的适宜执行不需要活化的基底材料的非限制性实
例是尼龙(聚酰胺同聚物)，特别是用于DNA或RNA分析时，这是因为它 对寡核苷酸和多核苷酸具有内在的亲和力。
用于本发明所述方法的基底可以是多孔的或非多孔的。如果基底为非 多孔的，可只需将所述非多孔基底与样品液接触进行杂交，优选情况下利 用一些搅拌和足够长的时间以使杂交发生(例如约4到20小时范围内的一段 时间)。
如果基底是多孔的，优选地将所述样品液通过所述多孔基底进行杂交。 例如可以将样品液以单向或双向抽吸一次或多次通过多孔基底来实现杂 交。还可以通过将多孔基底本身移动一次或多次通过样品液以迫使样品液 通过所述多孔基底的孔隙而实现杂交。例如，基底可以以垂直于所述基底 平面的方向相对移动到含有样品液的室。
如果基底为多孔的，它可包括一个具有许多各种几何形状和大小的孔、 开口和/或通道的网络。基底可为纳米孔或微米孔，即孔、开口和/或通道的 平均大小可适宜地被包含在0.05 pm到10.0 jam之间，优选地在0.1 到 l.Opm之间，更优选地在0.3到0.6nm之间。根据所述基底的生产技术， 孔度分布可基本一致或它可具有约1.1到约4.0的多分散性。对应于孔、开 口或通道的表面可代表多孔基底上表面或下表面约1到99%之间、优选为 约10%到90%之间、更优选为约20%到80°/。之间的总表面。
基底(例如膜)的厚度不是本发明的限制性特点，它可以在约10pm到1 mm,优选为50 nm到400 pm，更优选为70 到200 之间变化。基底 (例如膜)的形状不是本发明的限制性特点。它可以为环状，例如具有约3到 15 mm之间的直径，但是本发明所述方法也可应用于其他任何形状和/或大 小的基底。
选择适宜于本发明的探针时，应考虑到它们对靶生物化合物的亲和力 或它们对所述靶生物化合物的相关修饰的亲和力。例如，如果靶生物化合 物是DNA，探针可以但不限于为合成寡核苷酸、它们的类似物或特异抗体。 靶生物化合物合适修饰的一个非限制实例是生物素取代的靶生物化合物， 其中探针可具有抗生物素蛋白功能。
为了更易支持随后的检测和鉴定，还可以在基底的表面上点上一个或 多个另外的点(例如用于强度校正和/或位置检测)。
点样后，或是因为基底(如膜)内在或获得(例如通过活化)的属性而自发 性固定，或是通过一个附加的物理处理步骤(例如但不限于交联，如通过干 燥、加热或暴露在光源下)而固定，探针被固定在基底的表面上。
为了改进基底(如膜)和附着于其上的探针的保存期，在膜未使用时对其 干燥可能是有所帮助的。此后膜与样品液接触重新水化。
一旦将探针应用(例如通过喷墨点样)于基底的膜表面，加入一有效量的 封闭剂以灭活基底未点样的区域对于防止靶生物化合物或未结合标记物非 特异性地结合到未点样区域(那将导致不需要的背景信号)以增加信噪比可 能是有所帮助的。合适的封闭物质或封闭剂的实例一般包括但不限于鲑鱼 精子、脱脂牛奶或聚阴离子。
就多孔基底而言，在预先确定数量的抽吸循环后例如每一抽吸循环后， 或在预先确定数量的基底移动循环后例如每一基底移动循环后，定量测定 标记物的存在可能是有用的。该定量测定的结果结合对实际基底和/或样品 液温度的了解，.可允许测定靶生物化合物的一些动力学性质。将样品液加 热到一个确定的温度，经给予更为严格的结合条件，可允许实现对结合性 质尤其是结合特异性更为精确的控制。该结合步骤也可通过加热膜或样品 液或二者而得到实现。在达到所需温度后，然后将样品液与基底接触。
所述方法的敏感性和/或结合特异性还可通过适宜的方法而提高，这些 适宜的方法例如但不限于-
-使用适宜的温度曲线(例如一系列的一步或多步加热步骤，任选地在连 续加热步骤之间具有足够的平衡次数)，
-调整基底移动循环的数量，以及
-一个测量系列的测得标记物信号的信号后处理(例如荧光图像的图像 处理)，以及
-测定被俘获的耙生物化合物最适结合或再次分离的温度。 例如，提高温度时，测得信号的急剧下降表明已经达到了某个俘获探 针-靶生物化合物复合物的分离(熔解)温度。该性质可以用于区分特异与非 特异结合。为了进一步提高特异性，测量循环在超过熔解温度临界值后可 继续下去，这一次温度持续下降以确认靶生物化合物的重新结合在适宜的 特定熔解温度下会再次发生。
所述方法的一个任选最终步骤在于从检测室内除去残留样品液以进一 步降低由未结合的标记物和/或分子引起的背景信号。
所述检测室的几何形状优选地以这样一种方式设计，使得未结合的标 记物和/或生物化合物在测量时被屏蔽于检测系统，例如(在标记物是发光分 子的情况下)通过阻断膜下样品液发射出光线的光路，或通过移动膜使其接 近透光窗从而驱赶开上清。通过内置的搅拌器搅拌上清可以进一步减少背 景信号。样品液的去除以及检测室几何形状的设计确保了朝向检测系统的 基底表面以及膜的对侧具有极少量的样品液形成的表面层。这减少了来自 未结合标记物和/或未结合生物化合物的背景信号。
基底与样品液接触一段合适的时间后，例如在适宜数量的通过多孔基 底的样品抽吸循环或适宜数量的膜移动循环后，检测和测量结合到探针上 的靶生物化合物的标记物。此外，还可在移动膜的过程中测量标记物。
观测到的每个信号的物理位置、性质和强度可允许鉴定哪个靶生物化 合物被俘获，鉴定该靶生物化合物源自哪个样品和/或它属于哪种类型的生 物化合物和分析其浓度。
在本发明所述方法的最后一步中可通过含有落射荧光显微镜和
CCD(电荷耦合器件)相机或任何其他种类的相机的光学装置进行基底分析。 就荧光或磷光标记物而言，该光学装置优选地包括一个可在其相应激发波 长处激发标记物的光源(优选为uv)。
化学发光标记物的检测是例如通过向标记物加入适宜的反应物并借助 显微镜观察其荧光而进行的。
放射性标记物的检测是例如通过将医用X-射线胶片直接与基底对置而 进行的，该X-射线胶片因暴露于标记物而显影并形成对应于目的探针安放 位置的暗区。
酶标记物的检测是例如通过向标记物加入适宜的底物并观察该酶催化 的反应结果(例如颜色变化)而进行的。
比色标记物的检测是例如通过向标记物加入适宜的反应物并观察由此 形成的外观或颜色的改变而进行的。
声微泡标记物的检测是例如通过将所述标记物暴露于特定频率的声波 并记录由此形成的共振而进行的。
磁珠的检测是例如通过磁性传感器而进行的。
本发明所述方法经参照大量参数在上文得到了描述，其中每个参数都 包括优选或甚至更优选的取值或实施方式的可能选择。应理解的是，除非 参数的一定组合另有解释，用于这一参数的每一优选范围或实施方式可与 用于一个或多个其他参数的每个优选范围或实施方式随意组合。
本发明将针对下列实施例解释的某些工作实施方式并参照附图中进行 描述。但这些实施例仅用于说明本发明，不应视为以任何方式限制本发明。
实施例1
图1示出了本发明的第一工作实施方式。在图1的左侧，第一流体样
品(12)中的耙DNA分子(ll)被第一种标记物(13)标记，以生成标记的靶 DNA分子(14)。在图1的右侧，第二流体样品(16)中的靶DNA分子(15)被 第二种标记物(17)标记以生成标记的靶DNA分子(18)。在图1的中部，两 份样品混合在一起以形成混合物(19)，该混合物然后被迫通过基底(110)。 实施例2
图2示出了本发明的第二工作实施方式。在图2的上方，两种不同的 标记物(21)和(22)被掺入一份样品(23)中两种不同类型的靶分子(RNA分子 (24)和DNA分子(25))，以在所述样品中生成标记的RNA分子(27)和标记的 DNA分子(26)。所述样品然后被迫通过基底(110)。
权利要求
1、一种用于对含有靶生物化合物的一份或多份样品液进行微阵列检测的方法，所述方法包括以标记物标记所述靶生物化合物，将所述样品液与基底接触并检测所述基底的表面上所述标记物的存在，其中所述方法适合于在一个微阵列中同时分析一份或多份样品液中的一种或多种类型的靶生物化合物，以及其中(i)每一所述类型的生物化合物以不同的标记物进行标记，以使属于不同样品液的靶生物化合物具有不同的标记物，(ii)靶生物化合物类型的数量和样品液的数量中的至少一个为至少2，以及(iii)所述不同标记物在所述基底的表面上经检测可区分开来。
2、 如权利要求1所述的方法，其中将所述样品液通过所述基底。
3、 如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述基底是多孔基底。
4、 如权利要求1至3任一项所述的方法，其中所述基底包括聚合物。
5、 如权利要求1至4任一项所述的方法，其中所述基底包括聚酰胺同 聚物或共聚物。
6、 如权利要求5所述的方法，其中通过引入季铵、溶剂分解或将酰胺基衍生为脒基来修饰所述聚酰胺同聚物或共聚物。
7、 如权利要求1至4任一项所述的方法，其中所述基底包括纤维素材料。
8、 如权利要求1至4任一项所述的方法，其中所述基底包括热塑性氟 化聚合物。
9、 如权利要求1至8任一项所述的方法，其中所述不同标记物包括发 光分子。
10、 如权利要求l-9任一项所述的方法,其中所述不同标记物选自磁珠、 放射性同位素、酶、有色分子和微泡。
11、 聚合物基底在进行微阵列检测的方法中的用途，包括将一份或多 份样品液与基底接触，其中所述方法允许在一个微阵列中同时分析一份或 多份样品液中的一种或多种类型的靶生物化合物，其中靶生物化合物类型 的数量和样品液的数量中的至少一个为至少2。
全文摘要
本发明公开了一种用于对一种份多份样品液进行微阵列检测的方法，所述样品液包含靶生物化合物。所述方法包括以标记物标记所述靶生物化合物的步骤。下一步骤包括将所述样品液与基底接触和检测所述基底表面上所述标记物的存在。所述方法适合于在一个微阵列中同时分析一份或多份样品液中一种或多种类型的靶生物化合物。出于这一目的，每一所述类型的生物化合物以不同的标记物进行标记，以使属于不同样品液的靶生物化合物具有不同的标记物。所述不同标记物在所述基底的表面上经检测可区分开来。本发明还公开了聚合物基底在进行微阵列检测的方法中的用途。
文档编号C12Q1/68GK101341261SQ200680048114
公开日2009年1月7日 申请日期2006年12月11日 优先权日2005年12月21日
发明者A·博斯, G·吕德克, J·巴赫尔 申请人:皇家飞利浦电子股份有限公司