专利名称：基于表面体微电极阵列与变形膜结构的细胞电融合芯片装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物细胞电融合的装置。具体地，本发明涉及提供细胞电融合的芯片。
背景技术：
细胞电融合技术自上世纪80年代起，因为其效率较高、操作简便、对细胞无毒害， 便于观察，适于仪器应用和规范操作等优点，得到了快速发展和广泛应用(参见43^934， April 27， 1982， Pohl; 441972， April 10， 1982， Pohl； 4578168， March 25， 1986， Hofman； 4695547， Sep 22， 1987， Hillard; 4699881， Oct 13， 1987， Matschke, et
β·1. ； ) O细胞电融合可以分为两个主要阶段细胞排队和细胞融合。细胞排队的原理在于生物细胞处于非均勻电场中时，被电场极化形成偶极子，该偶极子在非均勻电场作用中会受到特定的力而发生运动，即介电电泳 (dielectrophoresis).利用介电电泳可以控制细胞的运动，在细胞电融合过程中，利用介电电泳现象使细胞排列成串，压紧相互接触的细胞，完成细胞电融合过程所需的排队和融合后压紧。细胞融合的原理在于强电场作用会导致细胞膜穿孔，这种效应称为细胞膜电致穿孔效应(electroporation)。在细胞电融合过程中利用电致穿孔效应，使两接触的细胞膜穿孔，从而使细胞间进行膜内物质交换，使细胞质、膜融合，在一定强度的电场作用下的电穿孔是一种可逆穿孔，细胞膜会在减小或撤销电场强度时回复原状，产生细胞电融合过程的膜融合。传统的细胞电融合系统通常都采用大型融合槽，其优点在于(1)操作较为简便， 采用大型融合槽降低了包括样品进样与出样等步骤的难度；(2)加工简便，大型融合槽的尺寸一般都在厘米量级，利用传统的机械加工手段可以较为方便地加工出所需要的融合槽结构；(3)融合量大，传统的融合槽可以容纳数毫升样品，一次实验即可获得足够的细胞进行后期筛选、培养等工作。但传统的细胞电融合设备也存在一些缺点(1)由于融合槽中的电极间距较大， 要达到够强度的细胞排队、融合及压紧信号，需要很高的外界驱动电压，往往高达几百上千伏，对系统的电气安全性要求高，系统的成本也因此大为提高；(2)电极间的较大间距不利于对细胞的精确控制等。为解决这一问题，研究者将细胞电融合技术与MEMS加工技术相结合。MEMS技术的加工范围通常在1 50 μ m，这与细胞的直径范围相当，所产生的微结构能有效控制细胞。有多家研究机构开始研究利用微流控芯片技术或者微电极阵列技术构建生物芯片来实现细胞电融合操作。例如，美国MIT的研究人员提出了利用微流控芯片技术实现对细胞的精确控制，达到高效的细胞配对和融合(参见J. Voldman, A.M. Skelley, 0. Kirak, H. Suh,R. Jaenisch, Microfluidic control of cell pairing and fusion, Nat Methods, 2009)；国内赵志强等研究人员也提出了利用MEMS技术构建微电极阵列(参见中国专利 200610054121. X)，通过构建微米量级间距的微电极阵列，实现在低电压条件下的细胞电融合。日本研究者提出的利用一对微电极，通过流路控制细胞的流动，使细胞运动到微电极对位置区域后，利用电场作用使两个细胞形成配对，再借助于电脉冲实现电融合(参见 Daniel T Chiu, A microfluidics platform for cell fusion， Current Opinion In Biotechnology,2001)。但上述芯片仍然存在一定的问题，如梁伟等人提出的金属丝微电极阵列，其间距依然较大，电压要求依然较高，同时，金属丝的直径较大不利于形成微电场细胞细胞配对与融合控制(参见CN86210174)；如美国MIT所研究的微流控芯片虽然较好的解决了细胞配对的问题，但该芯片两电极间的间距较大，仍然需要较高的外界电压才能够实现电融合。而赵志强提出的芯片所集成的微电极数量较少，不能实现高通量融合；微电极所产生的电场强度和电场梯度也比较弱，难以实现细胞的精确控制；所选择的加工材料的抗腐蚀、抗氧化能力也较差；同时，由于未集成进出样装置，操作也较为不便(参见中国专利200610054121. X)。日本研究者提出利用微孔的方式实现两个通道的分隔，进而实现不同细胞的独立进样完成细胞配对，但该方法对微孔的定位要求很高，无法进行大规模应用，同时，该方法依然采用距离较大的平板电极实现电融合，工作电压高(M. Gel, Y. Kimura, 0. Kurosawa, H. Oana, H. Kotera, Μ. ffashizu, Dielectrophoretic cell trapping and parallel one-to-one fusion based on field constriction created by a micro-orifice array, Biomicrofluidics, 2010)。重庆大学胡宁等研究人员在上述芯片的基础上也提出了包括三维微电极阵列(参见中国专利2007100^892. 2)，解决了一些问题，但仍存在进一步改进之处。该课题组提出的基于微小室阵列结构的细胞电融合芯片装置的细胞配对是基于一个随机原理进行的细胞配对与融合，虽然能够达到两个细胞配对的目地，但仍然无法精确实现AB细胞的配对与融合(参见中国专利200910191052. 0)。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提出一种基于表面体微电极阵列与变形膜结构的细胞电融合芯片装置，芯片上集成阵列化的微电极结构，保证微电极的集成度和较好的融合效率，微电极贴附于多聚物微通道层上，避免传统的齿状突出电极结构带来的细胞堵塞问题；同时，借助顶层的变形膜结构，利用气压控制柔性变形膜结构的变形程度， 柔性膜在气压作用下凸出于微通道中，将微通道分隔成为两微通道，实现不同细胞独立进样，解决细胞配对和多细胞融合的问题。本发明的技术方案如下
一种基于表面体微电极阵列与变形膜结构的细胞电融合芯片装置，其由表面体微电极阵列芯片与顶层变形膜结构组成。所述表面体微电极阵列芯片通过微加工工艺制作，自下而上依次分为石英基底层和多聚物微通道层。在所述石英基底层上制作有底层梳状微电极阵列，所述底层梳状微电极阵列在石英基底层上以梳齿相对的形式对称布置两组，两组间留有通道。所述多聚物微通道层的中间加工有上下开敞的微通道，微通道位置对应于两组底层梳状微电极阵列之间的通道，微通道的右端有两个进样孔，用于不同细胞的独立进样，左端为出样孔，用于融合后细胞的出样。在所述多聚物微通道层上制作有与底层梳状微电极阵列形状和位置均对应的顶层梳状微电极阵列，并在多聚物微通道层的微通道的侧壁上形成有侧壁表面电极，侧壁表面电极分别连接底层梳状微电极阵列和顶层梳状微电极阵列对应的每一对梳齿，使底层梳状微电极阵列、侧壁表面电极和顶层梳状微电极阵列电气联通。同一侧的所述底层梳状微电极阵列和顶层梳状微电极阵列向外延伸形成键合点，实现与外界控制电路的电气连接。在上述的底层梳状微电极阵列、侧壁表面电极和顶层梳状微电极阵列，组成了一个“三明治”结构的微电极阵列结构，在该结构中，所有的电极均为薄膜状的表面电极结构， 但三者共同形成的电极结构又具备了体电极结构的外形与功能，进行形成了所谓的表面体微电极阵列。所述变形膜结构由柔性变形膜和气压调节装置组成。柔性变形膜位于表面体微电极阵列芯片上，覆盖所述微通道的整个区域。所述气压调节装置上有进样孔、出样孔和进气孔，进样孔、出样孔与多聚物微通道层上的进样孔和出样孔一一对应，在气压调节装置内还设有下方开敞的气腔，气腔与进气孔，气压调节装置覆盖在变形膜上，气腔由柔性变形膜封闭，其位置正对微通道区域，面积大于微通道区域面积，以保证能够控制微电极阵列区域内柔性变形膜的变形操作。所述柔性变形膜通过气压调节装置的施加的气压可产生变形，向下凸进微通道中，形成隔壁，将微通道上半部分分隔开，形成左右两条微通道，实现不同类细胞的独立进样与不同细胞间的配对与高效融合目地。进一步，所述底层梳状微电极阵列、侧壁表面电极和顶层梳状微电极阵列厚度为 0. Γ0. 5 μ m,所述多聚物微通道层的厚度为20 30 μ m,微通道的宽度为40 60 μ m。所述的柔性变形膜的厚度为10-20 μ m,面积与表面体微电极阵列芯片一致，进而覆盖整个微通道阵列结构，实现芯片整体的有效工作，材料可选用PDMS等柔软具有良好弹性的多聚物材料。所述的气压调节装置的进样孔和出样孔孔径均为2mm ；气腔的面积大于微电极阵列区域面积，气腔的深度为1mm，进气孔直径为2mm。本发明具有如下优点
本装置可借助底层梳状微电极阵列、侧壁电极和顶层梳状微电极阵列电气联通，结合多聚物微通道层组成的“三明治”结构，在保证微电极的集成度和较好的融合效率的同时， 由于侧壁电极和顶层梳状微电极阵列是制作在多聚物微通道层上的，相当于与多聚物微通道层贴附，电极可以做得较薄，由此形成光滑的流路通道，其光滑的微通道流路结构有利于细胞在微通道内部的流动，降低了现有的具有锯齿状电极结构的微通道易使细胞堵塞的可能，消除了以往的齿状电极存在的突出电极影响微通道内部细胞流动的弊端。同时，金质的电极使微电极阵列结构芯片具有良好的电导通特性，结合微电极梳齿间较小的间距可以保证低压驱动条件下的高效融合。柔性变形膜与气压调节装置的使用将能够有效的控制柔性膜变形程度，进而在微通道中形成适宜的变形，将微通道分隔成两部分，进而实现两种细胞的独立进样，进而解决细胞配对的难题；同时，变形后的变形膜会改变微通道在垂直方向的形状，并改变相应的电场分布情况，进而可结合介电电泳实现两通道内部不同细胞的一对一配对控制，并使细胞连接点获得最高的细胞膜电位，进而可通过调控外界信号电压使凸出点处细胞连接处融合，并避免其他区域发生多细胞融合。本芯片材料具有良好的生物相容性及抗腐蚀性能，这保证了芯片的可靠性，也提高了细胞融合的安全性。同时，芯片内部集成了大量的微电极阵列，可实现大量细胞的同时融合，融合效率高。本芯片装置主要使用范围为动物、植物、微生物细胞的融合细胞制备，同时也可应用于电穿孔、电转染等研究中，可广泛应用于遗传学、动植物远缘杂交育种、发育生物学、药物筛选、单克隆抗体制备、哺乳动物克隆等领域。
图1基于表面体微电极阵列与变形膜结构的细胞电融合芯片装置总体示意图。图2基于表面体微电极阵列与变形膜结构的细胞电融合芯片装置主要功能模块示意图。图3基于表面体微电极阵列与变形膜结构的细胞电融合芯片装置组装示意图。图4基于表面体微电极阵列结构示意图。图5多聚物微通道层结构示意图。图6柔性变形膜结构示意图。图7气压调节装置结构示意图。图8a、图8b、图8c、图8d、图8e、图8f是本芯片装置的电融合过程示意图。
具体实施例方式以下结合附图进一步说明本发明的结构及工作方式
参见图1、图2和图3，基于表面体微电极阵列与变形膜结构的细胞电融合芯片装置由表面体微电极阵列芯片1，以及由柔性变形膜2和气压调节装置3组成的变形膜结构组成。表面体微电极阵列芯片1的具体结构为在石英基底层4上通过微加工工艺制作一层底层梳状微电极阵列7，底层梳状微电极阵列7在石英基底层4上以梳齿相对的形式对称布置两组，两组间留有通道。多聚物微通道层5通过软光刻成型后固化于底层梳状微电极阵列7之上，多聚物微通道层5上加工有上下开敞的微通道12，微通道12位置对应于两组底层梳状微电极阵列7之间的通道，微通道12的右端有两个进样孔11，用于不同细胞的独立进样，右端为出样孔13，用于融合后细胞的出样。同时，多聚物微通道层5上制作有与底层梳状微电极阵列7形状和位置均对应的顶层梳状微电极阵列8，并在微通道12的侧壁上形成有侧壁表面电极9，侧壁表面电极9分别连接底层梳状微电极阵列7和顶层梳状微电极阵列8对应的每一对梳齿，使底层梳状微电极阵列7、侧壁表面电极9和顶层梳状微电极阵列8形成电气联通。同一侧底层梳状微电极阵列7和顶层梳状微电极阵列8向芯片外延伸形成为键合点10，可通过金丝采用金丝键合工艺实现与外部控制电路的电气连接，参见图4。底层梳状微电极阵列7、侧壁表面电极9和顶层梳状微电极阵列8厚度为0. 1-0. 5 μ m,材料选用金、钼等具有良好生物相容性和抗氧化、抗腐蚀性的惰性金属，多聚物微通道层5 的厚度为20-30 μ m，微通道12的宽度为40-60 μ m，进样孔11和出样孔13孔径均为2mm。参见图5、图6和图7，变形膜结构由柔性变形膜2和气压调节装置3组成。柔性变形膜2是一层厚度为10-20 μ m的柔性膜，面积与表面体微电极阵列芯片1 一致，进而覆盖整个微通道12，保证装置整体的有效工作，材料可选用PDMS等柔软具有良好弹性的多聚物材料。该柔性变形膜上也加工有进样孔14和出样孔15与表面体微电极阵列芯片上的进样孔11和出样孔13—一对应。气压调节装置3的功能在于利用气压调节柔性变形膜2的形状，该装置包括进样孔16、出样孔18、气腔17和进气孔19。进样孔16和出样孔18与基于表面体微电极阵列芯片上的进样孔11和出样孔13 —一对应，孔径均为2mm。气腔17开在气压调节装置内，下方开敞，气腔与进气孔连通。气压调节装置3覆盖在柔性变形膜上，气腔由柔性变形膜封闭， 其位置正对微通道区域，气腔17的面积大于微通道区域面积，以保证能够控制微电极阵列区域内柔性变形膜的变形操作。气腔17的深度为1mm，进气孔19直径为2mm。本芯片装置内部细胞电融合过程如下
参见图8a，通过进气孔19注入空气于气腔17中，通过调节气压实现气腔17下方的柔性变形膜2的变形程度，进而实现柔性变形膜2向下凸进于微通道12中，实现将表面体微电极阵列芯片1上的微通道12变成两个通道(见图8b);随后，通过进样孔16、14、11注入待融合的细胞缓冲液(分别含有目标细胞A和目标细胞B)，由于微通道12被柔性变形膜分隔为两个独立而又未完全断开的通道，进而保证微通道12的两个通道分别注入一种细胞(图 8C中，左边为目标细胞A，右边为目标细胞B)；随后，加载交流信号，由于变形后的变形膜2 会改变微通道12在垂直方向的形状，使得变形区(凸出与微通道区域)的电场强度高于其他区域，在正向介电电泳效应的影响下，细胞会向变形区运动，进行固定于中央区，同时，由于通道A、通道B相互独立且不完去阻断，通道A和通道B中各自有1个细胞在中央区形成一对一的配对并建立细胞连接(图8d)；随后加载脉冲穿孔信号，同样由于变形后的变形膜 2会改变微通道12在垂直方向的形状，将使得变形膜凸出于微通道12的位置(也即是两细胞连接处)会产生最高的膜电位，进而使得该区域的两细胞连接处发生电穿孔和电融合的几率最高，并能够避免多细胞融合的发生(图Se)。完成电融合过程后，释放气腔17中的气体，使的柔性变形膜2复原，微通道12恢复为一个通道，目标细胞A和目标细胞B的融合细胞AB经出样孔18、15、/13收集(图8f)。本文中，加载的交流信号、脉冲穿孔信号、电融合信号等的设计现有技术已有大量研究，如曹毅，基于微电极阵列的高通量细胞电融合方法研究，重庆大学博士学位论文， 2009 ；胡宁，高通量细胞电融合芯片及实验研究，重庆大学博士学位论文，2010，等等。
权利要求
1.一种基于表面体微电极阵列与变形膜结构的细胞电融合芯片装置，其特征在于其由表面体微电极阵列芯片与顶层变形膜结构组成；所述表面体微电极阵列芯片通过微加工工艺制作，自下而上依次分为石英基底层和多聚物微通道层；在所述石英基底层上制作有底层梳状微电极阵列，所述底层梳状微电极阵列在石英基底层上以梳齿相对的形式对称布置两组，两组间留有通道；所述多聚物微通道层的中间加工有上下开敞的微通道，微通道位置对应于两组底层梳状微电极阵列之间的通道，微通道的右端连通两个进样孔，用于不同细胞的独立进样，左端连通一个出样孔，用于融合后细胞的出样；在所述多聚物微通道层上制作有与底层梳状微电极阵列形状和位置均对应的顶层梳状微电极阵列，并在多聚物微通道层的微通道的侧壁上形成有侧壁表面电极，侧壁表面电极分别连接底层梳状微电极阵列和顶层梳状微电极阵列对应的每一对梳齿，使底层梳状微电极阵列、侧壁表面电极和顶层梳状微电极阵列电气联通；同一侧的所述底层梳状微电极阵列和顶层梳状微电极阵列向外延伸形成键合点，实现与外界控制电路的电气连接；所述变形膜结构由柔性变形膜和气压调节装置组成； 柔性变形膜位于表面体微电极阵列芯片上，覆盖所述微通道的整个区域； 所述气压调节装置上有进样孔、出样孔和进气孔，进样孔、出样孔与多聚物微通道层上的进样孔和出样孔一一对应，在气压调节装置内还设有下方开敞的气腔，气腔与进气孔连通，气压调节装置覆盖在柔性变形膜上，气腔由柔性变形膜封闭，其位置正对微通道区域， 面积大于微通道区域面积；所述柔性变形膜通过气压调节装置的施加的气压可产生变形，向下凸进微通道中，形成隔壁，将微通道上半部分分隔开，形成左右两条微通道，实现不同类细胞的独立进样与不同细胞间的配对。
2.根据权利要求1所述的基于表面体微电极阵列与变形膜结构的细胞电融合芯片装置，其特征在于所述底层梳状微电极阵列、侧壁表面电极和顶层梳状微电极阵列厚度为 0. 1 0. 5 μ m0
3.根据权利要求1所述的基于表面体微电极阵列与变形膜结构的细胞电融合芯片装置，其特征在于所述多聚物微通道层的厚度为2(Γ30 μ m,微通道的宽度为4(Γ60 μ m,进样孔和出样孔孔径为2mm。
4.根据权利要求1所述的基于表面体微电极阵列与变形膜结构的细胞电融合芯片装置，其特征在于所述柔性变形膜的厚度为10-20 μ m，材料选用PDMS多聚物材料。
5.根据权利要求1所述的基于表面体微电极阵列与变形膜结构的细胞电融合芯片装置，其特征在于所述气压调节装置的气腔的深度为1mm，进气孔直径为2mm。
全文摘要
一种基于表面体微电极阵列与变形膜结构的细胞电融合芯片装置，由表面体微电极阵列芯片与顶层变形膜结构组成。表面体微电极阵列芯片分为石英基底层、微电极阵列层和多聚物微通道层。微电极阵列采用三明治结构，贴附于多聚物微通道层上，避免传统的齿状突出电极结构带来的细胞堵塞问题，同时保证微电极的集成度和较好的融合效率。变形膜结构由柔性变形膜和气压调节装置组成；柔性变形膜覆盖微通道，柔性变形膜通过气压调节装置的施加的气压可产生变形，向下凸进微通道中，形成隔壁，将微通道分隔为两条微通道，实现不同类细胞的独立进样与不同细胞间的配对。本装置可广泛应用于遗传学、动植物远缘杂交育种、发育生物学、药物筛选、单克隆抗体制备、哺乳动物克隆等领域。
文档编号C12M1/42GK102304475SQ20111026567
公开日2012年1月4日 申请日期2011年9月8日 优先权日2011年9月8日
发明者朱祥佑, 胡宁, 钱诗智 申请人:岭南大学校产学协力团