治疗慢性纤维化疾病的材料与方法

专利名称：治疗慢性纤维化疾病的材料与方法
技术领域：
本发明涉及治疗慢性纤维化疾病的方法和组合物.本发明更具体涉及慢性纤 维化疾病的免疫治疗干预.
背景技术：
炎症是对组织损伤或感染的协调反应.炎症发生时首先是趋化罔子的局部释 放、血小板活化、凝血和补体旁路的起动，从而对局部内皮产生剌激，引起嗜中性 粒细胞和单核细胞的外渗.炎症的第二个阶段以自适应免疫细胞(包括淋巴细胞) 进入组织为标志.接下来是溶解阶段，以基质细胞(如成纤维细胞)对组织损伤的 修补为标志.在溶解阶段，过量的白细胞凋亡，然后被组织中的巨噬细胞呑噬.
在修补机制中，局部的静止成纤维细胞迁移至损伤区域，分泌细胞外基质蛋 白，促进创口收敛或纤维化，也有人提出是循环中的纤维原前体细胞即纤维细胞 随血液迁移至创伤处或纤维化部位，然后发生分化并介导组织修补和其他纤维化 反应，纤维细胞由外周血单核细胞前体CD14+分化而来，表达造血干细胞标记物 (CD45、 II型MHC、 CD34)和基质细胞标记物(I型和HI型胶原蛋白及纤维 粘连蛋白).成熟的纤维细胞迅速进入组织损伤部位，分泌炎性细胞因子和细胞 外基质蛋白、其他细胞罔子和促血管生成素，从而发生纤维化，
纤维细胞的分化与许多纤维化疾病有关，包括但不限于硬皮病、瘢痕疙瘩、 风湿性关节炎、狼疮、肾源性纤维化硬皮病和特发性肺纤维化.纤维细胞在小鼠 感染日本血吸虫后纤维化病灶的形成中起重要作用，也参与自身免疫疾病的纤维 化.纤維细胞还与放射损伤、莱姆病和肺纤维化的致病性纤维化有关.纤維细胞 也参与胰腺炎中的基质重塑和基质纤维化，而这种纤维细胞的缺乏导致胰腺癌及 腺癌.当纤维细胞进一步分化为肌纤维母细胞时，哮喘病人和其他肺病如慢性阻
塞性肺病患者还会发生纤维化.
我们知道有一些特殊的疾病发生无休止的纤维化反应，如特发性间质性肺炎， 是一组以不同程度的肺纤维化为特征的多种多样慢性肺病.与特发性间质性肺炎 (IIP)中各种独特的组织结构有关的严重肺纤维反应的主要诱因尚不明确，罔此
这些疾病目前尚无有效的临床治疗手段(Green, Overview of pulmonary fibrosis. Chest2002;l22(suppl. 6):334S-9S).尽管其中的许多疾病表现为导致呼吸系统 损伤的肺泡微环境纤维增生反应，但是他们的纤维化病变程度差异相当大
(Nicholason Am. J. Resp. Crit. Car Med/ 2000:162:2213-7; Chapman J. Clin" Invest., 2004; 113:148-57).同样复杂的是如何清楚证明抗炎药物对不太严重的 IIP (如非特异性间质性肺炎(NSIP)和呼吸性细支气管间质性肺病(RBILD)) 具有治疗作用，但是常常却不能防止最严重的致命性IIP--普通型间质性肺炎
(U1P)病人的呼吸袭竭(Flaherty et al" Am. J. Med. 110:278-282 (2001); Lynch et al.， Curr. Opin. Pulm. Med.， 7:298-308 (2001); Flaherty et a，.， Thorax, 58:143-148(2003)).
独特的纤维母细胞灶的存在是特发性间质性肺炎的重要病理特征，显示不良 预后和致命的结果(King et al" Am. J. Respir. Crit. Care Med.， 164:1025-1032 (2001)).关于IIP发生和维持过程中的肺纤维化病变有一些分歧，在阚明这些 问题之后可以采用新的治疗方法(van den. BHnk et a，.， Arch. Immunol. Ther. Exp (Warsz)， 48:539-545 (2000)) . CC趋化因子受体7 ( CCR7，与MLP-3b/CCL19 和6-Ckine/CCL21结合(Nagira et al.， J. Biol. Chem.， 272:19518-19524 (1997)) 和CX趋化因子受体4 (CXCR4,与SDF-1/CXCL12结合(Forster et al.， J. Immunol" 160:1522-1531 (1998))被普遍认为是仅由造血干细胞来源的细胞表达 的趋化因子受体(Kim et al.， J. Leukoc. Biol" 66:455-461(1999); Kim et al.， J. Clin Invest., 108:1331-1339 (2001)).在免疫反应过程中，CCR7的表达促进成熟树突 细胞向淋巴组织的运动(Sa，lusto et al" Eur. J. Immunol" 29:1617-1625 (1999))， 调控1型和2型T辅助细胞在脾脏中的定位(Randolph et a，.， Science, 286:2159-2162 (1999))，指引2型T辅助细胞向过敏的肺部转移(Hammad et al.， J. Immunol" 169:1524-1534(2002)) . CXCR4的表达和作用主要限于来源于骨鍵 的免疫细胞(Ward et al" Biochem, J.， 333:457-470 (1998》Gonzalo et al" J. Immunol" 165:499-508 (2000)).最近有证据表明乳腺癌细胞表达CCR7和
CXCR4使其能够向肺部转移，因此改变了免疫中心的模式(Muller et al.， Nature, 410:50-56(2001)).乳腺细胞不表达这些趋化因子受体，对与之结合的配体也不 产生反应(Mulleretal.， Nature, 410:50-56 (2001)) 这一观察结果已被引伸至多 种转移性肿瘤，包括黑色素病(Murakami et al.， J. Dermatol. Sci.， 36:71-78 (2004))和各种类型的白血病(Tavor et al.， Cancer Res" 64:2817-2824 (2004); GhobHal et al" Mayo Clin, Proc.， 79:318-325 (2004))
慢性肺纤维化来源于全肺创伤，可由多种原因产生，包括慢性炎症(结节、 韦格纳肉芽肿)、环境闳素的感染(石棉、硅土、 ^露于某些气体)、电离放射 瀑露(如对乳腺胂瘤的放射治疗)、慢性病(狼掩、风湿性关节炎)甚至某些药 物治疗.罹患过敏性肺炎时，人体对吸入的有机粉尘或职业性化学物质的免疫反 应增强，肺部纤维化随后发生.这种疾病大多数由吸入的被细菌、真菌或畜产品 污染的粉尘所致.某些类型的肺纤維化，如非特异性间质性肺炎(NSIP)，受试 者可能对免疫抑制治疗有反应.慢性肺部炎症和纤维化常常在不明原罔的情况下 发展，这种疾病的患者往往对药物治疗没有反应，特别是那些特发性肺纤維化 (IPF)患者.特发性肺纤维化的治疗手段很有限.目前还没有任何药物对这种 疾病有效，罔为结痂一旦开始就会一直持续下去.肺移植是唯一可用的治疗方法. 在一些仍在进行的研究性试验中使用不同的药物延緩纤维性结痂，有一些肺纤维 化对皮质激素(如强的松)和/或其他能够抑制身体免疫系统的药物有反应，这些 药物有时被医生用来延緩纤维化进程，然而，众所周知的是，目前还没有对纤维 化疾病有效的治疗方法.在临床实践中，标准方案是给病人开处强的松和砥唑嘌 呤，但是没有数据表明这些药物具有治疗作用.实际上，这些药物的副作用可能 提高UIP患者的死亡率.
在肺纤维化中，趋化因子参与成纤维细胞灶的形成和纤维化反应的放大.在 慢性肺纤维化过程中，促纤维化介质环境的具体作用尚不明确，本发明详细阐述 了各趋化因子及其受体的作用，从而为药物治疗无效的特发性疾病提供了新的治 疗方法和处方，
发明概迷
本发明涉及用于治疗所述纤維化疾病的方法和組合物.更具体地，本发明论 述了对单独的CCL21活性或其与CCL19结合的活性的抑制或其它形式的降低，
能有效减少纤维化损害，并改善纤维化疾病的症状.
因此，在具体实施方案中，本发明提供治疗哺乳动物的慢性纤维化疾病的方
法，其包括降低纤维细胞和/或成纤维细胞中的CCL21的存在量(presence)或 活性，所迷纤維细胞和/或成纤维细胞位于所述纤维化疾病的纤维化損害处.某些 实施方案中，本方法可进一步包括降低与所述纤维化疾病有关的成纤维细胞中 CCL19的存在量或活性.例如，降低CCL21的存在量或活性可包括使所述哺乳 动物与有效重的药剂(agent)接触，以减轻所迷慢性纤維化疾病的一种或多种 症状，所述药刑从成纤维细胞去除CCL21.这种药刑的示例可以是与CCL21发 生特异性免疫反应的抗体，例如相比于其他趋化因子，优先识别CCL21上的表 位的抗体，
其它实施方案中，所述降低CCL21的存在量或活性包括使所述哺乳动物与 有效量的药刑接触，以减轻所述慢性纤维化疾病的一种或多种症状，所述药刑减 少所述成纤维细胞中的CCL21表达.用于此类实施方案的示例性药刑可以是定 向抗(directed against) CCL21的siRNA分子.
本发明可治疗的纤维化疾病可以是任何纤维化疾病，包括但不限于选自以下 疾病中的一种肺纤维化、慢性阻塞性肺病、肝纤维化、风湿性关节炎、充血性 心力衰竭、慢性肾病、过敏性肺炎、呼吸性细支气管炎/间质性肺病、更氏血吸虫 感染、原发性肺动脉高压(防止丛状损害形成)、疱疹病毒相关疾病(包括肺表 现和皮肤表现)、瘢痕疙瘩(keloid scarring)、狼疮、肾源性纤维化皮肤病、曰 本血吸虫感染相关的纤维化损害、自身免疫性疾病、致病性纤维化、莱姆病、胰 腺炎中的基质重塑和基质纤维化、子宫肌瘤、卵巢纤维化、角膜纤維化、充血性 心力衰竭和其他缺血后遣症、术后结疤(scarring)(包括腹部粘连)、开角型 (wide angle)青光眼小梁切除术后结疤，及其任意组合，
按照本发明治疗的典型肺动脉高血压包括原发性肺动脉高压(PPH)、继发性 肺动脉高压(SPH)、家族性PPH、偶发性PPH、毛细血管前肺动脉高压、肺动 脉高血压(PAH)、特发性肺动脉高压、血栓性肺动脉病(TPA)、致丛性肺动 脉病、功能类别(functional classes) 1~IV的肺动脉高压，以及与以下疾病相关、 由以下疾病引起或继发的肺动脉高血压左心室功能不良、二尖瓣病变、缩窄扭 心包炎、主动脉瓣狭窄、心肌病、纵膈纤维化、肺静脉异位引流、肺静脉闭塞病、 胶原血管病、先天性心脏病、HIV病毒感染、药物和毒素(如氟苯丙胺)、先夭
性心脏病、肺静脉高血压、慢性阻塞性肺病、间质性肺病、睡眠呼吸障碍、肺泡 通气不足、高海拔慢性啄露、新生儿肺病、肺泡毛细血管发育不良、镰状细胞疾
病、其它凝血障碍、慢性血栓栓塞(thromboemboH)、结締组织疾病、狼疳、 血吸虫病、结节病或肺毛细血管瘤.
按照本发明治疗的肺动脉高血压最特别的是与呼吸系统疾病和/或低氧血症 有关的肺动脉高血压，包括慢性阻塞性肺病、间质性肺病、睡眠呼吸障碍、肺泡 通气不足、高海拔慢性曝露、新生儿肺病和肺泡毛细血管发育不良，尤其是慢性 阻塞性肺病.优选实施方案中，纤维化疾病为慢性肺纤维化.
在治疗方法中，可将化合物局部施用于纤维化损害(fibrosing lesion )位点， 更具体的实施方案中，纤维化损害在肺中，使组合物与所述摘害局部接触.某些 实施方案中，预期药刑包含将所述药刑特异性定位于纤维化损害位点的靶向部分.
具体实施方案中，使用选自以下的给药方式施用所述抗体或抗CCL21或抗 CCL19组合物局部给药、注射、吸入、储库式或泉式持续释放(continuous release by depot or pump)，或其任意组合，
本发明的另一方面是抑制成纤维细胞和/或纤维细胞增殖的方法，包括使所述 成纤维细胞和/或纤维细胞与组合物接触，所述组合物包含抗CCL21抗体或设计 为抗(deigned against) CCL21的siRNA分子. 一些实施方案中，本方法进一步 包括使所述成纤维细胞与组合物接触，所述组合物包含抗CCL19抗体或设计为 抗CCL19的siRNA分子.其他实施方案中，本方法进一步包括使所述成纤维细 胞与组合物接触，所迷组合物包含抗CCR7抗体或设计为抗CCR7受体的siRNA 分子.受治的纤维细胞和/或成纤維细胞可位于体外或体内.它们优选位于体内， 更优选位于体内肺组织中.
还包括抑制纤维细胞迁移和/或成纤维细胞活化的方法，其包括对使所述纤维 细胞和/或成纤维细胞与抑制CCL21活性的组合物接触.此类方法中，纤维细胞 位于哺乳动物体内，所迷方法抑制纤维细胞向所述哺乳动物的肺组织迁移，由此 防止细胞外基质的过度产生.在这些方法中，成纤维细胞优选为位于所述哺乳动 物肺组织中的固有(resident)肺成纤维细胞，且所述方法抑制所述哺乳动物肺组 织中所述成纤維细胞的活化，由此防止细胞外基质的过度产生.
本文还教导治疗肺纤维化的方法，其包括通过抑制所述纤维细胞和/或所迷成 纤维细胞中CCL21的活性或表达来抑制罹患纤維化肺病的哺乳动物的纤维细胞
的迁移和/或位于肺组织中的固有肺成纤维细胞的活化，由此防止细胞外基质的过 度产生并改善肺纤维化症状.
展，改善其一种或多种症状，逆转病情，或达到治疗效果的方法，其包括对所述
受试者施用降低所述受试者肺组织中纤维细胞和/或成纤维细胞中CCL21的存在 重或活性的药刑，其中所述药刑可在放射治疗之前、和/或期间、和/或之后施用. 这种治疗方法可进一步包括施用降低所迷被试者的肺组织中CCL19的存在量或 活性的药刑.
本发明的另一方面预期对受试者治疗或抑制药物诱发的肺纤维化的发展，玫 善其一种或多种症状，逆转病情，或达到治疗效果的方法，其包括对所述受试者 施用降低所述受试者肺组织中纤维细胞和/或成纤维细胞中CCL21的存在量或活 性的药剂，其中所述药剂可在给药、和/或期间、和/或之后施用.还希望，这种 方法进一步施用降低所述被试者的肺组织中CCL19的存在量或活性的药刑.有 许多药物可导致纤维化，这样的药剂包括但不限于细胞毒素剂、抗生素、抗心摔 失常药、消炎药和违禁药.可导致肺纤维化的示例性药物包括但不限于两性審素 B、博来霉素、溴麦角隐亭、白消安、卡马西平、苯丁酸氮芥、可卡因、环磷狭 胺、苯妥英、麦角胺、氟卡尼、海洛因、美法仑、美沙稱、甲氨蝶呤、哌甲睇、 美西麦角(methylsergide)、矿物油、呋喃妥因、亚硝基脲类、丙卡巴肼、硅酮 (silicone)、柳氮磺吡啶、妥卡尼和长春花生物械类药刑(vinca alkaloid class of agents )
本文描述的治疗方法中，提供辅助治疗方案是合意的，其中将影响CCL21 和CCL19的治疗剂与皮质类固醇和/或免疫抑制刑联合.在其他方法中，联合治 疗可包括给予抗凝剂、利尿剂、强心甙、钙通道阻断刑、血管扩张剂、前列环素 类似物、内皮素拮抗剂、磷酸二酯酶抑制剂、p2激动刑、抗毒萆碱剂、内肽醉抑 制剂、降血脂药和血栓素抑制剂，或其组合.
此外，本发明进一步预期降低纤维化损害处的纤维细胞和/或成纤維细胞中 CCL21和/或CCL19的存在重或活性的药剂在制备治疗慢性纤维化疾病的药物中 的用途
示例性实施方案中，本发明提供了用于降低纤维化损害处的纤维细胞和/或成 纤维细胞中CCL21的存在量或活性的药剂以及任选的降低纤维化损害处的纤维
CCL19的存在量或活性的药剂在制备治疗哺乳动物慢性 纤维化疾病的药物中的用途.某些实施方案中，所术药剂是与CCL21产生特异 性免疫反应的抗体，该抗体优选为相比于其他趋化罔子，优先识別CCL21上的 表位的一种抗体.在其他实施方案中，该药刑是定向抗CCL21的siRNA分子. 制备所述药物用于治疗选自以下的纤维化疾病肺纤维化、慢性阻塞性肺病、肝 纤维化、风湿性关节炎、充血性心力袭竭、慢性肾病、过敏性肺炎、呼吸性细支 气管炎/间质性肺病、更氏血吸虫感染、由丛状损害引起的原发性肺动脉高血压、 疱渗病毒相关疾病的肺表现、疱疹病毒相关疾病的皮肤表现、瘢痕疙瘩、狼疮、 肾源性纤维化皮肤病、日本血吸虫感染相关的纤维化损害、自身免疫性疾病、致 病性纤维化、莱姆病、胰腺炎中的基质重塑和基质纤维化、子宫肌瘤、卵巢纤维 化、角膜纤维化、充血性心力衰竭和其他缺血后遣症、术后腹部结疤、开角型音 光眼小梁切除术后结疤，及其任意组合.优选地纤維化疾病为慢性肺纤维化.
优选将药物配制用于选自以下的给药方式局部给药、注射、吸入、储库式 或泵式持续释放，或其任意组合.
还预期的是，包含抗CCL21抗体或设计为抗CCL21的siRNA分子，以及任 选的抗CCL19抗体或设计为抗CCL19的siRNA分子的组合物在制备抑制成纤维 细胞和/或纤维细胞增殖的药物中的用途.该用途可进一步包括包含抗CCR7抗体 或设计为抗CCR7受体的siRNA分子的组合物在制备抑制成纤维细胞和/或纤维 细胞增殖的药物中的用途.
另一方面预期了抑制CCL21活性的组合物在制备抑制纤维细胞迁移和/或成 纤维细胞活化的药物中的用途.还提供了抑制纤維细胞中CCL21的活性或表达， 和/或抑制固有肺成纤维细胞活化的组合物在制备药物中的用途，所述药物通过防 止细胞外基质的过度产生并改善肺纤维化症状来治疗肺纤维化.
另外，本本还预期了降低肺组织中纤维细胞和/或成纤维细胞中CCL21的存 在量或活性的药剂或任选的降低肺组织中纤维细胞和/或成纤维细胞中CCL19的
物中的用途.
的药剂或任选的降低肺组织中纤维细胞和/或成纤维细胞中CCL19的存在量或活 性的药剂在制备治疗药物诱发的肺纤维化的药物中的用途.在这样的用途中，制
备的药物用于治疗药物诱发的非特发性肺纤维化，所述药物选自细胞毒素刑、拔
生素、抗心律失常药、消炎药和违禁药，例如所述药物可选自两性審素B、博来 霉素、溴麦角隐亭、白消安、卡马西平、苯丁酸氣芥、可卡因、环磷觥胺、苯妥 英、麦角胺、氟卡尼、海洛罔、美法仑、美沙稱、甲氨蝶呤、哌甲醋、美西麦角、 矿物油、呋喃妥罔、亚砩基脲类、丙卡巴肼、硅頃、柳氮橫吡啶、妥卡尼和长春 花生物碱类药剂. 一些实施方案中，考虑联合使用药剂来制备药物，其中将基于 CCL19或CCL21的药物与皮质类固醇、免疫抑制、抗凝剂、利尿剂、强心甙、 钙通道阻断刑、血管扩张刑、前列环素类似物、内皮素拮抗刑、裤酸二SS醉抑制 剂、P2激动剂、抗毒覃减刑、内肽酶抑制剂、降血脂药和血栓素抑制刑，或其纽 合联合.
附图简迷
图l.外科肺活检的上肺叶(lobe)和下肺叶中的(A) CCR7及(B) CXCR4 基因表达的SuperArray基因分析，所述肺叶来自UIP病人(n-7)组、NSIP病 人(n=6)组、RBILD病人(n=6)组以及正常边缘(normal margin)肿瘤病人 (n=5)组，显示的数据为平均值(SEM).未检测到显著差异.CCR7为CC 趋化因子受体7, CXCR4为CX趋化因子受体4， GAPDH为3-磷酸甘油醛脱象 醉，NSIP为非特异性间质性肺炎，RBILD为呼吸性细支气管炎/间质性肺病，UH 为普通型间质性肺炎.
图2.外科肺活检的上肺叶和下肺叶中的(A) CCL19、 (B) CCL21及(C〕 CXCL12基因表达的SuperArray基因分析，所迷肺叶来自UlP病人(n-7)组、 NSIP病人(n=6)组、RBILD病人(n=6 )组以及正常边缘肿瘤病人(n=5 )组. 显示的数据为平均值(SEM).未检测到显著差异.CCL为cc趋化罔子受体fie 体，CXCL为CX趋化罔子受体配体，GAPDH为3-磷酸甘油眵脱氬酶，NSIP为 非特异性间质性肺炎，RBILD为呼吸性细支气管炎/间质性肺病，UIP为普通型 间质性肺炎.
困3.外科肺活检的上肺叶和下肺叶中的CCR7及CCL21基因表达的定i Taqman聚合酶链反应分析，所述肺叶来自UIP病人(n=18 ) 、 NSIP病人(n-8 )、 RBILD病人(n=6)和正常边缘病人(n=6).显示的数据为平均值(SEM) "为与来自正常边缘的肿瘤病人组的适当肺叶相比，P<0.01. CCR7为CC趁化 因子受体7， CCL21为CC趋化目子受体4配体，NSIP为非特异性间质性肺炎，
RBILD为呼吸性细支气管炎/间质性肺病，UIP为普通型间质性肺炎.
图4.外科肺活检的上肺叶和下肺叶中的CCL19、 CCL21和CCL12的酶联免 疫吸附法分析，所迷肺叶来自UIP病人(n=18) 、 NS1P病人(n-6) 、 RBILD 病人(n-6)和正常边缘病人(n-6).显示的数据为平均值(SEM ) , CCL为 CC趁化罔子受体陪体，CXCL为CX趋化因子受体配体，NSIP为非特异性间质 性肺炎，RBILD为呼吸性细支气管炎/间质性肺病，UIP为普通型间质性肺炎.
图5. SLBs中CCR7的代表性免疫组化分析，所述SLBs来自UIP病人组(A、 B) 、 NSIP病人组(C、 D) 、 RBILD病人组(E、 F)和正常边缘的肿病病人组
(G、H).组(A)、 (C)、 (E)和(G)显示对照染色.来自UIP (B)、 NSIP ( D )和RBILD ( F )的SLBs中的病灶区(focus area )见到CCR7免疫反 应性(红色染色)，但在正常边缘组(H)則未发现.放大倍数6200. CCR7为 CC趋化罔子受体7， NSIP为非特异性间质性肺炎，RBILD为呼吸性细支气管炎 /间质性肺病，SLB为外科肺活检样，UIP为普通型间质性肺炎.
困6. SLBs中CXCR4的代表性免疫组化分析，所述SLBs来自UIP病人组
(A、 B) 、 NSIP病人组(C、 D) 、 RBILD病人组(E、 F)和正常边缘的肿瘤 病人组(G、 H).组(A) 、 (C)、 (E)和(G)显示对照染色.HP和正常 边缘组SLBs的单核细胞可见CXCR4免疫反应性(红色染色).放大倍数6200. CXCR4为CX趋化因子受体4， NSIP为非特异性间质性肺炎，RBILD为呼吸性 细支气管炎/间质性肺病，SLB为外科肺活检样，UIP为普通型间质性肺炎.
困7.来自UIP病人组(A-C)和NSIP病人组(D-F)的序列组织切片中CCR7
(B、 E)和CD45 (C、 F)的代表性免疫组化分析.组(A)和(D)显示对照 染色.UIPSLBs中，CCR7免疫反应性(B中红色染色)与CD45的免疫反应性
(C)部分重叠，双重染色的大部分与单核细胞(C)有关.在序列组织切片中(A、 F) ， CCR7和CD45似乎未在NSIP SLBs中共定位.放大倍数6200. CCR7为 CC趋化因子受体7， NSIP为非特异性间质性肺炎，SLB为外科肺活检样，Ulf 为普通型间质性肺炎.
图8. SLBs中CD34的代表性免疫组化分析，所述SLBs来自UIP病人組(A、 B) 、 NSIP病人组(C、 D) 、 RBILD病人组(E、 F)和正常边缘的肿瘤病人纽
(G、 H).组(A) 、 (C) 、 (E)和(G)显示对照染色.所有病人的SLBs 中，间质区见到CD34免疫反应性(红色染色).发现CD34在来自NSIP病入 组(D)的SLBs中表达最高.放大倍数6200.NSIP为非特异性间质性肺炎，RBILD 为呼吸性细支气管炎/间质性肺病，SLB为外科肺活检样，UIP为普通型间质性肺 炎.
困9. SLBs中1型胶原的代表性免疫组化分析，所述SLBs来自UIP病人组 (A、 B) 、 NSIP病人组(C、 D) 、 RB1LD病人组(E、 F)和正常边缘的肿癌 病人组(G、 H).组(A) 、 (C)、 (E)和(G)显示对照染色.胶原免疫反 应性(红色染色)弥散遍布于来自U1P病人组(B) 、 NSIP病人组(D) 、 RBILD 病人组(F)和正常边缘的肿瘤病人组(H)的SLBs.放大倍数6200. NSIP为 非特异性间质性肺炎，RBILD为呼吸性细支气管炎/间质性肺病，SLB为为外科 肺活检样，UIP为普通型间质性肺炎.


图10.来自UIP病人组(A-C )和RBILD病人组(D-F)的SLBs中1型胶 原(B、 E)和CCR7 (C、 F)的代表性免疫组化分析.组(A)和(D)为对照 染色.胶原免疫反应性(红色染色)存在于UIP病人组(B )和RB1LD病人组(E). 但是，在序列组织切片中，1型胶原发生免疫反应的区域没有CCR7表达(C， UIP; F， RBILD).放大倍数6200。 CCR7为CC趋化因子受体7， RBILD为 呼吸性细支气管炎/间质性肺病，SLB为为外科肺活检样，U1P为普通型间质性肺 炎.
困11.来自UIP病人组(A-C) 、 NS1P病人组(D-F )和RBILD病人组(G-l 〕 的SLBs中平滑肌肌动蛋白(aSMA)的代表性免疫组化分析.组(A) 、 (D) 和(G)显示对照染色.来自UIP病人(B) 、 NSIP病人(E)和RBILD病人(H) 的SLBs的病灶区中见到CCR7免疫反应性(红色染色).在序列組织切片中， 在UIP病人组(C) 、 NSIP病人组(F )和RBILD病人组(I)中还见到aSMA 表达(红色染色).但是，未见CCR7和aSMA表达的重叠.放大倍数6200. CCR7为CC趋化因子受体7， NSIP为非特异性间质性肺炎，RBILD为呼吸性细 支气管炎/间质性肺病，SLB为为外科肺活检样，aSMA为平滑肌肌动蛋白，DIP 为普通型间质性肺炎.
图12.与其它类型的非纤维化疾病患者相比，来自各种类型的慢性肺纤维化 病人外科肺活检中CCL21的转录物表达.不同病人组的CCL21基因表达(用 TAQMANPCR測定)有差异.在普通型间质性肺炎(UIP )病人SLBs的上肺叶 和下肺叶中观察到CCL21的最高表达，但是在下肺叶SLBs检查中，UIP组与
其它组SLBs之间的差异最为显著.综合起来，这些数据表明，在UIP期间，CCR7 和CCL21的表达得到明显増强.NSIP为非特异性间质性肺炎，RBILD为呼吸性 细支气管炎/间质性肺病.
困13.与其它类型的非纤维化疾病患者相比，来自各种类型的慢性肺纤维化 病人外科肺活检中CCL21的蛋白质表达，这里显示了 HP和非IIP活检样本的 ELISA分析结果.在上肺叶活检中，UIP、 NSIP和非IIP组的CCL21蛋白质表 达水平相似.但是，在下肺叶样本中(其中IIP病人中的肺纤维化更激进)，IIP 组的CCL21水平更高(即UIP、 NSIP和RBILD组与非IIP组相比).
图14.CCL21的存在显著增强了 UIP成纤维细胞的迁移，但不增强非IIP成 纤维细胞.这些实验包括将人成纤维细胞加到Transwell多孔培养平板系统中， 对在24小时孵育期间迁移通过(migrated through)的成纤维细胞进行计数.UIP 成纤维细胞迁移通过transweH至底孔(bottom well),如果在底孔中加入CCL21, 或用TNF处理成纤维细胞并在底孔中加入CCL21,则该反应显著增强.抗CCL21 抗体的存在显著减弱了后两组中成纤维细胞的迁移，但是对笫一组没有影响.
困15.这里显示了外源性CCL19和CCL21 (均为10 ng/ml)对来源于正常 SLBs、过敏性肺炎SLBs、类肉痛SLBs和UIP SLBs的原代成纤维细胞系的増殖 反应的影响測定，显然，UIP成纤维细胞对CCL19和CCL21配体的存在呈现增 殖反应.
图16.已经观察到，将IIP成纤维细胞引入SCID小鼠促进了间质纤维化的 发展，将接下来的研究设计为评价抗CCL21在这一模型中的抗纤维化作用.从 第35天开始给各组(五只小鼠一组)腹腔注射纯化的IgG或抗CCL21抗体，每 隔一天注射直至第63天.在第63天，摘除肺组织，取代表性切片.IgG处理的 小鼠明显显示出间质纤維化和重塑.相反，基于组织学分析，抗CCL21抗体治 疗组很少显示出肺纤維化.
本发明优选实施方案详述
纤维化涉及纤维细胞的不受抑制的增殖以及分化.纤维细胞是一群独特的成 纤维细胞样细胞，其源自外周血单核细胞，外周血单核细胞通常进入组织损伤但 点，促进血管生成和伤口痊愈.本发明显示，降低纤维细胞和/或成纤維细胞(存 在于纤维化病变的纤維化损害处)中CCL21的存在量或活性将减少纤维化病" 的存在量，和/或抑制纤维化病灶的形成和/或改善纤维化疾病的一种或多种症状， 从而获得有益的治疗结果，
已知的特发性慢性肺纤维化具有非常大的临床挑战性，各种治疗选择显示出
效力有限或有毒性(Flaherty et al.， Am. J. Med.， 110:278-282 (2001); (Hampton et al.， Am. J. Respir. CHt. Care Med.， 149:A878 (1994))，诊断后的中位存活率几乎 无变化(Ryu et al.， Mayo Clin. Proc.， 73:1085-1101 (1998); Lasky et al" Environ, Health Perspect.， 108 Suppl 4:751-762 (2000)),已知的促纤維化剌激因素包括放 射、吸入的矿物质及有机粒子、气态氧化刑、药物和感染性微生物，然而对于引 发特发性间质性肺炎(HP)的临床病理实体的致病因素的确认一直存在着争议. IIP是一组多种形式的疾病，与远端肺实质有关，其有许多共同的特征，但是很 难为命名为单独的疾病(Travis et al.， Am. J. Surg. Path" 24:19-33 (2000)) 不 清楚它们的发病机理，但集中认为是与肺部受到创伤(或多重损伤)后试困治愈 该创伤有关.成纤维细胞灶是活跃增殖的成纤维细胞的小聚集体，被认为是创伤 的优先细胞灶(prior foci)的组织化，显示纤维化处于活动和进行状态.
首先，以IIP为例说明慢性纤维化疾病，本文表述的数据表明，CCR7和/或 CXCR4在纤维化病症(此处为IIP外科肺活检(SLBs))高度表达，而在正常 边缘的SLBs中表达不高.对来自IIP病人组和正常边缘的肿瘤病人组的SLBs 进行了详细的基因转录和蛋白质分析.趋化罔子和趋化罔子受体转录分析结果表 明，CCR7 (而非CXCR4)在HP (特别是所有UIP活检分析样)的间质病灶区 中高度表达，但是在正常边缘的活检样中没有这样，IIP活检中的CCR7阳性区 域含有纤維细胞，但是假设存在于CCR7阳性区域内的细胞不共表达纤维细胞标 记物(如CD34和胶原)，CCR7阳性细胞不一定是来源于骨號的细胞.最后表 明，IIP活检中的CCR7阳性细胞是活化的闺有组织成纤维细胞.因此，这里描 述的例子证明了在严重IIP中增加了 CCR7的表达，这种表达定位于缺乏纤维细 胞和肌成纤维细胞的纤维化病灶区.
进一步研究表明，CCR7受体的CCL21和/或CCL19配体的靶向性有良好的 干预作用，用于慢性纤维化疾病的治疗.更具体地，临床和动物模型数据显示， 在UIP期间CCR7和CCL21的表达得到明显加强.进一步表明了 CCLM的存在 增强了 UIP成纤维细胞的迁移.另一方面，抗CCL21抗体制刑大大减弱了 U1F 中成纤维细胞的迁移，另外，当CCL21或CCL19配体存在时，U1P成纤维细胞
呈现明显的增殖反应.
将IIP成纤维细胞引入SCID小鼠，小鼠的发育引起间质性纤维化的发展. 此模型用作IIP的人源化SCID模型.与未经抗CCL21抗体处理的IIP人源化 SCID小鼠模型相比，用抗CCL21抗体治疗这些模型小鼠时，该小鼠很少或不显 示肺纤维化的组织学证据.
从本文显示的数据可以预期，涉及降低和/或抑制CCL21和/或CCL19活扭 的方法和组合物，对于治疗肺部和其他组织的纤维化疾病是特別有用.人成纤絲 细胞对CCL19和CCL21的反应性(由于其对CCR7的正调节作用)导致这些细 胞的不当活化，从而造成IIP中观察到的极度纤维化反应.有趣的是，肺纤維化 病人的细胞因子环境可能有利于CCL19和CCL21的异常反应，因为已经有其传 研究者文献记栽了 TNF-a蛋白水平升高(Sallusto et al.， Eur. J. Immunol. 29:1617-1625 (1999); Randolph et al" Science, 286:2159-2162 (1999))和IL-10减 少(Hammad et al.， J. Immunol., 169:1524-1534 (2002))，这两种细胞罔子均调 控与这些配体结合的受体.来自严重肺纤维化病人的人成纤维细胞明显对CCL" 和CCL21起反应，罔此使这些配体成为治疗肺部(可能还有其他组织)的纤雄 化疾病的吸引性靶点.
鉴于以上讨论，应理解，在某些实施方案中可以预期，靶向CCL21和/或 CCL19的组合物特异性地抑制趋化罔子与CCR7受体的相互作用.此类组合物可 以定向抗CCL21和/或CCL19本身(例如抗这些趋化因子的抗体、设计为抗这些 趋化因子反义分子或设计为抗这些分子的siRNA分子).或者，此类組合物可定 向抗CCR7受体(例如抗该受体的抗体、设计为抗该受体的反义分子或设计为抗 该受体的siRNA分子)，其它选择中，此类组合物可包含趋化闳子与CCR7受伟 相互作用的小分子抑制剂.这些同样用于治疗和/或改善受试者疾病征状的组合敎 和方法将在后面进行更为详细的讨论.
任何纤维化疾病都是可以治疗的.例如，这些疾病可包括肺纤维化、慢性fi 塞性肺病、肝纤维化、风湿性关节炎、充血性心力衰竭、慢性肾病、过敏性肺炎、 呼吸性细支气管炎/间质性肺病、更氏血吸虫感染、原发性肺动脉高压(防止丛批 损害形成)、疱疹病毒相关疾病(包括肺表现和皮肤表现)、瘢痕疙瘩、狼疮、 肾源性纤维化皮肤病、日本血吸虫感染相关的纤维化损害、自身免疫性疾病、效 病性纤维化、莱姆病、胰腺炎中的基质重塑和基质纤维化、子宫肌瘤、卵巢纤维
化、角膜纤维化、克血性心力衰竭和其他缺血后遣症、术后结疤(包括腹部粘连)、 开角型青光眼小梁切除术后结疤，及其任意组合，所述方法适用的其它领域是抑
制上皮细胞向间质细胞的转化(EMT).这是一种现象，其中各种器官(特別是 肾)中的上皮细胞"退化"成更"原始"的细胞表型(类似成纤维细胞).这种 过程有助于组织机体发育布局的形成，EMT在胚胎发育方面得到了很好的研究， 在成人组织的器官纤維化过程中，其对成纤维细胞的发生也发挥着作用.肾纤维 化研究的最新证据表明，全部疾病相关成纤维细胞中超过三分之一来源于损伤位 点处的管状上皮细胞，这种过程可被KaHuri和Nielsen发明的组合物抑制(J. Clin. Invest. 112:1776-1784(2003)).
充血性心力衰竭、非典型性肺炎(包括肺孢子虫类)和肿瘤淋巴弥散的病人 可出现肺纤维化，环堍性或职业性瀑露(包括吸入接触无机粉尘，例如硅稱、石 棉、铍(bery出os)，黑肺)也被认为是引起这些肺疾病的原罔.接触蛋白质抗 原(如农民肺、饲鹆者肺、热浴肺(hot-tub lung))以及接触有毒气体、烟雾、 浮尘和蒸气(如地窖装填者病(silo-fiHer，s disease))也会引起纤維化.瀑露于 放射(电离放射，频繁使用于医学治疗)也是众所周知的肺纤维化起罔，其还是 风湿病/结締组织病(例如硬皮病、风湿性关节炎、混合性结締组织病、系统性红 斑狼疮)的有关原罔.在以下疾病中也可见到纤维化肺肾综合征(即Wegner 或Goodpasture病症)；结节病和其他肉芽胂性疾病(例如铍中毒)；系统性疾 病，如丙型肝炎；炎症性肠道疾病；获得性免疫缺陷综合征；特发性或罕见性 DPLDs，如COP(特发性)、肺郎格汉斯细胞组织细胞增生症(罕见)、嗜酸细 胞性肺炎.另外，纤维化可见于家族性IPF或结节病、结节性硬化症、神经纤维 瘤、Niemann-Pick病、Gaucher病和Hermansky-Pudlak综合症*
可使用本发明的治疗性干预的另一领域为各种肿瘤治疗引起的纤维化.例如， 本发明的治疗方法可成为放射肿瘤治疗方案的辅助治疗方法.放射诱发的肺炎和 随后的肺纤维化;lii射治疗的副作用，其影响了放射治疗的效果，典型的例子是, 在肿瘤治疗中，放疗的施用刑量为20-85gray.但是，对病人的研究已表明，当放 射剂量增加时，肺叶炎形式的肺毒性几乎与之呈线性关系.随后还见到纤维化损
和/或活性的药刑，将改善放疗诱发的肺叶炎和/或放疗诱发的肺纤维化的发展或 进展.在某些实施方案中，预期本发明降低CCL19和/或CCL21的存在量或活性
的治疗法可在放射治疗之前和/或之后施用，以及/或与放疗同时施用.在某些实
例中，优选在实施放疗后的l、 2、 3、 4或5天内施用这样的药刑.
已被证明导致明显的肺纤维化的另一种癌症治疗是在施用砥酸博来審素时 出现药物诱发的纤维化.博来審素沉积在皮肤和肺部而引起纤维化.虽然有人建 议停止用药并给予皮质类固醇，但是对博来莓素引起的肺损伤的治疗未见说明. 预期本发明降低CCL19和/或CCL21的存在量或活性的治疗法可在给与砥酸博来 莓素之前、和/或之后，和/或同时施用.施用降低CCL19和/或CCL21的存在量 或活性的药刑将有效降低接受疏酸博来雾素的病人的肺纤維化发生或发展.
虽然将疏酸博莱雾素描迷为导致肺纤维化的示例性药刑，但是其他药物也可 诱发肺病，近年来这已经成为大家关注的一个领域.1972年公认可引起肺病的药 物只有19种.2001年的一篇文献综述指出，至少有150种药物已被显示能导致 肺病，这一名单还在增加中.这其中，已知纤维化可由以下药物引起细胞毒刑， 如博来審素、白消安、甲氦蝶呤；抗生素，如呋喃妥因、柳氮磺吡啶；抗心律不 齐药，如胺碘S^、妥卡尼；消炎药，如黄金、青審胺；违禁药，如快克可卡因、 海洛因.具体实施方案中，本发明的方法和组合物可用于治疗以下药物引起的纤 维化两性審素B、博来審素、溴麦角隐亭、白消安、卡马西平、苯丁酸氮芥、 可卡因、环裤酰胺、苯妥英、麦角胺、象卡尼、海洛因、美法仑、美沙頃、甲承 蝶呤、哌甲酯、美西麦角、矿物油、呋喃妥罔、亚硝基脲类、丙卡巴肼、硅頃、 柳氮磺吡啶、妥卡尼和长春花生物碱类药刑，包括丝裂審素和抗微生物刑.已这 意到亚硝基脲类(如卡莫司汀、洛莫司汀和司莫司汀)，尤其卡莫司汀的使用， 高达25%的接受卡莫司汀的病人发生早发型(在卡莫司汀治疗开始后36个月内) 肺纤维化.
术语"受试者"和"病人"是指哺乳动物或非哺乳动物物种的一个或多个威 员，其可对本文所述的制药方法、组合物和治疗存在需要.罔此，受试者和病入 包括但不限于灵长类(包括人)、犬科、猫科、有蹄类(如马科、牛科、猪科(例 如猪))、禽类，以及其受试者.特别感兴趣的是人和具有商业重要性的非人劲 物(例如家畜和馴养动物)."哺乳动物"是指任何哺乳物种的一个或多个成员， 举例来说，包括犬科、猫科、马科、牛科、绵羊科、啮齿目等，以及灵长类(尤 其是人类).非人动物棋型，尤其哺乳动物(例如灵长类、鼠科、兔类等)可用 于实验性研究.含有一种或多种抑制CCL21和/或CCL19的活性、表达和数量的药剂的组会 物可用于抑制不恰当位置、纤维化病症、慢性炎症等中的纤维化.这样的组合啦 可局部施用于纤维化损害位点，或者可全身施用.此外，这种旨在减少、抑止、 抑制或其它方式消除CCL21和/或CCL19的活性/效果的组合物可以单独施用或 者与其他可用于治疗纤維化疾病的药剂联合施用.这些其他组合物可例如包括皮 质类固醇和其他抗炎药，强的松、疏唑噪呤以及IFN"Y细胞因子治疗也是有益的. 特別预期这些组合物与抗CCL21/抗CCL19组合物的组合.以前提出单独使用免 疫抑制剂和皮质类固醇足以治疗肺纤维化，但是现在公认联合皮质类闺醇的免疾 抑制治疗对于治疗该疾病是无效的，罔为这种干预不仅对于改变疾病的m无效， 其也没有使存活预后有任何提高.肺纤维化受试者的预后为，当缺少手术干预时， 该疾病是致命的.这样，这些病人唯一的选择就是肺移植.因此，第一項发明的 组合物和方法与现有治疗方法相比是一项重大的进步，因为它们提供了能够阻止 或减緩该疾病的发展/进展的治疗方案.
具体实施方案中，含有抗CCL21抗体的组合物可用来降低靶位置中CCL21 的浓度.降低人体中CCL21和CCL19所需的刑量推测在较低的微克范闺.例如， 可以使用5-40 pg/kg大约刑量范闺的抗体.理想的是，这些抗体将在5-10 pg/kg 的较低剂量范闺内发挥作用.
IL-12、层粘连蛋白-1、交联IgG和IgG聚集体已经显示出抑制单核细胞分化 成纤维细胞(美国专利申请No. 20050238620).这些组合物可用于本文所讨论的 组合中.
在本治疗方法中，可施用于靶位置的所述组合物可来自外源性来源，或者它 们由靶位置中的细胞或与靶位置相同的器官(organism)中的细胞在体内产生. 这些组合物可从捐赠的人体组织(包括体液)中分离.也可以在细菌、组织培养
蛋白，它们也可以合成制备，或通过本领域已知的任何其他方法来制备.如果这 些组合物在体内制备，则它们可以是转基因的表达产物，或者它们可得自存在于 体内的来源的生产增强，如果这些组合物正常存在于靶位置，則也可以通过降仳 其正常的降解速率来提高其浓度.另外，例如通过供应辅助因子，也可能增强这 些组分对纤维细胞分化的抑制能力.
虽然以IIP作为纤维化疾病的例子来说明本发明方法，但是应理解，这种疾
病是用作其他纤维化疾病的范例.根据本文的教导，本领域技术人员将意识到， 可被治疗的其它疾病包括其中希望抑制纤维化的任何疾病，从而，本发明的方法
涉及由这样的病症引起的纤维化，其包括但不限于硬皮病；瘢痕疙瘩；风湿性关 节炎；狼疮；肾源性纤维化皮肤病；纤维化损害，例如日本血吸虫感染后形成的 損害；自身免疫疾病；致病性纤维化；莱姆病；胰腺炎中的基质重塑和基质纤维 化；哮喘；特发性肺纤维化；慢性阻塞性肺病；肺纤维化；子宫肌瘤；印巢纤维 化；其他纤维囊性形成物；角膜纤维化或其他眼部纤维化，例如角膜屈光手术引 起的纤维化；以及充血性心力袭竭和其他缺血后遣症引起的纤維化；术后结疙， 包括腹部粘连；开角型青光眼小梁切除.某些这样的纤维化疾病中，纤维细胞可 能不代表纤维化的最后阶段，例如，在津喘中，纤维细胞进一步分化为成肌纤维 细胞，后者持续存在于变厚的气道壁中.对于治疗，应了解纤维化疾病症状的任 何改善都是有益效果，并应視为治疗的证据.罔此，病症或疾病的"治疗(treating or treatment)"包括(1 )预防所述病症的至少一种症状，即使哺乳动物的临 床症状没有明显发展，所述哺乳动物可能暴露于疾病或有疾病先兆，但是尚未经 历疾病或表现疾病的症状；(2)抑制疾病，即阻滞或减援疾病或其征状的发展； 或(3)减轻疾病，即使疾病或其临床症状好转.这里所说的治疗、预防和改善病 症例如包括减轻或根除与纤维化疾病有关的有毒或有害状况.这类治疗的例子包 括减轻细菌感染、增强肺功能、对促炎细胞因子进行降调节，以及对单核细胞 聚集的升调节.
具体实施方案中，可通过施用抑制或其它形式降低CCL21和/或CCL19的作 用的药剂来治疗肺纤维化或其他肺纤维化疾病.治疗可减慢与纤维化有关的细胞 生长，也减少胶原沉积，治疗可防止进一步纤维化，或咸小现有纤维化的影响. 药刑可以任何刑量给予，且为任何刑型，只要能够减轻病人的疾病的至少一种症 状.可以每隔一天静脉给药，并且持续选定的时期.这种刑量、给药方法和给药 时间表对于治疗其他纤维化疾病也是有用的.剂量、刑型和给药方式可以用疾病 的动物模型加以优化.
下面提供的例子中给出用于肺纤维化的示例性模型.但是，本领域技术人员 会意识到这种纤维化疾病的其他模型.例如，在美国专利No. 20050238620中， 通过向其肺中注射博来審素，诱发大鼠(Sprague Dawley，含手术植入颈静脉导 管，Charles River Laboratories, Wilmington, Mass)肺纤维化，博来莓素是一
种抗肿瘤药，注入动物气道时导致肺部纤维化.这是研究肺纤维化的标准方法
(Crouch, E. 1990. Pathobiology of pulmonary fibrosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 259:L159-L184).在此类方法中，为了诱发纤维化，对大鼠进行麻 醉和监控，以保证获得并维持合适的麻醉手术平面.翔部腹側剃毛、消毒，准备 进行切口手术.在颈部腹側做一个垂直中线切口，缩回颈部肌肉，暴露气管.取 300 pi 3.3 U/ml (1个单位)博来審素(Calbiochem/EMD Biosciences. San Diego， Calif.)的0.9%生理盐水无菌溶液，用注射器和26号针头注入气管腔内.对照组 大鼠注入生理盐水.缝合2-3针闭合切口，该操作按照Underwood等人的方法进 行(2000, SB 239063， a p38 MAPK inhibitor, reduces neutrophilia, inflammatory cytokines, MMP-9, and fibrosis in lung. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 279:L895-L902.).在该搮作期间以及手术后，动物被安置于加热灯下， 一旦其 完全恢复就放回笼内.在该搮作过程中，对动物进行检查，以保证其i)呼吸规 律，ii)耳朵和粘膜呈粉红色，Hi)捏其脚趾不缩脚，iv)眼睛或眼睑受触碰不眨 眼.
为了试验抗CCL21组合物的效果，经由销售者植入的颈静脉导管对纤维化 模型静脉注射抗CCL21组合物.该组合物可以有利地用生理盐水(0.9%NaCl) 配制，使用前通过0.2pm过滤器.
用于本发明方法的特別优选的抗CCL21组合物是与CCL21产生免疫反应的 抗体.优选地，此类抗体是只与CCL21及其变异体产生免疫反应而对不与其它 趋化罔子反应的单克隆抗体.优选该抗CCL21抗体为配制用于对人被试者施用 的人源化抗体.本领域技术人员对用于研究目的的抗CCL21抗体非常了解.例 如，R&D Systems ( Minneapolis, MN )有一种可得商品制剂BAF457,这是一种 小鼠重组抗CCL21抗体，由大肠杆菌产生，可以用于本发明.P印roTech.( Rocky 训l， NJ )也有抗CCL21单克隆抗体，Abeam ( Cambridge, U.K., and Cambridge MA， USA)有与CCL21产生免疫反应的多克隆抗体(例如山羊抗CCL21多克隆 产品abl0350和abl0364),其可以很容易地用于再现实验，以显示在模型动物 中抑制CCL21的作用可改善纤维化.
由于本领域中很容易获得鼠科和山羊抗CCL21单克隆抗体，预期此类抗体 可以容易地作为"模板"用于制备相同单抗的人版本(human version)，用于人 体治疗，例如，预期可使用噬菌体呈现法来构建(device)能用于本发明治疗方
法的全长抗体或抗体片段.其它实施方案中，有可能制备全长人源化小鼠或山羊
重链或轻链免疫球蛋白，其含有人恒定区、小鼠或山羊CDRs以及具有许多"人 源化"改造氨基酸的实质小鼠或山羊构架，由此将降低此类种抗体对人类受试者 施用时发生不良反应的可能性，许多实施方案中，"人源化抗体"是含有人源化 可变轻链和/或人源化可变重链的抗体，通过"人源化"过程已经被"人源化"了 的修饰抗体与抗原(与提供CDRs的母抗体所结合的抗原相同)结合，且与母抗 体相比，其通常对人体的免疫原性较小.当然，以上关于抗CCL21抗体的描述 也适用于CCL19,后者的抗体在本领域也是可得的.
应理解，这里所使用的抗体可以含有Fc域，也可以不含Fc域.在一些实施 方案中，多价抗体可用作治疗性组合物."多价抗体"是指含有针对多个表位的 结合域的重组抗体样分子，例如，同时与CCL21和CCL19结合的多价抗体可被 认为对于治疗纤维化特别有用.在其他治疗性组合物中，抗体衍生蛋白包括其中 抗体Fab链已与结合域融合的分子，例如Fab-scFv 二体(bibodies )或三体 (tribodies).这些分子是有用的中等重量的不含Fc部分的重组双特异性抗体. 产生缺乏Fc域的抗体是有利的，因为当抗体相关的治疗分子上存在该域时，该分 子趋于延长其在血清中的保留时间，以防止其在肝脏中代谢，该分子还可能通过 其与Fc受体的相互作用而与其它细胞发生交联，从而因全身触发(systemic triggering)免疫效应细胞而产生毒性副作用.因此，某些抗体相关的治疗性分子 缺乏Fc域.本领域技术人员知道构建这类抗体相关分子的方法.例如，为了有效 产生多特异性抗体，可以由抗体衍生的结构单元(例如Fc、 (Fab，)2、 Fab、 scFv 和双体(diabody))与异源二聚模体的组合来制备重组抗体，
除抗体之外，预期设计为抗CCL21和/或CCL19的siRNA分子也将是治疗 纤维化疾病的有用组合物，本领域技术人贝熟知，通过称为RNA干扰(RNAi ) 的过程，双链RNA(dsRNA)可在许多有机体中引起序列特异性转录后基因沉默. 最近的研究表明，RNA片段是RNAi的序列特异性介质(Elbashir et al.， Nature, 411,494,2001),通过这些小干扰RNA (siRNA)对基罔表达的干扰现在被认为 是使线虫、果蝇、植物以及小鼠的胚胎干细胞、卵母细胞和早期胚胎中的基因沉 默的天然策略(Cogoni et al.， Antonie Van Leeuwetihoek， 65， 205， 1994; Bau，combe， Plant Mol. Biol" 32， 79， 1996; Kennerde，l， CeH， 95， 1017 1998; Timmons， Nature, 395， 854， 1998; Waterhouse et al" Proc. Na". Acad. Sci. U.S.A.
95， 13959, 1998; Wia呵and Zemicka-Goetz， Nat. Cell Biol" 2， 70， 2000; Yang et al*， Mol， Cell Biol" 21， 7807， 2001j Svoboda et al" Development, 127， 4147 2000 ) 在哺乳动物细胞培养物中，通过用合成RNA寡核苷酸转染细胞，已实现siRNA 介导降低基因表达(Caplan et al" Proc. Na". Acad. Sci. U.S.A., 98， 9742， 2001; Elbashir et al.， Nature, 411， 494， 2001 ).
典型地，为了实现治疗性siRNA的细胞内表达，构建含有发夹序列(例如 21-bp发夹)的RNA分子，所述发夹序列代表定向对抗感兴趣基因的序列(本案 中为CCL21基因和/或CCL19基罔.将SiRNA或编码该siRNA的DNA序列导 入把细胞中，例如在纤维化损害位点产生CCL21的细胞.siRNA降低目标inRNA 和该试刑的基因蛋白表达.使用组织特异性启动子将获得治疗性siRNA分子的有 益的组织特异性靶标.编码治疗性siRNA的构建物具有这样的构型，以致启动子 与发夹紧密相邻.根据是否需要可诱导的，组织或细胞特异性表达siRNA,从本 领城已知的容易得到的启动子中选择用于具体构建物的启动子.例如通过注射将 该构建物导入靶细胞，使细胞中靶基因表达减小.
因此，在示例性实施方案中，本发明提供了包含表达盒的栽体(即在重组基 因表达和/或送递中通常使用的病毒栽体，例如腺病毒栽体、慢病毒栽体、腺伴随 病毒(AAV)栽体、逆转录病毒栽体、脊链灰质炎病毒栽体、单纯疱务病毒(HSV) 栽体或鼠Maloney-based病毒栽体等)，其中表达盒包含分离的编码靶向抗CCL21 的小干扰RNA分子(siRNA)的核酸序列.CCL21的核酸结构为本领域技术人 员所熟知，CCL19的结构也一样，参见例如Genbank Accession No. AB002409, 其记栽了人CCL21的mRNA序列；Genbank Accession No. NM_006274，其记栽 了人CCL21的mRNA序列，恒河猴的CCL21记栽于Genbank Accession No. NM_001032855，在提出本申请时，猪、小鼠和狗的序列也可在Genbank得到. 这些序列都可以制备，且可将siRNA设计为对抗确定为CCL21的功能表达重要 的那些分子区域(注意相关蛋白质的序列公开可用于制备相同蛋白质的重组抗 体及产生其抗体).该siRNA可靶向于沿该核酸序列的任意10-30个相邻核酸片 段，特别有用的是对趋化因子的功能表达有重要的那个序列.siRNA可形成含有 双链体结构和环(loop)结构的发夹结构.环结构可含有4-10个核苷酸，例如4 个、5个或6个核普酸.双链体的长度优选小于30个核苷酸，例如19-25个核普 酸.siRNA可进一步包含突出区(overhang region ).这种突出可以是3，突出区、
5，突出区或3，和5，同时突出区，突出区可以是例如长度为1-6个核苷酸.表达盒 可进一步包含启动子.启动子的例子包括可调控启动子(regulataWe promoters 〕 和组成型启动子.例如，启动子可以为CMV、 RSV或polIH启动子.表达盒可 进一步含有聚腺苷酸化信号，例如合成的最小聚腺苷酸化信号.核酸序列可进一 步含有标记基因.
当然，除了定向抗CCL21和/或CCL19的组合物外，所述组合物还可以定向 抗CCR7 (这些趁化因子的受体)的组合物.此外，特別预期联合治疗，其中注
法联合使用.特別预期的其他具体联合治疗为其中基于降低纤维化疾病中CCL21 活性的治疗方法与已有的纤维化治疗的联合的那些治疗.例如，目前已经证明单
用可有效改善肺纤维化.临床项目在波生坦(bosentan) ( Tracker )对于特发
果.疏唑噪呤在纤维化疾病中对于稳定肺功能和改善症状也发挥作用.细胞闳子
(IFN-Y)治疗对于纤维化疾病也是一种有用的治疗方法.为了减轻、消除或其它 形式中止纤维化症状，可将任何此类組合物与基于抗CCL21的治疗和/或基于抗 CCL19的治疗联合使用(注意"基于抗CCL21"或"基于抗CCL19"的治疗既 指抗体治疗，又指使用siRNA分子的治疗).
不管抗体是在动物体内对抗具体的抗原而产生的，或是通过噬菌体呈现法和 抗体工程技术制备的嵌合抗体，此类抗体将最终被配制成用于治疗纤维化疾病的 药物制刑.同样，siRNA组合物最终也将被配制成用于治疗纤维化疾病的组合物. 局部递送这些组合物是优选的，但是预期全身递送也是可能的，
按照本发明，用于施用的药物组合物可以包含前面讨论的任何基于抗CCL21 和/或抗CCL19的组合物.该药物组合物还包括另一种用于治疗表面活性物质代 谢紊乱的药剂，例如支气管扩张药，特別是当病人表现出气道反应性迹象时；以 及溶軲液剂，如乙酰半胱氨酸、胰蛋白醉和氨溴索和/或GM-CSF;皮质类闺醉和 其他抗炎药物，在某些方面，这些制刑中的每一种以药学上可接受的形式提供， 任选与药学上可接受的栽体组合.可通过达到其预期目的的任何方法施用这些组 合物.使用本发明方法施用用于抑制、消除等纤维化损害处的CCL21或CCL19 的作用的组合物的个体化剂量和方案可以很容易地由本领域普通技术人员通过试
验来确定，所述试验用于疾病的诊断以及測定给定治疗性干扰产生的效果水平.
在IIP的治疗中，可以很容易地对先前用于治疗肺病的任何规程、刑型、绐 药途径等等进行修改，用于本发明.在一些实施方案中，当呼吸短促特别严重时，
可进行机械通气.这种通气包括高频振荡通气(HFOV)或其他非常规形式的枳 械通气.
本发明范围内的组合物包括包含至少一种用于降低CCL21效应或活性的药 刑的所有组合物，所迷药刑的用量为有效达到其降低、抑制、预防或减少CCL2
活性目的(例如减少或降低纤维化病变损害位点处的成纤维细胞的数量)的量. 在某些方面，这种治疗将緩解IIP的一种或多种症状.
其它方面中，通过吸入或口服给与本发明使用的组合物.
应理解，按照本发明的组合物的适当剂量将取决于接受者的年龄、健康状况 和体重，以及同时进行的治疗(如果有的话)类型、治疗頻率和想要的效果性质. 但是，如本领域技术人员无需进行过度的试验，就能够理解并能确定的，针对各 別受试者对刑量进行调整.这一般包括对标准剂量的调整，例如如果病人是低侔 重，则减小剂量，
治疗剂的总刑量可以多刑量或单刑量形式给与，在某些实施方案中，单独施 用所述组合物，在其它实施方案中，所迷组合物与其它针对该疾病或针对它的其 他症状的治疗结合施用.
在某些方面，将本发明的组合物配制成适当的药物组合物，即，适合在纤维 化疾病的治疗性干预中进行体内施用的剂型. 一般地，这需要制备基本不含热原 以及可对人体或动物有害的其他杂质的组合物.在某些方面，制备这些组合物用 于直接对肺施用.这些制刑借助吸入器进行口服，但是，预期其他的给药途径(例 如注射等)，从CCL21在IIP成纤维细胞中高度表达但在正常成纤维细胞或其他 組织中并非如此的发现可以得出结论，这种趋化罔子的主要位点整体涉及于纤维 化损害的形成，这在HP中似乎特别真实.这样，预期促使这些组合物容易施用 于肺组织的制刑和给药途径将特別有用.
人们通常希望使用适当的盐和緩冲液以使所述组合物保持稳定，且允许在靶 位点被摄入.通常本发明的蛋白质组合物以冻干形式提供，施用前进行重构.或 者，可能将这些组合物配制成片刑或其他口服递药的刑型.用于重构治疗刑的鍵 冲液或溶液可与药物制刑一起提供，以产生本发明的水性组合物，用于施用.A
类水性组合物将包含有效量的被使用、溶解或分散于药学上可接受的栽体或水性
介质中的各种治疗刑.此类组合物也称为接种体(inocula).本文所用的"药学 上可接受的"指对人体或动物施用时不产生不良反应、过敏反应或其他不利反应 的分子实体和组合物.本文所用的"药学上可接受的栽体"包括任意和所有的容 剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗刑和吸收延迟剂等等.对药物活 性物质使用此类介质和药刑为本领域所熟知.除了与这些治疗性组合物不相容的 常规介质或药剂之外，预期其在治疗性组合物中的使用，补充活性组合物也并入 这些组合物.
配制蛋白质和核酸用于治疗给药的方法也为本领域技术人员所知.可通过任 何常用途径施用按照本发明的这些组合物，只要通过该途径能够到达靶组织.最 常用的是，将这些组合物配制成口服给药的制剂，例如由吸入器吸入.但是，也 可使用其他常规给药途径(尤其当口服给药有问题时)，例如通过皮下、静脉内、 皮内、肌肉内、乳内、腹腔内、鞘内、眼内、眼球后、肺内(例如定期释放)、 气雾剂、舌下、鼻腔、肛门、阴道或透皮给药，或通过在特定位点的手术植入. 治疗可为单剂量，也可为一段时间内的多次给药.
在某些实施方案中，将用于施用的活性化合物制备成游离减或药学上可接受 的盐的水溶液，与表面活性剂(如羟丙基纤维素)适当混合.也可在甘油、液体 聚乙二醇及其混合物和油中制备分散体(dispersion),在普通的储存和使用条件 下，这些制剂含有防腐刑以防止微生物的生长.
适合于注射使用的药物刑型包括无菌水溶液或分散体，以及可即时配制成无 菌注射溶液或分散体的无菌粉末.在所有情况下，刑型都必须无菌，且必须有良 好的流动性，易于注射.其在生产和储存条件下必须稳定，并必须不受到微生物 (例如细菌和真菌)的污染影响，在某些方面，栽体为溶剂或含有诸如水、乙醇、 多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其适当的混合物以及植物油的 分散介质.通过以下方法保持适当的流动性例如使用包衣(例如卵磷脂)；对 于分散体，保持所需的粒度；以及使用表面活性刑.通过各种抗菌刑和抗真菌刑 来防止微生物的作用，所述抗菌刑和抗真菌剂例如为对轻基苯甲酸酯、氟丁醇、 苯酚、山梨酸、硫柳汞等.在许多情况下，优选包含等渗剂，例如糖或氯化钠. 在药刑组合物中使用延迟吸收刑(例如硬脂酸铝和明胶)，延长注射組合物的吸 收， 通过以下方法制备无菌注射溶液:将所需量的活性化合物混入的适当溶剂(按 需要含有以上列举的各种其他成分)中，然后过滤灭菌.通常，通过在无菌赋形 刑中混入各种经过灭菌的活性成分制备分散体，所迷无菌赋形剂中含有基础分散 介质和以上列举的其他需要的成分，就用于制备无菌注射溶液的无菌粉末而言， 其制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，由预先经过无菌过滤的溶液得到活性成 分加上任何附加的所需成分的粉末.
本文所用的"药学上可接受的栽体"包括任意和所有的容剂、分散介质、包 衣、抗菌刑和抗真菌刑、等渗刑和吸收延迟刑等.对药物活性物质使用此类介质 和药刑为本领域所熟知.除了与这些活性成分不相容的常规介质或药刑之外，预 期其在治疗性组合物中的使用.补充活性成分也并入这些组合物.
在某些方面，对中性或盐形式的本发明组合物进行配制.制药学上可接受的 盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)以及与无机酸(例如盐酸或鱗酸) 或有机酸(例如醋酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成的盐.与游离羧基形成的 盐也可以来源于无机减(例如氨氣化钠、氩氧化钟、氩氣化铵、氳氧化钙或氬氧 化铁)以及有机械(例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普香卡因等).
对于制刑，溶液将以与剂量制刑(dosage formulation )相容的方式，并以治 疗有效的量施用.各种剂型(例如注射溶液、释药胶囊等)的制刑容易施用.例 如，对于肠胃外给药的水溶液，需要时对该溶液进行适当緩冲，并且首先用足量 的生理盐水或葡萄糖使液体稀释刑保持等渗，这些特殊的水溶液特别适于静脉内、 肌肉内、皮下和腹腔内给药.
"单位剂量"定义为散于适当栽体中的治疗组合物的不连续量.在某些实施 方案中，治疗性化合物的肠胃外给药由推注开始，然后进行连续输注，以维持药 物产品的治疗循环水平.本领域普通技术人员根据良好的医疗规范和病人的个体 情况将容易地优化有效刑量和给药方案.
给药频率将取决于药剂的药代动力学参数和给药途径.本领域技术人员根据 给药途径和所需的剂量确定最佳的药物制刑.此类制刑可能影响被施用药物的物 理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率.根据给药途径，按体重、体表 面积或器官大小计算合适的刑量.动物模型的有效性对于确定给定治疗剂的合适 治疗刑量特别有用.本领域普通技术人员无需经过过度试验，可常规地对确定适 当治疗剂量所必需的计算进行改进，特别是根据剂量信息和本文揭示的分析方法， 以及在动物或人体临床试验中观察到的药代动力学数据进行改进，
一般地，通过使用已经建立的用于测定血药浓度的分析方法结合相关的刑量 反应数据来确定合适的剂量.最终的刑量方案由主治医师考虑改变药物作用的罔 素来确定，所述因素例如为药物的比活度，损伤的严重程度以及病人的反应性， 病人的年龄、身体状况、体重、性別和饮食，任何感染的严重程度，给药时间和 其他临床因素.随着研究的进行，将披露有关具体疾病和病症的合适刑量水平和 疗程的进一步信息.使用疾病模型(例如本文描述的那些啮齿类动物模型)可以 容易地优化任何这样的刑量.
应了解，本发明的药物组合物和治疗方法有用于人药和善药领域.因此，被 治疗的受试者是哺乳动物，例如人或其他哺乳动物.就善医学而言，受试者的例
子包括农场动物，包括母牛、绵羊、猪、马和山羊；伴侣动物，例如狗和猫；珍 奇动物和/或动物园动物；实验室动物，包括小鼠、大鼠、兔、豚鼠、仓鼠；以及 家禽，如鸡、火鸡、鸭子和鹅.
本发明还预期用于治疗纤维化疾病的试刑盒.此类试剂盒包含至少一种笫一 组合物，其含有位于药学上可接受的栽体中的上述基于抗CCL21和/或抗CCL19 的治疗剂.另一种组分是用于治疗该疾病的笫二治疗刑连同适当的容器以及用于 施用所述治疗组合物的工具(vehicle).这种试剂盒可另外包含影响第一组合物 和笫二组合物递送的溶液或援冲剂.这种试刑盒可进一步包含导管、注射器或其 他递药装置，用于递送在本发明方法中使用的一种或多种组合物.这种试剂盒可 进一步包含治疗方法的施用方案的说明书.
实施例
以下实施例对本发明的某些实施方案进行说明.本领域技术人员应了解，在 实施例中揭示的技术遵循发明者发现的代表技术，以在本发明实践中发挥良好作 用，因此被认为构成本发明实践的某些方面，但是，根据本公开内容，本领城扭 术人员应认识到，对所公开的具体实施方案可做# 多变化，并仍能获得相似的结 果，而不脱离本发明的精神和范囤.
实施例1:用于显示CCR7在特发性间质性肺炎中的作用的方法和材料 病人为疑患IIP者，根据临床、生理学、放射影像学和病理学发现的汇编来 确定(Flaherty et al" Am, J, Med.， 110:278-282 (2001》Flaherty et al" Curr, Opir Pulm, Med.， 6:404-410 (2000》Kazerooni et al" AJR Am, J, Roentgenol.
169:977-983 (1997); American Thoracic Society, European Respiratory Society (ATS/ERS)， Am. J. Respir. Crit. Care Med.， 165:277-304 (2002)).之前，招入本 研究的病人没人经历过活检手术或接受过IIP治疗.2000年5月至2004年8月， 进行SLBs,作为密执安大学专科研究中心(University of Michigan Specialized Center of Research )评价纤维化肺病病理生物学的一部分.从因肺癌而经受过胸 切除术的病人的切除样本远端边缘(distant margins)获得组织学正常的肺活检， 无疾病的病理学迹象.在层流通风橱中用无菌技术单独处理各个SLB，进行分子、 蛋白质和免疫组化分析(见下文).
由SLBs制备RNA和cDNA.将每份SLB中用于分子分析的部分速冻于液 氮中，并储存于-280lC.对于RNA分离，将这些样本在冰上解冻，在TRIzoIH 试刑(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, California, USA )中进行机械匀浆， 然后按生产商的说明制备总RNA.随后使用BRL逆转录试刑盒和oligo (dT) 12-18 引物将得自SLBs的纯化RNA逆转录至cDNA中.扩增緩冲液含有50mMKC,、 10 mM Tris/HCI (pH 8.3)和2.5 mM MgCI2,
基因阵列分析，如在先描述的，使用Super Array Inc (Bethesda， Maryland, USA)的Non-Rad GEArray基因阵列膜分析的人趋化罔子以及趁化罔子受体的 基因概况(profile)的变化(Choi et al" Am. J. Respir. Crit. Care Med.， 170:508-515 (2004)).由于3-裤酸甘油搭脱氬酶(GAPDH)在本研究分析的所 有SuperArrays中一致表达，罔此将其用作内部阳性对照.
实时TaqmanPCR分析，如在先描述的，通过实时定量逆转录聚合醉链反应 (PCR)程序，使用ABI PRISM 7700序列检测系统(Applied Biosystems， Foster City，CaH化rnia，USA)分析人CCR7、 CXCR4、 CCL19、 CCL21和CXCL12基 因在HP及正常边缘SLBs中的表达(J(akubzick et al.， Am. J. Pathol" 162:1475-1486 (2003)).对来源于上、下肺叶SLBs的cDNAs分析趋化因子受体、 趋化因子和GAPDH (内部对照)的表达，所用的所有引物和探针均购自Applied Biosystems.在计算趋化罔子表达中的倍数变化之前，将趋化因子基因的表达归 一化至GAPDH.通过将所有病人的基罔表达与正常边缘肿瘤病人组的上肺叶或
下肺叶中所测定的基因表达进行比较，计算细胞罔子基因表达中的倍数增加.
ELISA分析.使用标准的夹心酶联免疫吸附测定(ELISA败术(R&D Systems Minneapolis, Minnesota, USA )测定50 ml来自匀浆化IIP和正常边缘SLBs的不
含细胞的上清液样本中人CCL19、 CCL21和CXCL12的浓度.用重组人细胞因 子来绘制标准曲线，由此推知样本中的存在浓度.CCL19的检測限制，如在先描 述的，用免疫组织化学的常规免疫化学技术测定SLBs中CCR7、 CXCR4、 CD45、 CD34和aSMA ( Jakubzick et al" J. Clin. Pathol" 57:477-486 (2004)) 使用下列 目标抗体及其合适的同种型对照购自BD Biosciences PharMingen ( San Diego: California, USA )的小鼠抗人CCR7抗体和小鼠IgMk;购自R&D Systems的小 鼠抗人CXCR4和小鼠IgG2B;购自Abeam ( Cambridge, Massachusetts, USA) 的小鼠抗人CD45、 CD34和1型胶原抗体；购自R&D Systems的小鼠IgGl.使 用这些免疫组化技术对10名UIP病人、6名NSIP病人和5名RBILD病人的上 肺叶和下肺叶SLBs进行分析.对5名病人的切除胂病的正常边缘进行分析.对 每份SLB的连续切片(5mm厚)进行分析，在紧邻的连续切片上实施CCR7与 其他抗原的共定位.
实施例2:显示CCR7在特发性间质性肺炎中的作用的结果 SuperArray分析在IIP和正常边缘SLBs中的CCR7、 CXCR4、 CCL19、 CCL21和CXCL12转录物.用特异性SuperArray GEArray分析IIP和正常边縴 SLBs中CCR7和CXCR4的存在，虽然这是一种定性而非定量技术，可将CCR7 (图IA)和CXCR4 (困IB)的表达归一化为GAPGH的表达，该两种受体的數 值得到显示.CCR7和CXCR4的最高相对表达见于来自UlP病人组(n-7)的上 肺叶和下肺叶活检样.对来自NSIP病人组(n=6) 、 RBILD病人组(n=6)和正 常边缘(n=5)肿瘤病人组的下肺叶和上肺叶活检样进行了类似的分析.虽然没 有检测到显著的差异，总体上，两种趁化因子受体的相对表达遵循以下疾病严重 性模式(disease severity pattern ) : UIP、 NSIP、 RBILD、正常边缘.至今确定 的两种CCR7配体为CCL19 (Yoshida et a，., J. Biol. Chern" 272:13803-13209
(1997) )和CCL21 ( Campbell et al"丄Cell Bio," 141:1053-1059 (1998)) CCL19 (或ELC、 exodus-3和CKb-U34)组成型表达于传入淋巴内皮以及淋巴结的T
细胞区域，由此说明其在树突状细胞和T细胞向这些免疫位点的运动中起主要作 用(Sal，usto et al.， Eur. J. Immunol" 29:1617-1625 (1999)).同时进行的研究表 明，CCL21 (或SLC、 exodus-2、 TCA-4和CKb-99)具有类似的功能和类似的 表达模式，但是，已经在肺(Gunn et al" Proc, Natl. Acad, Sci. USA， 95:258-263
(1998) )和肾脏(Banas et al" J. Immunol" 168:4301-4307 (2002))中检測到该两
种趋化因子，说明它们可能具有除免疫监視之外的作用.CCL19的相对转录物表 达的分析揭示，这种CCR7配体在UIP上肺叶和下肺叶活检样中的量较高(困 2A).在NSIP和RBILD活检样中检測到相似量的CCL19转录物，在正常边缘 活检样中见到的量最低.但是，在IIP和正常边缘活检样中没有看到CCL21 (图 2B)和CXCL12 (困2C)转录物表达的明确模式.
IIP和正常边缘SLBs中的CCR7、 CXCR4、 CCX19、 CCL21和CXCL12转 录物表达的定量实时PCR分析，对四个病人组的上肺叶和下肺叶活检样的 Taqman实时PCR分析揭示，与正常边缘肺瘤病人组(n-5 )的适当活检样相比， UlP病人组(n-18)上肺叶和下肺叶SLBs中CCR7的转录物表达均明显增加(困 3A ).与正常边缘病人组的适当肺叶相比，UIP上肺叶和下肺叶SLBs中平均CCR7 转录物值(transcript values)分別大约高146倍(SEM， 58)和675倍(SEM， 300).相比于UIP上肺叶活检样，UIP下肺叶活检样中检测到的CCR7转录物 表达大约高5倍.与正常边缘SLBs相比，NSIP上肺叶和下肺叶SLBs中平均CCR7 转录物值均增加4倍(SEM， 1).相对于正常边缘SLBs，在RBILDSLBs中也 提高了平均CCR7转录物值上肺叶SLBs中增加36倍(SEM, 28)，下肺叶活 检样中增加4.4倍(SEM， 3.2). NSIP和RBILD的SLBs中CCR7转录物表达 相对于正常边缘SLBs的增加不显著.
这些发现是CCR7所特有的，罔为对CXCR4的Taqman PCR分析发现，IIP SLBs中的CXCR4转录物表达相对于正常边缘SLBs没有显著增加(数据未显示). 最后，在所检查的IIP和正常边缘肿瘤病人组中间，CCL19(数据未显示)、CCL21 (困3B)和CXCL12 (数据未显示)转录物表达未表现出或被检测到清楚的模式 或显著的差异.但是发现，相对于正常边缘肿瘤病人组，UIP病人组的上肺叶和 下肺叶活检样中CCL21转录物表达的増加最大(比正常边缘SLB值高40倍以 上)，与NSIP的SLBs相比，RBILD上肺叶和下肺叶SLBs中的CCL21转录物 表达有较大增加.这些数据合起来表明CCR7转录物表达在DIP中大量增加， CCR7转录物表达的增加存在于稍轻度的HP.
IIP和正常边缘SLBs中CCL19、 CCL21和CXCL12蛋白的ELISA分析， 图4显示了得自SLBs匀浆的不含细胞的上清液中CCL19 (图4A ) 、 CCL21 (困 4B)和CXCL12 (困4C)蛋白的浓度，未发现CCL表达的明确棋式，所分析的 各组病人之间未检測到显著的差异，罔此，这些数据表明IIP的纤维化病变与肺中增加产生CCR7和CXCR4配体无关.
IIP SLBs中的灶性间质性的(focal interskial) CCR7蛋白表达，SuperArray 和实时PCR转录物分析显示，CCR7在IIP SLBs中的表达比在正常边缘SLBs 中的表达高得多，因此，对IIP和正常边缘SLBs的全肺切片进行免疫组化分析 以证实这些观測结果.如困5所示，在UIP、 NSIP和RBILD病人组的SLBs中 见到灶性间质性的CCR7表达，虽然在RBILD病人的巨噬细胞中看见CCR7表 达(困5F)，灶性间质性模式的CCR7表达并不唯一地与UIP (图5B )和NSIP (困5D)活检样中的免疫细胞相关.在UIP病人组(n-10)的所有上肺叶和下 肺叶SLBs的间质区域中存在着多个CCR7蛋白灶性表达区域.注意到，CCR7 表达的细胞灶并不唯一地包含成纤維细胞，其它细胞(包括单核细胞和上皮细胞) 似乎也表达这种趋化因子受体.相比于更严重的亚型UIP， NSIP和RBILD亚 型表达的CCR7均更少.虽然这些活检样中的50。/o呈现CCR7染色，NSIP病人 组(n-6)上肺叶和下肺叶SLBs中所见到的表达CCR7的细胞灶区域要少得多. 在四分之三的RBILD (n=5) SLBs中，CCR7常常局限于血管和单核细胞，但是 在该IIP组的活检样的间质区域中很少观察到CCR7染色，与UIP SLBs中见到 的明显染色相反，对正常边缘病人组(n-5)的上肺叶和下肺叶SLBs进行的免疫 组化分析中，没有发现CCR7表达(图5H ).
用于CCR7测定的相同IIP和正常边缘SLBs中，CXCR4染色看来局限于免 疫细胞，更为重要的是，这一趋化罔子受体的表达不是灶性的，在被试验的4组 病人之间没有差异.所測定的所有HP和正常边缘活检样显示与单核细胞相关的 CXCR4高度表达，这在闺6中体现，困6显示了 UIP(困6B) 、 NSIP (困6D)、 RBILD (图6F)和正常边缘(图5D) SLBs中的代表性CXCR4染色，因此，免 疫組化调查揭示了与CXCR4不同，CCR7主要在IIPSLBs中表达，但并不在正 常边缘SLBs中表达，并且CCR7的表达似乎定位于IIP中的灶性间质区。
为了阐述构成IIP SLBs中CCR7阳性区域的细胞的身份，对连续切片进行针 对CD45和CCR7表达的另外染色试验(图7),在检查UIP SLBs时，发现CCR7 的免疫组化表达(图7B)与CD45(困7C)的部分重叠.同时表达CCR7和CD45 的细胞看起来是单核细胞，相反，虽然CCR7在NSIP活检样中高度表达(困7E )， 这种趋化因子受体的免疫定位与CD45不一致.对RBILD SLBs的类似免疫组化 研究揭示同样缺乏CCR7与CD45的共定位(未显示).因此，单核细胞上的CD45与CCR7的双重表达存在于UIP中，但并不存在于非其他形式的IIP.如上所述， CD34是造血干细胞抗原，其已经在外周血纤维细胞上得到鉴定(Abe et al.， J. Immunol., 166:7556-7562 (2001)).发明者接下来检查了能否在IIP和正常边缘活 检样的组织学切片中鉴定这种标记物(困8).令人感兴趣的是，在UIP活检样 (困8B)中CD34表达很少，并且当该抗原被检测到时，其主要定位于活检样的 间质区域.发现CD34在NSIP活检样中表达最高，其中这种标记物在间质区域 中的单核细胞上高度表达(困8D).在RBILD (固8F)和正常边缘(困8H) SLBs的间质区域中也检测到强的CD34表达.对CD34和CCR7共定位的进一步 检查没有揭示在HP或正常边缘SLBs中显示这些蛋白质的双重表达(未显示) 的区域.因此，CD34突出表达于较不严重的IIP形式以及正常边缘的SLBs中.
1型胶原主要由纤维细胞表达，这些细胞在组织损伤位点聚集并产生胶原 (Abe etal" J. Immunol., 166:7556-7562 (2001)).困9总结了 l型胶原蛋白在IIP 和正常边缘SLBs中表达的免疫组化分析.在UIP (困9B) 、 NSIP (困9D)、 RBILD (图9F)和正常边缘(图9H)肿瘤病人活检样中，1型胶原免疫定位于 的间质区域.l型胶原的最高表达见于UIP SLBs,但是在正常边缘SLBs中也可 发现1型胶原蛋白的高度表达.为了确定1型胶原和CCR7是否在IIP活检样中 共定位，还对连续切片进行染色，以测定这两种蛋白质的表达(困10).虽然l 型胶原在所有UIP SLBs (困10B )中高度表达，但是CCR7在1型胶原高度表达 的区域(图IOC)没有表达.类似的情况见于NSIP (未显示)和RBILD (困IOE， F) SLBs,其中1型胶原(图10E)与CCR7表达(图10F)看来并未呈现共定 位.罔此，IIP SLBs中的CCR7阳性区域并不也是1型胶原的阳性区域.
IIP SLBs中的CCR7阳性区域没有aSMA表达，困ll显示了肺组织切片中 CCR7和aSMA的代表性免疫组化染色，所迷切片得自诊断患有UIP(困IIA-C)、 NSIP (困11D-F)和RBILD (困11G-I)的病人.如上所述，全部三组病人中， 在肺间质区发现表达CCR7(困IIB,E，H)的细胞灶.但是，在连续切片中CCR7 阳性区与aSMA阳性区没有重叠(困IIC，F，I).
本研究的总体目的是调查CCR7、 CXCR4、 CCL19、 CCL21和CXCL12在 IIP和正常边缘肿瘤病人组的肺活检样本中的表达模式，定量转录物分析和定性 蛋白质分析表明，相对于正常边缘SLBs, CCR7 (但非CXCR4)在UIP中的表 达显著增加，UIP SLBs以及NSIP SLBs (程度较小)显示强表达CCR7蛋白的
灶性间质区域(focal interstitial aeras)，但其不同时对CD34、 1型胶原或aSMA 呈阳性，在所有UIP SLBs以及较少部分的NSIP和RBILD活检样中见到CCR7 蛋白的灶性表达(focal expressio) 在UIP SLBs中，CCR7蛋白在间质中的灶 性表达看来包括一些CD45阳性细胞(Salhisto et al.， Eur. J. Immunol" 28:2760-2769 (1998)),但是在NSIP和RBILD病人的活检样中，绝大部分CCR7 阳性细胞不表达CD45，并且CCR7与CD45的表达不重叠.虽然CCR7在UIP
al.， Mol. Med.， 1:71-81 (1994))，但是没有证据表明这些活检样中的CCR7活性 区域也对纤维细胞标记物(如CD34和1型胶原)呈现阳性.另外，这些CCR7 阳性细胞缺乏成肌纤维细胞标记物aSMA.这些数据引发一种思考，即CCR7蛋 白的灶性表达可指示特发性损伤的位点，以及固有成纤维细胞的不当活化，而不 表示表达CCR7的纤维细胞的补充.虽然它们在人类疾病中的作用尚待确定，也 没有鉴定出纤维细胞的特异性细胞表面标记物，但是几种实验性纤维化模型指出 了来源于骨號的循环细胞在皮肤(Fathke et al.， Stem CeHs, 22:812-822 (2004))及 肺(Hashimoto et al.， J. Clin. Invest" 113:243-252 (2004); Phillips et al.， J. Clin. Invest" 114:438-446 (2004); Epper，y et al" Am. J. Respir. Cell Mol. Biol" 29:213-224 (2003); Schmidt et a，.， J. Immunol" 171:380-389 (2003))纤维化病变中 的作用.这些实验性研究中大部分使用骨號嵌合体模型，其通过将转基罔表达嵌 合绿色荧光蛋白的鼠骨髄过继转移入受放射的小鼠而建立.来源于绿色荧光蛋白 阳性骨鍵的细胞在形态上表现为巨噬细胞状(Epperly et al.， Am. J. Respir. Cell Mol" Biol" 29:213-224 (2003))和/或成纤维细胞状(Hashimoto et al.， J. CHn. Invest" 113:243-252 (2004); Phillips et al., J, Clin. Invest" 114:438-446 (2004)), 其被显示为组织纤维化的主要贡献罔素.另外，这些来源于骨拔的细胞对锰超氣 化物歧化醉敏感(Epperly et al.， Am. J. Respir. Cell Mol. Bio，., 29:213-224(2003)),表达1型胶原(Hashimoto et ah, J. Clin. Invest" 113:243-252 (2004); Phillips et a，" J. Clin. Invest" 114:438-446 (2004); Schmidt et al.， J. Immunol" 171:380-389 (2003)) 、 CD34 ( Schmidt et al" J, Immunol" 171:380-389 (2003)) 、 CD45 ( Phillips et al. J, Clin. Invest" 144:438-446 (2004))、端粒酶逆 转录醉(Hashimoto et a，" J. C，in, Invest" 113:243- 252 (2004) )、CCR7( Hashimoto et al" J. Clin. Invest" 113:243-252 (2004))和CXCR4 ( Hashimoio et al" J. Clin. Invest., 113:243-252 (2004); PhH,ips et al" J. Clin. Invest" 144:438-446 (2004)) 然而，关于纤维细胞一旦定位于肺中，它们最终是否分化为成肌纤维细胞仍 有争议.目前的假设是，在啄露于过敏源后补充进入支气管组织(Schmidt etal., J. Immunol" 171:380-389 (2003))或皮肤受损部位(Abe et al" J. Immunol" 166:7556-7562 (2001))的纤维细胞分化为成肌纤维细胞，但是在博来霉素引起的 特发性纤维化期间移向肺的纤维细胞不表达aSMA,且不会被诱导表达这种成肌 纤维细胞标记物(Hashimoto et al， J. CHn. Invest" 113:243-252 (2004)),关于这 些细胞的另外争论是这样一个观察结果，即在组织修复过程中并非所有来源于骨 鍵的细胞都有害.罔此，Ortiz和他的同亊们(Ortiz et al.， Proc. Na", Acad. Sci. USA, 100:8407-8411 (2003))展示了鼠间质干细胞向受损的肺迁移，呈现上皮样 表型，减少受博来審素攻击的小鼠体内的炎症和胶原沉积.很明显，需要进行进 一步研究来阐明来源于骨拔的细胞在临床纤维化反应中的作用，
HP病人的SLBs中CCR7和CXCR4进行检测的动力来自这样的在先研究， 其表明COL21 (CCR7趋化因子受体的配体)在体外和体内是纤维细胞趋化性的 有效剌激物(Abe et al.， J. Immunol" 166:7556-7562 (2001));来源于CXCR4阳 性骨號的细胞有助于实验性诱发纤維化(Hashimoto et al., J. Clin. Invest., 113:243-252 (2004); Phillips et a " J. Clin. Invest" 114:438-446 (2004)) 假定纤 维细胞能够通过依赖于CCR7、CXCR4或者可能其它的趋化罔子受体的趋化活动 迅速进入组织损伤位点，并在肺纤维化的发病机理中发挥作用(Phillips et al.， J. Clin. Invest., 114:438-446 (2004)).在本研究中，检查表达CCR7的病灶区是否 存在假定的纤维细胞标记物，包括CD45、CD34和1型胶原(Abe et a，， J. Immunol., 166:7556-7562 (2001); Hartlapp et al.， FASEB J.， 15:2215-2224 (2001)) . CD45 是存在于表达CCR7的病灶区的唯一标记物，CD45和CCR7的共定位仅见于UIP 内存在的单核细胞中，在其它IIP活检样中没有看到，另外，所有这些标记物均 在正常边缘SLBs中检测到，但是免疫组化技术在这些活检样中没有检测到 CCR7,虽然这些发现没有排除在病人活检样中看到的CCR阳性细胞为纤维细胞 的可能性，但是有可能当纤维细胞从循环系统迁移入肺时，这些标记物的表达被 快速降调节.
CXCR4不存在于IIP SLBs的病灶区的观察也不排除这种趋化罔子受体对于 向肺补充纤维细胞和/或制备骨拔来源细胞的胶原的重要性.在所有分析的SLBs
中看到了弥散模式(difuse pattern)的CXCR4表达，表达这种趋化因子受体的
鉴于UIP成纤維细胞的异常合成和增殖特性(组织学上突出表现为明显的成 纤维细胞灶)(King et al" Am. J. Respir. Crit. Care Med" 164:1025-1032 (2001))， 发明者假设这些细胞还可以对通常调控免疫细胞功能的趋化因子配体产生不当反 应.组织固有的成纤维细胞包含肺结构的主要成分，许多研究者提出这些细胞的 不当活化是UIP (可能还有其它类型的IIP)中见到的病理性纤维化反应的基础 (Suganuma et al" Thorax, 50:984-989 (1995》Hogaboarn et al" Proc. Assoc, Am. Physicians, 110:313-320 (1998); Ramos et al" Am. J. Respir. Cell Mol. BioL， 24:591-598 (2001); Selman et al" Respir. Res.， 3:3 (2002)),引起这种不当活化的 因素还有待阐明，但是几家实验室的数据表明趋化因子可能在这一过程中发挥作 用(van den Blink et al" Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz)， 48:539-545 (2000); Selman， Am. J. Respir. CHt. Care Med" 168:730-731 (2003)),例如，现在普遍 认为来自纤维化肺的UIP成纤维细胞的迁移快于来自对照肺的那些细胞 (Suganuma et al.， Thorax, 50:984-989 (1995))，小鼠试验存在一些有关趋化因 子在这方面起主要作用的提示(Moore et aL， J. Immunol., 167:4368-4377 (2001)).
对CCR7和CXCR4在IIP中的细胞异常迁移活动中起作用的可能性进行检 验的另 一个动力来自肿瘤生物学领域的最新发现，已文献记栽了乳腺癌细胞上独 特的一套趋化罔子受体的表达，这部分解释了乳腺癌的转移特性(Muller et al.， Nature, 410:50-56 (2001)).
因此，本研究说明了 CCR7在IIP中的灶性间质性表达.表达这种受体的细 胞的身份有待进行全面阐明，但是含有CCR7灶性表达的区域对CD34和1型胶 原不呈阳性，IIP活检样的间质区域中表达CCR7的细胞不表达aSMA，因此排 除了这些细胞是成肌纤维细胞的可能性.
在以下实施例3中，提供了数据以显示IIP成纤维细胞(但不是正常边缘成 纤维细胞)的合成和增殖特征受外源性CCL19和CCL21的不同影响.这些研究 具有潜在的治疗价值，如果有可能抑制纤维细胞的迁移和/或固有肺成纤维细胞响 应CCR7特异性趋化罔子的活化，则可防止细胞外基质的过度生成，以利于适当 的肺修复.
实施例3:靶向(targeting) CCL19或CCL21用于治疗慢性纤维化疾病本实施例具体说明了在肺的慢性纤维化过程中靶向CCL19和/或CCLM的新 颖潜在方法，已知的特发性慢性肺纤维化具有非常大的临床挑战性，各种治疗选 择显示出效力有限或有毒性(Flaherty et al" Am. J. Med" 110:278-282 (2001); (Hampton et al.， Am. J. Respir. Crit. Care Med" 149:A878 (1994)),诊断后的中 位存活率几乎没有变化(Ryu et al" Mayo Clin. Proc.， 73:1085-1101 (1998); Lasky et al" Environ. Health Perspect" 108 Suppl 4:751-762 (2000)) 已知的促纤维化 刺激罔素包括放射、吸入的矿物质及有机粒子、气态氣化刑、药物和感染性微生 物，然而对于引发特发性间质性肺炎(IIP)的临床病理实体的致病因素的确认一 直存在着争议.HP是一组多种形式的疾病，与远端肺实质有关，其有许多共同 的特征，但是很难为命名为单独的疾病(Travis et al.， Am. J. Surg. Path., 24:19-33 (2000)).它们的发病机理仍不清楚，但集中认为是与肺部受到创伤(或多重损 伤)后试困治愈该创伤有关.成纤维细胞灶是活跃增殖的成纤维细胞的小聚集体， 被认为是创伤的优先细胞灶(prior foci)的组织化，显示纤维化处于活动和进行 状态.现在的假设是，人成纤维细胞对CCL19和CCL21的响应(由于它们对 CCR7的升调节)引起这些细胞的不当活化，从而导致IIP中所见的极度纤维化 反应，
令人感兴趣的是，纤维化病人肺中的细胞罔子环境可能有利于CCL19和 CCL21的异常反应，罔为已经有其他研究者文献记栽了 TNF-a蛋白水平的升高 (Ziegenhagen et al" J, Investig, Med.， 46:223-231 (1998》Kapanci et al" Am, J. Respir. Crit. Care Med" 152:2163-2169 (1995))和IL-10的降低(Martinez et al.， Am. J. Physiol., 273:L676-683 (1997)),这两种细胞因子均调控与这些配体结合 的受体.来自严重肺纤维化病人的成纤維细胞明显对CCL19和CCL21有反应，
发明者已致力于研究在将人成纤维细胞系经静脉引入免疫缺陷小鼠后是否有 可能引起肺纤维化.利用这一模型，发明者检验了静脉内注射的人成纤维细胞能 否在无炎症反应能力的体内系统中引发纤维化反应，
数据还显示，在肺纤维化起始时期或其发展之后可对该模型实施靶向CCR7 或其配体的效力试验.看起来C.B-17-bg SCID小鼠对于人成纤维细胞的过继转移 研究是理想的，罔为C.B-17-bg小鼠缺乏T细胞和B细胞(与C.B-17和ICR SCIDs 相似)并且带有米色(beige)突变，这种突变可引起细胞毒性T细胞、巨噬细胞
和NK细胞功能的损伤.
将生长自人纤维化活检样的成纤维细胞经静脉引入C.B-17-bg，基于Masson 三色染色，看到组织学表现和明显的肺纤维化.
在其他研究中，在注射成纤维细胞后第35天，使用羟脯氨酸測定法对SCID 小鼠的肺组织进行检验，发现与接受正常的人成纤维细胞的小鼠相比，接受生长 自人纤维化活检样的成纤维细胞的小鼠的肺部样本中羟脯氛酸的水平显著升高. 因此，来自人源化SCID模型的数据表明，通过人IIP成纤维细胞有可能"转移" 纤维化疾病，这种人源化SCID模型应允许对在维持肺纤维化中起作用的闳素进 行检查，
人体研究显示，与患有其他类型的非纤維化疾病的那些人相比，患有各种慢 性肺纤维化的病人的外科肺活检样中CCL21转录物(图12)和蛋白质(图13) 表达显著增加.数据表明，得自具有肺纤维化迹象的病人(但非得自无异常纤维 化迹象的病人)的肺成纤维细胞对外源性CCL19或CCL21表现迁移反应(困14) 和增殖(困15)反应.CCL19和CCL21引起肺成纤维细胞迁移(困14)的发现 令人兴奋，因为这一反应在增殖性成纤维细胞灶(UIP的主要组织病理学特征之 一)的发展中起作用.
最后，使用以间质性纤维化和成纤維细胞灶为特征的纤维化鼠SCID模型证 实了把向CCL21在肺纤维化的起始中的作用已经通过加以
实施例4:靶向CCL21或CCR7有效消除通过在免疫缺陷小鼠中过继转移人 肺成纤维细胞而引起的肺纤维化
如上所讨论的，CC趋化因子受体7 (CCR7)在HP活检样本和原代成纤维 细胞系中表达。在本实施例中提供了用肺纤维化模型研究CCR7的体内作用的细 节.简而言之，将1.0 x 106个生长自特发性肺纤维化/普通型间质性肺炎(IPF/UIP) 活检样、非特异性间质性肺炎(NSIP)活检样或组织学上正常的活检样的原代成 纤维细胞静脉注射入C.B.-17 SCID/米色(bg)小鼠.在注射IPF/UIP成纤维细胞后 第35天和第63天，免疫缺陷小鼠的肺中出现补丁型间质性纤维化(patchy interstitial fibrosis)和羟脯氨酸含量升高.在所述两时间处，过继转移的NSIP 成纤维细胞均引起更弥散的间质性纤维化并提高羟脯氨酸水平，但是注入的正常 人的成纤维细胞不在C.B.-17 SCID/bg小鼠中引起问质重塑变化，人CCR7或 CCL21及其配体的全身治疗性免疫中和可显著緩解接受任一种IIP成纤維细胞的C.B.-17SCID/bg小鼠的肺纤维化.因此，本研究表明，经静脉向免疫缺陷小鼠注 入原代人成纤维细胞系引发肺纤维化，且这种纤维化反应取决于CCL21和CCR7 之间的相互作用.
肺纤维化小鼠模型已经提供了的实验性范例，用于研究呼吸系统中异常组织 的重塑和结疤(Gharee-Kermani et al" Meths. Mol. Med" 2005， 117:251-259) 已采用许多途径来诱发肺纤维化，其包括转基因和基闳转移、放射、无机剌激物 (例如二氧化硅)以及促进氣化刑引起的炎性损伤的药物(例如博来審素)(Chua et al.， Am. J. Resp. Cell Mol. Bio，.， 2005， 33:9-13 ).在这些模型中，博来審素模 型的应用最为广泛，因为其具良好的再现性以及与人肺纤维化的病理学相似性 (Chua et al" Am. J. Resp. Cell Mol. Biol" 2005， 33:9-13 ),因此，博来審素模型 已被用于评价许多在IPF/UIP中感兴趣的靶标(Kaminski et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 200, 97:1778-1783; Pardo et al.， PLoS Med 2005， 2e251 ).
不幸的是，尚不存在完全重现IPF/IJIP的临床病理学特征的动物模型，关于 正在进行中的炎性损伤(用于诱导实验性纤维化的主要模式)对于末期UIP的相 对重要性仍然存在争议(Gauldie， Am. J. Resp. Crit. Care Med. 2002， 165:1205-1206; Sorter Am. J. Resp. Crit. Care Med. 2002， 165:1207-1208 ),
本实验通过使用另一种诱导实验性肺纤维化的策略来解决这个领域内问趙. 由于重度联合免疫缺损基因突变(scid)或重组嗥激活基因1 (rag-1)敲除，基 因免疫缺陷小鼠已经被广泛用作过继转移正常或患病的人细胞的宿主.本实施例 中显示，经静脉(i.v.)将IPF/UIP或非特异性间质性肺炎(NSIP;另一种较不 严重的HP)而非正常的成纤维细胞过继转移入具有scid-米色(C.B-17SCID/bg) 突变的C.B-17小鼠，引发并维持肺纤维化.在注入成纤维细胞后笫35天，两个 IIP成纤维细胞组的C.B-17SClD/bg小鼠均首次表现出纤维化的組织学和生物化 学迹象，在第63天达到显著.看起来细胞因子和趋化因子在IIP的发病机理中都 发挥主要作用，对接受IPF/UIP或NSIP成纤维细胞的C.B-17SCID/bg小鼠全肺 样本的ELISA分析表明，与较早时间点所测定的全肺水平或未接受成纤维细胞的 小鼠肺组织中测定的全肺水平相比，鼠的IL-13、 CCL6和CCL21水平在第63 天显著升高.
IL-13和CCL6是肺纤維化的介质，但是CCL21在肺重塑亊件(events)中 的作用尚不知晓.对CCL21和CCR7在由人IIP成纤维细胞引起(precipitated) 的肺重塑事件中的作用进行检验的动力来自以上报道的发现，即在IIP活检样中
提高了 CCR7表达，以及CCL21显著增强HP成纤维细胞的迁移、合成及增殖 性质(EMP和CMH，未发表的发现).在单独的免疫中和研究中，在将IIP成 纤维细胞注射入C.B-17SClD/bg小鼠后笫35天至63天，对人CCL21或CCR7
(CCL21的受体)进行靶向，相比于接受IIP成纤维细胞和IgG的C.B^17SCID/bg 小鼠组，显著降低了肺纤维化的所有参数.这些数据合起来强调了通过对 C.B-17SCID/bg小鼠静脉注入IIP成纤維细胞引发并維持肺纤维化的新的鼠棋型 的创造性，并证明了在此模型中，CCL21和CCR7在维持纤维化中的新颖作用.
小鼠雌性，lCR-scid( ICRSCID)、 C.B-17-scid( C.B-17SCID )和C.B-17-scid-米色(C.B-17SCID/bg )小鼠(6-8周龄)，购自Taconic Farms( Germantown， NY), 所有SCID小鼠被安置在密执安大学医学院(University of Michigan Medial School)的悉生屏陣(gnotobiotic barrier facility )设施内.开始两组小鼠有重度 联合免疫缺损(scid)突变，由于V(D)J重组缺陷导致同时缺乏T淋巴细胞和B 淋巴细胞，而C.B-17SCID/bg小鼠有两种突变第一种是scid突变，第二种是米 色突变，主要引起细胞毒性T细胞和巨噬细胞功能的缺陷以及NK细胞功能的选 择性损伤.所有小鼠随意采食高压灭菌水和小鼠顆粒钩料.下面所迷的所有步錄 均在无菌的层流环境中进行，并得到密执安大学医学院的动物护理与使用委员会
(animal care and use committee)批准，
人成纤维细胞培养从机械解离的IPF/UIP和NSIP外科肺活检样获得混合 的细胞群，按先前在其它文献(Jakubzick et al.， Am. J. Pathol., 2004 164:1989-2001)所述的详细方法得到纯净的人成纤維细胞培养物，用同样的方法
究中，在本文所描述的起始、模型表征以及治疗发明研究的第四传代(passage) 之后，总共使用10个IPF/UIP成纤維细胞系，6个NS1P成纤維细胞系和4个正 常的成纤维细胞系.
将人肺成纤维细胞静脉引入SCID小鼠对150 cn^烧瓶中的组织培养物进 行胰酶消化，得到IPF/UIP、 NSIP和正常成纤维细胞的单细胞制刑，按生产商 (Sigma Co.， St. Louis, MO)的说明用PKH26染料标记.将每种标记的成纤维细 胞系稀释至1 x 1os细胞/m，PBS，取lml这种悬浮液，经尾静脉注射入每组5只 的SCID小鼠.其它每组5只SCID小鼠只静脉注射PKH26和PBS标记溶液(即
为对照组).静脉注射人肺成纤维细胞后第7天、21天、35天、49天和63天用 过量麻醉剂对小鼠施行安乐死，并在这些时间切除全肺组织，用于分子分析、组 织学分析、生物化学分析和/或蛋白质组学分析(见下文).
人肺成纤维细胞过继转移后，评价C.B-17SCID/bg小鼠中CCL21和CCR7 的作用为了说明静脉过继转移人成纤维细胞后，CCL21及其受体CCR7在肺重 塑反应中的作用，各C.B-17SCID/bg小鼠组接受IPF/UIP ( n-35只小鼠)、NSIP (n-20只小鼠)、正常成纤维细胞(n=15只小鼠)或单独的栽体(即PBS) ( n=15 只小鼠).35天后，所有C.B-17SCID/bg小鼠组(5只/组)从笫35天至笫63 天每隔一天接受鼠IgG或鼠抗人CCL21单克隆抗体或鼠抗人CCR7单克隆抗体 (全部为10pg/ml， R&D Systems, Minneapolis, MN)，在笫63天，所有动物 用过量麻醉剂施行安乐死，并切除全肺组织，用于分子分析、组织学分析、生物 化学分析和蛋白质组学分析(见下文)
分子分析如先前(Jak由ick et al" J. Immunol. 2003， 171:2684- 2693)所 详细描述的，从全肺样品中分离总RNA,并生成cDNA.根据生产商(SuperArray， Inc.， Bethesda， MD )的说明书，用非放射性GEArray基因分析膜分析合并样 (n-5)中人及鼠趋化因子和趋化因子受体的基因概况变化，并如先前(Jakubzick etal.， Am. J. Pathol.， 162:1475-1486(2003))详细描述的，测定信号强度.如先前 所述(Jakubzick et al.， J. Immunol. 2003, 171:2684-2693 )，通过实时定量RT-PCR 程序，使用7500实时PCR系统(Applied Biosystems， Foster City, CA )对各个 全肺cDNA样品(n>5)分析人CCR7、 1型胶原、组织蛋白酶E、基质金属蛋 白酶(MMP)-2、 MMP-9、 MMP-19、纤维粘连蛋白、金属蛋白酶的组织抑制刑 (TIMP) -1和GAPDH的表达.
组织学分析用麻醉剂施行安乐死之后，切取每只小鼠的右肺叶，用10%福 尔马林溶液完全充胀，在新鲜福尔马林中放置24小时，利用标准的组织学技术， 用石蜡包埋每个肺叶，制作5nm切片，用H&E和Mason三色染色，进行組织 学分析.借助荧光显微镜对其它的未染色的全肺组织切片进行分析，
生化分析使整个左肺样品在lxPBS中匀浆，并离心沉淀，取不含细胞的 上清液进行ELISA分析，真空干燥沉淀，并重悬浮于0.5M冰醋酸中.然后按先 前所述的方法(Zhang et al.， J. Immunol. 1994， 153:4733-4741 )对組织进行羟脯 氨酸浓度測定.
蛋白质组学分析从全肺样品匀浆中取50 pl不含细胞的上清液，用标准的 夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)技术(R&D Systems, Miimeapolis， MN)分析 鼠IL-13、 CCL6、 CCL21、 IFN个IL>12、 IL-4、 CCL2、 CCL7、 CCL17、 CCL3、 CXCL13、 TNF-a、 CXCLIO、 CXCL9和CXCL2蛋白，所述分析方法如先前所 详述的(JakubzicketaL， 3. Immunol. 2003， 171:2684-2693),
统计学分析所有结果用平均值土SEM表示.用单因素方差(one-way ANOVA )分析和Tukey-Kramer或Dunnett，s多重比较试验来确定UIP、 NSIP、 正常和对照组SC1D小鼠之间的统计学差异.显著性设定为p<0.05.
静脉过继转移IPF/UIP或NSIP(但非正常)肺成纤维细胞引起C.B-17SCID/bg 小鼠的肺组织病理学和重塑.起初进行研究，以评价过继转移的正常成纤维细胞 和IIP成纤维细胞对各种品系的SCID小鼠肺部结构的影响，包括ICRSCID、 C.B-17SCID和C.B-17SCID/bg (每个时间点n=5).使用3个IPF/UIP成纤维细 胞系和2个正常人成纤维细胞系开展这些最初的研究.用PKH2G标记所有的人 成纤维细胞系，然后注射入各SCID小鼠组，这样可以在组织切片中检测标记的 细胞.注射后笫7天和21天，对每个SCID组肺血管中的人成纤维细胞进行检測. 但是，21天后这一标记物的强度减弱(来源于Sigma提供的信息表)，因此，在 注射成纤维细胞后第35天我们未能在各组织切片中检测到PKH16荧光(未显 示).其它器官(即肝脏、脾脏和肾脏)可能含有人肺成纤維细胞，但是我们在 这些器官中未观察到肉眼可见的变化.由于IIP是一种肺特异性疾病，不在任何 其它器官中表现纤维化，在本研究中未对其它器官进行详细的组织学分析，
在后面的时间点对各组SCID小鼠的全肺切片进行检测，结果表明标记的肺 重塑只存在于C.B-17SClD/bg小鼠中.特别是，在将IPF/UIP成纤维细胞注入 ICRSCID小鼠(n-5只小鼠，未显示)后笫49天未见纤维增生.同样地，将IPF/UIP
细胞后第7天(n-5只小鼠)、21天(n-10只小鼠)、35天(n-5只小鼠)或
假设C，B-17SCID/bg组中存在标记的肺组织病理迹象，下面所述的后续研究 涉及正常成纤维细胞和HP成纤维细胞过继转移入C.B-17SCID/bg小鼠.在模型 表征研究中，将4个1PF/U1P成纤维细胞系、4个NSIP成纤维细胞系和1个正 常成纤维细胞系过继转移入各别的C.B-17SCID/bg小鼠组，在转移成纤维细胞后
C.B-17SCID小鼠，未能在静脉注射IPF/UIP成纤维第35天和63天进行肺组织病理学、基因组学和蛋白质组学变化分析.
接受正常肺成纤维细胞的C.B-17SCID/bg小鼠中少见或未见肺组织病理学. 但是，静脉注射NSIP或IPF/UIP成纤維细胞系的C.B-17SCID/bg小鼠在其后笫 35天表现明显的肺组织病理学迹象.注入NSIP或IPF/UIP肺成纤维细胞的 C.B-17SCID/bg小鼠的肺组织病理学表征为肺泡腔破裂、纤维增生明显和存在嗜 酸性粒细胞.
过继转移正常的、NS1P或IPF/UIP人肺成纤维细胞后第35天， C.B-17SCID/bg小鼠的肺组织切片的Mason三色染色显示，接受IIP (但非正常 的)成纤维细胞的C.B-17SCID/bg组的重塑区域内存在细胞外基质(淡蓝色染色).
后来对各C.B-17SCID/bg组的组织切片的分析揭示了通过引入IPF/UIP或 NSIP成纤维细胞而引起的肺部重塑的程度和外观的主要差异.63天前接受 IPF/UIP成纤维细胞的CB-17SCID/bg小鼠肺部呈现异质外观，外观相对正常的 肺组织区域与发生严重的间质破裂与重塑的区域相邻.另外，接受IPF/UIP成纤 维细胞的C.B-17SCID/bg小鼠有明显的人成纤维细胞病灶，但是这些病灶是在血 管中检测到的，而不像临床UIP那样在间质区域(Am. J. Resp. Crit. Care Med 2002， 165:277-304) , 63天前接受NSIP成纤维细胞的C.B-17SCID/bg小鼠的全 肺组织切片的组织学格局表征为间质增厚和明显的病灶区，这些小鼠中的重塑看 来涉及大部分肺.这些数据合起来表明将人IIP成纤维细胞引入C.B-17SCID/bg 小鼠可导致这些小鼠中的纤维化损害.
将IIP成纤维细胞引入C.B-17SCID/bg小鼠后，雍脯氨酸水平以时间依赖方 式发生显著变化在涉及肺重塑的实验模型中，羟脯氨酸是胶原从头合成的常用 标记物(Jakubzick et al.， Am. J. Pathol" 2004， 165:1222-1221 ) 在本研究中， 在之后笫35天或63天，对没有接受人肺成纤维细胞、或者接受正常的人肺成纤 维细胞、NSIP或IPF/UIP人肺成纤维细胞的C.B-17SCID/bg小鼠的全肺样品中 的祭脯氨酸水平进行测定.引入正常成纤维细胞后，在这些时间点的羟脯氨酸水 平没有变化.这些C.B-17SCID/bg组的幾脯氨酸水平在第35天和第63天分別为 4.7 ± 0.3 ng/mg蛋白质和5.6 ± 0.5 ng/mg蛋白质，与未接受人成纤维细胞的 C.B-17SCID/bg小组中测到的水平(4.5 ± 1.3 pg/mg蛋白质)相似.但是，与正 常成纤维细胞组相比，在静脉转移NSIP ( 11.4 ± 3.7 pg/mg蛋白质)或IPF/UIF (8.2士2fig/mg蛋白质)成纤维细胞后第35天，小鼠肺部的羟脯氨酸含量更高.
同样，在静脉过继转移后第63天，NSIP和IPF/UIP成纤維细胞组的羟脯氨酸水 平分別进一步提高3倍(M ± 11 fig/mg蛋白质)和2.5倍(22 ± 4 pg/mg蛋白质) 在第63天的时间点，与接受正常成纤维细胞的CB-17SCID/bg组相比，接受NSIP 或IPF/UIP人成纤维细胞的CB-17SCID/bg组中幾脯氨酸水平的提高达到统计显 著.因此，静脉注射人IIP成纤维细胞，在过继转移后第35天提高了幾脯氨酸水 平，在第63天，显著提高羟脯氛酸水平.
全肺细胞因子分析表明，接受HP成纤维细胞的C.B-17SCID/bg小鼠肺中的 鼠1L-13、 CCL6和CCL21水平明显升高在i.v.过继转移人正常或IIP成纤维细 胞后第35天和63天，用EL1SA对全肺分析数种细胞因子、CC配体和CXC配 体趋化因子进行分析，结果表明在鼠1L-13、 CCL6和CCL21发生许多统计显著 的变化.虽然接受正常成纤維细胞的C.B-17SCID/bg组的全肺IL-13水平低于 ELISA检测水平，但是与注射正常成纤维细胞的C.B-17SCID/bg组相比，注射 NSIP或IPF/UIP成纤维细胞的C.B-17SCID/bg组在之后笫35天和/或63天的全 肺IL13水平显著更高.另外，对于接受IPF/UIP成纤维细胞的C.B-17SClD/bg 小鼠，成纤维细胞过继转移后第63天在其肺中检测到的IL-13水平显著高于笫 35天的水平.注射成纤维细胞后笫63天，接受1PF/U1P或NS1P成纤维细胞的 C.B-17SCID/bg组的全肺CCL6水平显著高于接受正常成纤維细胞的 C.B-17SCID/bg组，对于接受IPF/UIP或NSIP成纤维细胞的C.B-17SCID/bg小 鼠，成纤维细胞过继转移后第63天在其肺中检測到的CCL6水平显著高于第35 天的水平.通过将人成纤维细胞引入C.B-17SCID/bg小鼠而发生变化的其他鼠 CC配体只有CCL21.在第63天，这种趋化因子在NSIP和IPF/UIP成纤维细胞 C.B-17SCID/bg组中的水平明显高于正常成纤維细胞C.B-17SCID/bg组，另外， 在成纤维细胞转移后笫63天，IPFAHP成纤维细胞组的全肺鼠CCL21水平明显 高于NSIP成纤维细胞组.最后，对于HP成纤维细胞C.B-r7SCID/bg组，过继 转移后第63天其全肺样品中的CCL21存在水平的的显著高于过继转移后第35 天的水平.因此，综合以上数据可知，在C.B-17SCID/bg小鼠中存在IIP成纤维 细胞(但非正常成纤维细胞)，显著改变了鼠细胞因子以及在肺中具有确定的促 纤维化作用的趋化因子(即IL-13和CCL6)和假定的促纤维化作用(即CCL21 ) 的全肺水平.
35天前接受人肺成纤维细胞的C.B-17SCID/bg小鼠肺中存在人CCR7和
CCL21基因转录物对接受NSIP或IPF/UIP成纤维细胞的C.B-17SCID/bg小鼠 中鼠CCL21的全肺水平变化的兴趣来自在先研究，其说明这些CC配体在肾脏 (Barias et al" 3, ImmunoL， 2002 168:430 1- 4307)和肝脏(Bonacogi et al. Gastroenterology, 2003， 125:1060-1076)中的重要重塑作用.这促使进一步分析 人IIP成纤维细胞引起的肺重塑反应过程中的这种CC配体及其受体CCR7.用 SuperArray基因分析检测CCR7和CCL21的人转录物，在三个C.B-17SCID/bg 组中，CCR7和CCL21的最高转录物表达存在于IPF/UIP成纤维细胞组的肺样本 中.另外，TAQMAN分析证实了 CCR7的存在，并在各C.B-17SCID/bg组中， IPF/UIP组再次显示出最高的CCR7转录物表达，对鼠CCR7和CCL21的 SuperArray和TAQMAN分析也证实了在接受人成纤维细胞的全部三个 C.B-17SClD/bg组中均存在这些转录物产品，且两种转录物的最高水平存在于接 受IPF/UIP成纤维细胞的C.B-17SClD/bg组中.因此，静脉内过继转移正常或IIP 成纤维细胞导致存在CCR7和CCL21的人基罔转录物.
人成纤维细胞过继转移入C.B-17SCID/bg小鼠后，对鼠细胞外基质相关基因 进行定量TAQMAN PCR分析使用定量PCR法分析肺部鼠细胞外基质相关基 罔的变化.63天前接受正常人成纤维细胞、NSIP和IPF/UIP人成纤维细胞的 C.B-17SCID/bg小鼠中存在1型胶原、组织蛋白醉E、 MMP-19和TIMP-1的表 达.更为重要的是，将成纤维细胞攻击的小鼠中这些基因的转录物水平与对照 C.B-17SCID/bg小鼠中的转录物水平进行比较，接受任一类型IIP成纤维细胞的 C.B-17SCID/bg小鼠中1型胶原和组织蛋白酶的转录物表达的增加，以及接受 IPF/UIP成纤维细胞的小鼠中MMP-19和TIMP-1的转录物表达的増加相比于接 受正常人成纤维细胞的C.B-17SClD/bg小鼠中这些基因转录物的增加达到统计显 著.用TAQMAN分析其他细胞外基质基因，并证实存在MMP-2、 MMP-9和 纤维粘连蛋白.各组C.B-17SCID/bg小鼠的这些转录物的水平之间未见显著差异， 但IPF/UIP C.B-17SCID/bg组中观察到MMP-2和纤维粘连蛋白的增加最大，而 MMP-9在该相同C.B-17SClD/bg组中的增加最小.因此，这些数据说明在 C.B-17SCID/bg小鼠中因存在人成纤维细胞而使鼠细胞外基质相关基因的转录物 水平发生变化.
人CCR7或人CCL21免疫中和消除接受人HP成纤维细胞的C.B-17SClD/bg 小鼠的肺重塑在后面的一系列实验中，评价了人CCR7和CCL21在接受人正
常成纤维细胞(n-l个细胞系)或IIP成纤维细胞(n-3个IPF/UIP细胞系，n=2 个NSIP细胞系)的C.B-17SCID/bg小鼠中的作用.虽然測定全肺样本中人CCL21 的尝试没有成功(大概罔为该CC配体的存在水平低于ELISA检测限)，但是先 前的研究已经说明鼠CCL21和人CCL21都能通过人CCR7促进细胞鈣流动 (Jenh et al.， J. Immunol" 1999 ，62:3765-3769 ).另外，已经证明使用多克隆抗 体免疫中和鼠CCL21可消除尘螨诱发的过敏性气道疾病(house dust mite-induced allergic airway disease )的人源化模型中人树突状细胞的迁移和人T 细胞的启动(Hammad et al. J. Immunol. 2002, 169:1524-1534) 基于报道的鼠 CCL21和人CCL21的交叉反应性，实施这样的治疗方案其中在过继转移成纤 维细胞后第35-63天，施用单克隆抗体对人CCL21或人CCR7进行靶向治疗.在 第63天，对采用试验的三种治疗方式的三个C.B-17SCID/bg组进行全肺组织学 调查，结果表明，正常成纤维细胞C.B-17SCID/bg组中，任何治疗组(IgG治疗、 抗CCL21抗体治疗、抗CCR7抗体治疗)均未见间质性肺重塑迹象.但是这些 C.B-17SCID/bg组中，出现组织学明显的正常成纤维细胞的血管积累.没有一种 治疗能改变接受正常成纤维细胞的C.B-17SCID/bg小鼠的这一特征.接受IgG的 NSIP成纤维细胞C.B-17SCID/bg组中间质重塑明显，但是通过在过继转移后第 35-63天施用抗CCL21抗体或抗CCR7抗体可消除这种重塑反应.同样，接受 IPF/UIP成纤维细胞的IgG C.B-17SCID/bg组出现明显间质重塑，在过继转移 IPF/UIP成纤维细胞后笫35-63天施用抗CCL21抗体或抗CCR7抗体的 C.B-17SCID/bg组小鼠中则消失了 .罔此，CCL21或CCR7靶向治疗(therapeutic targeting)可消除接受IIP成纤维细胞的C.B-17SCID/bg小鼠的间质重塑的组织 学迹象.
接受人正常成纤维细胞或HP成纤维细胞的C.B-17SCID/bg小鼠进行人 CCL21或CCR7靶向治疗后，对鼠细胞外基质相关基因进行定量TAQMAN PCR 分析对抗体治疗组的定量TAQMAN分析也证明抗CCL21和抗CCR7治疗可 明显改变MMP-2和MMP-19的转录物水平.将抗体治疗的对照C.B-17SClD/bg 小鼠中这些MMPs的转录物水平与抗体治疗的成纤维细胞攻击的C.B-17SCID/bg 小鼠中的这些转录物水平进行比较.与接受IgG的C.B-17SCID/bg组中的转录物 水平的倍数増加相比，抗CCL21抗体治疗显著降低了接受正常成纤维细胞的 C.B-17SCID/bg组中MMP-2转录物水平的倍数增加.与适当的IgG组相比，抗
CCR7抗体治疗显著降低了 MMP-2转录物水平的倍数增加.对MMP-19的定量 TAQMAN分析表明，抗CCR-7显著增加了接受正常成纤维细胞的 C.B-17SCID/bg组中的倍数变化，但是与适当的IgG组相比，两种抗体治疗都显 著增加这种转录物的倍数变化.因此，对抗体治疗显著改变了用人成纤维细胞攻 击的C.B-17SCID/bg小鼠的细胞外基质相关基因的转录物表达.
人CCR7或CCL21的免疫中和显著降低接受人IIP成纤维细胞的 C.B-17SCID/bg小鼠的全肺幾脯氨酸水平对来自IgG治疗、抗CCL21治疗或 CCR7治疗的对照CB-17SCID/bg小鼠(即未接受人成纤維细胞的小鼠)以及接 受正常成纤维细胞、NSIP或IPF/UIP成纤维细胞的各组治疗小鼠的全肺样本进 行羟脯氦酸水平测定.接受正常成纤维细胞和IgG的C.B-17SCID/bg小鼠全肺样 本中的羟脯氨酸水平升高，但是两种抗体治疗均没有改变这些水平.NSIP成纤维 细胞C.B-17SCID/bg组中，轻脯氨酸水平显著高于对照C.B-17SCID/bg组中测定 的水平，并且与IgG治疗组相比，抗CCL21抗体和抗CCR7抗体治疗分別使羟 脯氨酸水平显著降低了 52 ± 6.7%和51 ± 5.6%.在接受IgG的IPF/UIP成纤维细 胞C.B-17SCID/bg组中，羟脯氨酸水平显著高于对照C.B-17SCID/bg组中测定的 水平.另外，与IgG治疗的C.B-17SCID/bg IPF/U1P成纤维细胞组相比，抗CCL21 抗体和抗CCR7抗体治疗组中，IPF/UIP成纤维细胞攻击小鼠的羟脯氨酸水平分 別显著降低了 66 ± 7.2%和59 ± 7.1%,因此，这些数据证明CCL21或CCR7把 向治疗显著降低C.B-17SCID/bg小鼠中过继转移NS1P或IPF/UIP成纤维细胞所 引起的肺重塑.
全肺细胞因子分析表明，接受IPF/UIP成纤维细胞和抗CCR7抗体治疗的 C.B-17SCID/bg小鼠的肺中鼠CCL21水平显著降低NSIP和IPF/UIP成纤维细 胞在C.B-17SCID/bg小鼠中的存在改变和/或升高了鼠IL-13、 CCL6和CCL21 的全肺水平，因此在第63天评价IgG和单克隆抗体治疗对这些介质的效果.抗 CCR7抗体和抗CCL21抗体治疗对任何C.B-17SCID/bg成纤维细胞组的IL-13 或CCL6全肺水平都没有影响.但是，与接受IPF/UIP成纤维细胞+lgG的 C.B-17SClD/bg组相比，抗CCR7抗体治疗显著降低接受IPF/UIP成纤维细胞 C.B-17SCID/bg组中鼠CCL21的全肺水平.因此，CCR7靶向治疗降低鼠CCL21 水平，但是对其他两种在IIP成纤维细胞模型中升高的介质没有影响.
讨论本研究致力于以下两个问題l)过继转移的人肺成纤维细胞是否重塑
SCID小鼠的肺结构？ 2) CCL21和CCR7在过继转移人成纤維细胞引起的重塑 反应中发挥什么作用？第一个问题的答案是肯定的，因为将lxio6 IPF/UIP或 NSIP成纤维细胞静脉内过继转移入缺乏适应性及先天性免疫特征的 C.B-17SClD/bg小鼠可引起纤維化，所述纤維化经组织学分析、分子分析和生物 化学分析证实.通过治疗性施用定向抗人CCL21或CCR7的单克隆抗体消除这 种纤维化，由此证明这种配体及其受体在肺纤维化中起主要作用，这与它们在肾 纤维化(Banas et al.， J. Immonul.， 2002， 168:4301-4307 )和肝纤維化(Bonacchi at a，.， Gastroenterology 2003， 125:1060-1076 )中的作用相似，
虽然已知和假设的促纤维化介质的鼠的等价物在接受IPF/UIP或NSIP成纤 维细胞的C.B-17SCID/bg小鼠中水平提高，但是这些介质在纤维化过程中的作用 仍有疑问，因为显示显著降低肺重塑的多组C.B-17SCID/bg小鼠中，其水平没有 变化.因此，本研究在过继转移IIP成纤维细胞促进C.B-17SCID/bg小鼠的纤维 化方面提供了证据，并确立了新的IIP治疗靶标.
临床肺纤维化的建模一直是实验室的重大挑战(Chua et al.， Am J. Resp. Cell M"Biol.， 2005 33:9-13).虽然疏酸博来審素是诱导实验性纤维化中选择的一种 药刑，但是博来霉素诱导的肺纤维化已经被批评为不理想的IPF/UIP模型(Chua et al., Am J. Resp. Cell Mol. Biol.， 2005 33:9-13 ).我们意识到更新的肺纤维化棋 型应体现尽可能多的临床IIP特征，本研究利用这样的观察在这些疾病中成纤 维细胞主要负责严重且常常是致命的重塑(Zisman et al.， Meth. Mol. Med. 2005， 117:3-44). IPF/UIP或NSIP成纤維细胞的过继转移引发间质重塑，并在静脉内 过继转移这些细胞系后第35天(但是不会更早)观察到组织学明显的纤维化.不 容易解释纤维化的延迟显现，但是这些发现与先前的研究是一致的，在先前的研 究中，将人上皮细胞过继转移入(:.8-178€: )/&经小鼠，需要大约30-40天才能显 现清晰的血管(Skovsethetal.， Am. J. Pathol.， 2002， 160:1629-1637 ).因此，本 研究强调通过过继转移人肺成纤维细胞在免疫缺陷小鼠中建立临床相关的肺纤维 化模型.
本文所述的IPF/UIP和NSIP成纤维细胞C.B-17SCID/bg模型的明显好处在 于其在试验这些疾病的新疗法中的实用性.本研究致力于人CCL21和CCR7的 作用，我们已经观察到两者在IIP活检样本(Choi et al" J. C,in. Pathol. 2006， 59:28-39 )和培养的IIP成纤维细胞中有显著表达.我们现在的假设是，抗人CCL21抗体和抗人CCR7抗体治疗的疗效与其否定CCL21对IPF/UIP和NSIP成纤维 细胞的促增殖效果有关.但是这里所用的单克隆抗体不可能对静脉注射的成纤维 细胞的迁移产生影响，因为抗体治疗被延迟到C.B-17SCID/bg小鼠出现组织学明 显的纤维化的时间点.可以想象，如果用于其它肺纤维化模型，这种治疗手段可 能影响对肺的纤维细胞补充.CCR7在纤维细胞上显著表达(Abe et al.， J. Immunol" 2001， 166:7556-7563; Hashimoto et al" <! Clin. Invest., 2004 113:243-252 ) , CCL21促进纤维细胞向各种组织位点的补充(Abe et al.， J. Immunol" 2001， 166:7556-7563 ).目前正在进行的研究使用CCR7野生型和基罔 缺陷小鼠来闲明CCR7阳性纤维细胞在博来莓素诱发的肺纤维化中的作用.
过继转移的人IIP成纤维细胞和与小鼠相关的纤维化成分(即细胞和介质) 对C.B-17SCID/bg小鼠中观察到的整体肺重塑反应的确切作用尚待确定.在本研 究中，转移的人成纤维细胞和小鼠成分之间看起来具有相互作用，其证振是在 C.B-17SCID/bg小鼠(最显著的是接受了两种IIP成纤维细胞中的任一种)的肺 中，鼠细胞外基质相关的转录物以及鼠可溶性促纤维化蛋白质发生了动力学变化. 虽然在这点上，对C.B-17SCID/bg小鼠的纤维化反应中检测到的可溶性鼠蛋白质 的相对重要性仍有疑问，但是相对于正常成纤維细胞C.B-17SClD/bg组的IIP成 纤维细胞C.B-17SCID/bg组中的组织蛋白醉E、 MMPs、细胞外基质成分(即胶 原和纤维粘连蛋白)和MMPs抑制剂的变化可能说明小鼠相关的纤维化成分积极 参与重塑反应.定量TAQMAN PCR证实了，相对于在接受正常成纤维细胞的 C.B-17SCID/bg小鼠中的这些基因的转录物水平变化，在接受HP成纤维细胞的 C.B-17SCID/bg组中的1型胶原、组织蛋白酶E、 MMP-19和TIMP-1转录物水 平显著增加.这些转录物变化与临床肺纤维化相关，因为组织蛋白醉(Kimuraet al.， J. Med. Invest 2005， 52:93-100; Wattiez et al" Electrophoresis 2000， 21:2703-2712 )、MMPs和TIMPs(综述于Pardo et al. Proc, Am, Thorac Soc.， 2006， 3:383-388)、以及细胞外基质(Kuhii and Mason, Am, J, Pathol. 1995j Adachi Am J. Pathol 1988， 133: 193-203 )在较严重的IIP类型(例如IPF/UIP和NSIP )中得 到增多，MMP-19在接受IPF/UIP成纤维细胞的C.B-17SCID/bg小鼠中增加最显 著，虽然这种蛋白酶看起来在皮肤损伤康复反应中起主要作用(Mauch J. Invest. Dermatol. 2003， 121注释)，但是其在肺纤维化中的作用仍不知晓.几乎没有例 外地，使用定量TAQMAN PCR分析下，抗CCL21抗体和抗CCR7抗体治疗减
少了所有上述鼠细胞外基质相关的基罔产物.MMP-19是一个例外，对MMP-19 在过继转移人IIP成纤维细胞后引起的肺纤维化反应中的相对重要性的深入研究 证明了这一点以及我们的其它发现.
总之，本实例证明，通过静脉过继转移IPF/UIP或NSIP原代成纤维细胞系 可将肺纤维化转移至C.B-17SCID/bg小鼠.该模型在试验新型治疗策略中的实用 性已得到证明，所述发现进一步支持CCL21-CCR7相互作用可能为临床NSIP和 IPF/U1P的重要把标.
实施例5:特发性肺纤维化成纤维细胞的迁移以及CC趋化因子配体-21的增殖
本实施例的目的是检验生长自IPF/UIP和正常外科肺活检样的原代成纤维细 胞表达CCR7的功能和信号显著性，从IPF/UIP和正常病人的外科肺活检样本培 养原代成纤维细胞.使用免疫细胞化学分析、基罔阵列、T叫man实时PCR、迁 移、增殖和蛋白质印迹分析对经过或未经CC趋化罔子配体(CCL) 21治疗的成 纤维细胞进行功能、转录物和蛋白质组学差异分析.
CCR7由IPF/UIP成纤维细胞(但非正常成纤维细胞)表达.当漆露于CCL21 时，IPF/UIP成纤维细胞(但非正常成纤维细胞)表现出明显的迁移和增殖反应， 其受百日咳毒素或CCR7的中和抗体的抑制.将IPF/UIP成纤维细胞曝露于 CCL21，改变了这些细胞中MEK1/2、 ERK 1/2和p90RSK的磷酸化状态，该改 变被百日咳毒素或CCR7特异性小干扰RNA消除.这些数据合起来证明CCL21 调控IPF/UIP成纤维细胞的功能特性，但不调控非常成纤维细胞，
假设CCR7在HP SLBs的间质中表达，发明者相信这种趋化因子受体可在来 源于SLB的原代成纤维细胞中表达并具有活跃的功能.在本研究中，当曝露于 CCL21时，1PF/U1P成纤维细胞(但非正常成纤维细胞)中观察到迁移和增殖活 动.IPF/UIP成纤维细胞膝露于CCL21引起IPF/UIP成纤维细胞中与胞外信号调 节激酶(ERK 1/2)信号传导途径有关的蛋白质的磷酸化发生改变，这种改变可 被百日咳毒素或CCR7 siRNA阻滞.因此，这些数据说明IPF/UIP成纤维细胞与 CCR7依赖型活化有关，由此CCR7成为IPF/1JIP中有吸引力的靶标.
病人所有病人在进行纤维支气管镜检之前接受临床评价，包括胸片、肺功 能测试和薄切片电脑断层扫描(thin-section computed tomography),在这些病 人中，综合症状、生理症状和放射影像结果来确定疑患IIP者，招入本研究的病 人之前没人经历过活检手术或接受过HP治疗.由密执安大学医学院IIP专科研
究中心(IIP Specialized Center of Research)附属的临床中心(Clinical Core) 自2000年5月至2003年5月从疑患UIP或NSIP的病人获得SLBs. SLBs得自 进行SLB用于诊断IIP(如前所详述)的所有病人的至少两片肺叶(通常在左側). 组织学正常的肺得自经受胸切除的病人的切除样本获得.在层流通风橱中用无菌 技术单独处理每份活检样本，进行原代成纤维细胞系的培养(见下文).
分离和培养成纤维细胞如先前所迷(Hogaboam et al.， Meths. Mol. Med.， 2005， 117:209-221 ),对来源于IPF/UIP或组织学正常的SLBs的成纤维细胞进行 机械解离和培养.
收集蛋白质和提取RNA:以2.5M()S细胞/ml将原代成纤维细胞接种于12 孔组织培养板中，并允许贴壁过夜.用PBS洗涤成纤维细胞一次.在孔中加入500 pi含0.5% FBS的Dulbecco，s改进的Eagle培养基(DMEM-0.5)，或加入500 p， 含有10 ng/ml CCL19或CCL21重组蛋白的DMEM-0.5 —式四份，培养24小时. 收集不含细胞的上清液，储存于-80lC直至进行可溶性蛋白质含量检測.除去上清 液后，每孔加入250 pi Trizol，根据生产商(Invitrogen， Carlsbad, CA)的说明 提取RNA.
抗体Western抗体包括抗人CCR7单克隆抗体(R&D systems. Minneapolis, MN ) 、 Phospo-p44/42 Map激酶(Thr202/Tyr204 ) 、 Phospho-MEKl/2 (Ser217/221 ) 、 Phospho画p90RSK ( Thr573 ) 、 Phospho画SEKl/MKK4 (Ser257/Thr261 ) 、 Phospho-SAPK/JNK ( Thrl83/Tyr185 ) 、 Phospho-c-Jun (Ser63 ) II、 Phospho-p38 MAP激醉(Thrl80/Tyr182 ) 、 Phospho-MKK3/MKK6 (serl89/207)(全部来自Cell Signaling, Danvers， MA);抗P肌动蛋白、抗 -GAPDH、兔抗a平滑肌肌动蛋白多克隆抗体(Abcam， Cambridge, MA ) 所用 的其他抗体有Anti-rabbit， HRP conjugated, Anti-mouse, HRP conjugated, anti-biotin， HRP conjugated (Cell Signaling, Danvers， MA),
基罔阵列用购自SuperArray (Carlsbad, CA)的特异性趋化因子和趋化因 子受体基因阵列分析人CCR7、 CCL19和CCL21基因的表达.
TAQMan分析如前所述(19)，通过实时定量RT-PCR程序，使用7500 实时PCR系统(Applied Biosystems， Foster City, CA)对IPF/UIP和正常成纤 维细胞中的CCR7和GAPDH表达进行分析.所有抗体和探针均购自Applied Biosystems (Foster City, CA),在计算表达变化之前用GAPDH对CCR7的表
达进行标化，在计算表达的倍数变化之前，将CCR7的表达归一化至GAPDH.
免疫细胞组织化学(Imiminocytohistochemistry):按生产商(R & D Systems, Minneapolis, MN )的说明，使用HRP-AEC细胞和组织染色试刑盒，通过免疫细 胞化学方法对人CCR7蛋白的表达进行分析.
成纤维细胞迁移測定在存在或没有10ng/ml CCL19或CCL21的条件下， 将原代IPF/UIP和正常成纤维细胞加到6孔培养板中的8 pm transwell inserts中， 培养24小时，将迁移至底孔中的成纤维细胞固定、苏木精染色并计数.为了測试 受体或配体的特异性，每孔加入5时/m，抗人CCR7、 CCL19或CCL21抗体. 加入5pg/m，IgG或10plPBS，作为对照.
增殖分析如前所述(9)，在24孔培养板中用卩H1胸腺嘧啶脱氣核苷掺入 法分析成纤维细胞的增殖能力.
Sircol胶原分析用Biocolor Sircol胶原分析(Accurate Chemical & Scientific Corp， Westbury， NY )测定可溶性胶原的含量.分析时，将100 pl不含细胞的上 清液样品加到1 ml Sircol染料中，室温振摇30分钟，然充后以10,000 x g离心 试管10分钟.除去染料，在每个试管中加入l m，碱溶液，分混匀.分析读数 每份溶液取200 pl，连同200 pl标准品转移至96孔光学平底板(optical flat-bottom plate).用读板仪在540nm处读板，将浓度归一化至Bradford分析确定的总蛋 白含量.
Bioplex蛋白测定用细胞外抗体试剂盒(Invitrogen BioSource， Carlsbad, CA)和Bio-Rad Luminex Bio-Plex 200 System ( Hercules, CA)分析不含细胞的 上清液样品中的人RANTES/CCL5.简而言之，50 pi不含细胞的上清液样品和标 准品与50 pi multiplex珠子在振荡器中辨育30分钟.用洗涤緩冲液洗涤珠子3次， 每次100 pi.然后与25nl检测抗体溶液在振荡器中孵育30分钟.再洗涤3次后， 加入链審亲和素-PE ( str印tavidin-PE)，珠子在振荡器中孵育10分钟，再洗涤 3次.将珠子重悬浮于分析緩冲液中，用上述系统读数.
Western Blot分析以5><105细胞/孔，将成纤维细胞接种于6孔板中，并允 许贴壁过夜.然后使成纤维细胞在不含血清的DMEM中饥俄M小时.成纤维细 胞用0.5%小牛血清DMEM或掺加10 ng/ml CCL19或CCL21重组蛋白的相同培 养基处理0.5、 2、 5、 30分钟. 一些成纤维细胞在处理前舉露于200nM百曰咳毒 素(Sigma，St. Louis，MO) 2小时.然后用水冷的磷酸盐緩冲盐水洗涤成纤维细胞，用500 pl冰冷的裂解緩冲液裂解，所述裂解緩冲液的由1% Triton X-IOO、 50mMNaF、 2 mM EDTA、 (U5MNaCI、 0.01 M裤酸钠、200pM原钒酸钠、5 pg/ml胃蛋白酶、5 pg/m，亮抑酵肽和100 nM花萼海绵诱癌素组成.在冰上醉育 5分钟后，刮下成纤維细胞裂解物，转移至试管中.用Bradford分析測定总蛋白 含量，将含有20 pg总蛋白质的样品与4 pl 4xLDS样品緩冲液(Invitrogen， Carlsbad, CA)和双重去离子水(ddH20)混合，90X:煮沐5分钟，然后在4-12% NuPage Bis-Tris凝胶(Invitrogen， Caiisbad， CA)中通过SDS-PAGE分离.将 蛋白转移至硝酸纤維素膜(Invitrogen, Carlsbad， CA)上.用含5% NFDM的1 x TBS/T封闭后，用原发性phospho-抗体印迹膜、经去除(RestoreTM Western Blot Stripping Buffer, Pierce, Rockford， IL )、洗涤和GAPDH (加样对照)再印迹.
siRNA的转染为了阻断CCR7的表达，用Qiagen custom synthesis site制 备小干扰RNA (siRNA),用Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 将两个候选siRNA转染至lPF/UlP肺成纤维细胞中，用Taqman分析CCR7，以 测试其有效性.将更有效的 siRNA (约 70%敲减， AGCGGACATCAGCTGGTCAA )用于Erk 1/2途径磷酸化的Western蛋白质印 迹分析，
生长自正常及IPF/UIP SLBs的成纤维细胞中存在CCR7、 CCL19和CCL21 基因表达.用特异性人趋化因子和趋化闳子受体SuperArray对3个正常SLB来 源的成纤维细胞系和3个IPF/UIP来源的成纤维细胞细进行RNA分析.该分析 表明，在两组细胞中都存在CCR7、 CCL19和CCL21，但是CCR7在IPF/UIP 成纤维细胞系中的表达明显高于在正常成纤维细胞系中的表达.用TAQMAN实 时PCR对基因表达进行进一步分析，证实了在用于本研究的所有成纤维细胞系中 均存在CCR7、 CCL19和CCL21的转录物.因此，这些数据证明CCR7、 CCL19 和CCL21基因转录物存在于正常成纤维细胞和IPF/UIP成纤维细胞中.
标记的CCR7蛋白表达存在于IPF/UIP成纤维细胞中，但在正常成纤维细胞 中不存在.发明者已经表明接近100%的UIP SLBs在间质区既有灶性CCR7蛋 白表达又有弥散性CCR7蛋白表达.而且，CCR7局灶区似乎与组织学明显的成 纤维细胞灶一致，为了测定生长自正常SLBs和IPF/UIP SLBs的原代成纤维细胞 是否表达CCR7，对CCR7进行了免疫细胞化学染色.IPF/UIP成纤维细胞呈现 强的CCR7阳性，然而正常成纤维细胞很少表达或不表达CCR7. CCL21定向IPF/UIP成纤维细胞的迁移，但不定向正常成纤维细胞，CCR7 的表达在成熟树突状细胞上受到升调节，从而使这些细胞迁移至淋巴结，用于免 疫激活(Sozzani et al.， J. ImmunoL， 1998， 161(3):1083-1086)),在某些乳腺癌细 胞(Muller et al" Nature, 2001， 410(6824):50-56 )和黑素瘤细胞(Murakam et al" J. Dermatol. Sci" 2004， 36(2):71-78 )上，已证明CCR7和CCL21的相互作用对 于转移有重要作用，在本研究中，CCL19和CCL21都促进IPF/UIP成纤维细胞 的迁移，但对正常成纤維细胞不促进.但是，CCL21是IPF/UIP成纤维细胞迁移 的更有效的诱导剂，将这些细胞的迁移增强到比只接触单独的DMEM的IPF/UIP 成纤维细胞培养物高约7倍，为了检验这种迁移是否依赖于CCR7，在三份孔中 分別加入IgG、抗人CCR7抗体或抗人CCL21抗体(全部为5 pg/ml).虽然IgG 的存在不改变IPF/UIP成纤維细胞的迁移，但是抗CCR7抗体或抗CCL21抗体 显著抑制了 IPFAJIP成纤维细胞的迁移反应.用200 ng/ml百日咳毒素预处理成 纤维细胞也抑制了由CCL21诱导的IPF/UIP成纤维细胞的迁移反应，闳此，这 些数据表明CCR7活化促进IPF/UIP成纤维细胞(但非正常成纤维细胞)的迁移.
CCR7活化刺激原代IPF/UIP成纤维细胞的增殖.IPF/UIP表征为肺泡和肺 间质的严重结疤，这部分由极度纤维増生所致.在本研究中观察到了增强的 IPF/UIP成纤维细胞系增殖反应，其中所有三个IPF/UIP细胞系显示约3倍高于 所研究的正常成纤维细胞系的基线(即单独DMEM)增殖速度.另外，加入10 ng/ml CCL21 (但非CCL19)显著提高了所有三个原代IPF/UIP成纤维细胞系的 增殖特性，高于只暴露于DMEM的培养物.CCL19或CCL21的存在不改变正 常成纤維细胞的増殖特性.
CCR7活化促进原代IPF/UIP成纤维细胞产生CCL5 (但非从头产生胶原). 先前的研究已经表明，趋化因子可驱动各种细胞中其它趋化因子的表达.例如， 在IPF/UIP成纤维细胞培养物中加入CCL5显著增强CCL7的表达，CCL7为公 认的IPF/UIP生物标记物.为了测定经由CCL21的CCR7活化是否改变IPF/UIP 和正常成纤维细胞产生趋化闳子的特性，在进行多重可溶性蛋白质分析之前，将
胞的培养物中，CCL21显著提高了 IPF/UIP (但非正常成纤维细胞)中的CCL5 水平.令人惊讶的是，如用Sircol胶原分析法所测定的，CCL21在IPFAJIF成纤 维细胞培养物中存在24小时，并未改变其对可溶性胶原的合成.该数据连同先前
CCL21 24小时.CCL5存在于IPF/U1P和正常成纤维细 研究的数据表明，CCR7活化增强了 IPF/UIP成纤维细胞合成趋化因子的能力.
a平滑肌肌动蛋白(aSMA)在原代IPF/UIP成纤维细胞和原代正常成纤维 细胞中的表达不受CCL21的影响.
aSMA是用于高合成性成纤维细胞亚型(称为成肌纤维细胞)的蛋白质标记 物(White et al" Am. J. Respir. Crit. Care Med" 2006， 173(l):112-1121 ) 假设 CCL21对IPF/UIP成纤维细胞合成趋化罔子有重大的影响，我们接下来研究 CCR7配体是否改变aSMA在这些细胞中的表达.蛋白质印迹分析表明，IPF/UIP 成纤维细胞培养物中表达的aSMA水平比正常成纤维细胞培养物高，这与 IPF/UIP细胞更高的合成特性是吻合的.但是，CCL21的存在不影响aSMA的表 达.虽然aSMA阳性IPF/UIP成纤维细胞表达CCR7 (基于免疫细胞化学分析)， 但是在这些细胞中加入CCL21看起来并没有进一步提高这种蛋白的水平，说明 CCR7活化不是成纤维细胞分化为成肌纤維细胞的主要剌激因素，
CCL21激活CCR7后，IPF/UIP成纤維细胞的P44/p42胞外信号相关激蘇 (ERK 1/2)信号传导途径被激活.许多重要的细胞功能受到合称为促分裂原活 化蛋白激酶(MAPK)途径的一组信号蛋白的调控.每种途径对细胞周期、生长 和迁移有独特的影响，这部分因为每种途径由独特的剌激物激活，包括生长因子、 应激和炎性细胞因子.这些刺激物引发的級联激活涉及MAPKK激蘇、MAPK激 酶和MAPK的顺序磷酸化.最后一步使MAPK进入细胞核，激活一种或数种下 游转录因子，从而引起生物学反应，例如细胞的增殖、迁移和存活.为了确定活 化的CCR7对MAPK途径的影响，分別在30秒以及2、 5和30分钟收集未经处 理且经CCL21激活的成纤维细胞相关蛋白质，对ERK 1/2、 p38和c-Jun N-末 端激酶(JNK) MAPK途径进行蛋白质印迹分析.在IPF/UIP成纤维细胞培养物 中加入CCL21后，虽然与p38和JNK途径相关的信号蛋白的裤酸化没有变化， 但是ERK 1/2途径显示出罅酸化变化的迹象.另外，该途径没有c-RAF和 MAPKKK轔酸化的迹象.
暴露于CCL21后，IPF/UIP成纤维细胞中的促分裂原活化蛋白激酶激醉 (MEK 1/2)发生裤酸化.未经处理(即血清饥俄)的原代正常成纤维细胞系和 原代IPF/UIP成纤维细胞系未显示组成性激活的MEK 1/2.正常成纤维细胞中单 独加入DMEM-0.5,导致MEK1/2的裤酸化呈时间依赖性增加，5分钟时达到最 离.但是，存在10 ng/ml的CCL21不改变这种磷酸化概况.虽然单独加入
DMEM-0,5促进IPF/UIP成纤维细胞中MEK 1/2的时间依赖性活化，5分钟达到 峰值，但是加入CCL21 (10 ng/ml)在2分钟和5分钟引起裤酸化的增加，MEK 1/2磷酸化水平在30分钟终点回到培养基水平.这些数据合起来说明IPF/UIP成 纤维细胞漆露于CCL21时加快MEK 1/2的活化.
CCL21加速IPF/UIP成纤维细胞中ERK 1/2的活化.未经处理的原代正常 成纤维细胞和原代IPF/UIP成纤維细胞显示组成性ERK 1/2轔酸化，但是该 MAPK在正常成纤维细胞中的基线活性看来比在IPF/UIP成纤维细胞中高，这说 明组成性ERKl/2裤酸化很少。正常成纤维细胞中单独加入DMEM-0.5，在5分 钟时ERK 1/2活化达到顶峰.在暴露于掺加10 ng/ml CCL21的DMEM-0.5的正 常成纤维细胞中观察到类似的ERK 1/2活化模式，但是这些培养物中的总体ERK 1/2裤酸化水平较低.在IPF/UIP成纤维细胞培养物中单独加入DMEM-0.5所产 生的ERK 1/2磷酸化模式与正常成纤维细胞培养物中观察到的相似，但是， IPF/UIP成纤维细胞中的活化程度比正常成纤维细胞中的高得多.相比于只啄露 于DMEM-0.5的那些成纤维细胞培养物中的ERK 1/2裤酸化，舉雾于CCL21和 DMEM-0.5的IPF/UIP成纤维细胞培养物中的ERK 1/2裤酸化在2分钟时显著増 加.由于IPF/UIP成纤维细胞中的低组成性ERK 1/2鱗酸化，这些细胞啄露于 DMEM-0.5或DMEM-0.5+10 ng/ml CCL21后的磷酸化水平比含有未经处理的 IPF/UIP成纤维细胞的培养物高60-125倍.
CCL21促进IPF/UIP成纤维细胞中的核糖体56激醉(p90RSK)磷酸化.已 经显示，在拔细胞生成方面，p90RSK被趋化因子CXCL12激活(Lee et a，.， 2002， Blood 99(12):4307-4317 ).本研究对p90RSK的分析显示，这种转录罔子(位于 ERK 1/2的下游)以裤酸化状态存在于未处理的正常和IPF/UIP成纤維细胞中. 正常成纤维细胞培养物中p90RSK活化的变化相似，与CCL21是否存在无关， 相反，CCL21在IPF/UIP成纤维细胞培养物中的存在，在各测试时间点都加强了 这种转录罔子的裤酸化，大约比未处理的培养物中见到的高2.5倍.这些数据合 起来表明CCR7是IPF/UIP成纤維细胞中的一种活性受体，该受体看来至,部分 通过ERK 1/2途径进行信号传导.虽然正常成纤维细胞表现出ERK 1/2途径的活 化，这种活化看起来与CCL21的存在无关.
百曰咳毒素抑制G-蛋白或小干扰RNA静默CCR7基罔削弱CCL21介导的 ERKl/2活化.为了验证CCR7在IPF/U1P成纤维细胞活化中的作用，进行其它
研究来检验百日咳毒素(Gi和Go蛋白抑制剂)或siRNA介导的CCR7基因沉默 是否消除CCL21对ERKl/2活化的作用.转染24小时后，特异性CCR7 siRNA 的加入将该受体的蛋白质表达减少约70%.在这些研究期间，这种对CCR7蛋白 表达的抑制持续30分钟.Lamin A/C特异性siRNA和随机siRNA对IPF/UIP成 纤维细胞的CCR7蛋白表达都没有任何影响.因此，这些数据表明使用特异性 siRNA在体外成功定向CCR7.在IPF/UIP成纤維细胞培养物中存在百日咳毒素 或CCR7siRNA，将MEK1/2、 ERK 1/2和p90RSK裤酸化水平降低至与暴露于 单独的DMEM-0.5的培养物相同的水平.几項研究已经表明，原代人肺成纤维细 胞对趋化因子产生促纤维化活化反应(Atamas et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol" 2003， 29(6):743-9; Keane et al.， J. Immunol" 1997, 159(3):1437-1443; Prasse et al" Am. J. Respir. Crit. Care Med" 2006， 173(7)781-792; Puxeddu et a，" J. AHergy CHn. Immunol., 2006， 117(1): 103-110),并且是趋化因子的稳固来源 (Keane et al" J* Immunol" 1997， 159(3): 1437-14化Prasse et al" Am, J, Respir, Crit. Care Med.， 2006， 173(7)781-79).
本研究致力于来自疾病诊断时取得的SLBs的原代IPF/UIP成纤维细胞表达 CCR7的作用.与来源于切除的肺部肿癌的正常边緣的原代正常成纤维细胞不同， IPF/UIP成纤维细胞和aSMA阳性成肌纤维细胞表达CCR7 (被认为是局限于造 血源细胞的一种受体).通过CCL21 (CCL19较少)的CCR7活化促进和/或显 著加强IPF/UIP成纤維细胞的迁移、增殖和趋化罔子合成特征.外源性CCL21 通过CCR7依赖的方式激活Erk 1/2 MAPK途径.罔此，本研究提示IPF/UIP成 纤维细胞具有响应CCR7配体的能力，CCR7配体在肺中有丰富表达，不管病情 如何(Choi et a，., J. C，in. Pathol" 2006 59(l):28-39)，这种反应性可能在表征 IPF/UIP的过度纤维増生中发挥主要作用.
总之，本实施例说明来源于IPF/UIP SLBs的原代人成纤维细胞表达功能性 CCR7.由其配体(特別是CCL21)活化CCR7，诱导IPF/UIP成纤维细胞的迁 移、增殖和趋化因子合成.通过CCR7的CCL21诱导活化是G-蛋白依赖性的， 与ERK1/2MAPK途径的激活有关.根据该数据和其他证据，对CCL21定向抑 制实验性肾小球(Banas et al" J. Immunol" 2002， 168(9):4301-4307 )和肝 (Bonacchi et a，. Gastroenterology, 2003， 125(4): 1060-1076)结疤，认为CCR7 代表IPF/UIP的新靶标.此外，数据表明CCL21诱导的MEK 1/2、 ERK 1/2和
p90RSK裤酸化依赖于功能性G-蛋白偶联的信号传导和CCR7.
贯穿本说明书中以及在随附的权利要求书中，除非上下文另有要求，词语"包 含"或其变化，如"comprises"或"comprising"应被理解为暗示包括声明的整 数或步樣，或一组整数或步骤，但是不排除其它整数或步騍，或整数或步驟组.
根据本公开内容，无需进行过度实验，能够制备和实施本文所公开或要求保 护的所有组合物和/或方法.虽然已经以具体实施方案的形式描述了本发明的组合 物和方法，本领域技术人贝显然能够在不脱离本发明的概念、精神和范闺的条件 下，n对本文描述的组合物和/或方法以及方法的步錄或步錄的順序加以变化.更 具体地，显然，可以使用某些化学或生理学上均相关的药剂来替代本文描述的药 刑而获得相同或相似的结果.所有这些相似的替代或修改对于本领域技术人员是 明显的，且被认为包含在所附权利要求所定义的发明精神、范困和概念之内.
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文引用的参考文献，均通过引用具体并入本文.
权利要求
1.一种治疗哺乳动物慢性纤维化疾病的方法，其包括降低纤维细胞和/或成纤维细胞中CCL21的存在量或活性，所述纤维细胞和/或成纤维细胞存在于所述纤维化疾病的纤维化损害处。
2. 权利要求l所述的方法，其中所述方法进一步包括降低与所述纤维化疾病 有关的成纤维细胞中CCL19的存在量或活性.
3. 权利要求l所述的方法，其中所述降低CCL21的存在量或活性包括使所 述哺乳动物与从成纤维细胞去除CCL21的药剂接触，所述药刑的量为有效减轻 所述慢性纤维化疾病的一种或多种症状的量.
4. 权利要求3所述的方法，其中所述药剂是与CCL21发生特异性免疫反应 的抗体，
5. 权利要求4所述的方法，其中与其它趋化因子相比，所述抗体优先识別 CCL21上的表位.
6. 权利要求l所述的方法，其中所述降低CCL21的存在量或活性包括使所 述哺乳动物与咸少CCL21在成纤维细胞中的表达的药刑接触，所述药刑的量为 有效减轻所迷慢性纤维化疾病的一种或多种症状的量.
7. 权利要求6所述的方法，其中所述药剂是定向抗CCL21的siRNA分子.
8. 权利要求l所述的方法，其中所述纤维化疾病选自肺纤雉化、慢性阻塞性 肺病、肝纤维化、风湿性关节炎、充血性心力表竭、慢性肾病、过敏性肺炎、呼 吸性细支气管炎/间质性肺病、曼氏血吸虫感染、由丛状损害引起的原发性肺动脉 高压、疱疹病毒相关疾病的肺表现、疱疹病毒相关疾病的皮肤表现、瘢痕疙瘩、 狼疮、肾源性纤维化皮肤病、日本血吸虫感染相关的纤维化损害、自身免疫性疾 病、致病性纤维化、莱姆病、胰腺炎中的基质重塑和基质纤维化、子宫肌瘤、卵 巢纤维化、角膜纤维化、充血性心力衰竭和其他缺血后遣症、术后腹部结疤、开 角型青光眼小梁切除术后结疤，及其任意组合.
9. 权利要求8所述的方法，其中所述纤维化疾病为慢性肺纤维化.
10. 权利要求3或6所迷的方法，其包括在纤维化损害位点局部施用所述药剂.
11. 权利要求10所述的方法，其中所述纤维化损害在肺内，且所述组合物与 所述损害局部接触.
12. 权利要求3或6所迷的方法，其中所述药刑包含将所述药刑特异性定但 于纤维化损害位点的靶向部分.
13. 权利要求12所述的方法，其中所述纤维化损害在肺内，且所述组合物与 所述损害局部接触.
14. 权利要求3所述的方法，其中使用选自以下的给药方式施用所述抗体， 包括局部给药、注射、吸入、储库式或泵式持续释放，或其任意组合.
15. 抑制成纤维细胞和/或纤维细胞増殖的方法，其包括使所迷成纤维细胞和 /或纤维细胞与组合物接触，所述组合物包含抗CCL21抗体或设计为抗CCL21 的siRNA分子，
16. 权利要求15所述的方法，其进一步包括使所述成纤维细胞与组合物接触， 所述组合物包含抗CCL19抗体或设计为抗CCL19的siRNA分子.
17. 权利要求15或16所述的方法，其进一步包括使所述成纤維细胞与组合 物接触，所述组合物包含抗CCR7抗体或设计为抗CCR7受体的siRNA分子.
18. 权利要求15所述的方法，其中所迷纤维细胞和/或成纤维细胞位于体外.
19. 权利要求15所述的方法，其中所述纤维细胞和/或成纤维细胞位于体内.
20. 权利要求15所述的方法，其中所述纤维细胞和/或成纤維细胞位于体内 肺组织中.
21. 抑制纤维细胞迁移和/或成纤维细胞活化的方法，其包括使所述纤维细胞 和/或成纤維细胞与抑制CCL21活性的组合物接触.
22. 权利要求21所述的方法，其中所述纤维细胞位于哺乳动物体内，且所述 方法抑制纤维细胞向所述哺乳动物的肺组织迁移，由此防止细胞外基质的过度产 生.
23. 权利要求21所述的方法，其中所述成纤维细胞为位于哺乳动物肺组织中 的固有肺成纤维细胞，且所述方法抑制所述哺乳动物肺组织中的所述成纤维细胞 的活化，由此防止细胞外基质的过度产生.
24. 治疗肺纤维化的方法，其包括通过抑制所述纤维细胞和/或所述成纤维细 胞中CCL21的活性或表达来抑制罹患纤维化肺病的哺乳动物的纤維细胞的迁移 和/或位于肺组织中的固有肺成纤维细胞的活化，由此防止细胞外基质的过度产生 并改善肺纤维化症状，
25.权利要求24所述的方法，其中CCL21的存在量或活性的药刑，其中所述药刑可在放射治疗之前、和/或期间、 和/或之后施用.
26. 权利要求25所述的方法，其中所述方法进一步包括施用降低与所述纤维 化疾病有关的成纤维细胞中CCL19的存在量或活性的药刑，
27. 对受试者治疗或抑制药物诱发的肺纤维化发展的方法，其包括对所述受 试者施用降低所述受试者肺组织中纤维细胞和/或成纤维细胞中CCL21的存在量 或活性的药刑，其中所述药刑可在给药之前、和/或期间、和/或之后施用.
28. 权利要求27所述的方法，其中所述方法进一步包括施用降低与所述纤維 化疾病有关的成纤维细胞中CCL19的存在量或活性的药剂.
29. 权利要求27所述的方法，其中所述药物选自细胞毒素刑、抗生素、抗心 律失常药、消炎药和违禁药.
30. 权利要求27所述的方法，其中所述药物选自两性霉素B、博来審素、溴 麦角隐亭、白消安、卡马西平、苯丁酸氮芥、可卡因、环磷跣胺、苯妥英、麦角 胺、象卡尼、海洛罔、美法仑、美沙新、甲氛蝶呤、哌甲醋、美西麦角、矿物油、 呋喃妥因、亚硝基脲类、丙卡巴肼、硅稱、柳氳磺吡啶、妥卡尼和长春花生物碱 类药刑.
31. 权利要求24~30中任一项所述的方法，其中所述药刑与皮质类闺醇、免 疫抑制剂、抗凝刑、利尿剂、强心式、鈣通道阻断剂、血管扩张剂、前列环素类 似物、内皮素拮抗剂、裤酸二酯酶抑制刑、p2激动剂、抗毒革械剂、内肽酶抑制 刑、降血脂药和血栓素抑制剂，或其组合联合施用.
32. 用于降低纤维化损害处的纤维细胞和/或成纤维细胞中CCL21的存在量 或活性的药剂以及任选的降低纤维化损害处的纤维细胞和/或成纤维细胞中 CCL19的存在量或活性的药刑在制备治疗哺乳动物慢性纤维化疾病的药物中的 用途.
33. 权利要求32所迷的用途，其中所述药剂是与CCL21发生特异性免疫反 应的抗体.
34. 权利要求33所述的用途，其中所述抗体与其它趋化罔子相比优先识別 CCL21上的表位.
35. 权利要求32所述的用途，其中所述的药刑是定向抗CCL21的siRNA分子.
36. 权利要求32所述的用途，其中所述纤维化疾病选自肺纤维化、慢性阻塞 性肺病、肝纤维化、风湿性关节炎、充血性心力衰竭、慢性肾病、过敏性肺炎、 呼吸性细支气管炎/间质性肺病、曼氏血吸虫感染、由丛状损害引起的原发性肺动 脉高血压、疱疹病毒相关疾病的肺表现、疱渗病毒相关疾病的皮肤表现、瘢痕疙 瘩、狼疮、肾源性纤维化皮肤病、日本血吸虫感染相关的纤维化损害、自身免疫 性疾病、致病性纤维化、莱姆病、胰腺炎中的基质重塑和基质纤维化、子宫肌瘤、 卵巢纤維化、角膜纤维化、充血性心力衰竭和其他缺血后遣症、术后腹部结疤、 开角型青光眼小梁切除术后结疤，及其任意组合.
37. 权利要求36所述的用途，其中所述纤维化疾病为慢性肺纤维化.
38. 权利要求l所述的用途，其中使用选自以下的给药方式施用所迷药刑包 括局部给药、注射、吸入、储库式或泵式持续释放，或其任意组合，
39. 包含抗CCL21抗体或设计为抗CCL21的siRNA分子，以及任选的抗 CCL19抗体或设计为抗CCL19的siRNA分子的组合物在制备抑制成纤维细胞和 /或纤維细胞增殖的药物中的用途，
40. 权利要求39所述的用途，其中所述用途进一步包括包含抗CCR7抗体 或设计为抗CCR7受体的siRNA分子的组合物在制备抑制成纤维细胞和/或纤维 细胞增殖的药物中的用途.
41. 抑制CCL21活性的组合物在制备抑制纤维细胞迁移和/或成纤维细胞活 化的药物中的用途.
42. 抑制纤维细胞中CCL21的活性或表达，和/或抑制國有肺成纤维细胞活 化的组合物在制备药物中的用途，所述药物通过防止细胞外基质的过度产生并改 善肺纤维化症状来治疗肺纤维化.
43. 降低肺组织中纤维细胞和/或成纤維细胞中CCL21的存在量或活性的药 刑或任选的降低肺组织中纤维细胞和/或成纤维细胞中CCL19的存在量或活性的
44.降4氐肺组织中纤维细胞和/或成纤维细胞中CCL21的存在量或活性的药 刑或任选的降低肺组织中纤維细胞和/或成纤维细胞中CCL19的存在量或活性的 药刑在制备治疗药物诱发的肺纤维化的药物中的用途.
45. 权利要求43或44所述的用途，其中所述药物选自细胞毒素刑、抗生素、 抗心律失常药、消炎药和违禁药.
46. 权利要求43或44所述的用途，其中所迷药物选自两性審素B、博来審 素、溴麦角隐亭、白消安、卡马西平、苯丁酸氮芥、可卡罔、环磷酰胺、苯妥英、 麦角胺、氟卡尼、海洛因、美法仑、美沙嗣、甲氨蝶呤、哌甲酯、美西麦角、矿 物油、呋喃妥因、亚硝基脲类、丙卡巴肼、硅嗣、柳氣磺吡啶、妥卡尼和长春花 生物碱类药刑.
47. 权利要求32~46中任一項所述的用途，其中所述药物与皮质类闺醇、免 疫抑制剂、抗凝刑、利尿刑、强心式、鈣通道阻断刑、血管扩张刑、前列环素类 似物、内皮素拮抗刑、裤酸二醋酶抑制刑、P2激动剂、抗毒覃碱刑、内肽醉抑制 刑、降血药和血栓素抑制刑，或其组合联合.
48. 权利要求2所迷的方法，其中所述降低所述纤維细胞和/或成纤维细胞中 CCL21和CCL19的存在量或活性包括使所述哺乳动物与从所述成纤维细胞去除 CCL21和CCL19的药剂接触，所述药剂的重为有效减轻所述慢性纤维化疾病的 一种或多种症状的量.
全文摘要
本发明公开了用于治疗纤维化疾病的方法和组合物。更具体地，本发明论证了对单独的CCL21活性或其与CCL19结合的活性的抑制或其它形式的降低，能有效减少纤维化损害，并改善纤维化疾病的症状。
文档编号C12Q1/68GK101351545SQ200680048342
公开日2009年1月21日 申请日期2006年12月19日 优先权日2005年12月23日
发明者C·M·霍加博亚姆, S·L·昆克尔 申请人:密执安大学评议会