专利名称：一株降解河道底泥中硝基苯的微球菌的培养方法
一株降解河道底泥中硝基苯的微球菌的培养方法 技术领域i本发明涉及降解毒性有机污染物的微生物的筛选与培养方法，特别是一株对河道底泥中硝基苯化合物具有特异降解能力的微球菌(M/crococc附 平)的筛选和培养方法。
背景技术：
硝基苯类化合物是美国国家环保总署(EPA)优先控制污染物名 录中的典型物质，对人体具有显著的神经和消化毒性，虽然硝基苯在生物体内一般不会累积，但一些研究结果表明在硝基苯浓度较高的场合，通过食物链摄入，可能会导致诱发恶性肿瘤。因此，采用各种方法严格限制环境介质中的硝基苯含 量，对保证人类健康具有重要意义。硝基苯类化合物通^具有一定的挥发性， 一般由化工、炸药、制药等行业产 生，并随废水排放至地表水体，如河流。硝基苯进入河水后，随着水流紊动，一 部分将挥发至大气中，另一部分可吸附在泥沙颗粒上，沉入河道底部，进入河底 污泥层。由于污泥层中的有机质含量较高，污泥层内的颗粒更加细，因此硝基苯 趋向于与污泥更加牢固地吸附，形成累积。当水力条件适宜时，会重新进入水体， 或逸入大气，造成生物毒害。硝基苯类化合物的生物降解性较差，传统上通常采取首先进行臭氧氧化或者 铁碳微电解方法处理，使硝基苯的苯环在化学力作用下打开，降低其生物毒性， 然后采用微生物好氧处理的方法进一步降解，使其成为低分子量无害物质。这种 方法的优点是能确保苯环开环，降低硝基苯对微生物的毒性，提高后续生化处理效率；缺点是流程过长，工艺复杂，成本较高。为了解决传统处理方法存在的不足，研究者开始尝试寻求利用特异微生物一 次完成硝基苯降解的新途径，而实现这一途径必须要首先解决特异微生物的筛选 与培养问题。河道底泥中的硝基苯形态稳定，不易脱附，为微生物发挥定向降解 作用提供了较好的条件。但遗憾的是，到目前为止，.尚没有以河道底泥硝基苯为 降解对象，建立对硝基苯具有特异降解能力的微球菌培养方法的文献报道。
发明内容
本发明的目的是提供一株降解河道底泥中硝基苯的微球菌的培养 方法，该方法具有流程短、工艺简单、和成本低的特点。为实现上述目的，本发明首先设计一种富集分离培养基，从河道底泥中分离
出一种硝基苯优势降解细菌并进行纯化培养，其具体步骤如下1、 配制富集分离培养基富集分离培养基由NaCl、 K2S04、 MgS(V7H20、 维生素B、硝基苯和水组成，pH为7.0-7.2，先准备5个三角瓶，分别标记为A 瓶、B瓶、C瓶、D瓶和E瓶，每个瓶都装等量的富集分离培养基，其中NaCl、 K2S04、 MgSCV7H20和维生素B的含量是固定的，它们是(质量百分比)0.5% NaCl， 0.8%K2SO4， 0.5% MgS04.7H20， 0.01%维生素B，在A瓶、B瓶、C瓶、 D瓶和E瓶中，硝基苯的含量依次为(质量百分比)0.5%、 0.4%、 0.3%、 0.2% 和0.1%，水的含量依次为(质量百分比):97.69%、 97.79%、 97.89%、 97.99% 和98.09%。然后将富集分离培养基于lirC下湿热灭菌30min，冷却至常温备用。2、 富集分离培养首先，按照上述富集分离培养基质量的5%取河道底泥， 接种到A瓶中，置28'C-3(TC空气浴震荡培养箱中培养36h-48h;培养完成后， 在A瓶内取5ml培养液，接种到B瓶中，置28r-30°。空气浴震荡培养箱中培 养24h - 36h;培养完成后，在B瓶内取5ml培养液，接种到C瓶中，置28°C - 30°C 空气浴震荡培养箱中培养24h;培养完成后，在C瓶内取5ml培养液，接种到D 瓶中，置28'C - 3(TC空气浴震荡培养箱中培养24h;培养完成后，在D瓶内取 5ml培养液，接种到E瓶中，置28'C-30'C空气浴震荡培养箱中培养24h。这样 便获得最终富集培养液。3、 配制纯化培养基其组分和含量为(质量百分比)0.1%牛肉膏，0.5%葡 萄糖，0.5%NaCl， 0.8%K2SO4， 0.5% MgS04-7H20， 0.01%维生素B, 0.1%硝 基苯，1.5-2.0%琼脂，95.49% - 95.99%水，pH = 7.0-7.2，于111。C下湿热灭菌 30min，然后将纯化培养基分别倾倒入8个培养皿中，冷却至常温，使每个培养 皿底部均形成均匀的薄层凝固层。4、 纯化培养a、取富集分离培养得到的最终富集培养液lml接种到一个形 成纯化培养基均匀薄凝固层的培养皿中，置28°C - 30'C恒温培养箱中培养24h， 在纯化培养基表面形成若干乳黄色菌苔；b、选取形态相同且数量居多数的菌苔， 用接种环挑取微量，在另一个形成纯化培养基均匀薄凝固层的培养皿中划线，置 28X:-3(TC恒温培养箱中培养24h，在纯化培养基表面形成形态基本相同的菌苔； c、按上述b步骤重复操作6次，最终获得纯菌株，即对硝基苯具有特异降解能 力的微球菌，于4'C保存。5、 配制扩大繁殖培养基其组分和含量为(质量百分比)0.2%-0.3%牛肉 膏，0.5% - 1.0%葡萄糖，0.4% - 0.6% NaCl， 0.6% - 0.8% K2S04， 0.3% - 0.6%MgS04.7H20， 0.01%-0.03%维生素B， 96.67% - 97.99%水，pH = 7.0-7.2，置于 三角瓶中，于1lrC下湿热灭菌30min,冷却至常温备用。6、扩大增殖培养a、在无菌条件下，取扩大繁殖培养基200ml置于三角瓶 中；b、用接种环取两环微球菌菌苔，接种于盛有200ml扩大繁殖培养基的三角 瓶中，于28'C -3(TC空气浴震荡培养箱中培养36h-48h后，静置10min，待培 养液中的浑浊物全部沉淀于三角瓶底部后，倒出三角瓶中50ml - 100ml上层清 液；c、在无菌条件下，向该三角瓶中补充与倒出上层清液等体积(50ml-100ml) 的扩大繁殖培养基，置28t:-3(rC空气浴震荡培养箱中培养24h后，所获培养液 即为扩大增殖的微球菌菌液。本发明首次从河道底泥中筛选出对硝基苯具有特异降解能力的微球菌。该位 球菌的筛选、分离、纯化和扩大培养方法简单、可靠，各培养基的组分易得、配 制方便。利用所获微球菌直接降解河道底泥中的硝基苯，可縮短传统治理工艺流 程、縮减成本，提高效聿，为开发硝基苯污染河道底泥的原位微生物修复新技术 提供了可能。
具体实施例方式实施例1:1、 配制富集分离培养基准备5个300ml三角瓶，分别标记为A瓶、B瓶、 C瓶、D瓶和E瓶，按组分含量(质量百分比，下同)为0.5%硝基苯、0.5%NaCl， 0.8%K2SO4、 0.5% MgS04-7H20、 0.01%维生素B、 97.69%水，pH = 7.0配制 的lOOg富集分离培养基置于A瓶；将组分含量为0.4%硝基苯、0.5%NaCl， 0.8% K2S04、 0.5%MgSO4'7H2O、 0.01%维生素B、 97.79%水、pH-7.0配制的lOOg 富集分离培养基置于B瓶；将组分含量为0.3%硝基苯、0.5%NaCl， 0.8%K2SO4、 0.5% MgS04'7H20、 0.01%维生素B、 97.89%水、pH = 7.0配制的lOOg富集分 离培养基置于C瓶；将组分含量为0.2%硝基苯、0.5%NaCl， 0.8%K2SO4、 0.5% MgS04.7H20、 0.01%维生素B、 97.99%水、pH = 7.0配制的lOOg富集分离培 养基置于D瓶；将组分含量为0.1%硝基苯、0.5% NaCl， 0.8% K2S04、 0.5% MgS04'7H20、 0.01%维生素B、 98.09%水、pH = 7.0配制的lOOg富集分离培 养基置于E瓶。然后将富集分离培养基于lirC下湿热灭菌30min，冷却至常温备用o2、 富集分离培养取5g河道底泥，接种于A瓶中，置28'C空气浴震荡培 养箱中培养40h后，在A瓶内取5ml培养液，接种到B瓶中，置28'C空气浴震
荡培养箱中培养30h后，在B瓶内取5ml培养液，接种到C瓶中，置28'C空气 浴震荡培养箱中培养24h后，在C瓶内取5ml培养液，接种到D瓶中，置28" 空气浴震荡培养箱中培养24h后，在D瓶内取5ml培养液，接种到E瓶中，置 28'C空气浴震荡培养箱中培养24h，获得最终富集培养液。3、 配制纯化培养基其组分和含量为(质量百分比)0.1%牛肉膏，0.5%葡 萄糖，0.5%NaCl， 0.8%K2SO4， 0.5% MgS04.7H20， 0.01%维生素B， 0.1%硝 基苯，1.5%琼脂，pH = 7.0， 95.99%水，置于lirC下湿热灭菌30min，在无 菌条件下分别倾倒入8个培养皿中，冷却至室温后，每个培养皿底部均形成均匀 薄凝固层。4、 纯化培养a、用移液管量取lml最终富集培养液，接种到一个形成纯化 培养基均匀薄凝固层的培养皿中，置28'C恒温培养箱中培养24h，在纯化培养基 均匀薄凝固层表面形成若干乳黄色菌苔。b、用接种^"'挑取该培养皿中的数量居 多的乳黄色菌苔，在另、一个形成纯化培养基均匀薄凝固层的培养皿中划线，置 28'C恒温培养箱中培养24h，在纯化培养基均匀薄凝固层表面形成形态基本相同 的菌苔。c、按上述b步骤重复操作6次，即可获得纯化的微球菌株，于4。C下 保存。5、 配制扩大繁殖培养基其组分和含量为(质量百分比)0.2%牛肉膏，0.5% 葡萄糖，0.4% NaCl， 0.6% K2S04， 0.3% MgS04'7H20， 0.01%维生素B， pH = 7.0， 97.99%水，置于三角瓶中，于1lrC下湿热灭菌30min，冷却至常温备用。6、 扩大增殖培养a、在无菌条件下，取扩大繁殖培养基200ml置于三角瓶 中。b、用接种环取两环微球菌苔，接种于上述盛有200ml扩大繁殖培养基的三 角瓶中，置28'C空气浴震荡培养箱中培养40h后，静置10min，待培养液中的浑 浊物全部沉淀于三角瓶底部，倒出50ml上层清液。c、在无菌条件下，向该三角 瓶中补充50ml扩大繁殖培养基，置28'C空气浴震荡培养箱中培养24h后，即获 得扩大增殖的微球菌菌液。实施例2:1、配制富集分离培养基准备5个300ml三角瓶，分别标记为A瓶、B瓶、 C瓶、D瓶和E瓶，按组分含量(质量百分比，下同)为0.5%硝基苯、0.5%NaCl， 0.8%K2SO4、 0.5% MgS04'7H20、 0.01%维生素B、 97.69%水，pH = 7.0配制 的lOOg富集分离培养基置于A瓶；将组分含量为0.4%硝基苯、0.5%NaCl， 0.8% K2S04、 0.5%MgSO4'7H2O、 0.01%维生素B、 97.79%水、pH-7.0配制的lOOg
富集分离培养基置于B瓶；将组分含量为0.3%硝基苯、0.5%NaCl， 0.8% K2S04、 0.5% MgS04.7H20、 0.01%维生素B、 97.89%水、pH = 7.0配制的100g富集分 离培养基置于C瓶；将组分含量为0.2%硝基苯、0.5%NaCl， 0.8%K2SO4、 0.5% MgS04.7H20、 0.01%维生素B、 97.99%水、pH = 7.0配制的100g富集分离培 养基置于D瓶；将组分含量为0.1%硝基苯、0.5% NaCl， 0.8% K2S04、 0.5% MgS04.7H20、 0.01%维生素B、 98.09%水、pH = 7.0配制的100g富集分离培 养基置于E瓶。然后将富集分离培养基于lirC下湿热灭菌30min，冷却至常温备用o2、 富集分离培养取5g河道底泥，接种于A瓶中，置3(TC空气浴震荡培 养箱中培养48h后，在A瓶内取5ml培养液，接种到B瓶中，置30'C空气浴震 荡培养箱中培养36h后，在B瓶内取5ml培养液，接种到C瓶中，置28'C空气 浴震荡培养箱中培养36h后，在C瓶内取5ml培养液，接种到D瓶中，置28'C 空气浴震荡培养箱中培养24h后，在D瓶内取5ml培养液，接种到E瓶中，置 28'C空气浴震荡培养箱中培养24h，获得最终富集培养液。3、 配制纯化培养基其组分和含量为(质量百分比)0.1%牛肉膏，0.5%葡 萄糖，0.5%NaCl， 0.8%K2SO4， 0.5% MgS04'7H20， 0.01%维生素B， 0.1%硝 基苯，2.0%琼脂，pH = 7.2， 95.49%水，置于lirC下湿热灭菌30min，在无 菌条件下分别倾倒入8个培养皿中，冷却至室温后，每个培养皿底部均形成均匀 薄凝固层。4、 纯化培养a、用移液管量取lml最终富集培养液，接种到一个形成纯化 培养基均匀薄凝固层的培养皿中，置3(TC恒温培养箱中培养24h，在纯化培养基 均匀薄凝固层表面形成若干乳黄色菌苔。b、用接种针挑取该培养皿中的数量居 多的乳黄色菌苔，在另一个形成纯化培养基均匀薄凝固层的培养皿中划线，置 3(TC恒温培养箱中培养24h，在纯化培养基均匀薄凝固层表面形成形态基本相同 的菌苔。c、按上述b步骤重复操作6次，即可获得纯化的微球菌株，于4。C下 保存。5、 配制扩大繁殖培养基其组分和含量为(质量百分比)0.3%牛肉膏，1.0% 葡萄糖，0.6% NaCl， 0.8% K2S04, 0.6% MgS04'7H20， 0.03%维生素B， pH = 7.2， 96.67%水，置于三角瓶中，于1lrc下湿热灭菌30min，冷却至常温备用。6、 扩大增殖培养a、在无菌条件下，取扩大繁殖培养基200ml置于三角瓶 中。b、用接种环取两环微球菌苔，接种于上述盛有200ml扩大繁殖培养基的三
角瓶中，置30'C空气浴震荡培养箱中培养48h后，静置10min，待培养液中的浑 浊物全部沉淀于三角瓶底部，倒出100ml上层清液。c、在无菌条件下，向该三 角瓶中补充100ml扩大繁殖培养基，置3(TC空气浴震荡培养箱中培养24h后， 即获得扩大增殖的微球菌菌液。
权利要求
1、一株降解河道底泥中硝基苯的微球菌的培养方法，其特征是本发明首先设计一种富集分离培养基，从河道底泥中分离出一种硝基苯优势降解细菌并进行纯化培养，其具体步骤如下(1)、配制富集分离培养基富集分离培养基由NaCl、K2SO4、MgSO4·7H2O、维生素B、硝基苯和水组成，pH为7.0-7.2，先准备5个三角瓶，分别标记为A瓶、B瓶、C瓶、D瓶和E瓶，每个瓶都装等量的富集分离培养基，其中NaCl、K2SO4、MgSO4.7H2O和维生素B的含量是固定的，它们是(质量百分比)0.5％NaCl，0.8％K2SO4，0.5％MgSO4·7H2O，0.01％维生素B，在A瓶、B瓶、C瓶、D瓶和E瓶中，硝基苯的含量依次为(质量百分比)0.5％、0.4％、0.3％、0.2％和0.1％，水的含量依次为(质量百分比)97.69％、97.79％、97.89％、97.99％和98.09％，然后将富集分离培养基于111℃下湿热灭菌30min，冷却至常温备用；(2)、富集分离培养首先，按照上述富集分离培养基质量的5％取河道底泥，接种到A瓶中，置28℃-30℃空气浴震荡培养箱中培养36h-48h；培养完成后，在A瓶内取5ml培养液，接种到B瓶中，置28℃-30℃空气浴震荡培养箱中培养24h-36h；培养完成后，在B瓶内取5ml培养液，接种到C瓶中，置28℃-30℃空气浴震荡培养箱中培养24h；培养完成后，在C瓶内取5ml培养液，接种到D瓶中，置28℃-30℃空气浴震荡培养箱中培养24h；培养完成后，在D瓶内取5ml培养液，接种到E瓶中，置28℃-30℃空气浴震荡培养箱中培养24h。这样便获得最终富集培养液；(3)、配制纯化培养基其组分和含量为(质量百分比)0.1％牛肉膏，0.5％葡萄糖，0.5％NaCl，0.8％K2SO4，0.5％MgSO4·7H2O，0.01％维生素B，0.1％硝基苯，1.5-2.0％琼脂，95.49％-95.99％水，pH＝7.0-7.2，于111℃下湿热灭菌30min，然后将纯化培养基分别倾倒入8个培养皿中，冷却至常温，使每个培养皿底部均形成均匀的薄层凝固层；(4)、纯化培养a、取富集分离培养得到的最终富集培养液1ml接种到一个形成纯化培养基均匀薄凝固层的培养皿中，置28℃-30℃恒温培养箱中培养24h，在纯化培养基表面形成若干乳黄色菌苔；b、选取形态相同且数量居多数的菌苔，用接种环挑取微量，在另一个形成纯化培养基均匀薄凝固层的培养皿中划线，置28℃-30℃恒温培养箱中培养24h，在纯化培养基表面形成形态基本相同的菌苔；c、按上述b步骤重复操作6次，最终获得纯菌株，即对硝基苯具有特异降解能力的微球菌，于4℃保存；(5)、配制扩大繁殖培养基其组分和含量为(质量百分比)0.2％-0.3％牛肉膏，0.5％-1.0％葡萄糖，0.4％-0.6％NaCl，0.6％-0.8％K2SO4，0.3％-0.6％MgSO4·7H2O，0.01％-0.03％维生素B，96.67％-97.99％水，pH＝7.0-7.2，置于三角瓶中，于111℃下湿热灭菌30min，冷却至常温备用；(6)、扩大增殖培养a、在无菌条件下，取扩大繁殖培养基200ml置于三角瓶中；b、用接种环取两环微球菌菌苔，接种于盛有200ml扩大繁殖培养基的三角瓶中，于28℃-30℃空气浴震荡培养箱中培养36h-48h后，静置10min，待培养液中的浑浊物全部沉淀于三角瓶底部后，倒出三角瓶中50ml-100ml上层清液；c、在无菌条件下，向该三角瓶中补充与倒出上层清液等体积(50ml-100ml)的扩大繁殖培养基，置28℃-30℃空气浴震荡培养箱中培养24h后，所获培养液即为扩大增殖的微球菌菌液。
全文摘要
一株降解河道底泥中硝基苯的微球菌的培养方法，本发明首先设计一种富集分离培养基，从河道底泥中分离出一种硝基苯优势降解细菌并进行纯化培养，其具体步骤为1.配制富集分离培养基；2.富集分离培养；3.配制纯化培养基；4.纯化培养；5.配制扩大繁殖培养基；6.扩大增殖培养。本发明首次从河道底泥中筛选出对硝基苯具有特异降解能力的微球菌。该位球菌的筛选、分离、纯化和扩大培养方法简单、可靠，各培养基的组分易得、配制方便。利用所获微球菌直接降解河道底泥中的硝基苯，可缩短传统治理工艺流程、缩减成本，提高效率，为开发硝基苯污染河道底泥的原位微生物修复新技术提供了可能。
文档编号C12N1/20GK101210229SQ20071015825
公开日2008年7月2日 申请日期2007年11月13日 优先权日2007年11月13日
发明者孙铁珩, 李晓东, 李海波, 杨瑞崧 申请人:沈阳大学