专利名称：：仿生化二氧化硅固定β-葡萄糖醛酸苷酶的纳米颗粒制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种仿生化二氧化硅固定e-葡萄糖醛酸苷酶的纳米颗粒制备方法，属于酶的固定化技术。
背景技术：
：二氧化硅凝胶是一种常用的固定化酶载体。目前，二氧化硅作载体固定化酶主要釆用包埋法或吸附法。吸附法操作简单，但是酶易脱落，重复使用性差。包埋法负载率高，有利于维持酶的结构完整性，进而提高酶的活性维持率，而且二氧化硅具有介孔结构，有利于反应物和产物传递。目前普遍采用溶胶-凝胶(sol-gel)法，以酸或碱为催化剂，利用硅酸钠或有机硅烷前驱体的水解和缩聚在常温下合成具有较高比表面积和介孔结构的二氧化硅材料。这种方法虽然简单易行，但过程中产生的醇类副产物对生物酶的活力维持有着不利影响，导致活性下降甚至完全失活。仿生硅化为二氧化硅材料的制备提供了一条新途径。自然界中的硅藻利用水中溶解的微量硅可形成坚硬的硅质细胞壁。研究表明，这类硅藻植物都是通过在有机质参与下的生物硅化作用来构建细胞壁的，即由一定的有机模板通过静电吸引作用促进和调控二氧化硅的沉积。某些天然或合成的有机物，如silaffins、聚赖氨酸、聚乙烯亚胺等可在室温和中性条件下调控二氧化硅的快速聚合。仿生硅化过程避免了酸碱催化剂的使用，所用原料均具有很好的生物相容性且包埋条件更加温和，酶或生物分子可在二氧化硅形成过程中直接被包埋，适用范围更广。
发明内容本发明的目的在于提供一种仿生化二氧化硅固定e-葡萄糖醛酸苷酶的纳米颗粒制备方法。以该方法所制得的固定e-葡萄糖醛酸苷酶的纳米颗粒，e-葡萄糖醛酸苷酶的活力维持率高，稳定性好，重复使用性好。本发明是通过下述技术方加以案实现的，一种仿生化二氧化硅固定e-葡萄糖醛酸苷酶的纳米颗粒制备方法，其特征在于包括以下过程(1)将硫酸鱼精蛋白溶于浓度为0.05mol/L的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tirs-HC1)缓冲液中或去离子水中，配制成浓度为215mg/mL的硫酸鱼精蛋白溶液，将P-葡萄糖醛酸苷酶溶于浓度为0.05mol/L的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tirs-HCl)缓冲液中或去离子水中，配制成浓度为0.Img/mL的e-葡萄糖醛酸苷酶溶液，然后将硫酸鱼精蛋白溶液与e-葡萄糖醛酸苷酶溶液按体积比为1:1的混合均匀制得混合液；(2)将硅酸钠溶于去离子水或浓度为215mg/mL的盐水中，并用2mol/LHC1调节溶液的pH至7.0，配制1030画ol/L的硅酸钠溶液；(3)按照体积比为1:710的比例，将步骤(1)得到的混合液加入到步骤(2)制得的硅酸钠溶液中，静置520min，离心分离，去除上清液，用去离子水洗涤至上清液中无e-葡萄糖醛酸苷酶存在为止，再经冷冻干燥，得到仿生化二氧化硅固定P-葡萄糖醛酸苷酶的纳米颗粒。本发明提出的制备方法的优点在于制备条件温和，制备工艺简单易行，所得二氧化硅沉淀对酶具有很好的固定能力，固定化e-葡萄糖醛酸苷酶的活力维持率高，重复使用稳定性好。图i为本发明实施例二制备的仿生化的二氧化硅固定e-葡萄糖醛酸苷酶的纳米颗粒的扫描电镜(SEM)照片。图2为本发明实施例二制备的仿生化的二氧化硅固定e-葡萄糖醛酸苷酶的纳米颗粒的透射电镜(TEM)照片。图3为本发明实施例二制备的仿生化的二氧化硅固定e-葡萄糖醛酸苷酶的纳米颗粒的孔径分布图。图4为采用本发明实施例二制备的仿生化二氧化硅所固定的e-葡萄糖醛酸苷酶的纳米颗粒的循环使用酶活力的变化图。具体实施方式实施例一准确称取e-葡萄糖醛酸苷酶l.Omg，溶解于0.05mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲溶液中，定容至10mL，得到0.Img/mLe-葡萄糖醛酸苷酶液。称取300mg硫酸鱼精蛋白，溶解于0.05mol/LTris-HC1缓冲溶液中，定容至20mL，得到15mg/mL硫酸鱼精蛋白溶液。用去离子水溶解硅酸钠，并用2mol/LHCl调节溶液的pH至7.0，制备10mmol/L硅酸钠溶液。e-葡萄糖醛酸苷酶液和硫酸鱼精蛋白溶液各取0.5ml，混合均匀后加入到7mL新鲜配制的硅酸钠溶液中，静置5min，设置离心机转速为4500r/min，离心分离10min。将上清液倒出，再用去离子水清洗，再离心10min，倒出上清液。反复清洗2-3次。通过黄芩苷的转化反应分析上清液中的e-葡萄糖醛酸苷酶含量，发现上清液无e-葡萄糖醛酸苷酶存在，对P-葡萄糖醛酸苷酶的固定率为100%。将仿生化二氧化硅固定e-葡萄糖醛酸苷酶的纳米颗粒置于真空冷冻干燥器中，-30'C下干燥，称重，沉淀量为19.5mg，于4'C下保存。将固定0-葡萄糖酸酸苷酶的纳米颗粒加入到8mL黄芩苷浓度为0.09mol/L的中性溶液中。并于37'C、搅拌条件下进行黄芩苷的转化反应，反应lh后，用高效液相色谱确定黄芩素的生成量，黄芩苷的转化率为2i.8%，相对游离e-葡萄糖醛酸苷酶的反应活性，酶活保持率41.7%。实施例二准确称取6-葡萄糖醛酸苷酶l.Omg，溶解于0.05mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HC1)缓冲溶液中，定容至10mL，得到0.lmg/mLe-葡萄糖醛酸苷酶液。称取40mg硫酸鱼精蛋白，溶解于0.05mol/LTris-HCl缓冲溶液中，定容至20mL，得到2mg/mL硫酸鱼精蛋白溶液。用去离子水溶解硅酸钠，并用2mol/LHCl调节溶液的pH至7.0,制备30國ol/L硅酸钠溶液。e-葡萄糖醛酸苷酶液和硫酸鱼精蛋白溶液各取0.5mL，混合均匀后加入到7mL新鲜配制的硅酸钠溶液中，静置10min，设置离心机转速为4500r/min，离心分离10min。将上清液倒出，再用去离子水清洗，再离心10min，倒出上清液。反复清洗2-3次。通过黄苳苷的转化反应分析上清液中的e-葡萄糖醛酸苷酶含量，发现上清液无e-葡萄糖醛酸苷酶存在，对e-葡萄糖醛酸苷酶的固定率为100%。将仿生化二氧化硅固定e-葡萄糖醛酸苷酶的纳米颗粒置于真空冷冻干燥器中，-30'C下干燥，称重，沉淀量为14.6mg，于4'C下保存。将固定e-葡萄糖醛酸苷酶的纳米颗粒加入到8mL黄芩苷浓度为0.09mol/L的中性溶液中。并于37-C、搅拌条件下进行黄苳苷的转化反应，反应lh后，用高效液相色谱确定黄苳素的生成量，黄零苷的转化率为23.5%，相对游离e-葡萄糖醛酸苷酶的反应活性，酶活保持率44.91实施例三准确称取e-葡萄糖醛酸苷酶l.Omg，溶解于去离子水中，定容至10ml，得到0.lmg/mie-葡萄糖醛酸苷酶液。称取300mg硫酸鱼精蛋白，溶解于去离子水中，定容至20ml，得到15mg/ml硫酸鱼精蛋白溶液。用去离子水溶解硅酸钠，并用2mol/LHC1调节溶液的pH至7.0，制备0.03腿ol/L硅酸钠溶液。P-葡萄糖醛酸苷酶液和硫酸鱼精蛋白溶液各取0.5mL，混合均匀后加入到10mL新鲜配制的硅酸钠溶液中，静置5min，设置离心机转速为4500r/min，离心分离10min。将上清液倒出，再用去离子水清洗，再离心10min，倒出上清液。反复清洗2-3次。通过黄芩苷的转化反应分析上清液中的P-葡萄糖醛酸苷酶含量，发现上清液无e-葡萄糖醛酸苷5酶存在，对e-葡萄糖醛酸苷酶的固定率为100%。将仿生化二氧化硅固定e-葡萄糖醛酸苷酶的纳米颗粒置于真空冷冻干燥器中，-30'C下干燥，称重，沉淀量为23.9mg，于4'C下保存。将固定e-葡萄糖醛酸苷酶的纳米颗粒加入到8mL黄芩苷浓度为0.09mol/L的中性溶液中。并于37'C、搅拌条件下进行黄芩苷的转化反应，反应lh后，用高效液相色谱确定黄芩素的生成量，黄芩苷的转化率为2i.i%，相对游离e-葡萄糖醛酸苷酶的反应活性，酶活保持率40.4%。实施例四准确称取e-葡萄糖醛酸苷酶l.Omg,溶解于去离子水中，定容至10mU得到0.l呢/mLe-葡萄糖醛酸苷酶液。称取40mg硫酸鱼精蛋白，溶解于去离子水中，定容至20mL，得到2mg/mL硫酸鱼精蛋白溶液。用去离子水溶解硅酸钠，并用2mol/LHC1调节溶液的pH至7.0，制备0.03mol/L硅酸钠溶液。e-葡萄糖醛酸苷酶液和硫酸鱼精蛋白溶液各取0.5mL，混合均匀后加入到8mL新鲜配制的硅酸钠溶液中，静置5min，设置离心机转速为4500r/min，离心分离10min。将上清液倒出，再用去离子水清洗，再离心10min，倒出上清液。反复清洗2-3次。通过黄芩苷的转化反应分析上清液中的葡萄糖醛酸苷酶含量，发现上清液无葡萄糖醛酸苷酶存在，对e-葡萄糖醛酸苷酶的固定率为100%。将仿生化二氧化硅固定e-葡萄糖醛酸苷酶的纳米颗粒置于真空冷冻干燥器中，-30'C下干燥，称重，沉淀量为13.5mg，于4。C下保存。将固定e-葡萄糖醛酸苷酶的纳米颗粒加入到8mL黄芩苷浓度为0.09mol/L的中性溶液中。并于37'C、搅拌条件下进行黄芩苷的转化反应，反应lh后，用高效液相色谱确定黄芩素的生成量，黄芩苷的转化率为24.2°/。，相对游离e-葡萄糖醛酸苷酶的反应活性，酶活保持率46.3%。实施例五准确称取0-葡萄糖醛酸苷酶l.Omg，溶解于0.05mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲溶液中，定容至10mL，得到0.lmg/mLe-葡萄糖醛酸苷酶液。称取100mg硫酸鱼精蛋白，溶解于0.05mol/LTris-HC1缓冲溶液中，定容至20mL，得到5mg/mL硫酸鱼精蛋白溶液。用浓度为15mg/mL的盐水溶解硅酸钠，并用2mol/LHC1调节溶液的pH至7.0，制备0.03mol/L硅酸钠的盐水溶液。P-葡萄糖醛酸苷酶液和硫酸鱼精蛋白溶液各取0.5mL，混合均匀后加入到7mL新鲜配制的硅酸钠溶液中，静置5min，设置离心机转速为4500r/min，离心分离10min。将上清液倒出，再用去离子水清洗，再离心10min，倒出上清液。反复清洗2-3次。通过黄芩苷的转化反应分析上清液中的e-葡萄糖醛酸苷酶含量，发现上清液无e-葡萄糖醛酸苷酶存在，对e-葡萄糖醛酸苷酶的固定率为100%。将仿生化二氧化硅固定e-葡萄糖醛酸苷酶的纳米颗粒置于真空冷冻干燥器中，-30"C下干燥，称重，沉淀量为33.6mg，于4t:下保存。将固定P-葡萄糖醛酸苷酶的纳米颗粒加入到8mL黄芩苷浓度为0.09mol/L的中性溶液中。并于37'C、搅袢条件下进行黄芩苷的转化反应，反应lh后，用高效液相色谱确定黄芩素的生成量，黄芩苷的转化率为23.9%，相对游离e-葡萄糖醛酸苷酶的反应活性，酶活保持率45.7%。实施例六准确称取葡萄糖醛酸苷酶l.Omg，溶解于0.05mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲溶液中，定容至10mL，得到0.lmg/mLe-葡萄糖醛酸苷酶液。称取100mg硫酸鱼精蛋白，溶解于0.05mol/LTris-HC1缓冲溶液中，定容至20mL，得到5mg/mL硫酸鱼精蛋白溶液。用浓度为2mg/mL的盐水溶解硅酸钠，并用2mol/LHC1调节溶液的pH至7.0，制备30mmol/L硅酸钠的盐水溶液。e-葡萄糖醛酸苷酶液和硫酸鱼精蛋白溶液各取0.5mL，混合均匀后加入到7mL新鲜配制的硅酸钠溶液中，静置15min，设置离心机转速为4500r/min，离心分离10min。将上清液倒出，再用去离子水清洗，再离心10min，倒出上清液。反复清洗2-3次。通过黄苳苷的转化反应分析上清液中的e-葡萄糖醛酸苷酶含量，发现上清液无e-葡萄糖醛酸苷酶存在，对葡萄糖醛酸苷酶的固定率为100%。将仿生化二氧化硅固定e-葡萄糖醛酸苷酶的纳米颗粒置于真空冷冻干燥器中，-30'C下干燥，称重，沉淀量为21.1mg，于4'C下保存。将固定P-葡萄糖醛酸苷酶的纳米颗粒加入到8mL黄芩苷浓度为0.09mol/L的中性溶液中。并于37。C、搅拌条件下进行黄芩苷的转化反应，反应lh后，用高效液相色谱确定黄芩素的生成量，黄芩苷的转化率为22.1%，相对游离3-葡萄糖醛酸苷酶的反应活性，酶活保持率42.3%。实施例七循环使用稳定性的测定对本发明实施例二制备的固定0-葡萄糖醛酸苷酶的纳米颗粒的循环使用稳定性进行将黄芩苷和无水亚硫酸钠溶解到0.03mol/LTris-HC1缓冲溶液中，配成黄芩苷浓度为0.09mol/L，无水亚硫酸钠浓度为0.1%w/v的溶液，加入实施例二制备的固定化e-葡萄糖醛酸苷酶的纳米颗粒，在37°C，搅拌的条件下进行黄芩苷的转化反应，用高效液相色谱确定黄芩素的生成量，得到固定化e-葡萄糖醛酸苷酶的酶活力，并以此酶活力为初始酶活力，定义为100%。将反应悬浮液离心分离10min(离心机转速为4500r/min)，用去离子水清洗颗粒至上清液中无黄芩苷和黄芩素。重复上述反应过程，得到第二次重复使用的鹵定化e-葡萄糖醛酸苷酶的酶活力，与初始活力相比，此时的相对酶活力为97%。重复分离和反应过程，得到第三次重复使用的固定化e-葡萄糖醛酸苷酶的相对酶活力为90%;第四次重复使用的固定化e-葡萄糖醛酸苷酶的相对酶活力为80%;第五次重复使用的固定化e-葡萄糖醛酸苷酶的相对酶活力为78%;第六次重复使用的固定化e-葡萄糖醛酸苷酶的相对酶活力为57%。实施例八将本发明实施例二制备的固定e-葡萄糖醛酸苷酶的纳米颗粒在4'C条件下存储30天，然后测定其酶活力将黄芩苷和无水亚硫酸钠溶解到0.03mol/LTris-HCl缓冲溶液中，配成黄芩苷浓度为0.09mol/L，无水亚硫酸钠浓度为0.1%w/v的溶液，加入在4'C条件下存储了30天的实施例二制备的固定3-葡萄糖醛酸苷酶的纳米颗粒，在37'C，搅拌的条件下进行黄芩苷的转化反应，在一定的时间间隔内，取出100uL反应液，用高效液相色谱确定黄芩素的生成量，得到固定化e-葡萄糖醛酸苷酶的酶活力，与新鲜制备的固定化e-葡萄糖醛酸苷酶的酶活力相比，相对酶活力为99%。表i所示为实施例七和实施例八测定的固定化e-葡萄糖醛酸苷酶及其在4'c条件下存储30天后进行黄芩苷转化反应的相对酶活力。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>从对比结果可见，4'C条件下存储30天固定化e-葡萄糖醛酸苷酶用于黄芩苷的转化反应，相对酶活力与固定化e-葡萄糖醛酸苷酶的相对酶活力基本相当。权利要求1.一种仿生化二氧化硅固定β-葡萄糖醛酸苷酶的纳米颗粒制备方法，其特征在于包括以下过程(1)将硫酸鱼精蛋白溶于浓度为0.05mol/L的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液中或去离子水中，配制成浓度为2～15mg/mL的硫酸鱼精蛋白溶液，将β-葡萄糖醛酸苷酶溶于浓度为0.05mol/L的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液中或去离子水中，配制成浓度为0.1mg/mL的β-葡萄糖醛酸苷酶溶液，然后将硫酸鱼精蛋白溶液与β-葡萄糖醛酸苷酶溶液按体积比为1∶1的混合均匀制得混合液；(2)将硅酸钠溶于去离子水或浓度为2～15mg/mL的盐水中，并用2mol/LHCl调节溶液的pH至7.0，配制10～30mmol/L的硅酸钠溶液；(3)按照体积比为1∶7～10的比例，将步骤(1)得到的混合液加入到步骤(2)制得的硅酸钠溶液中，静置5～20分钟，离心分离，去除上清液，用去离子水洗涤至上清液中无β-葡萄糖醛酸苷酶存在为止，再经冷冻干燥，得到仿生化二氧化硅固定β-葡萄糖醛酸苷酶的纳米颗粒。全文摘要本发明公开了一种仿生化二氧化硅固定β-葡萄糖醛酸苷酶的纳米颗粒制备方法。该方法过程包括，将硫酸鱼精蛋白溶于三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液或去离子水中，配制硫酸鱼精蛋白溶液，将β-葡萄糖醛酸苷酶溶于三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液中或去离子水中，配制β-葡萄糖醛酸苷酶溶液，硫酸鱼精蛋白溶液与β-葡萄糖醛酸苷酶溶液混合制得混合液；将硅酸钠溶于去离子水或盐水中，并调节pH值得硅酸钠溶液；将混合液加入硅酸钠溶液中，经静置，分离，去除上清液，洗涤，冷冻干燥，得到仿生化二氧化硅固定β-葡萄糖醛酸苷酶的纳米颗粒。本发明的优点在于制备工艺简单，所固定的β-葡萄糖醛酸苷酶的活力维持率高，重复使用稳定性好。文档编号C12N11/14GK101182511SQ20071015025公开日2008年5月21日申请日期2007年11月21日优先权日2007年11月21日发明者洪吴,姜忠义,张羽飞,林李申请人:天津大学