肌醇六磷酸酶变体的制作方法

专利名称：：肌醇六磷酸酶变体的制作方法
技术领域：
：本发明涉及亲^MJf六磷酸酶的变体，具体为热稳定性和/或比活性提高的变体。本发明也涉及编码此变体的DNA序列，在重组宿主细胞生产它们，以及^JD所述变体的方法，胁在动物饲料领域。优选的亲^RSI六磷酸酶是包含SEQIDNO:2的隔孢伏革菌属(尸era'o/^ora)Mii享六磷酸酶。
背景技术：
：名称为"Modifiedphytases"的EP897010公开了本文^J见的(i.a.)烟曲霉G4s/e^z7/ws^7Ww^紐)月/LS孚六磷酸酶的某些变体。名称为"Consensusphytases"的EP897985公开了本文^t见的可基于例如数个子嚢菌月/Uil"六磷酸酶的序列多重比对i殳计的真菌共有(Consensus)MJ孚六石粦酸酵。名称为"Thermostablephytasesinfeedpreparationandplantexpression"的WO99/48380涉及4躺热稳定的月/LS孚六磷酸酶的某些方面。热稳定的肌醇六磷酸酶的实施例见第30页粗线下列出的数个共有(consensus)MJ孚六磷酸酶。名称为"Improvedphytases"的WO00/43503涉^^文未现的热稳定性增加的某些MJ享六磷酸酶变体，该变体可通过EP897985所述类似的方法来设计。热稳定的月/U享六磷S吏酶的实施例见第54-55页粗线下所示。这些MJ享六磷酸酶均与SEQIDNO:2具有75%以下的百分比同一性。本发明的一个目的是提供新的和改进的M^I六磷酸酶变体,具体为热稳定性改进和/或比活性增加。WO98/28408中公开了来自尸ew/op/Kra/yd/的肌醇六磷酸酶，并且WO99/49022中公开了它的某些变#<见例如在第76-77页的权利要求31)，然而已放弃了为了4^发明目的的变体。
发明内容本发明涉及亲代肌醇六磷酸酶的变体，包含在选自如下区域的至少一个区域的至少一个位置的取代20;26;28-31;37-48;55-69;73-83;91-119;123-126;135-142;152-163;169-199;204-222;229-238;248-266;284-289;300-308;321-335;343-350;384-398;407-412;和419-430;其中(a)所述变体具有肌醇六磷酸酶活性；并且(b)每个位置对应于SEQIDNO:2的一个位置；并且(c)所述变体与SEQIDNO:2有至少75%的百分比同一性；并且(d)附带所述变体不是选自如下的户e"/o;/zora/yc//CBS686.96月/LSf六磷酸酶的变体G26S;Y28N;D29S;F31Y;E42D，KA;T45R;V46I;W59F;S62D;A64K;R65Q,E,GA;S66T;R67A，I，Q，K;Q68Y,V,I;K74民A;A99N;D100S;L102V;P103E;F104L;扁7T，Q;S109M;H腦，V;Qll1E，N;Tl12A,S;M116F，I,L;A135S;D137Y;Q138D,S,G;D142A;()154fH;S155N;G156P;E157Q，S;E169S;E170A，P;G171A;0171aS;T174P，A;N177S;N178S,T;M179T,V，L;N182A，V;V184G;D185E;()185eT;G186S,A;D187R^K，S;()187aV，T;E188Q,S，A,V;S189E;V195L;N199A，P;L204N;A207D,H;S216T;D217E;L219Y，T;T220Y，N;L221F;M222L;L230V;()235eE，Q;V248民I;S249Q,A;E251D;Y254A，L，G;D255N;D257K;Y259F;T262H;P264A;G286民H;Q287K,S;A288P;T321Q，S，G;M322I;V323I;P324A;A327S，F,I,L;F332Y;N333P;E344R;R346P;W348F;V349L,A,S;D350S,V;G388A;V393R;E395KT;或L396R。本发明也涉及编码所必/LS享六磷酸酶变体的分离的核酸序列，和包含所述核酸序列的核酸构建体，载体，^Jft主细胞，以M产并使用所iiMJ争六磷酸酶变体的方法。具体地说，本申请涉及如下方面(1)亲代肌醇六磷酸酶的变体，包含选自如下区域的至少一个区域的至少一个位置的取代20;26;28-31;37-48;55-69;73-83;91-119;123-126;135-142;152-163;169-199;204-222;229-238;248-266;284-289;300-308;321-335;343-350;384-398;407-412;和419-430;其中(a)所述变体具有肌醇六磷酸酶活性；和(b)每个位置对应于SEQIDNO:2的位置；和(c)所述变体与SEQIDNO:2具有至少75%的百分比同一性；和(d)附带条件是所述变体不是选自如下的Pe"/o//2oraCBS686.96肌醇六磷酸酶的变体G26S;Y28N;D29S;F31Y;E42D，K,A;T45R;V46I;W59F;S62D;A64K;R65Q,E，GA;S66T;R67A，I，Q，K;Q68Y,V,1;K74R，A;A99N;D100S;L102V;P103E;F104L;N107T,Q;S109M;H110S,V;Q111E,N;T112A,S;M116F，I，L;A135S;D137Y;Q138D,S，G;D142A;()154fH;S155N;G156P;E157Q,S;E169S;E170A，P;G171A;()171aS;T174P，A;N177S;N178S，T;M179T,V,L;N182A，V;V184G;D185E;()185eT;G186S，A;D187R，K，S;()187aV,T;E188Q，S,A，V;S189E;V195L;N199A，P;L204N;A207D，H;S216T;D217E;L219Y,T;T220Y,N;L221F;M222L;L230V;()235eE，Q;V248R，I;S249Q,A;E251D;Y254A,L，G;D255N;D257K;Y259F;T262H;P264A;G286R,H;Q287K,S;A288P;T321Q,S,G;M322I;V323I;P324A;A327S，F，I，L;F332Y;N333P;E344R;R346P;W348F;V349L，A，S;D350S，V;G388A;V393R;E395K,T;和L396R。(2)项1的变体，其含有的取代或取代的组合选自下述取代和取代的组合(i)20R+95R+97V+98G;(ii)29N+102I;(iii)29N+118A;(iv)29N+163P+324S;(v)29N+163P+324S+395G;(vi)29N+234S;(vii)29N+324S;(viii)29S;(xi)29S+95H+110W+183W+324A+350V;(xii)29S+95M+110W+183W+324A+350V;(xiii)29S+95N+110R+183W+324A+350V;(xiv)29S+95R+110W+183W+324A+350V;(xv)29S+95S+l10R+183W+324A+350V;(xvi)29S+95S+110W+183W+324A+350V;(xvii)29S+95T+110R+183W+324A+350V;(a0s￡+SW7￡+Vl7a+18i2+asn+s6z(a!pO〗A0S￡+V1^￡+NS81+丛￡8l+人01HS6乙(n!F):A0S￡+3l7e￡+Vt^￡+CKn+a66+S6S(mx):A0S￡+V1^￡+AV￡8I+A0II+丄S6+S6乙(nx)(Vl7Z￡+AV￡8I+A0n+lS6+S6Z(P0〗A0S￡+V1^￡+CI8t^+AV￡81+入(HI+丄S6+S6乙(XPX):八OS￡+Vt^￡+lI611+入011十工S6+S6乙("!八皿):AOS￡+V1/Z￡+S81^+dS81+AV￡81+入011+丄S6+S6乙(n八xxx)〗A0Se+V1^+O,+dS8I+yM8I+人0II+丄S6+S6Z(!證x):AOSS+Vt7^+丄8t^+3S81+AV￡81+人011十丄S6+S6乙(八xxx)()():A0S￡+Vt^￡+S81^+:^8I+yW￡8I+A0n+lS6+S6Z(!xxx)—O01乙+S161+3061+S/<811+AV￡81+人011十丄S6+S6乙(XIXX):AOS￡+VW￡+€)81^+HS81+丛￡81+入011+1S6+S6Z(H!axx)-Vt7^￡+V￡^￡+VI2￡+￡)8l7^+HS8I+AV￡8I+A0II+丄S6+S6乙(H八xx):AOS￡+VW￡+S81^+3S81+AV￡81+人011十丄S6+S6乙(!八xx)tA0S￡+V1^￡+38t^+VS8I+AV￡8I+A(HI+IS6+S6Z(Ap)(A0S￡+Vt^￡+O8t^+VS8I+AV￡8I+A0n+lS6+S6Z(!nxx)fA0"+V匿+V8t7乙+VS8I+A^8I+入0II+丄S6+S6乙(Hxx)乙+"H161+S061+"H/<811+AV￡81十^I厶SI+人011十丄S6+S6乙(!xx):AOS￡+Vt^￡+AV￡81I+"H9SI+人011十丄S6+S6乙(xx)￡+丛￡811SI+39^I+VZ^I+人011+丄6^(x!x):A0^+Vl7^+S98乙+A^8I+CKn+人0H+丄S6+S6乙(!nAX)虽s8/，憲法能改(xlvii)29S+125D+324A;(xlviii)29S+125D+324A+330R+395G;(xlix)29S+125D+324A+350V;(1)29S+183A+324A+350V;(li)29S+183G+324A+334E+344S+350V;(lii)29S+183W+324A+350V;(liii)29S+205S;(liv)29S+324A+350V;(Iv)29T+324L;(Ivi)45A+350V+421R+422R+423N+424S+425L+426E+427G+428R+4291+43OM;(Ivii)69A+334E;(Iviii)99D+398T;(lix)114A+187G+194R+324S;(Ix)218T+334G;(Ixi)323A+324S;(Ixii)324S;(Ixiii)324S+328T;(Ixiv)324S+345D+347Q;(Ixv)324S+395G;(Ixvi)330R;(Ixvii)334D+343N+344V;(Ixviii)334E+344A;(Ixix)345H+347P+350V;和(Ixx)350V。(3)分离的核酸序列，其包含编码项1或2变体的核酸序列。(4)核酸构建体，其包含项3的核酸序列，其可操纵连接到一或多个指导在适宜表达宿主生产所述多肽的可控序列。(5)重组表达载体，其包含项4的核酸构建体。(6)重组宿主细胞，其包含项4的核酸构建体和/或项5的表达载体。(7)生产项1或2任一的变体的方法，其包含(a)培养项6的宿主细胞来生产包含所述变体的上清；和(b)回收所述变体。(8)转基因植物，或植物部分，其能表达项1或2的肌醇六磷酸酶变体。(9)转基因，非人动物，或产物，或其元件，其能表达项1或2的肌醇六磷酸酶变体。(10)包含项1或2的至少一个肌醇六磷酸酶变体的组合物，和(a)至少一种脂肪可溶维生素；(b)至少一种水溶维生素；和/或(c)至少一种痕量矿物质。(11)项10的组合物，其还包含至少一个选自下述酶的酶木聚糖酶，葡聚糖内切酶，内切-1,3(4)-(3葡聚糖酶，和蛋白酶。(12)项10或11的组合物，其为动物如]^l"添加剂。(13)动物饲料组合物，其粗制蛋白质含量为50-800g/kg，并包含项1或24壬一的变体或项10或124壬一的组合物。(14)提高动物饲料营养价值的方法，其中将项1或2任一的变体或项10或12任一的组合物加到所述饲料。(15)降低动物粪便中肌醇六磷酸盐水平的方法，包含喂给动物有效量的项13的饲料。(16)处理植物蛋白质的方法，包含将项l或2任一的变体或项10或12任一的组合物加到至少一个植物蛋白质或蛋白质源的步骤。(17)项1或2任一的变体或项10或12任一的组合物在如下的用途在动物飼料中；在动物饲料制备中；为提高动物饲料营养价值；降低动物粪便中肌醇六磷酸盐水平；处理植物蛋白质；或从肌醇六磷酸酶底物释放磷。图1提供了含有SEQIDNO:2的氨基酸序列的尸em'op/zora/_yc//肌醇六磷酸酶3D结构的坐标。发明详述隔孢伏革菌肌醇六磷酸酶的三维结构才艮才居在X隱RayStructureDetermination,Stout,G.K.andJensen,L.H.,JohnWiley&Sons,Inc.NY,1989给出的X-射线结晶(crystallographic)方法的原理得到所述尸e"/op/wra/_yc"肌醇六磷酸酶的结构。用同晶置换(isomorphousreplacement)方法在2.2A分辨率下在图1以标准的PDB格式(ProteinDataBank,BrookhavenNationalLaboratory,Brookhaven,CT)给出所述晶体结构的结构坐标。图i的PDB文件仅涉及此肌醇六磷酸酶序列的一部分，也就是对应于SEQIDNO:2的残基22-422的部分。分子动力学(Dynamics)(MD)分子动力学(MD)模拟(simulations)指示了所述氨基酸在蛋白质结构内的流动性(见McCammon，JAandHarvey,SC.,(1987)，"Dynamicsofproteinsandnucleicacids"，CambridgeUniversityPress)。所述蛋白质的动力学通常可与所述结晶B因子(见Stout,GHandJensen,LH,(1989),"X-raystructuredetermination",Wiley)相关。通过在例如不同温度进行所述MD模拟，可模拟残基与温度相关的流动性。建议随机诱变流动性或柔性(flexibility)(这里指各向同性波动(isotropicfluctuations))最高的区域。可以理解在所述蛋白质的某些区域发现的高流动性，可以通过取代这些残基来温度改进(thermallyimproved)。用程序CHARMM(MolecularSimulations(MSI)),用MD在300,350，400，450，和500K处理上述的隔孢伏革菌肌醇六磷酸酶结构300和600ps，然后用300stepsSteepestDescent,600stepsConjugatedGradients,和3000stepsABNR以0.001kcal/mole的公差等级(tolerancegrade)最小化。由MD才莫拟产生如下建议的诱变区域300和400K无水MD:37-48，91-119，232-238,300-308,325-335，343-348;300和400K有水MD:407-412;300K无水MD:229-236;有周期(period)边界(boundary)的立方水盒(waterbox)的MD:123-126,154-157,204-216，284-289,419-423。由对X-结构中B-因子的评估产生如下建议的诱变区域73-83,207-217。上述区域可净皮组合如下37-48;73-83;91-119;123-126;154-157;204-217;229-238;284-289;300-308;325-335;343-348;407-412;419-423。得自MD模拟的其他区域是154-163;204-218;323-335;342-350。得自B-因子评估的其他区域是1-29,优选1-28;59-106;169-171;178-247;339-344;367-371;417向前。更优选的区域是1-24;69-94;182-188;199-220;229-241;368-370;420-423。活性位点和底物结合壳(Shells)可用本领域已知的程序，如MolecularSimulationsMSI，SanDiego，California的INSIGHTII来限定包含那些与所述催化残基(H55，D319,R54)很临近的氨基酸残基的活性位点壳。也可限定底物结合壳，其包含与所述底物结合位点(H55,R54，R139,N320)很临近并因此可期待与所述底物接触的那些氨基酸残基。很临近可被限定为与相关残基距离例如，0A，15A，16A,或20A。可通过将肌醇六磷酸或其衍生物如肌醇-l,4,5-三磷酸(Brookhavendatabasefileldjx.肌醇-l,4,5-三磷酸)楔入(dock)所述活性位点裂缝(cleft)(所述残基构成(makingup)所述活性位点的表面)来推断底物结合的信息。制备变体的策略基于图1的3D-结构和SEQIDNO:2，随后对活性位点和底物结合壳(16A，优选15A，更优选10A)的研究，以及分子动力学，主要为了改进热稳定性和/或增加比活性，建议对下述区域进行诱变氨基酸26-31;55-69;99-104;135-142;169-193;253-266;或SEQIDNO:2的氨基酸321-323。优选对SEQIDNO:2上述区域的下述位置进行诱变G26,P27,Y28，D29,P30，W59,P60，T61,S62,G63,A64，R65,S66,R67，Q68，V69,A99,D100,L102,P103，F104,A135,G136,D137，Q138，V141，D142,E169,E170,N177,N178,M179,P181,N182,D189，T191,W192,L193,Y253,Y254,D257,K258,Y259，Y260，T262,G265,N266,T321,和/或V323。包括下述变体G26S,A;P27X,M;Y28F,N,Q;D29S，T，A;F30X;W59X,F，Y;P60S;T61S;S62A;G63A,S;A64G，K,R,S;R65A;S66K,T;R67X，K,A，L，V，S;Q68E,D,N，M;V69X;A99X，D，S，E,N;D100X，S,E，N;LI02V;P103X,E;F104X,L;A135S，D;G136X,S，D;D137S;Q138X，D，N;V141X;D142X;E169A;E170X,A，T;N177D;N178A，GL;M179V，T;P181X，T,V;N182X，A;D189X;T191X;W192X;L193T，I;Y253N，G;Y254A,G;D257S;K258L;Y259X，F，P，W;Y260X,P，W;T262Y，V;G265X;N266Q;T321Q，L,N;和/或V323I。主要指向所述底物的氨基酸残基或位置如下P27，Y28,R65,R67,Q68，A99,DIOO，L102,A135,G136,D137,E169,N177,T191,W192,Y253,Y254,T262,和T321。在一或多个这些位置改变的变体具体包括，例如包含在这些位置的至少一个，至少两个，至少三个，至少四个，至少五个，至少六个，至少七个，至少八个，至少九个，或至少十个改变的变体。在具体实施方案中，所述变体包含在至少十一个，至少十二个，至少十三个，至少十四个，至少十五个，至少十六个，至少十七个，至少十八个，或在所有的十九个位置上的改变。所述变体的实施例是选自如下的那些包含至少一个，两个，三个，四个，五个，六个，七个，/\个，九个，或至少十个突变的变体P27X，M;Y28F，N，Q;R65A;R67X,K,A,L，V,S;Q68E,D，N,M;A99X,D，S,E，N;D100X，S，E,N;L102V;A135S，D;G136X,S，D;D137S;E169A;N177D;T191X;W192X;Y253N，G;Y254A，G;T262Y，V;和/或T321Q，L,N。在具体实施方案中，所述变体含有至少十一个，十二个，十三个，十四个，十五个，十六个，十七个，至少十八个，或十九个这些突变。具有肌醇六磷酸酶活性的多肽本文中，具有肌醇六磷酸酶活性的多肽(肌醇六磷酸酶)是催化肌醇六磷酸盐(肌醇六磷酸盐(hexakisphosphate))水解为(1)肌醇和/或(2)其一磷酸盐，二磷酸盐，三磷酸盐，四磷酸盐，和/或五磷酸盐和(3)无积畴酸盐的酶。本文中，术语肌醇六磷酸酶底物包括本文未示的肌醇六磷酸及任何肌醇六磷酸盐(肌醇六磷酸的盐)，及上面(2)所列的磷酸盐。互联网上的ENZYME地址(http:〃www.expasy.ch/enzyme/)汇集了与酶命名相关的信息。它主要根据国际生物化学和分子生物学联合会命名委员会(IUB-MB)的推荐并且它描述了每种提供了EC(酶学委员会)编号的定性的(characterized)酶(BairochA.TheENZYMEdatabase,2000,NucleicAcidsRes28:304-305)。也见NC-IUBMB的EnzymeNomenclature手册，1992。根据所述ENZYME地址，已知两种不同种类的肌醇六磷酸酶所谓的3-肌醇六磷酸酶(肌醇六磷酸盐3-磷酸水解酶，EC3丄3.8)及所谓的6-肌醇六磷酸酶(肌醇六磷酸盐6-磷酸水解酶，EC3丄3.26)。本发明中，肌醇六磷酸酶的定义包括这两种类型。本发明中以单位FYT测定所述肌醇六磷酸酶活性，一FYT为每分钟释放(liberates)l微摩尔无机正磷酸盐的酶。在下述条件pH5.5;温度37。C;底物肌醇六磷酸钠(C6H6024P6Na,2)浓度为(X0050mo1/1。适当的肌醇六磷酸酶试验(assay)是WO00/20569实施例1所述的FYT和FTU试验。FTU是为了测定饲料和预先混合物中的肌醇六磷酸酶活性。所述FYT试验也在本文实施例2描述。亲代肌醇六磷酸酶亲代肌醇六磷酸酶是与来自尸em'op/wra/_yc"CBS686.96的肌醇六磷酸酶同源的肌醇六磷酸酶。本文中，同源的是指与本文SEQIDNO:2具有至少60%的同一性，所述的SEQIDNO:2对应于所述完整(complete)氨基酸序列的氨基酸17-439，其包括来自Pem'o//7ora(yc//CBS686.96(WO98/28408的SEQIDNO:2)肌醇六磷酸酶的信号肽部分。通常如下氨基酸同源性部分所述来测定同源性。所述亲代肌醇六磷酸酶可为野生型或自然出现的多肽，或其等位变体，或其具有肌醇六磷酸酶活性的片段，特别是其成熟部分。它也可为其变体和/或遗传工程化或合成多肽。在具体实施方案中所述野生型亲代肌醇六磷酸酶是真菌肌醇六磷酸酶,如丝状真菌的肌醇六磷酸酶，或酵母肌醇六磷酸酶。酵母肌醇六磷酸酶的实施例是US5830732所述的许旺酵母(5W2w朋m-o^yc^occ/A"to/^)月几醇六磷酸酶。在另一具体实施方案中，所述野生型真菌亲代肌醇六磷酸酶来自丝状真菌，例如子嚢菌04wom_ycoto)门或担子菌(5asWowycoto)门(分别为子嚢菌肌醇六磷酸酶，或担子菌肌醇六磷酸酶)。子嚢菌肌醇六磷酸酶的实施例来自曲霉(/1;^^///^)的菌抹，例如泡盛曲霉0^/erg"/wsavramon〕PHYA(SWISSPROTP34753,Gene133:55-62(1993)),黑曲霉G4w^^〃Mm'gw)(无花果曲霉(/c丽m))PHYA(SWISSPROTP34752,EP420358,Gene127:87-94(1993))，泡盛曲霉PHYB(SWISSPROTP34755,Gene133:55-62(1993))，黑曲霉PHYB(SWISSPROTP34754,Biochem.Biophys.Res.Commun.195:53-57(1993));或翘孢霉属()的菌才朱,例如构巢#果孑包壳(五we〃'ce〃"wV/w/ara)PHYB(SWISSPROT000093,Biochim.Biophys.Acta1353:217-223(1997));或嗜热霉属(77^^7^^^"(腐质霉属(/^柳^/0))的菌林，例如WO97/35017所述的细毛嗜热霉(77^rwomycey/aw^/ww^)肌醇六磷酸酶。其他子嚢菌肌醇六磷酸酶的实施例在公开EP684313(例如来自烟曲霉，土曲霉G^/wg/〃wte〃ew力，和嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila);JP11000164(来自青霉菌属(尸em'c/〃/ww)菌抹的肌醇六磷酸酶)；US6139902(来自曲霉菌抹的肌醇六磷酸酶)，及WO98/13480(Mo"oscw肌醇六磷酸酶)。担子菌肌醇六磷酸酶的实施例是所述来自巻边桩菇(尸fljd〃w/"w/w/to),线毛检菌(rra附etespw^cem1)，々racy6e/Waties1和Pem'op/zora(y"7(见WO98/28409)的肌醇六磷酸酶。优选的亲代肌醇六磷酸酶来自隔孢伏革菌种，优选来自尸e"/o/7/zora(yc//的菌林，最优选来自所述/^2/op/wra/_yc"CBS686.96的菌抹。不管上述种已知的种名，可以理解其定义包括完全(perfect)和不全阶段(imperfectstates),及其它分类学等效物(叫uivalent)例如，无性型。本领域技术人员很容易辨认适当等效物的同一性。公众可容易地在数个培养物保藏中心，如美国典型培养物保藏中心(ATCC),德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ),真菌菌种保藏中心(CBS),和农业研究机构保藏中心，北方地区研究中心(NRRL)得到这些种的菌林。另外，可用合适探针从其他来源，包括从自然(例如土壤，堆肥，水等)分离的微生物鉴定并得到所述多肽。从自然生长环境分离微生物的技术在本领域已知。然后可以通过类似筛选其它微生物的基因或cDNA文库得到所述氨基S吏序列。一旦已用所述探针检测出编码多肽的氨基酸序列，可用本领域一般技术人员已知的技术(见例如，Sambrook等，1989,见上文)分离或克隆所述序列。在另一具体实施方案中所述亲代肌醇六磷酸酶是合成的肌醇六磷酸酶。合成的肌醇六磷酸酶是人设计的，并希望不会在自然出现。EP897985和WO00/43503公开了这些合成的，真菌的肌醇六磷酸酶的实施例，通常叫做共有肌醇六磷酸酶。改组的(Shuffled)肌醇六磷酸酶是合成或遗传工程化的亲代肌醇六磷酸酶的其它实施例，可如本领域通常已知，例如通过定点诱变，通过PCR(用含有所需突变的PCR片,殳作为所述PCR反应的引物之一)，或通过随机诱变来制备它。合成的肌醇六磷酸酶的概念中还包括任何杂种的(hybrid)或嵌合的肌醇六磷酸酶，即肌醇六磷酸酶含有来自至少两个肌醇六磷酸酶的部分氨基酸序列的组合。所述亲代肌醇六磷酸酶可含有所述特定氨基酸序列，或它可能是其等位变体；或其具有肌醇六磷酸酶活性的片段。在一实施方案中，所述亲代肌醇六磷酸酶含有所述特定氨基酸序列或其等位变体；或其具有肌醇六磷酸酶活性的片段。在另一实施方案中，所述亲代肌醇六磷酸酶由特定氨基酸序列或其等位变体；或其具有肌醇六磷酸酶活性的片段组成。特定氨基酸序列的片段是从此氨基酸序列氨基和/或羧基末端缺失一或多个氨基酸的多肽。在一实施方案中，所述片段包含至少150，或至少200，或至少250，或至少260,或至少280,或至少300，或至少320,或至少340,或至少360，或至少380,或至少390,或至少400，或至少410,或至少420，或至少430，或至少440,或至少450个氨基酸残基。等位变体指占据相同染色体位点的基因的两或多个可选形式中的任一。等位变化通过突变自然出现，并且可导致种群内多态性(polymorphism)。基因突变可能是沉默的(所编码多肽无改变)或者可编码氨基酸序列改变的多肽。多肽的等位变体是基因等位变体所编码的多肽。所述亲代肌醇六磷酸酶也可是上述任一氨基酸序列中的成熟部分。成熟部分指成熟的氨基酸序列并且指在已经剪切可能的信号肽部分后保留的氨基酸序列的那部分。在另一实施方案中，所述亲代肌醇六磷酸酶可以是上述肌醇六磷酸酶的变体，其包含一或多个氨基酸的取代，缺失，和/或插入。所述肌醇六磷酸酶变体的氨基酸序列可能不同于由于插入或缺失了一或多个氨基酸残基和/或用不同氨基酸残基取代一或多个氨基酸残基而特定的氨基酸序列。氨基酸变化优选性质次要(minornature)的变化，即不显著影响所述蛋白质折叠和/或活性的保守氨基酸取代；小型(small)缺失，通常1到约30氨基酸；小型氨基或羧基末端延伸，如氨基末端曱硫氨酸残基；至多约20-25残基的小接头(linker)肽；或通过改变净电荷或其他功能，如多组氨酸区(tract),抗原表位或结合区来利于纯化的小型延伸。保守取代的实施例在碱性氨基酸(精氨酸，赖氨酸和组氨酸)，酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)，极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)，疏水氨基酸(亮氨酸，异亮氨酸和缬氨酸)，芳香族氨基酸(苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸)，及小(small)氨基酸(甘氨酸，丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸和曱硫氨酸)范围内。通常不改变比活性的氨基酸取代在本领域已知并在例如H.Neurath和R.L.Hill,1979，In,TheProteins,AcademicPress,NewYork中描述。最常出现的交换是Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thr/Ser,Ala/Gly,Ala/Thr，Ser/Asn,Ala/Val,Ser/Gly，Tyr/Phe,Ala/Pro,Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/lle,Leu/Val，Ala/Glu,和Asp/Gly以及这些的逆向方式。微生物分类学(Taxonomy)涉及分类学的问题可以通过参考分类数据库，如位于下述互联网址http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/taxonomyhome.html/的NCBI分类学浏览器，和/或通过参考分类学手册解决。本发明涉及的真菌分类的手册优选为DictionaryoftheFungi,9thedition,Kirk，P.M.，P.F.Ca画n，J.C.David&J.A.Stalpers编辑，CAB出版，2001。合成的肌醇六磷酸酶，如共有的肌醇六磷酸酶，改组的肌醇六磷酸酶，或杂种的肌醇六磷酸酶可含有来自至少两种子嚢菌肌醇六磷酸酶，至少两种担子菌肌醇六磷酸酶或来自至少一种子嚢菌和至少一种担子菌肌醇六磷酸酶的部分氨基S吏序列的组合。部分氨基酸序列所来自的这些子嚢菌和担子菌肌醇六磷酸酶可为例如，任一本文所指的那些具体的肌醇六磷酸酶。本文中，来自至少一个真菌的合成的肌醇六磷酸酶是真菌的肌醇六磷酸酶。另外，仅来自子嚢菌肌醇六磷酸酶的合成的肌醇六磷酸酶是子嚢菌肌醇六磷酸酶；并且仅来自担子菌肌醇六磷酸酶的合成的肌醇六磷酸酶是担子菌肌醇六磷酸酶。任何来自至少一种子嚢菌肌醇六磷酸酶以及至少一种担子菌肌醇六磷酸酶的合成肌醇六磷酸酶可被命名为混合子嚢菌/担子菌肌醇六磷酸酶。命名隔孢伏革菌肌醇六磷酸酶指来自隔孢伏革菌属的野生型肌醇六磷酸酶，包括其等位变体，片段或变体，或基于至少一种，优选至少两种隔孢伏革菌肌醇六磷酸酶，更优选只基于隔孢伏革菌肌醇六磷酸酶制备的合成的肌醇六磷酸酶。隔孢伏革菌种的实施例为尸e"/op/oraawra"^aca，灰隔孢^en'<i/(9"a//5"，沣果隔孑包伏革菌(Pwwt/a)'Pp/ceae,p/w/'i/o(ygw/",i3n^，变色隔孢伏革菌(Pvera/co/o。，和被简单归类隔孢伏革菌的菌种。优选的种是尸em'op/zora/少"7。优选的菌抹是尸emb;/zora/一CBS686.96。氛基酸同源性本发明涉及具有的氨基酸序列与SEQIDNO:2(下文"同源肌醇六磷酸酶")有某种程度同一性的肌醇六磷酸酶。本发明中，通过程序"align",它是Needleman-Wunsch序列对比(即总体序列对比)来测定两氨基酸序列之间的同一性程度，以及两核苷酸序列之间的同一性程度。该程序可用于多肽，以及核苷酸序列的序列对比。所述缺省记分矩阵(matrix)BLOSUM50用于多肽序列对比，并且所述缺省同一性矩阵用于核苷酸序列对比。缺口的第一个残基的罚分对多肽是-12并且对核香酸是-16。缺口的更多残基的罚分对多肽是-2，对核苷酸是-4。"Align"是FASTA软件包版本v20u6(见W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988),"ImprovedToolsforBiologicalSequenceAnalysis",PNAS85:2444-2448,及W.R.Pearson(1990)"RapidandSensitiveSequenceComparisonwithFASTPandFASTA，"MethodsinEnzymology183:63-98)的一部分。FASTA蛋白质序列对比使用不限制缺口尺寸的Smith-Waterman算法(见"Smith-Watermanalgorithm"，T.F.Smith和M.S.Waterman(1981)J.Mol.Biol.147:195-197)。在具体实施方案中，所述亲代肌醇六磷酸酶的氨基酸序列与SEQIDNO:2的同一性程度为至少约55%,或至少约60%,或至少约65%，或至少约70%，或至少约75%,或至少约80%,或至少约85%，或至少约90%,或至少约91%,或至少约92%,或至少约93%，或至少约94%,或至少约95%，或至少约96%，或至少约97%,或至少约98%,或至少约99%。在另一具体实施方案中，这些同源的亲代肌醇六磷酸酶具有的氨基酸序列与所述特定的氨基酸序列差三十，二十五，二十二，二十一，二十，十九，十/\，十七，十六，十五，十四，十三，十二，十一，十，九，y、七，六，五，四，三，二，或^f义一个氨基酸。所得变体肌醇六磷酸酶也与SEQIDNO:2同源。在具体实施方案中，所述变体肌醇六磷酸酶含有或具有的氨基酸序列与SEQID.NO:2的同一性程度为至少约55%,或至少约60%,或至少约65%,或至少约70%，或至少约71%，或至少约72%,或至少约73%,或至少约74%,或至少约75%,或至少约76%,或至少约77%,或至少约78%，或至少约79%,或至少约80%,或至少约82%，或至少约85%,或至少约87%，或至少约90%,或至少约92%，或至少约95%，或至少约97%。核酸杂交可选的，同源的亲代肌醇六磷酸酶，以及变体肌醇六磷酸酶，可被定义为所述核酸序列所编码，该核酸序列在很低严格条件，优选低严格条件，更优选中度严格条件，更优选中高度严格条件，甚至更优选高度严格条件，而且最优选很高严格条件下与SEQIDNO:1的核苷酸49-1320,或其亚序列(subsequence)或互补链杂交(J.Sambrook,E.RFritsch,和T.Maniatus,1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual,2dedition,ColdSpringHarbor,NewYork)。亚序列可为至少100个核苷酸，或至少200，300,400，500,600,700,800，900,1000，1100,1200，或至少1300个核苦酸。并且，所述亚序列可编码具有相关酶活性的多肽片段。对于长度至少IOO个核苷酸的长探针，从很低到很高的严格条件被限定为在42°C在5xSSPE，0.3%SDS,200pg/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA,和25%曱酰胺(对于很低和低严格度)，35%曱酰胺(对于中度到中高度严格度)，或50%曱酰胺(对高度和很高严格度)中预杂交并杂交，之后是标准Southern印迹法步骤。对于长度至少100个核苷酸的长探针，最后洗涤所述载体物质3次，每次用2xSSC，0.2%SDS优选至少在45。C(很低严格度)，更优选至少在50。C(低严格度)，更优选至少在55。C(中严格度)，更优选至少在60。C(中高严格度)，甚至更优选至少在65。C(高严格度)，并最优选至少在7(TC(很高严格度)洗涤15分钟。对于长度约15个核苷酸到约70个核苷酸的短探针，严格条件被限定为在低于使用根据Bolton和McCarthy的计算(1962,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA48:1390)所算出的Tm5°C到10°C在0.9MNaCl,0.09MTris陽HClpH7.6,6mMEDTA,0.5%NP-40,1xDenhardt's溶液，1mM焦磷酸钠，1mM磷酸二氢钠，0.1mMATP，以及每毫升0.2mg酵母RNA中预杂交、杂交和杂交后洗涤，之后是标准Southern印迹法步骤。对于长度约15个核苷酸到约70个核苷酸的短探针，将所述载体物质用6xSCC加0.1%SDS洗涤15分钟一次，并用6xSSC在低于所计算的Tm5°C到10°C洗涤15分钟各2次。位置编号本文用来限定氨基酸位置的命名基本如WO99/49022所述，即参照来自尸em'o//7ora(y"7CBS686.96的肌醇六磷酸酶氨基酸序列，除了本上下文的编号从WO99/49022的图1所示的P—lycii序歹llS17开始。因此，本文所用的位置数与WO99/49022的位置数相差16(见WO99/49022第14页26行和图1)。由此可见，例如本文的SI等同于(equivalentto)WO99/49022的S17，并且本文的F8等同于WO99/49022的F24。序列SEQIDNO:2含有WO99/49022的图6所示序列的氨基酸-14-409,对应其图1所示P—lycii序列的氨基酸16-439。因此本上下文以从S1开始到E423终止的SEQIDNO:2作为编号位置的基础。亲代肌醇六磷酸酶，以及变体肌醇六磷酸酶，可含有与SEQIDNO:2相比的延伸(extension),即在其N末端和/或C末端。如果存在延伸，此延伸的氨基酸将按本领域通常地来编号，即对于C末端延伸424，425,426以此类推，而对于N末端延伸-1,-2,-3以此类推。改变，如取代，缺失，插入本文中，下述为多种途径的实施例，其中至少理i仑上，即在文献(paper)中的肌醇六磷酸酶变体可来自亲代氨基酸序列氨基酸可被另一氨基酸取代；可缺失氨基酸；可插入氨基酸；以及任何数量的这些改变的任何组合。为本发明目的，术语取代指包括任何数量任何种类的此种改变。这是个合理限定，因为例如缺失可为氨基酸，AA,在已知位置nn为空白()取代。可命名此取代为AAnn()。类推，仅在氨基酸，AA下游的已知位置nn插入一个氨基酸，BB,可被命名为()nnaBB.并且如果将两个氨基酸，BB和CC在位置nn插入氨基酸AA的下游，可命名该取代(两个取代的结合)为()nnaBB+()nnbCC，因此在亲代序列氨基酸nn和皿+1之间产生的所述缺口被指定小写(lowercase)或脚标字母a、b、c等给前面的位置号，这里为nn。取代基之间的逗号(，)，如例如在A327S，F,I,L的取代中指"或"，即A327被S，或F,或I，或L取代。取代间的加号(+),如例如在29S+125D+324A中的取代指"和"，即这三个单个取代在一个相同的肌醇六磷酸酶变体中组合。此限定氨基酸改变的命名也基本如WO99/49022(见其16页)所述。或者，在不同限定术语取代时，本发明涉及亲代肌醇六磷酸酶的变体,包含在选自本文所指的多组区域的至少一个位置的改变，其中所述改变在占据所述位置的氨基酸下游独立插入至少一个氨基酸；缺失占据所述位置的氨基酸；和/或用不同氨基酸取代占据所述位置的氨基酸；其中所述变体具有肌醇六磷酸酶活性，并且每个位置对应于具有SEQIDNO:2氨基酸序列的酶的氨基酸序列的一个位置，并且所述变体与SEQIDNO:2具有至少75%的百分比同一性；并附带如本文(d)所限。本文中，术语"取代"指至少一个取代。至少一个指一或多个，例如一个，或两个，或三个，或四个，或五个，或六个，或七个，或八个，或九个，或十个，或十二个，或十四个，或十五个，或十六个，或十/\个，或二十个，或二十二个，或二十四个，或二十五个，或二十八个，或三十个等等，以在大体上包括任何数量的取代。然而，本发明变体仍必须，例如与SEQIDNO:2至少75%相同，此百分比是用上述程序测定的。可将所述取代应用到在权利要求1所提到的任何区域所包括的任何位置，并且也包括包含任何数量和种类此类取代的组合的变体。本文所用的取代也包括缺失以及延伸，或插入，其可增加对应于SEQIDNO:2的所述序列的长度。在具体实施方案中，取代的数目最多为200,或175,或150,或125，或120，或110，或106，或105，或100,或90，或80,或70,或60,或50,或40,或30,或25。而且，术语"取代"包括取代为其他十九个天然氨基酸中的任一个，或其他氨基酸，如非天然氨基酸。例如在位置20氨基酸Q的取代包括下述取代中的每一个20A,20C,20D，20E,20F,20G,20H,201,20K,20L，20M,20N，20P,20R,20S，20T，20V，20W，或20Y。附带地，这是名称20X的等效物(equivalent),其中X指任何氨基酸。这些取代也能被命名为Q20A,Q20C,Q20X等。以此类推本文提到的每个位置，来具体包括任一本文的此类取代。鉴定相应的位置编号对于尸e"/o一ora(yc"CBS686.96的亲代肌醇六磷酸酶，所述位置编号涉及SEQIDNO:2的编号。对于在另一肌醇六磷酸酶的已知位置，无论它是亲代还是变体肌醇六磷酸酶，总能在SEQIDNO:2中发现对应位置。或者，在可选方案中，总能发现一个位置对应于包含(或具有)所述SEQIDNO:2氨基酸序列的肌醇六磷酸酶的氨基酸序列上的一个位置。将除了Pem'op/zoraCBS686.96的肌醇六磷酸酶以外的亲代肌醇六磷酸酶的氨基酸序列，或反过来将(inturn)变体肌醇六磷酸酶的氨基酸序列命名为SEQ-X。发现对应SEQIDNO:2的位置N的位置如下亲代或变体肌醇六磷酸酶氨基酸序列SEQ-X与上面氨基酸同源性部分所述的SEQIDNO:2序列比对。用下述原理，可以清楚无误地从所述序列对比得到序列SEQ-X上对应于SEQIDNO:2的位置N的位置。仅作为例子，参照WO99/49022的图1,假设出于简单性(simplicity),序歹寸A_pediades,A—fumigatus或T—lanuginosus是例嗦口已与我们々支i殳只于应于本文所述的SEQIDNO:2的P—lycii肌醇六磷酸酶序列比对的变体肌醇六磷酸酶(为本发明目的它们应该与SEQIDNO:2序列比对)问题1:A_pediades的何位置对应于P—lycii的S17(为本发明目的，该位置被命名为S1)该答案是A15。问题2:在命名为A—fumigatus的肌醇六磷酸酶的何位置对应于P_lycii的55b()(为本发明目的，该位置被命名为39b())该答案是S63。问题3:A_pediades的何位置对应于P—lycii的L31(为本发明目的，该位置被命名为L15)该答案是()30d。问题4:P—lycii的何取代对应于具有取代G3L的假设的(imaginative)T—lanuginosa肌醇六磷酸酶变体？该答案是()-6L(为本发明目的，该取代被命名为0-22L)。SEQ-X可以是所述(inquestion)肌醇六磷酸酶的成熟部分，或它也可包括信号肽部分，或它可以是所述具有肌醇六磷酸酶活性的成熟肌醇六磷酸酶的片段，例如SEQIDNO:2相同长度的片段，或如本文所迷与SEQIDNO:2进行序列比对时从SI延伸到E423的片段。区域和位置本文中，术语区域指亲代肌醇六磷酸酶氨基酸序列的至少一个位置，术语位置指此氨基S吏序列的氨基酸残基。一实施方案中，区域指亲代肌醇六磷酸酶氨基酸序列的一或多个连续位置，例如所述序列的一个，两个，三个，四个，五个，六个，七个，八个等等到任何数目的连续位置。因此，区域可仅由一个位置组成，或它可由任何数目的连续位置，如例如，位置37，38和39;或位置37，38,39,40和41;或位置37,38,39,40,41,42,43,44,45，46，47和48组成。为本发明目的，后三个区域分别被命名为37-39，37-41和37-48。这些区域或范围的边界都^皮包括在所述区域中。SEQIDNO:2是优选的亲代肌醇六磷酸酶氨基酸序列的实施例。区域具体包括每个和每个它所包含(embrace)的位置。例如区域37-48具体包括所述位置37，38，39,40,41,42，43，44，45,46，47和48中的每个。以此类推应用到本文提到的其它区域。热稳定性为本发明目的，在某种多肽上下文所用的术语热稳定的涉及该多肽的熔解温度Tm，其通过在pH5.5用差示扫描量热法(DSC)来测定对于热稳定多肽，所述Tm为至少61°C。在具体实施方案中，所述Tm为至少62,63,64,65,66，67，68，69，70，71,72，73,74，75，76,77,77.5,78，79,80,81,82，83,84，85，86，87,88,89，90,91，92，93,94，95,96，97,98，99或100。C。在可选方案中，所述术语热稳定涉及用DSC在pH7.0测定的至少49°C，优选至少50，51，52,53，54,55,56，57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68，69,70,71,72,73,74,75,76,77，77.5，78,79，80,81，82,83,84,85,86,87，88,89,或90°C的熔解温度。在另一可选方案中，所述术语热稳定涉及用DSC在pH3.0测定的至少51°C,优选至少52,53,54，55,56,57,58，59，60,61,62，63,64,65,66,67，68,69，70，71,72,73，74，75，76,77,77.5，78,79，80,81,82,83,84,85,86，87,88,89,或90°C的熔解温度。在另一可选方案中，所述术语热稳定涉及用DSC在pH2.5测定的至少37°C,优选至少38,39，40,41，42，43，44,45,46,47,48,49,50,51，52，53,54，55,56,57,58,59,60,61,62，63,64，65，66,67,68,69，70,71,72,73,74,75,76，77,77.5,78,79,80,81，82,83，84,85，86,87,88,89,或90°C的熔解温度。为测定Tm，可使用通过SDS-PAGE测定纯度为至少90%(或91,92,93,94，95,96,97或98%)的多肽样本。另夕卜，才艮据在吸光度280nm所测并且基于所述酶的氨基酸序列来计算的消光系数，所述酶样本浓度可为0.5-2.5mg/ml蛋白质(或0.6-2.4,或0.7-2.2,或0.8-2.0mg/ml蛋白质)。在所需pH(例如pH5.5,7.0，3.0或2.5)并以恒定加热速度，例如1,1.5,2,3，4，5，6，7,8,9或10。C/min进行DSC。适宜緩沖液的实施例如实验部分所述。在使用如本文实施例2所述的设备时优选加热速度的实施例是1.0,1.5或2.0°C/min。对于其他样品体积较小的其他类型的仪器来说，可用例如3,4，5,6,7，8，9或甚至10°C/min的加热速度来得到对Tm的可靠估计。在具体实施方案中，本发明所述肌醇六磷酸酶变体比所述亲代肌醇六磷酸酶更加热稳定。此目的优选的亲代肌醇六磷酸酶是Pe"/op/7ora/yc"CBS686.96肌醇六磷酸酶。比活性术语比活性高，增高或提高指用同种方法测定，比活性是亲代肌醇六磷酸酶比活性的至少105%。在具体实施方案中，相对比活性为用同种方法测定为所述亲代肌醇六磷酸酶比活性的至少110,115,120,125,130，140,145，150,160,170,180,190，200，220，240,260,280,300，350或甚至400%。或者可选，术语高比活性指比活性为至少200FYT/mg酶蛋白质(EP)。在具体实施方案中，所述比活性为至少300，400,500，600,700，800，900,1000:1100,1200,1300，1400,1500,1600,1700,1800,1900,2000，2100,2200，2300,2400，2500,2600,2700，2800,2900或3000FYT/mgEP。用高纯度样品测定比活性(SDS聚丙烯酰胺凝胶应该显示存在只有一种成分)。所述酶蛋白质浓度应通过氨基酸分析测定，并且所述肌醇六磷酸酶活性单位为FYT。比活性是所述特定肌醇六磷酸酶变体的性质，它通过每mg酶肌醇六磷酸变体酶蛋白质以单位FYT测定的肌醇六磷酸酶活性来计算。更多细节见实施例3。'本发明所述肌醇六磷酸酶变体为热稳定的和/或比活性高。在具体实施方案中它是热稳定的。在另一具体实施方案中它的比活性高。在第三种具体实施方案中它是热稳定的，并且比活性高。在其它具体实施方案中(a)它比亲代肌醇六磷酸酶热稳定；(b)比亲代肌醇六磷酸酶比活性高；或(c)比亲代肌醇六磷酸酶热稳定并且比活性高。低变应原(Low國allergenic)变体具体实施方案中，本发明所述肌醇六磷酸酶变体(也)是低变应原变体，它被设计用来引发(invoke)与动物，包括人接触后下降的免疫应答。可理解术语免疫应答为由接触该肌醇六磷酸酶变体的动物免疫系统引起的任何反应。一种免疫应答是在接触动物内的造成IgE水平升高的变应原反应。低变应原变体可用本领域已知技术制备。例如所述肌醇六磷酸酶变体可与屏蔽(shielding)参与免疫应答的所述肌醇六磷酸酶变体的部分或表位的聚合物部分(moieties)偶联。与聚合物偶联可能涉及聚合物与所述肌醇六磷酸酶变体的体外化学偶连，例如如W096/17929,WO98/30682,WO98/35026,和/或WO99/00489所述。偶连还可或另外可替换地涉及聚合物与所述肌醇六磷酸酶变体的体内偶连。实现该偶连可通过编码所述肌醇六磷酸酶变体的核苷酸序列的遗传工程化，在所述肌醇六磷酸酶变体中插入编码附加糖基化位点的共有序列，并在能够糖基化所述肌醇六磷酸酶变体的宿主表达此肌醇六磷酸酶变体，见例如WO00/26354。另一种提供低变应原变体的方法是遗传工程化编码所述肌醇六磷酸酶变体的核苷酸序列从而造成所述肌醇六磷酸酶变体自身-寡聚体化(sdf-oligomerize)，结果为肌醇六磷酸酶变体单体可屏蔽其它肌醇六磷酸酶变体单体的表位并因而降低所述寡聚体的抗原性。该产物及它们的制备物例如见WO96/16177所述。参与免疫应答的表位可用多种方法鉴定如WO00/26230和WO01/83559所述的噬菌体展示方法，或EP561907所述的随机途径。一旦鉴定了表位，就可改变其氨基酸序列来生产免疫性质改变的所述肌醇六磷酸酶变体，它所用的是已知基因操纵技术如定点诱变(见例如WO00/26230，WO00/26354和/或WO00/22103)和/或可足够接近所述聚合物的表位来进行聚合物偶连以屏蔽该表位。核酸序列和构建体本发明也涉及包含编码本发明肌醇六磷酸酶变体的核酸序列的核酸序列。术语"分离的核酸序列"指基本无其他核酸序列的核酸序列，例如，通过琼脂糖凝胶电泳测定纯度至少约20%,优选纯度至少约40%，更优选纯度至少约60%，甚至更优选纯度至少约80%,并且最优选纯度至少约90%。例如可通过遗传工程中应用的标准克隆方法，以将所述核酸序列从其天然位置重新定位到它将被复制的不同位置而获得分离的核S臾序列。所述克隆方法可涉及剪切分离包含编码所述多肽的核酸序列的所需核酸片段，将所述片段插入载体分子，并将所述重组载体并入复制所述核酸序列的多拷贝或克隆的宿主细胞。所述核酸序列可来自基因组，cDNA,RNA，半合成的，合成的来源，或其任何组合。制备本发明核酸序列可通过向亲代肌醇六磷酸酶编码序列或其亚序列引入至少一个突变，其中所述突变核酸序列编码变体肌醇六磷酸酶。向所述核酸序列引入突变来将一个核香酸变换为另一个核苷酸，这可用任一本领域已知方法通过定点i秀变，例如通过定点i秀变，通过随4几i秀变，或通过4参杂(doped),掺入(spiked),或定域(localized)随机诱变来完成。随机诱变适合作为定域或区域特异的随机诱变来操作，所述的诱变位于翻译成所述氨基酸序列的基因的至少三个部分，或在整个基因内。当用寡核苷酸进行所述诱变时，在待改变位置上合成所述寡核苷酸的过程中可将三个非-亲代核苷酸掺杂或掺入所述寡核苷酸。可进行掺杂或掺入以避免不必需氨基酸的密码子。可将所述掺杂或摻入的寡核苷酸并入如编码所述肌醇六磷酸酶的DNA,通过应用认为合适的例如，PCR，LCR或任何DNA聚合酶和连接酶的任何技术。优选，用"恒定(constant)随机掺杂"进行所述掺杂，其中每个位置的野生型和突变的百分比都被预先限定。并且，该掺杂可针对引入某种核苷酸的偏好，并进而优先引入一或多个特定氨基酸残基。可进行掺杂，例如，从而在每个位置允许引入90%野生型和10%突变。选择掺杂方案时另外的考虑是基于遗传和蛋白质-结构限制因素。所述随机诱变可有利位于所述亲代肌醇六磷酸酶的一部分。当所述酶的某些区域已经被鉴定为对所述酶的给定性质特别重要时，这，例如可以是有利的。提供本发明变体的可选方法包括例如，如W095/22625或WO96/00343所述的基因改组，和如EP897985所述的共有衍生(consensusderivation)方法。核酸构建体核酸构建体含有本发明核酸序列，其可操纵连接到一或多个控制序列，所述控制序列在与所述控制序列相容的情况下在合适宿主细胞中指导(direct)所述编码序列的表达。表达将被理解为包括任何涉及生产所述多肽的方法，包括但不限于转录，转录后修饰，翻译，翻译后修饰和分泌。表达载体编码本发明肌醇六磷酸酶变体的核酸序列可使用表达载体表达，所述的表达载体通常包括编码启动子，操纵子，核糖体结合位点，翻译起始信号和可选抑制子基因或多种激活子(activator)基因的控制序列。所述携带编码本发明葡萄糖淀粉酶(glucoamylase)变体的DNA序列的重组表达载体可以为任何载体，其可方便地用重组DNA方法处理，并且选择载体通常依赖于它所引入的宿主细胞。此载体可以在引入宿主细胞时整合到所述宿主细胞基因组并与它所整合到的染色体一起复制。所述肌醇六磷酸酶变体也可与至少一种动物飼料所需的其它酶共表达,如木聚糖酶，内切葡聚糖酶(endoglucanase),内切-1，3(4)-(3-葡聚糖酶(endo-l，3(4)-beta匿glucanase),禾口/或蛋白酶。it酶可乂人不同载体，乂人一个载体，或混合使用两种技术共表达。当用不同载体时，该载体可有不同选择性标记和不同的复制起点。当只使用一种载体时，该基因可从一或多个启动子表达。如果在单启动子(二或多顺反子)调节下克隆，所述基因克隆的顺序会影响所述蛋白质的表达水平。所述肌醇六磷酸酶变体也可作为融合蛋白质表达，即编码所述肌醇六磷酸酶变体的基因已经按读码框融合到编码其他蛋白质的基因。此蛋白质可以是另一种酶或来自其它酶的功能域。宿主细胞本发明也涉及重组宿主细胞，包含在多肽重组生产中有利使用的本发明核酸序列。包含本发明核酸序列的载体是引入宿主细胞所以保持所述载体作为染色体整合体或自身复制染色体外载体。术语"宿主细胞"包括任何由于复制过程中出现突变而不等同于亲代细胞的亲代细胞后代。选择宿主细胞很大程度上依赖于编码所述多肽的基因及其来源。所述宿主细胞可以是单细胞微生物，例如，原核细胞，或非单细胞微生物，例如，真核细胞如动物，哺乳动物，昆虫，植物，或真菌细胞。优选动物细胞是非人动物细胞。在优选实施方案中，所述宿主细胞是真菌细胞，或酵母细胞，如念珠菌属(Candida),汉森氏酵母属(Hansenula)，克鲁维酵母属(Kluyveromyces),毕赤酵母属(Pichia)，酵母菌属(Saccharomyces)，裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，或西洋蓍霉(Yarrowia)纟田月包。所述真菌的宿主细月包可以是丝状真菌细胞，如一种细胞，包括但不限于，枝顶孢属(Acremonium),曲霉属(Aspergillus),镰孑包菌属(Fusarium)，腐质霉属(Humicola),毛霉属(Mucor)，Myceliophthora,链孢霉属(Neurospora),青霉菌属，梭孑包壳属(Thielavia),Tolypocladium,或木霉属(Trichoderma)。可用的单细胞是细菌细胞如革兰氏阳性细菌，包括但不限于芽孢杆菌(Bacillus)细胞，或链霉菌细胞，或乳酸细菌细胞；或革兰氏阴性细菌如大肠杆菌和假单胞菌(Pseudomonassp)。乳酸细菌包括但不限于乳球菌属(Lactococcus),乳酉吏才干菌属(Lactobacillus)，白耳关i朱菌属(Leuconostoc),4连3求菌属，片3求菌属(Pediococcus),和肠5求菌属(Enterococcus)的菌种。生产方法
技术领域：
：本发明也涉及生产本发明肌醇六磷酸酶的方法包含(a)在有助于生产所述肌醇六磷酸酶变体条件下培养宿主细胞；和(b)回收所述肌醇六磷酸酶变体。本发明生产方法中，在适合生产所述多肽的营养培养基中用本领域已知方法培养所述细胞。例如可在合适培养基中，在允许所述多肽表达和/或分离的条件下，在实验室或工业发酵罐里用摇瓶培养，小规模或大规模发酵(包括连续，分批(batch)，补料分批(fed-batch)，或固态(solidstate)发酵)培养所述细胞。所述培养在包含碳和氮源和无机盐的合适营养培养基，用本领域已知方法进行。合适培养基可商购或可根据公开组分(例如，见美国典型培养物保藏中心的目录)来制备。如果所述肌醇六磷酸酶分泌入所述营养培养基，可从所述培养基直接回收它。如其为不分泌型，可从细胞裂解物回收它。所得肌醇六磷酸酶可用本领域已知方法回收。例如可用常用方法从营养培养基回收它，所述方法包括但不限于，离心，过滤，提取，喷雾干燥(spray-drying),蒸发，或沉淀。本发明肌醇六磷酸酶可用多种本领域已知方法纯化，所述方法包括但不限于，层析(chromatography)(例如，离子交换，亲和，疏水，色语聚焦(chromatofocusing),和尺寸才非阻(sizeexclusion))，电〉永方法(例^口，制备等电聚焦)，差别溶解度(differentialsolubility)(例如，硫酸铵沉淀)，SDS-PAGE，或才是取法(见例如，ProteinPurification,J.-C.JansonandLarsRyden,editors,VCHPublishers,NewYork,1989)。植物本发明也涉及用编码具有本发明肌醇六磷酸酶活性多肽的核酸序列转化的转基因植物，植物部分，或植物细胞从而表达和产生回收量(recoverablequantities)的所述多肽。所述多肽可从植物或植物部分回收。或者，含有所述重组多肽的植物或植物部分可被如此应用来提高食物或铜料的质量，例如，提高营养价值，可口性(payability)和流变学(rheological)性质，或石皮坏抗营养(antinutritive)因子。在具体实施方案中，所述多肽靶向种子中的胚乳贮藏泡(endospermstoragevacuoles)。可以通过合成带有合适信号肽的前体来得到它，见Horvath等PNAS，Feb.15,2000，vol.97,no.4,p.1914-1919。所述转基因植物可为双子叶植物或单子叶植物或其工程化变体。单子叶才直#勿实施i"列为草,^口草i也早4禾(meadowgrass)(莓系牧草(bluegrass)，Poa)，牧草(foragegrass)如羊茅属(festuca),黑麦草属(lolium)，温带草(temperategrass)，如禾草属(Agrostis)，和谷物，例如，小麦，燕麦，黑麦(rye)，大麦，稻，高粱(sorghum),和玉蜀黍(maize)(玉米)。双子叶植物的实施例为烟草，豆类(legume),如羽扇豆(lupin)，马铃薯，甜菜，豌豆，豆(bean)和大豆(soybean),和十字花科植物(十字花(Brassicaceae)科)，如花椰菜，油菜籽，和紧密相关的模型生物体拟南芥(Arabidopsisthaliana)。例如美国专利5,689,054和美国专利6,111,168所述的低肌醇六磷酸盐植物是工程化植物的实施例。植物部分的实施例是茎，愈伤组织(callus)，叶，根，果实，种子和块茎。特定植物组织如叶绿体，质外体，线粒体，液泡，过氧化物酶体和胞质也被认为是植物部分。并且，任何植物细胞，无论来源于何种组织都被认为是植物部分。本发明范围也包括此种植物，植物部分和植物细胞的后代。表达本发明多肽的转基因植物或植物细胞可以根据本领域已知方法构建。筒言之，构建所述植物或植物细胞是通过引入一或多个编码本发明多肽的表达构建体到植物宿主基因组并将所得被修饰植物或植物细胞增殖(propagate)到转基因植物或植物细胞。方便地，所述表达构建体为含有编码本发明多肽的核酸序列的核酸构建体，其可操纵地连接到在优选的植物或植物部分表达所述核酸序列所需的合适调控序列。并且，所述表达构建体可含有用于鉴定已整合入表达构建体的的DNA引入方法)的选择性标记。例如基于需要表达所述多肽的时间地点和方式来确定调控序列的选择,如启动子和终止子序列及可选信号或运输(transit)序列。例如，编码本发明多肽的基因表达可以是组成型的(constitutive)或诱导型的(inducible),或可以是发育特异性的(developmental),阶段特异性的(stage)或组织特异性的，并且所述基因产物可以靶向特定组织或植物部分如种子或叶子。调控序列，例如见Tague等，1988，PlantPhysiology86:506所述。对于组成型表达，可用所述35S-CaMV启动子(Franck等，1980,Cell21:285-294)。器官特异性启动子可为，例如来自储藏(storage)累积(sink)组织如种子，马铃薯块茎和果实的启动子(Edwards&Coruzzi,1990,Ann.Rev.Genet.24:275-303)，或来自代谢累积组织如分生组织的启动子(Ito等，1994，PlantMol.Biol.24:863-878),种子特异性启动子如来自稻的谷蛋白，醇溶谷蛋白，球蛋白，或白蛋白启动子(Wu等，1998，PlantandCellPhysiology39:885-889),来自豆球蛋白B4的蚕豆(Viciafaba)启动子和来自蚕豆的未知种子蛋白质基因(Conrad等，1998,JournalofPlantPhysiology152:708-711)，来自种子油(oil)体蛋白质(bodyprotein)的启动子(Chen等，1998,PlantandCellPhysiology39:935-941)，来自Brassicanapus的贮藏蛋白质napA启动子，或任何其它本领域已知的种子特异性启动子，例如，如WO91/14772所述。另外，所述启动子可以是叶子特异性启动子如来自稻或西红柿的rbcs启动子(Kyozuka等，1993,PlantPhysiology102:991-1000)，小球藻病毒(chlorellavirus)腺嘌呤曱基转移酶基因启动子(MitraandHiggins,1994,PlantMolecularBiology26:85-93),或来自稻的aldP基因启动子(Kagaya等,1995，MolecularandGeneralGenetics248:668-674)，或创伤诱发(woundinducible)启动子如马铃薯pin2启动子(Xu等，1993,PlantMolecularBiology22:573-588)。也可用启动子增强子元件来使所述酶在植物中较高表达。例如，所述启动子增强子元件可为位于所述启动子和编码本发明多肽的核苷酸序列之间的内含子。例如，Xu等，1993，见上文公开了稻肌动蛋白l基因的首个内含子在增强表达中的用途。又及，所述密码子用途可根据所述植物种最优化来提高表达(参照上面Horvath等)。所述表达构建体的可选标记基因和任何其它部分可从本领域选择。根据本领域常用技术将所述核酸构建体整合入所述植物基因组，包括土壤杆菌-介导的转化，病毒-介导的转化，显微注射，粒子轰击，基因枪(biolistic)转化和电穿孑L(Gasser等，1990,Science244:1293;Potrykus，1990,Biol/Technology8:535;Shimamoto等，1989,Nature338:274)。现在根癌土壤杆菌-介导的基因转移是产生转基因双子叶植物的优选方法(综述可见HooykasandSchilperoort，1992,PlantMolecularBiology19:15-38)。然而它也可用于转化单子叶植物，尽管其它转化方法通常对于这些植物优选。现在产生转基因单子叶植物优选方法是胚胎愈伤组织或发育中胚芽的粒子轰击(用转化DNA包被的显微金或钨粒子)(Christou,1992，PlantJournal2:275-281;Shimamoto,1994,CurrentOpinionBiotechnology5:158-162;Vasil等，1992，Bio/Technology10:667-674)。转化单子叶植物的替代方法是基于如Omirulleh等，1993,PlantMolecularBiology21:415-428所述的原生质体转化。根据本领域熟知方法在转化后，选择已引入了表达构建体的转化体并再生(regenerate)入完整才直物。本发明也涉及生产本发明多肽的方法，其包含(a)在有助于生产所述肌醇六磷酸酶变体的条件下，培养包含编码本发明肌醇六磷酸酶变体的核酸序列的转基因植物或植物细胞；和(b)回收所述肌醇六磷酸酶变体。作为表达宿主的动物本发明也涉及转基因，非人动物，和其产物或元件，其实施例是体液如奶和血，器官，肉和动物细胞。表达蛋白质的技术，例如在哺乳动物细胞中在本4贞i或已4口,见侈'B口手册ProteinExpression:APracticalApproach,HigginsandHames(eds)，OxfordUniversityPress(1999)及三本其他的系列手册涉及基因转录，RNA加工作用，和翻译后加工作用。通常制备转基因动物，用编码本发明肌醇六磷酸酶变体的核酸序列转化选定动物的选定细胞从而表达并产生该力/L醇六^l酸酶变体。可,人所述动物，例如/人)难性动物的奶回收所述肌醇六磷酸酶变体，或可能其表达对动物自身有利，例如辅助动物的消化。为产生为从该动物的奶回收所述肌醇六磷酸酶变体的转基因动物，可将编码所述肌醇六磷酸酶变体的基因插入所述动物的受精卵，例如通过使用含有合适奶蛋白质启动子的转基因表达载体，及编码所述肌醇六磷酸酶变体的基因。将所述转基因表达载体显微注射到受精卵，并优选永久整合到所述染色体。一旦所述卵开始生长并分裂，将所述可能的(potential)胚胎植入替代(surrogate)母体，并鉴定出携带所述转基因的动物。然后可用常用饲养方法(breeding)繁殖所得动物。可从所述动物的奶纯化肌醇六磷酸酶变体，见例》口Meade,H.M.等(1999):ExpressionofRecombinantProteinsinthemilkoftransgenicanimal,GeneExpressionsystems:UsingnaturefortheartofExpression.J.M.FernandezandJ.RHoeffler(eds.)，AcademicPress。或者，为产生在其体细胞和/或生殖细胞基因组中携带核酸序列的转基因非人动物，该核酸序列包括的异源转基因构建体包括编码所述肌醇六磷酸酶变体的转基因，可将所述转基因可操作连接到首个调控序列用于唾液腺来特异性表达所述肌醇六磷酸酶变体，如WO2000064247所公开。动物饲料和动物饲料添加剂为本文目的，术语动物包括所有动物，包括人。在具体实施方案中，所述肌醇六磷酸酶变体和本发明组合物可用作非人动物的饲料添加剂。动物实施例为非反刍动物和反刍动物，如牛，羊和马。在具体实施方案中，所述动物为非反刍动物。非反刍动物包括单胃的(mono-gastric)动物，例如猪(包括但不限于小猪，生长(growing)猪和母猪)；家禽如火鸡和鸡(包括但不限于肉用仔鸡(broilerchicks),下蛋的母鸡)；小牛犊；和鱼(包括但不限于鲑鱼)。术语祠料或饲料组合物指任何适合或为了动物摄入的化合物，制备物，混合物，或组合物。将所述饲料喂给动物可在进食之前，之后或同时。优选后者。本发明组合物，在为了添加到动物饲料中时，可被称为动物饲料添加剂。此添加剂常含有所述的肌醇六磷酸酶变体，优选以稳定(stabilized)液体或干燥组合物的形式。所述添加剂可含有其他动物饲料的组分或成分。所述动物饲料的预混合物(pre-mix)为此动物饲料添加剂的具体实施例。预混合物可含有所述的酶，及另外至少一种维生素和/或至少一种矿物质。因此，在具体实施方案中，除了多肽组分，本发明组合物可含有或包含至少一种脂溶性维生素，和/或至少一种水溶性维生素，和/或至少一种痕量矿物质。也可包括至少一种常量(macro)矿物质。脂肪可溶性维生素的实施例是维生素A,维生素D3，维生素E，和维生素K,例如维生素K3。水溶性维生素的实施例是维生素B12,生物素和胆碱，维生素B1，维生素B2，维生素B6，维生素PP(niacin),叶酸和泛酸盐(panthothenate)，例如D-泛酸钓。痕量矿物质的实施例是锰，锌，铁，铜，碘，硒和钴。常量矿物质的实施例是钙，磷和钠。另夕卜，可选的伺料添加成分是着色剂(colouringagents)，芳香化合物，稳定剂，附加酶，和抗微生物肽。本发明组合物的附加酶成分包括至少一种具有木聚糖酶活性的多肽；和/或至少一种具有内切葡聚糖酶活性的多肽；和/或至少一种具有内切_1,3(4)-(3-葡聚糖酶活性的多肽；和/或至少一种具有蛋白酶活性的多肽。可用任何试验测定木聚糖酶活性，其中所用底物包括木聚糖中的1，4-卩-D-木糖苷内部连接(endo-linkage)。可得到用于测定木聚糖酶活性的不同类型的底物，例如Xylazyme交联的阿拉伯木聚糖(arabinoxylan)片剂(来自MegaZyme)，或偶氮(azo)-染色的阿拉伯木聚糖的不可溶粉末分散体(dispersion)和溶液。可用任何本领域已知内切葡聚糖酶试验测定内切葡聚糖酶活性。例如可用多种含纤维素或p-葡聚糖的底物。内切葡聚糖酶试验可用AZCL-大麦卩-葡聚糖，或优选(l)AZCL-HE-纤维素，或(2)偶氮-CM-纤维素作为底物。在两种情况，所述底物降解后在OD595分光光度计测量(见对于AZCL-多糖用于内(endo)-水解酶试-险在http:〃www.megazvme.com/booklets/AZCLPOL.pdf的Megazyme方法)。可用任何本领域已知的内切-1，3(4)-(3-葡聚糖酶试验测定内切-1，3(4)-(3-葡聚糖酶活性。测定内切-1,3(4)-(3-葡聚糖酶活性的优选底物是交联的偶氮染色的(3-葡聚糖大麦底物，其中所述测定是基于分光光度计测量的测定原理。可用任何试验测定蛋白酶活性，其中所用底物包括与所述蛋白酶特异性有关的肽键。蛋白酶底物的实施例是酪蛋白，和pNA-底物，如Suc-AAPF-pNA(例如购自SigmaS-7388)。另一实施例是ProtazymeAK(MegazymeT-PRAK制备为片剂的天青精(azurine)染色的叉联酪蛋白)。WO01/58276的实施例2描述了适合的蛋白酶试验。优选试验为实施例2D的Protazyme试验(如上通常所述按所述蛋白酶调节所述pH和温度)。为试验木聚糖酶，内切葡聚糖酶，卩-l,3(4)-葡聚糖酶和蛋白酶的活性，按所述酶调节试验pH和试验温度(优选接近最适pH的pH,和接近最适温度的温度)。优选试验pH在2-10,优选3-9的范围，更优选pH3或4或5或6或7或8，例如pH3或pH7。优选试验温度在20-80°C,优选30-80。C,更优选40-75°C，甚至更优选40-60°C的范围，优选40或45或50°C。参照合适遮蔽物(blind),例如緩沖遮蔽物限定所述酶活性。抗微生物肽实施例(AMP's)是CAP18,亮杀菌素A(LeucocinA),Tritrpticin,内源性抗微生物多肽-1(Protegrin-1)，Thanatin,乳铁蛋白(Lactoferrin)，Lactoferricin和Ovispirin长口Novispirin(RobertLehrer，2000),及其保留抗微生物活性的变体或片段。其他实施例是抗真菌的多肽(AFP's),如来自巨大曲霉(^^e^/〃wg/g朋few)和黑曲霉的那些多肽，及其保留抗真菌活性的变体和片段，见WO94/01459和PCT/DK02/00289所公开。在具体实施方案中，本发明动物饲料添加剂预期以0.0010-12.0%，或0.0050-11.0%,或0.0100-10.0%;更特别0.05-5.0%;或0.2-1.0%(%指每100克伺料中的克添加剂)的水平包括(或处方认为必须包括的)在动物饮食或伺料中。对于预混合物特别是这种情况。因此，通过乘以同种组分在最终伺料内(in-feed)的浓度，分别为10-10000;20-2000;或100_500(指上述三个百分比所包括的间隔)可得到所述动物饲料添加剂，例如所述预混合物的单组分浓度。重要饲料组分的最终飼料内浓度可反映所述动物的营养需要，其通常为有经验的营养学家所知，并且在如下公开文献中提供NRC，Nutrientrequirementsinswine，ninthrevisededition1988，subcommitteeonswinenutrition,committeeonaminalnutrition,boardofagriculture,nationalresearchcouncil.NationalAcademyPress,Washington,D.C.1988;和NRC,Nutrientrequirementsofpoultry,ninthrevisededition1994,subcommitteeonpoultrynutrition,committeeonaminalnutrition,boardofagriculture,nationalresearchcouncil,NationalAcademyPress,Washington,D.C.，1994。所述肌醇六磷酸酶变体当然应该以有效量，即以足以提高所述飼料营养价值的量应用到动物饲料中。现在预期它以下述剂量范围给药0.01-200;或0.01-100;或0,05-100;或0.05-50;或0.10-10-所有这些范围均以每千克伺料毫克酶蛋白质(ppm)表示。为测定每千克饲料或饲料添加剂的毫克肌醇六磷酸酶蛋白质，从所述饲料组合物或所述饲料添加剂纯化所述酶，并且用相关试验测定所述纯化酶的比活性。也用相同试验测定所述饲料组合物或所述饲料添加剂的肌醇六磷酸酶活性，并且基于这两项测定，计算每千克飼料的毫克肌醇六磷酸酶蛋白质剂量。当然，如果存在用于制备所述饲料添加剂或所述饲料的肌醇六磷酸酶变体样品，就从此样品测定比活性(不需要从所述飼料组合物或添加剂纯化该酶)。可根据本领域已知方法制备本发明组合物，例如通过将所述肌醇六磷酸酶变体与附加成分(如果有)混合。动物饲料组合物或饮食的蛋白质含量相对较高。根据本发明的动物饲料组合物具有的粗制(crude)蛋白质含量为50-800，或75-700，或100-600,或110-500,或120-490g/kg,并还含有本发明组合物。另外，或可替换地(对于上述粗制蛋白质的含量)，本发明动物饲料组合物代谢能量(metabolisableenergy)含量为10-30,或11-28,或11-26,或12-25MJ/kg;和/或4丐含量为0.1-200，或0.5-150,或1-100,或4-50g/kg;和/或可利用的(available)磷含量为0.1-200,或0.5-150,或1-100,或1-50，或1-25g/kg;和/或曱硫氨酸含量为0.1-100,或0.5-75，或1-50,或1-30g/kg;和/或曱硫氨酸加半胱氨酸含量为0.1-150，或0.5-125,或1-80g/kg;和/或赖氨酸含量为0.5-50，或0.5-40，或l-30g/kg。粗制蛋白质以氮(N)乘因子6.25来计算，即如AnimalNutrition,4thedition,Chapter13(Eds.P.McDonald,R.A.Edwards和J.F.D.Greenhalgh,LongmanScientificandTechnical,1988,ISBN0-582-40903-9)所述，粗制蛋白质(g/kg)=N(g/kg)x6.25。此氮含量可用凯氏(Kjeldahl)方法(A.O.A.C.，1984,OfficialMethodsofAnalysis14thed.，AssociationofOfficialAnalyticalChemists,WashingtonDC)测定。而且可用其他方法，如所谓的Dumas方法，在该法中所述样品在氧中燃烧并将所形成的氮气量作为氮来分析并重新计算。i十算^i射能量可基于NRCpublicationNutrientRequirementsofSwine(1988)pp.2-6，禾口theEuropeanTableofEnergyValuesforPoultryFeed-stuffs,Spelderholtcentreforpoultryresearchandextension,7361DABeekbergen,TheNetherlands.GrafischbedrijfPonsen&looijenbv,Wageningen.ISBN90-71463-12-5。在一具体实施方案中，本发明所述动物伺料组合物包含至少一种植物蛋白质或蛋白质源。植物蛋白质或蛋白质源的实施例为来自豆科(leguminosae)和芥科(brassica)的大豆，豌豆和油菜籽，以及谷物如大麦，玉蜀黍(玉米)，燕麦，稻，黑麦，高粱和小麦。在另一具体实施方案中，本发明所述动物祠料组合物包含0-80%玉蜀黍；和/或0-80。/。高粱；和/或0-70°/。小麦；和/或0-70%大麦；和/或0-30%燕麦；和/或0-40%大豆粉(meal);和/或0-10%鱼粉(fishmeal);和/或0-20%乳清。动物饮食可以例如被生产为糊状(mash)饲料(无颗粒(non-pelleted))或颗粒饲料。通常，混合所碾磨的(milled)饲料-原料(stuff)并根据所述种类的说明书来添加足够量的必需维生素和矿物质。本发明所述肌醇六磷酸酶变体可以固体或液体酶制剂的形式，或饲料添加剂的形式，如预混合物来添加。通常在混合步骤前或之中添加固体组合物；并且通常在造粒(pellet)步骤后添加液体组合物。当将本发明所述肌醇六磷酸酶变体添加到动物饲料时，会导致所述饲料的营养价值提高，例如所述动物的生产率(growthrate)和/或体重增加和/或如]料转化(conversion)(即摄取饲料重量相对体重增加)提高。这些结果可以反过来由于一或多个下述作用所述肌醇六磷酸的磷酸盐部分螯合二价和三价阳离子如金属离子，即必需营养离子钙，铁，锌和镁以及所述痕量矿物质锰，铜和钼。除外，所述肌醇六磷酸也在某种程度上通过静电作用结合蛋白质。在所述蛋白质等电点，pI以下的pH时，带正电荷的蛋白质直接结合所述肌醇六磷酸盐。在pI以上的pH时，带负电荷的蛋白质通过金属离子结合到肌醇六磷酸盐。肌醇六磷酸及其盐，肌醇六磷酸盐通常不会被代谢(metabolized),因为它们不从胃肠系统吸收，即从其中的磷，所述螯合金属离子，和所结合的蛋白质营养上都不可利用(nutritionallyavailable)。因此，因为磷是所有有机体生长的必需元素，食物和饲料制剂需要补充无机磷酸盐。通常也必须补充营养必需离子如铁和钩。并且另外，因为通过肌醇六磷酸结合了蛋白质，已知饮食的营养价值降低。在具体实施方案中所述体重增加为所述对照的至少101，102,103，104,105,106,107,108,109，或至少110%(无酶添加)。在另一具体实施方案中所述饲料转化为与所述对照相比最多(或不超过)99,98，97,96,95，94,93,92，91或最多卯％(无酶添加)。所述本发明组合物也可体外使用，例如来处理植物蛋白质。本文所用的术语植物蛋白质涉及任何化合物，组合物，制剂或混合物，其包括至少一个衍生自或来自植物的蛋白质，包括修饰的蛋白质和蛋白质衍生物。在具体实施方案中所述植物蛋白质的蛋白质含量为至少10,20，30，40，50,或60%(w/w)。植物蛋白质或蛋白质源的实施例为谷物如大麦，小麦，黑麦，燕麦，玉蜀黍(玉米)，稻和蜀黍。其它实施例为来自豆科和芥科的大豆粉，豌豆和油菜籽粉。所述植物蛋白质或蛋白质源通常在溶剂，例如水性溶剂如水中悬浮，并由所述肌醇六磷酸酶变体及附加酶(如果有)的性质适当注意调节所述pH和温度值。继续所述酶反应直到达到所需效果，之后可通过灭活所述酶，例如通过热处理步骤，来使反应可能停止或可能不停止。在本发明处理方法的另一具体实施方案，维持所述酶作用指，例如将所述酶组合物加入植物蛋白质或蛋白质源，但如此来说所述酶活性不被改变(switched)直到后面，一旦建立适当的反应条件，或一旦灭活任何酶抑制物，或无论应用什么其他途径来推迟所述酶的作用所需要时。产生肌醇六磷酸酶变体的方法另一方面，本发明涉及产生亲代肌醇六磷酸酶的变体的方法，其中所述变体比所述亲代肌醇六磷酸酶热稳定性和/或比活性更高，所述方法包含(d)随机诱变编码所述亲代肌醇六磷酸酶的DNA序列；(f)筛选表达肌醇六磷酸酶变体的宿主细胞，该变体比所述亲代肌醇六磷酸酶热稳定性和/或比活性更高。本发明上述方法的步骤(d)如实验部分所述，优选用掺杂引物(dopedprimer)进行。在优选实施方案中，上述方法包括下述在上述步骤(d)-(f)前的附加步骤(a)建立亲代肌醇六磷酸酶的3D结构；(b)在升高的温度下对(a)的3D结构进行MD模拟；(c)鉴定在所述高流动性(各向同性波动)亲代肌醇六磷酸酶的氨基酸序列中的区域并建议随机诱变这些，其中至少一个步骤(c)中鉴定的区域在步骤(d)中被耙向(targeted)。所述(a)的结构可用同源建模(modelling)建立。优选模型是图1的结构。高温的实施例是一或多个下述温度300K,350K,400K,450K,500K,和550K。本发明这方面，所述亲代肌醇六磷酸酶可以是野生型亲代肌醇六磷酸酶，或其等位变体，或其具有肌醇六磷酸酶活性的片段，或其成熟部分，或其变体，或在其基础上设计的遗传工程化或合成的多肽。下述为优选野生型亲代肌醇六磷酸酶的实施例真菌的肌醇六磷酸酶，如丝状真菌的肌醇六磷酸酶，或酵母肌醇六磷酸酶。酵母肌醇六磷酸酶实施例是US5830732所述的许旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)肌醇六磷酸酶。丝状真菌的肌醇六磷酸酶实施例是来自子嚢菌门或担子菌门的肌醇六磷酸酶(分别为子嚢菌肌醇六磷酸酶，或担子菌肌醇六磷酸酶)。子嚢菌肌醇六磷酸酶实施例是那些来自曲霉属的菌抹，例如泡盛曲霉PHYA(SWISSPROTP34753,Gene133:55-62(1993))，黑曲霉(无花果曲霉)PHYA(SWISSPROTP34752,EP420358,Gene127:87-94(1993)),泡盛曲霉PHYB(SWISSPROTP34755,Gene133:55-62(1993》，黑曲霉PHYB(SWISSPROTP34754,Biochem.Biophys.Res.Commun.195:53-57(1993));或翘孢霉属的菌抹，例如构巢棵孢壳PHYB(SWISSPROT000093,Biochim.Biophys.Acta1353:217-223(1997》；或嗜热霉属(腐质霉属)的菌抹，例如WO97/35017所述的细毛嗜热霉肌醇六磷酸酶。其他子嚢菌肌醇六磷酸酶的实施例7>开在EP684313(例如来自烟曲霉，土曲霉，和嗜热毁丝霉的菌抹；JP11000164(来自青霉菌属菌抹的肌醇六磷酸酶)；US613"02(来自曲霉菌抹的肌醇六磷酸酶)，及WO98"3480(MW70SCWS肌醇六磷酸酶)中。担子菌肌醇六磷酸酶的实施例是所述来自巻边枉蒜CPaxz7/ws/wvo/由力，绒毛检菌(rramefes戸Z)esce"力，々raqy6e/eAWM和户em'o;/7ora/yc"(见WO98/28409)的肌醇六磷酸酶。也为本发明这方面的目的，最优选所述担子菌肌醇六磷酸酶，并且很优选的亲代肌醇六磷酸酶是来自PeniphoralyciiCBS686.96的肌醇六磷酸酶(以及上面通常所述的其等位变体，片段等，以及同源肌醇六磷酸酶)。也为本发明这方面的目的，WO00/43503的下述肌醇六磷酸酶和肌醇六磷酸酶序列是优选合成的亲代肌醇六磷酸酶的实施例SEQIDNO:22(担子(basidio)共有)，SEQIDNO:24(共有肌醇六磷酸酶-10的成熟部分)；SEQIDNO:26(共有肌醇六磷酸酶-10);SEQIDNO:27(共有肌醇六磷酸酶-11),SEQIDNO:31(共有肌醇六磷酸酶-10-热(thermo)(3)-Q50T-K91A)，SEQIDNO:3《共有肌醇六磷酸酶-12),SEQIDNO:91(共有肌醇六磷酸酶-孓热(11)-Q50T)，SEQIDNO:93(共有肌醇六磷酸酶-3-热(ll)-Q50T-K91A),SEQIDNO:95(共有肌醇六磷酸酶-10-热(5)-Q50T);和SEQIDNO:97(共有肌醇六磷酸酶-10-热(5)-Q50T-K91A)，共有肌醇六磷酸酶-10-热(3),共有-肌醇六磷酸酶-10-热C3)-QS0T,共有-肌醇六磷酸酶-10-热(3)-KWA,共有肌醇六磷酸酶-10-热(3)的氨基酸27_467，共有肌醇六磷酸酶-10-热("-QS0T的氨基酸27-467，共有肌醇六磷酸酶-10-热(3)-K91A的氨基酸27-467。其他优选合成的亲代肌醇六磷酸酶的实施例是在EP897010公开的烟曲霉肌醇六磷酸酶变体，在EP897985公开的真菌的共有肌醇六磷酸酶及其变体，在WO00/43503公开的烟曲霉肌醇六磷酸酶变体，和命名为共有肌醇六磷酸酶-7的肌醇六磷酸酶，以及共有肌醇六磷酸酶-1的变体。筛选热稳定的^L醇六磷酸酶变体的优选方法是实施例1所述的初次(primary)筛选在适宜固体培养基(例如SC-葡萄糖平板)培养候选菌落(例如酵母文库)适当的时间(例如30。C3天)，用硝化滤膜(filter)将平板复制到新平板，温育适当时间(例如30°C1天)，在适宜pH(例如pH5.5和53°C)将滤膜转移到预热的肌醇六磷酸钠平板，在升高的温度温育适当的时间(例如在53°C过夜)，移去(remove)滤膜，并倒入含Ca离子的溶液(例如0.5MCaCl2溶液)，选出比所述亲代肌醇六磷酸酶具有更大的清楚边界(clearingzones)菌落。另一优选筛选方法是如实施例1所述的二次(secondary)筛选(浸没(submerse)培养，建立上清的肌醇六磷酸酶活性对比温度的曲线，选择比所述亲代肌醇六磷酸酶操作更好的候选(在较高温度活性越高越好))。对这两个实验，在热稳定性部分指出那些可选温度。可如实施例1所述在结合/连续中应用所述两种方法。优选随机诱变方法是摻杂的，及掺入寡改组(oligoshuffling)。上述产生肌醇六磷酸酶变体方法甚至更优选实施方案中，所述方法可重复(iterative)，指在第一步，所述亲代肌醇六磷酸酶是上述肌醇六磷酸酶之一，例如所述隔孢伏革菌肌醇六磷酸酶，在第二步所述亲代肌醇六磷酸酶是比其热稳定更高的变体X,第三步中所述亲代肌醇六磚酸酶是比X热稳定性甚至更高的变体Y,以此类推。比活性提高的优选筛选方法是实施例1所指的初次筛选方法。另一比活性提高的优选筛选方法是实施例1所指的二次筛选方法。本发明也涉及生产可得到的或通过上述产生肌醇六磷酸酶变体的方法可得到的肌醇六磷酸酶变体的方法，包含(a)培养宿主细胞来生产包含所述变体的上清；并(b)回收所述变体。进一步通过下述实施例描述本发明，其不应作为限制本发明范围。具体实施方案本发明一方面是在隔孢伏革菌肌醇六磷酸酶骨架通过与其他骨架，优选同源骨架的同源性序列对比，转移所选的(阳性，就是说例如热稳定性和/或比活性提高)突变。此概念可如下描述在如下面所列举的那些权利要求和附加具体实施方案中的每一个，用"来自Peni叩horalyciiCBS686.96的肌醇六磷酸酶，，取代"亲代肌醇六磷酸酶"并加入下述权利要求与来自PeniophoralyciiCBS686.96肌醇六磷酸酶同源的肌醇六磷酸酶变体，该变体包含在对应于那些在附加实施方案所要求并列举的至少一个位置的取代,通过将所述同源的肌醇六磷酸酶与如上SEQIDNO:2序列比对推导出所述对应位置。要求了本发明所述肌醇六磷酸酶变体的多种具体实施方案，并且在如下列举了附加具体实施方案。本发明也涉及下述实施方案的下述方面分离的核酸序列；核酸构建体；重组表达载体；重组宿主细胞；生产方法；转基因植物，或植物部分；转基因非人动物，或产品，或其组分/元素(元件)；组合物如饲料添加剂，和动物饲料；使用的方法和过程；及用途(如本文所要求的)。本文具体包括的组合物包含至少一个任何所述权利要求或任何上述实施方案的肌醇六磷酸酶变体。所述动物饲料优选含有至少一种植物蛋白质或蛋白质源。亲代肌醇六磷酸酶的变体，包含在至少一个选自如下的位置的取代20;26;28;29;30;31;37;38;39;40;41;42;43;44;45;46;47;48;55;56;57;58;59;60;61;62;63;64;65;66;67;68;69;73;74;75;76;77;78;79;80;81;82;83;91;92;93;94;95;96;97;98;99;100;101;102;103;104;105;106;107;108;109;110;111;112;113;114;115;116;117;118;119;123;124;125;126;135;136;137;138;139;140;141;142;152;153;154;155;156;157;158;159;160;161;162;163;169;170;171;172;173;174;175;176;177;178;179;180;183;184;185;186;187;188;189;190;191192;193;194;195;196199;204;205;206;207;208;209;210;211212;213;214;215;216219;220;221;222;229;230;231;232;233234;235;236;237;238250;251;252;253;254;255;256;257;258259;260;261;262;263266;284;285;286;287;288;289;300;301302;303;304;305;306321;322;323;324;325;326;327;328;329330;331;332;333;334344;345;346;347;348;349;350;384;385386;387;388;389;390393;394;395;396;397;398;407;408;409410;411;412;419;420其中禾:口181;182;197;198;217;218;248;249;264;265;307;308;335;343;391;392;421;422;423;424;425;426;427;428;429;430;(a)所述变体具有肌醇六磷酸酶活性；(b)每个位置对应于SEQIDNO:2的位置(c)所述变体与SEQIDNO:2具有至少75%的百分比同一性；并且(d)附带所述变体不是选自如下的PeniophoralyciiCBS686.%肌醇六磷酸酶的变体G26S;Y28N;D29S;F31Y;E42D,K,A;T45R;V46I;W59F;S62D;A64K;R65Q,E,QA;S66T;R67A，I,Q,K;Q68Y，V,I;K74R，A;A99N;D100S;L102V;P103E;F104L;N107T,Q;S109M;H110S,V;Q111E,N;T112A:S;M116F，I,L;A135S;D137Y;Q138D，S,G;D142A;()154fH;S155N;G156P;E157Q,S;E169S;E170A,P;G171A;()171aS;T174P,A;N177S;N178S,T;M179T,V,L;N182A,V;V184G;D185E;()185eT;G186S,A;D187R，K，S;()187aV，T;E188Q,S,A,V;S189E;V195L;N199A，P;L204N;A207D,H;S216T;D217E;L219Y,T;T220Y,N;L221F;M222L;L230V;()235eE,Q;V248R，I;S249Q,A;E251D;Y254A,L,G;D255N;D257K;Y259F;T262H;P264A;G286R,H;Q287K，S;A288P;T321Q,S,G;M322I;V323I;P324A;A327S,F,IL;F332Y;N333P;E344R;R346P;W348F;V349L,A,S;D350S,V;G388A;V393R;E395K,T;和L396R。亲代肌醇六磷酸酶的变体，包含在选自如下区域的至少一个区域的至少一个位置的取代20;26;28-31;37-48;55-69;73-83;91-119;123-126;135-142152-163;169-199;204-222;229-238;248-266;284-289;300-308;321-335;343-350;384-398;407-412;和419-430;其中(a)所述变体具有肌醇六磷酸酶活性；并且(b)每个位置对应于SEQIDNO:2的一个位置；并且(c)所述变体与SEQIDNO:2具有至少75%的百分比同一性；并且其中在位置26;28;29;31;42;45;46;59;62;64;65;66;67;68;74;99;100;102;103;104;107;109;110;111;112;116;135;137;138;142;154f;155;156;157;169;170;171;171a;174;177;178;179;182;184;185;185e;186;187;187a;188;189;195;199;204;207;216;217;219;220;221;222;230;235e;248;249;251;254;255;257;259;262;264;286;287;288;321322;323;324;327;332;333;344;346;348;349;350;388;393;395;和396的所述变体选自26A,C，D，E,F,H,I,K,L，M，N,P，Q，R,T，V,W，Y;28A,C，D,E,F，GH，I,K,L，M,P，Q，R,S，T，V，W;29A,C,E,F，G，H，I，K，L,M,N,P，Q，R，T，V，W,Y;31A，C，D,E,G,H，I，K,L,M,N,P,Q,R，S，T,V,W;42C,F,GH,I,L,M，N，P,Q,R,S，T,V，W,Y;45A,C，D,E,F，G，H，I,K，L，M，N，P，Q,S，V，W,Y;46A，C，D,E,F,GH,K,L,M,N，P,Q,R,S，T,W，Y;59A，C，D,E，G,H，I,K,L,M，N，P,Q,R,S，T，V,Y;62A,C,E,F，G，H，I,K,L,M,N,P,Q，R,T,V,W,Y;64C，D，E，F，G，H,I,L,M，N,P,Q,R,S,T，V,W，Y;65C,D,F,H,I,K，L,M,N，P，S，T，V,W,Y;66A,C，D，E,F，G，H，I,K,L，M,N,P，Q，R,V,W,Y;67C,D,E,F,QH,L，M,N,P，S,T,V，W,Y;68A，C,D,E,F,GH,K,L，M，N，P,R,S,T,W;74C,D，E,F，G,H，I,L，M，N,P,Q，S,T,V，W,Y;99C,D,E,F,GH,I，K,L,M,P,Q，R,S,T，V,W，Y100A,C，E,F,GH，I，K，L,M，N，P,Q，R，T，V，W，Y;102A,C，D，E，F，朋，I,K，M,N,P，Q,R,S,T，W，Y;103A,C,D,F，GH,I,K,L,M,N,Q，R，S,T,V,W,Y;104A,C,D,E，GH,I,K,M,N,P，Q,R，S,T，V，W,Y;107A,C，D,E,F，GH,I,K，L，M,P，R，S，V,W,Y;109A,C，D,E,F,G,H，I,K,L,N,P,Q,R，T，V,W,Y;110A，C，D,E,F,G,I，K，L,M,N,P,Q，R，T,W,Y;111A,C，D，F,GH,I,K,L,M，P，R,S，T,V,W，Y;112C，D,E,F,G,H，I，K,L,M,N，P,Q，R，V，W，Y;116A,C，D,E，G,H,K,N，P，Q，R，S，T,V,W,Y;135C,D,E，F,G,H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T,V,W,Y;137A，C，E，F,G,H,I,K，L,M,N，P,Q,R,S,T,V,W;138A,C,E,F,H,I,K，L,M,N,P,R,T,V,W,Y;142C,E，F，G，H,I,K，L，M,N，P,Q,R，S,T，V,W,Y;154fA，C,D,E，F,GI，K,L,M，N,P,Q,R,S,T,V,W,Y;155A,C,D，E,F,GH，I,K,L，M，P,Q，R，T,V,W,Y;156A，C,D,E,F,H,I，K,L,M，N,Q,R,S，T,V，W,Y;157A,C，D,F，G，H,I,K，L，M,N,P,R,T，V,W，Y;169A,C,D，F，GH，I,K,L,M，N,P，Q，R，T，V，W,Y;170C，D,F,GH,I，K，L，M,N，Q,R,S,T,V,W，Y;171C,D，E，F,H,I，K，L，M,N，P,Q,R,S，T,V,W,Y;171aA,C，D，E,F，GH，I，K,L，M,N,P,Q,R，T，V,W,Y;174C,D,E,F,GH,I,K，L，M,N，Q,R,S,V,W,Y;177A,C，D，E,F，G，H,I,K,L,M,P，Q,R，T，V，W,Y;178A,C,D,E,F,G,H，I,K,L,M,P,Q,R，V,W，Y;179A,C,D,E,F,GH,I，K,N，P,Q，R，S,W，Y;182C，D,E,F,G,H,I,K，L，M，P,Q，R,S,T，W，Y;184A，C，D，E,F,H,I,K，L，M,N,P,Q,R,S,T,W,Y;185A,C，F,G，H,I，K,L,M，N，P,Q,R,S,T,V,W,Y;185eA,C,D，E,F，G，H,I,K,L,M,N,P,Q，R,S,V,W,Y;186C,D，E，F,H，I，K，L,M,N，P,Q,R,T,V,W，Y;187A，C，E,F,GH,I,L，M，N，P，Q,T,V，W,Y;187aA,C,D，E，F,G,H,I，K，L，M，N，P,Q，R，S,W，Y;188C,D,F，G,H,I,K，L，M,N,P,R,T,W,Y;189A,C,D，F，GH,I，K，L，M，N，P，Q，R,T,V,W,Y;195A，C,D,E,F,GH,I,K,M，N,P,Q，R,S,T,W，Y;199C,D,E,F，G，H,I，K,L，M，Q，R,S，T,V,W，Y;204A,C，D，E，F,GH,I，K,M,P,Q,R，S，T,V,W,Y;207C,E,F，G,I，K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V，W,Y;216A,C,D,E,F,QH,I，K，L,M，N，P,Q,R,V，W,Y;217A,C，F,GH,I,K,L，M，N,P,Q,R,S,T，V,W,Y;219A，C，D,E，F,G,H,I,K,M,N,P,Q，R，S,V,W;220A,C，D,E,F，G，H,I,K,L,M,P,Q,R,S，V，W;221A,C,D,E,G，H，I，K,M,N,P，Q，R，S，T,V,W，Y;222A,C，D，E,F,G，H,I，K，N，P,Q，R,S,T,V,W,Y;230A，C，D,E,F,GH，I，K，M,N,P,Q,R,S,T,W,Y;235eA，C,D，F,G,H,I,K,L,M,N,P,R，S,T,V，W,Y;248A,C，D,E,F,G,H,K，L,M，N,P,Q,S,T,W，Y;249C，D，E，F,G,H,I,K,L,M,N，P,R,T，V，W,Y;251A，C，F，G,H，I，K,L，M,N,P,Q,R，S,T，V，W，Y;254C,D,E,F,H,I,K,M，N,P,Q，R,S,T,V，W;255A,C,E,F,G,H,I,K,L，M，P,Q,R,S,T，V，W，Y;257A,C，E,F,G,H，I,L，M,N,P，Q，R,S，T，V,W,Y;259A,C,D，E,G，H,I,K,L,M，N，P，Q，R,S，T,V，W;262A,C,D,E,F,G,I,K,L,M,N,P，Q,R,S，V,W,Y;264C,D,E,F,G，H,I，K,L,M，N，Q,R，S,T，V，W,Y;286A,C，D，E,F,I，K，L，M，N，P,Q，S，T,V，W,Y;287A,C，D，E,F,QH,I,L，M,N，P,R,T，V，W,Y;288C,D，E,F，G,H,I，K，L,M,N，Q，R,S,T,V,W，Y;321A,C,D,E,F,H,I,K,L，M,N,P,R,V,W,Y;322A,C，D，E,F,QH,K，L，N,P,Q,R,S,T,V,W,Y;323A，C,D,E,F,G，H,K,L，M，N,P,Q，R，S,T,W,Y;324C,D,E,F,QH,I,K，L,M,N，Q，R,S,T,V,W,Y;327C,D,E,GH,K,M，N,P,Q,R,T,V,W,Y;332A，C，D,E,G，H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S，T,V，W;333A,C,D，E,F，G,H,I,K,L,M，Q,R,S，T，V，W,Y;344A,C，D,F,QH，I,K,L,M，N,P,Q,S,T,V,W,Y;346A,C，D,E，F,G,H,I,K,L,M,N,Q,S,T,V,W,Y;348A，C,D,E,G,H，I，K，L，M，N，P，Q,R，S,T,V，Y;349C,D，E,F,G，H，I,K,M，N,P，Q，R,T,W，Y;350A,C,E，F,GH,I，K，L,M，N,P，Q,R，T,W，Y;388C，D，E，F,H,I，K,L，M，N,P，Q,R,S,T,V,W,Y;393A,C,D,E,F，G,H,I,K,L，M,N，P,Q,S,T，W，Y;395A,C,D,F，GH,I，L,M,N,P，Q,R,S，V,W,Y;和396A,C，D,E,F，QH，I,K，M,N，P，Q，S,T，V，W，Y;亲代肌醇六磷酸酶的变体，包含在选自如下区域的至少一个区域的至少一个位置的取代20;28-31;37-48;55-69;91-119;123-126;152-163;169-199;204-222;229-238;248-266;284-289;321-335;343-350;384-398;407-412;和419-430;其中(a)所述变体具有肌醇六磷酸酶活性；并且(b)每个位置对应于SEQIDNO:2的位置；并且(c)所述变体与SEQIDNO:2具有至少75%的百分比同一性；并且(d)附带所述变体不是选自如下的PeniophoralyciiCBS686.96肌醇六磷酸酶的变体Y28N;D29S;F31Y;E42D，K,A;T45R;V46I;W59F;S62D;A64K;R65Q,E,G,A;S66T;R67A,I，Q，K;Q68Y，V,I;A99N;D100S;L102V;P103E;F104L;N107T，Q;S109M;H110S，V;Q111E,N;T112A,S;M116F，I,L;()154fH;S155N;G156P;E157Q,S;E169S;E170A,P;G171A;()171aS;T174P，A;N177S;N178S,T;M179T，V,L;N182A,V;V184G;D185E;()185eT;G186S，A;D187R，K，S;()187aV,T;E188Q,S,A,V;S189E;V195L;N199A,P;L204N;A207D，H;S216T;D217E;L219Y,T;T220Y，N;L221F;M222L;L230V;()235eE,Q;V248R,I;S249Q,A;E251D;Y254A,L，G;D255N;D257K;Y259F;T262H;P264A;G286R,H;Q287K，S;A288P;T321Q,S,G;M322I;V323I;P324A;A327S，F,I，L;F332Y;N333P;E344R;R346P;W348F;V349L,A,S;D350S,V;G388A;V393R;E395K，T;和L396R。亲代肌醇六磷酸酶的变体，包含在选自如下的至少一个位置的取代20;29;45;63;69;92;93;95;97;98;99;102;110;114;118;125;152;156;157;160;163;183;185;187;190;191;194;199;205;210;218;222;234;248;286;321;323;324;328;330;334;343;344;345;347;349;350;384;395;398;409;421;422;423;424;425;426;427;428;429;430;其中(a)所述变体具有肌醇六磷酸酶活性；(b)每个位置对应于SEQIDNO:2的位置；并且(c)所述变体与SEQIDNO:2具有至少75%的百分比同一性；并且(d)附带所述变体不是选自如下PeniophoralyciiCBS686.96肌醇六磷酸酶的变体D29S;T45R;A99N;L102V;H110S,V;G156P;E157Q,S;D185E;()185eT;D187R,K,S;()187aV,T;N199A,P;M222L;V248R，I;G286R,H;T321Q，S,G;V323I;P324A;E344R;V349L，A,S;D350S,V;和E395K,T。亲代肌醇六磷酸酶的变体，包含选自如下的至少一个位置的取代20;29;45;63;69;92;93;95;97;98;99;102;110;114;118;125;152;156;157;160;163;183;185;187;190;191;194;199;205;210;218;222;234;248;286;321;323;324;328;330;334;343;344;345;347;349;350;384;395;398;409;421;422;423;424;425;426;427;428;429;430;其中(a)所述变体具有肌醇六磷酸酶活性；(b)每个位置对应于SEQIDNO:2的位置；并且(c)所述变体与SEQIDNO:2具有至少75%的百分比同一性；并且(d)其中在位置29;45;99;102;110;156;157;185;185e;187;187a;199;222;248;286;321;323;324;344;349;350;和395的所述变体选自29A,C，E，F，G,H,I,K,L,M,N，P，Q,R,T，V，W，Y;45A,C,D,E，F,G,H，I，K,L,M,N,P,Q,S,V,W,Y;99C,D,E，F，G,H，I,K,L,M,P,Q,R,S，T,V,W,Y;102A，C，D,E,F，G，H，I，K,M，N，P,Q,R，S,T,W,Y;110A,C，D，E,F,G，I,K,L，M，N,P,Q，R,T,W,Y;156A,C，D，E,F,H，I，K,L,M,N,Q,R,S,T,V，W,Y;157A,C，D，F,GH,I，K,L,M,N,P，R，T,V,W,Y;185A，C,F，G，H,I，K,L,M，N,P,Q,R,S，T，V，W,Y;185eA，C，D,E,F,GH，I,K,L,M，N,P,Q,R,S,V,W，Y;187A，C，E，F,GH,I,L,M,N，P，Q,T,V,W,Y;187aA，C,D,E,F,GH，I,K，L,M,N，P,Q,R,S,W,Y;199C，D，E,F,GH，I，K,L，M,Q，R,S，T，V,W,Y;222A,C，D，E，F，QH,I，K，N，P,Q,R，S,T,V,W，Y;248A,C，D,E，F,GH,K,L,M，N，P，Q,S,T,W,Y;286A,C,D，E,F，I，K,L,M，N,P，Q，S,T，V，W,Y;321A,C，D,E，F，H,I，K，L,M，N,P，R，V,W,Y;323A，C,D,E，F,G,H,K，L，M，N,P，Q,R，S，T，W,Y;324C,D,E,F，G,H，I，K,L，M,N，Q，R,S,T,V,W，Y;344A,C，D，F,G，H，I，K，L,M，N,P，Q，S,T,V,W,Y;349C,D,E,F,G,H,I,K，M,N,P,Q,R，T，W,Y;350A，C,E,F,GH,I,K，L,M，N，P,Q,R,T,W,Y;和395A,C,D,F，QH,I,L,M，N，P,Q,R,S，V，W，Y。所述权利要求或任何上述实施方案的变体，其含有至少一个选自如下的取代20R;29N,C，T;45A;63N;69A;92L;931;95R,H,M，N,S,T;97V;98G;99D;1021;110Y，R，W;114A;118A;125D;152A;156C，R;157K;160R;163P;183K,A，W，G;185A,H,N,P，K;187G;190S，K;191L,R，S;194R;199S;205S;210G;218T;2221;234K,S;248A,C,D,E，QH,S,T;286S;321A;323A;324S,L;328T;330R;334E,D,G;343N;344A,V，S;345D，H;347Q,P;349M,K;D350T，M，I,L;384S，A;395G;398T;409S;421R,S;422R;423N;424S;425L;426E;427G;428R;4291;和430M。所述权利要求或任何上述实施方案的变体，其中所述亲代肌醇六磷酸酶i)具有的核酸序列与SEQIDNO:2的氨基酸序列有至少约60%,优选至少60%的同一性；ii)在低严格条件与SEQIDNO:1的核苦酸49-1320或其互补链杂交的氨基酸序列所编码；iii)为真菌的肌醇六磷酸酶，优选担子菌肌醇六磷酸酶或混合的子嚢菌/担子菌肌醇六磷酸酶，如隔孢伏革菌肌醇六磷酸酵，例^口来自Peniophoralycii，例^口PeniophoralyciiCBS686.96的月几醇六石粦酸酶。所述权利要求或任何上述和下述实施方案的肌醇六磷酸酶变体，其为热稳定的和/或比活性高，优选比所述亲代肌醇六磷酸酶热稳定性和/或比活性更高。亲代肌醇六磷酸酶的变体，包含选自如下区域的至少一个区域的至少一个位置的取代20;29;37-48;63;69;73-83;91-119;123-126;154-157;163;183;187;194;199;204-218;229-238;248;284-289;300-308;323-335;343-350;384;395;398;407-412;和419-430;其中(a)所述变体具有肌醇六磷酸酶活性；(b)每个位置对应于SEQIDNO:2的位置；并且(c)所述变体与SEQIDNO:2具有至少75%的百分比同一性；并且(d)附带所述变体丕是选自如下PeniophoralyciiCBS686.96肌醇六磷酸酶的变体D29S;E42D,K，A;T45R;V46I;K74R,A;A99N;D100S;L102V;P103E;F104L;N107T,Q;S109M;H110S，V;Q111E，N;T112A，S;M116F,I,L;S155N;()154fH;G156P;E157Q,S;D187R,K,S;()187aV，T;N199A,P;L204N;A207D，H;S216T;D217E;L230V;()235eE,Q;V2缀，I;G286R,H;Q287K，S;A288P;V323I;P324A;A327S,F,I，L;F332Y;N333P;E344R;R346P;W348F;V349L,A,S;D350K,A;和E395K,T。亲代肌醇六磷酸酶的变体，包含选自如下至少一个位置的取代20;29;37;38;39;40;41;42;43;44;45;46;47;48;63;69;73;74;75;76;77;78;7980;81;82;83;91;92;93;94;95;96;97;98;99;IOO;IOI;102;103;104;105106;107;108;109;110;111;112;113;114;115;116;117;118;119;123;124125;126;154;155;156;157;163;183;187;194;199;204;205;206;207;208209;210;211,212;213;214;215;216;217;218;229;230;231;232;233;234235;236;237;238;248;300;301;302;303;304;305;306;307;308;323;324325;326;327;328;329;330;331;332;333;334;335;343;344;345;346;347348;349;350;384;395;398;407;408;409;410;411;412;419;420;421;422423;424;425;426;427;428;429;430;其中(a)所述变体具有肌醇六磷酸酶活性；(b)每个位置对应于SEQIDNO:2的位置；并且(c)所述变体与SEQIDNO:2具有至少75%的百分比同一性；并且(d)附带所述变体丕是选自如下PeniophoralyciiCBS686.96肌醇六磷酸酶的变体D29S;E42D,K，A;T45R;V46I;K74R,A;A99N;D100S;L102V;P103E;F104L;N107T,Q;S109M;H110S,V;Q111E,N;T112A，S;M116F，I，L;S155N;()154fH;G156P;E157Q,S;D187R,K，S;()187aV，T;N199A,P;L204N;A207D,H;S216T;D217E;L230V;()235eE,Q;V248R,I;G286R，H;Q287K,S;A288P;V323I;P324A;A327S,F,I,L;F332Y;N333P;E344R;R346P;W348F;V349L,A，S;D350K，A;和E395K,T。亲代肌醇六磷酸酶的变体，包含选自如下区域的至少一个区域的至少一个位置的取代20;29;37-48;63;69;73-83;91-119;123-126;154-157;163;183;187;194;199;204-218;229-238;248;284-289;300-308;323-335;343-350;384;395;398;407-412;和419-430;其中(a)所述变体具有肌醇六磷酸酶活性；(b)每个位置对应于SEQIDNO:2的位置；并且(c)所述变体与SEQIDNO:2具有至少75%的百分比同一性；并且其中在位置29,42,45,46，74，99,100,102,103,104,107,109，110,111,112，116,155，154,156,157,187,187a,199,204,207，216,217,230，235e,248,286,287，288，323,324,327，332,333,344,346,348，349,350,395的所述变体选自:29A，C,E,F,G，H,I，K,L,M,N,P,Q,R,T,V,W,Y;42C,F,H,I，L，M，N，P,Q,R,S，T,V,W,Y;45A,C,D,E,F,G，H，I，K,L，M，N，P，Q,S,V，W，Y;46A，C，D，E,F,GH，K，L，M,N，P，Q,R,S,T,W，Y;74C，D,E,F,G，H，I,K,L,M,N，P，Q,S,T,V,W，Y;99C,D，E,F，G,H,I,K,L,M,P，Q,R,S,T,V，W,Y;IOOA,C,E,F，QH,I,K,L，M，N,P,Q,R,T,V,W，Y;102A，C，D,E,F，G,H,I，K，M,N，P,Q,R，S,T,W,Y;103A,C,D,F,GH,I,KL,M，N,Q，R，S，T,V，W，Y;104A，C，D，E，QH,I,K,M，N，P,Q,R，S，T，V,W,Y;107A,C，D,E，F,G，H，I,K,L,M，P,R，S，V,W,Y;109A,C，D,E,F，GH,I,K，L，N,P,Q,R，T,V，W，Y;110A，C,D，E,F，GI,K,L，M,N,P,Q，R,T，W,Y;111A，C，D,F，GH,I,K，L，M,P,R，S，T，V，W，Y;112C,D，E，F,GH，I，K,L,M，N，P,Q，R，V，W,Y;116A，C，D，E,GH，K，N,P，Q,R，S，T，V,W,Y;155C,D，E,F，G，H,I，K,L,M,P,Q，R,T，V，W，Y;154fA，C，D,E，F，G，I，K，L，M,N,P,Q,R，S，T,V,W，Y;156A，C,D,E,F，H,I,K，L，M，N，Q，R,S，T，V,W，Y;157A,C,D,F，G,H,I，K,L，M,N,P,R,T,V，W,Y;187A，C，E,F,GH，I，L，M，N,P,Q，T，V,W,Y;187aA，C，D,E,F，GH,I，K,L,M,N,P,Q,R,S,W,Y;199C,D,E,F，GH,I,K,L,M，Q，R,S,T,V，W，Y;204A,C,D，E,F,QH，I,K，M，P,Q,R,S，T，V,W，Y;207C,E,F，G,I，K,L，M，N,P,Q,R，S,T,V，W,Y;216A，C,D，E,F,G，H，I，K，L，M,N,P，Q，R,V，W,Y;217A,C，F，G,H，I，K,L，M,N,P，Q,R，S,T,V，W，Y;230A，C,D,E,F,GH,I,K，M,N,P,Q,R，S,T，W，Y;235eA，C，D，F,G，H，I,K,L,M，N,P，R,S,T，V,W,Y;248A,C，D，E,F，G,H，K，L,M，N,P,Q,S,T，W,Y;286A,C,D，E，F,I,K,L,M，N，P,Q,S，T，V,W，Y;287A，C,D,E，F,G,H，I,L，M，N，P,R,T，V,W，Y;288C,D,E,F,GH,I,K，L,M，N，Q,R，S,T,V，W,Y;323A,C,D，E,F,G,H,K，L,M，N,P,Q,R,S，T,W,Y;324C,D,E,F,G，H，I,K,L,M，N,Q,R,S,T,V，W，Y;327C,D,E，G,H,K,M,N，P,Q,R，T，V,W,Y;332A，C,D，E,G,H，I,K,L,M,N,P，Q,R，S,T,V,W;333A,C，D,E,F,G，H,I,K，L,M,Q,R，S,T,V,W，Y;344A,C，D,F，GH，I,K,L,M，N,P，Q,S,T，V，W，Y;346A，C，D，E,F，G，H,I,K，L,M,N，Q,S，T,V,W，Y;348A,C，D,E，GH,I,K,L，M,N,P,Q,R，S，T，V,Y;349C,D,E,F,GH,I,K,M,N，P,Q，R,T,W,Y;350C，E，F，GH,I,L,M，N，P,Q,R,S,T，V，W，Y;和395A,C，D,F,G,H,I,L,M:N，P,Q，R，S，V,W，Y。亲代肌醇六磷酸酶的变体，包含选自如下至少一个位置的取代20;29;45;63;69;95;97;98;99;102;114;118;125;163;183;187;194;199;205;218;234;248;323;324;328;330;334;343;344;345;347;349;350;384;395;398;421;422;423;424;425;426;427;428;429;430;其中(a)所述变体具有肌醇六磷酸酶活性；(b)每个位置对应于SEQIDNO:2的位置；并且(c)所述变体与SEQIDN0:2具有至少75%的百分比同一性；并且(d)附带所述变体丕是选自如下PeniophoralyciiCBS686.96肌醇六磷酸酶的变体D29S;T45R;A99N;L102V;D187R,K,S;()187aV，T;N199A，P;V248R，I;V3231;P324A;E344R;V349L，A，S;D350K,A;和E395K，T。亲代肌醇六磷酸酶的变体，包含选自如下区域的至少一个区域的至少一个位置的取代20;29;37-48;63;69;73-83;91-119;123-126;154-157;163;183;187;194;199;204-218;229-238;248;284-289;300-308;323-335;343-350;384;395;398;407-412;和419-430;其中(a)所述变体具有肌醇六磷酸酶活性；(b)每个位置对应于SEQIDN0:2的位置；并且(c)所述变体与SEQIDNO:2具有至少75%的百分比同一性；并且其中在位置29,45，99,102,187，187a,199,248,323,324,344,349,350,和395的所述变体选自:29A,C,E，F,G,H,I，K,L,M，N,P，Q，R，T，V,W,Y;45A，C，D，E，F,GH,I，K，L，M,N，P,Q，S，V，W，Y;99C,D，E，F,GH，I，K,L,M，P,Q，R,S，T,V,W,Y;102A,C，D,E，F,G，H，I，K,M,N,P，Q,R,S,T，W，Y;187A，C,E,F，G,H,I,L,M,N,P,Q，T,V,W,Y;187aA,C，D,E,F,GH，I，K,L，M,N,P，Q，R,S，W,Y;199C，D,E，F,G,H，I,K,L，M，Q,R，S,T，V,W,Y;248A，C,D，E，F,G，H,K，L,M，N，P，Q，S，T，W,Y;323A，C,D，E，F,G，H,K，L,M,N,P，Q,R，S,T,W，Y;324C,D，E,F,G，H,I,K，L，M,N,Q,R，S，T,V,W，Y;344A,C,D，F,GH，I,K,L,M,N，P,Q,S,T,V,W，Y;349C,D，E,F，G，H,I,K,M,N,P,Q，R,T,W,Y;350C，E,F,QH，I,L,M,N，P，Q,R，S,T，V,W,Y;和395A，C,D，F,G,H，I,L，M，N,P,Q,R，S,V,W,Y。上述任何实施方案的变体含有选自如下的至少一个取代20R;29N,C,T;45A;63N;69A;92L;931;95R;97V;98G;99D;1021;110Y;114A;118A;125D;163P;183K;187G;194R;199S;205S;218T;234K,S;248A;323A;324S，L;328T;330R;334E,D，G;343N;344A，V，S;345D，H;347Q，P;V349M;D350V,T;384S，A;395G;398T;409S;421R，S;422R;423N;424S;425L;426E;427G;428R;4291;和430M。上述任何实施方案的变体，该变体含有一个选自如下取代或取代组合的耳又代或取代组合20R+95R+97V+98G;29N+102I;29N+118A;29N+234S;29N+324S;29N+163P+324S;29N+163P+324S+395G;29S;29S+205S;29S+125D+324A;29S+324A+350V;29S+125D+324A+350V;29S+125D+324A+234K+330R;29S+125D+324A+330R+395G;29S+99D+125D+324A+334E+350V;29S+125D+324A+218T+344S+350V;29S+125D+324A+234K+330R+395G;29S+324A+125D+350V+63N+218T+334E+183K+421S;29S+324A+125D+350V+45A+69A+99D+110Y+334E+344S;9I+430M;69A+334E;99D+398T;114A+187G+194R+324S;114A+187G+194R+324S;218T+334G;323A+324S;324S;324S+328T;324S+395G;324S+345D+347Q;330R;334E+344A;334D+343N+344V;345H+347P+350V;和350V。亲代肌醇六磷酸酶的变体，包含选自如下区域的至少一个区域的至少一个位置的取代20;29;37-40;45;47-48;63;69;73-83;91-98;99;102;103110;113-119;123-125;154-157;163;183;187;194;199;204-218;229-238248;284-289;300-308;323-324;328-335;343-347;349;350;384;395;398407-412;和419-430;其中(a)所述变体具有肌醇六磷酸酶活性；(b)每个位置对应于SEQIDNO:2的位置；并且(c)所述变体与SEQIDNO:2具有至少75%的百分比同一性；并且(d)附带所述变体丕是选自如下PeniophoralyciiCBS686.96肌S享六磷酸酶的变体D29S;T45R;K74R，A;A99N;L102V;P103E;H110S,V;M116F,I，LS155N;()154fH;G156P;E157Q,S;D187R,K,S;()187aV,T;N199A，PL204N;A207D,H;S216T;D217E;L230V;()235eE,Q;V248R,I;G286R,HQ287K,S;A288P;V323I;P324A;F332Y;N333P;E344R;R346P;V349L，A,SD350K，A;和E395K,T。亲代月几醇六磷酸酶的变体，包含选自如下区域的至少一个区域的至少一个位置的取代20;29;37-48;63;69;73-83;91-119;123-126;152-163;183-199;204-218;229-238;248;284-289;300-308;323-335;343-350;384;395;398;407-412;和419-430;其中(a)所述变体具有肌醇六磷酸酶活性；(b)每个位置对应于SEQIDNO:2的位置；并且(c)所述变体与SEQIDNO:2具有至少75%的百分比同一性；并且(d)附带所述变体丕是选自如下PeniophoralyciiCBS686.%肌醇六磷酸酶的变体D29S;E42D,K,A;T45R;V46I;K74R,A;A99N;D100S;L102V;P103E;F104L;N107T，Q;S109M;H110S,V;QlllE,N;T112A，S;M116F，I,L;()154fH;S155N;G156P;E157Q,S;V184G;D185E;()185eT;G186S，A;D187R，K,S;()187aV,T;E188Q,S,A，V;S189E;V195L;N199A，P;L204N;A207D，H;S216T;D217E;L230V;()235eE，Q;V2微，I;G286R，H;Q287K,S;A288P;V323I;P324A;A327S,F,I,L;F332Y;N333P;E344R;R346P;W348F;V349L，A,S;D350S，V;和E395K，T。亲代肌醇六磷酸酶的变体，包含选自如下至少一个位置的取代20;29;37;38;39;40;41;42;43;44;45;46;47;48;63;69;73;74;75;76;77;78;79;80;81;82;83;91;92;93;94;95;96;97;98;99;100;101;102;103;104;105;106;107;108;109;110;111;112113;114;115;116;117;118;119;123;124;125;126;152;153;154;155;156;157;158;159;160;161;162;163;183;184;185;186;187;188;189;190;191;192;193;194;195;196;197;198;199;204;205;206;207;208;209;210;211，212;213;214;215;216;217;218;229;230;231;232;233;234;235;236;237;238;248;284;285;286;287;288;289;300;301;302;303;304;305;306;307;308;323;324;325;326;327;328;329;330;331;332;333;334;335;343;344;345;346;347;348;349;350;384;395;398;407;408;409;410;411;412;419;420;421;422;423;424;425;426;427;428;429;430;其中(a)所述变体具有肌醇六磷！度酶活性；每个位置对应于SEQIDNO:2的位置；并且(c)所述变体与SEQIDNO:2具有至少75%的百分比同一性；并且(d)附带所述变体丕是选自如下Peni叩horalyciiCBS686.96肌醇六磷酸酶的变体D29S;E42D,K，A;T45R;V46I;K74R,A;A99N;D100S;L102V;P103E;F104L;N107T，Q;S109M;H110S，V;Q111E，N;T112A,S;M116F,I,L;()154fH;S155N;G156P;E157Q，S;V184G;D185E;()185eT;G186S，A;D187R,K，S;()187aV，T;E188QSAV;S189E;V195L;N199A,P;L204N;A207D，H;S216T;D217E;L230V;()235eE,Q;V248R,I;G286R,H;Q287K，S;A288P;V323I;P324A;A327S，F，I，L;F332Y;N333P;E344R;R346P;W348F;V349L，A，S;D350S,V;和E395K,T。亲代肌醇六磷酸酶的变体，包含选自如下区域的至少一个区域的至少一个位置的取代20;29;37-48;63;69;73-83;91-119;123-126;152-163;183-199;204-218;229-238;248;284-289;300-308;323-335;343-350;384;395;398;407-412;和419-430;其中(a)所述变体具有肌醇六磷酸酶活性；(b)每个位置对应于SEQIDNO:2的位置；并且(c)所述变体与SEQIDNO:2具有至少75%的百分比同一性；并且其中在位置29,42,45，46,74,99,100，102,103,104,107,109,110,111,112,116，154,155，156，157,184,185,185e,186，187,187a，188，189,195,199，204，207，216，217，230，235e,248，286,287，288，323,324,327,332,333,344，346，348,349,350,395的所述变体选自:29A,C,E，F，QH,I,K,L,M,N,P,Q，R，T，V，W,Y;42C,F,G，H,I，L,M，N,P，Q，R,S,T，V，W,Y;45A,C,D，E，F,G，H,I,K,L,M,N，P,Q,S,V，W,Y;46A,C，D,E,F,GH,K,L,M,N,P，Q，R，S，T,W，Y;74C，D，E,F,GH，I,K,L，M,N,P，Q,S，T,V，W，Y;99C，D，E，F，G，H，I，K，L,M,P，Q,R，S，T,V,W,Y;100A,C，E，F，G,H，I,K，L,M,N,P,Q,R，T,V,W，Y;102A，C,D,E,F，GH,I,K，M,N,P,Q,R，S,T，W,Y;103A,C,D，F，G，H，I,K,L,M,N,Q，R,S,T,V,W,Y;104A,C，D,E,G，H，I,K，M,N，P，Q,R,S,T,V，W,Y;107A,C，D,E，F，G，H,I,K，L，M，P，R,S,V,W，Y;109A,C,D,E，F,G,H,I,K，L,N,P,Q，R,T,V，W,Y;lIOA，C，D,E，F,G，I,K,L，M，N,P,Q，R,T，W,Y;111A,C,D,F，G，H，I,K，L，M,P,R，S,T,V,W,Y;112C,D,E，F，G,H,I，K,L，M,N,P,Q,R,V,W,Y;116A，C，D,E,G,H，K,N，P,Q,R，S,T,V,W,Y;154fA,C，D，E,F，G,I，K,L,M,N，P,Q,R，S,T,V,W,Y;155A，C，D,E,F，QH,I,K,L，M，P，Q,R,T，V，W,Y;156A，C,D,E,F,H，I，K,L，M，N,Q,R，S,T，V，W,Y;157A，C,D,F,QH,I，K,L,M,N，P,R，T,V,W,Y;184A,C,D,E,F，H，I,K，L,M,N,P,Q，R,S,T，W,Y;185A,C,F,GH,I，K,L，M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y;185eA,C，D，E,F,QH，I,K,L,M,N，P，Q,R,S，V,W,Y;186C,D,E,F,H,I,K,L，M，N,P,Q,R,T,V,W，Y;187A,C,E，F,G,H,I，L，M，N,P，Q，T,V,W,Y;187aA，C，D,E,F，G,H,I,K,L,M,N,P，Q,R,S，W,Y;188C,D,F，G,H，I,K,L,M,N,P，R，T，W,Y;189A，C,D,F，G，H,I,K，L,M,N，P,Q，R，T，V,W，Y;195A,C,D,E，F，GH,I,K，M，N，P，Q，R，S，T，W，Y;199C,D,E,F，G,H,I,K，L,M,Q,R,S，T,V,W，Y;204A，C，D,E，F，G,H,I，K,M,P,Q，R，S，T,V,W，Y;207C,E,F,G,I,K,L,M,N，P，Q,R，S,T,V,W,Y;216A,C,D，E,F，QH,I,K，L，M,N,P，Q,R,V,W,Y;217A,C,F,QH,I，K,L，M,N，P,Q,R,S,T，V,W,Y;230A,C,D，E,F,G,H,I，K,M，N,P,Q,R,S,T,W,Y;235eA,C,D,F,朋，I,K,L,M，N,P，R，S，T，V,W，Y;248A,C,D,E,F,GH，K，L，M,N,P，Q,S,T,W,Y;286A，C,D,E,F,I,K，L,M,N,P,Q,S，T，V,W,Y;287A,C，D,E,F,G,H，I,L,M，N,P，R，T，V,W，Y;288C，D，E，F，QH，I,K，L,M，N,Q，R，S，T,V，W，Y;323A,C,D,E,F,GH,K,L，M,N,P,Q,R,S,T,W，Y;324C,D，E,F,G，H，I，K,L，M,N,Q，R,S,T，V，W,Y;327C，D,E,GH,K，M,N:P，Q,R，T,V，W,Y;332A,C，D,E，GH，I，K,L,M,N,P，Q,R,S,T,V，W;333A，C,D,E,F，G，H，I，K，L,M，Q,R，S,T,V，W,Y;344A,C，D，F,G,H，I,K,LM，N,P,Q,S,T,V,W,Y;346A,C，D，E,F,G，H,I,K，L，M，N,Q,S，T,V,W,Y;348A,C，D，E,G,H，I,K,L,M,N,P,Q,R,S，T，V,Y;349C,D，E，F，GH，I,K，M，N，P,Q，R，T，W,Y;350A,C，D，E，F,G，H，I，K，L，M,N,P,Q,R，T,W,Y;和395A,C,D,F,G,H,I,L，M,N,P,Q,R,S，V,W,Y。亲代肌醇六磷酸酶的变体，包含选自如下至少一个位置的取代20;29;45;63;69;92;93;95;97;98;99;102;110;114;118;125;152;156;157;160;163;183;185;187;194;199;205;218;234;248;286;323;324;328;330;334;343;344;345;347;349;350;384;395;398;409;421;422;423;424;425;426;427;428;429;430;其中(a)所述变体具有肌醇六磷酸酶活性；(b)每个位置对应于SEQIDNO:2的位置；并且(c)所述变体与SEQIDNO:2具有至少75%的百分比同一性；并且(d)附带所述变体丕是选自如下PeniophoralyciiCBS686.96肌醇六磷酸酶的变体D29S;T45R;A99N;L102V;H110S，V;G156P;E157Q，S;D185E;()185eT;D187R,K,S;()187aV,T;N199A,P;V248R，I;G286R,H;V323I;P324A;E344R;V349L,A，S;D350S,V;和E395K，T。亲代肌醇六磷酸酶的变体，包含选自如下至少一个位置的取代20;29;45;63;69;92;93;95;97;98;99;102;110;114;118;125;152;156;157;160;163;183;185;187;194;199;205;218;234;248;286;323;324;328;330;334;343;344;345;347;349;350;384;395;398;409;421;422;423;424;425;426;427;428;429;430;其中(a)所述变体具有肌醇六磷酸酶活性；(b)每个位置对应于SEQIDNO:2的位置；并且(c)所述变体与SEQIDNO:2具有至少75%的百分比同一性；并且其中在位置29,45,99,102,110;156;157;185;185e;187，187a,199,248,286;323,324，344，349，350，和395的所述变体选自:29A，C，E，F，QH，I,K，L,M，N,P,Q，R,T,V,W,Y;45A,C,D,E,F，GH,I,K,L，M，N,P，Q,S,V,W，Y;99C,D，E,F,G,H,I，K,L,M，P,Q,R,S，T，V,W,Y;102A,C,D，E,F,G,H,I，K,M,N，P,Q,R,S,T,W,Y;lIOA,C,D,E,F,G,I，K，L，M，N,P,Q，R,T,W,Y;156A，C,D，E，F,H，I，K，L,M,N,Q，R，S,T,V,W，Y;157A,C,D，F,G，H，I,K，L，M，N，P，R，T，V,W，Y;185A,C,F,G，H,I,K，L,M,N,P，Q，R,S，T，V,W,Y;185eA,C,D,E,F,G，H，I，K，L,M，N，P，Q，R,S,V,W,Y;187A，C,E，F，GH,I，L，M,N，P,Q,T，V,W，Y;187aA，C，D,E,F，G,H，I,K,L,M,N,P,Q,R,S,W，Y;199C,D,E,F,G，H，I,K,L,M，Q,R，S，T,V,W,Y;248A，C,D,E,F，GH,K,L,M,N,P,Q，S,T,W,Y;286A，C,D,E,F,GI,K，L，M，N,P,Q,S，T,V，W,Y;323A,C,D,E,F，GH,K,L,M,N，P,Q，R,S，T，W,Y;324C,D,E,F,QH,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y;344A，C，D，F,G，H,I,K,L,M，N,P，Q，S,T,V,W,Y;349C,D,E，F，QH，I,K，M,N，P，Q,R,T,W,Y;350A,C，D,E,F,G，H，I,K,L,M，N，P,Q,R，T,W，Y;和395A,C,D,F,G，H，I,L,M,N，P,Q,R,S,V,W，Y。任何上述实施方案的所述变体，其含有至少一个选自如下的取代20R;29N,C,T;45A;63N;69A;92L;931;95R，H，M,N,S，T;97V;98G;99D;1021;11OY,R，W;114A;118A;125D;152A;156C,R;160R;163P;183K,A,W,G;185A,H,N,P;187G;191L;194R;199S;205S;218T;234K,S;248A,C,D，E，G，H，S;286S;323A;324S，L;328T;330R;334E,D,G;343N;344A,V,S;345D,H;347Q,P;V349M;D350T;384S，A;395G;398T;409S;421R,S;422R;423N;424S;425L;426E;427G;42眠429I;和430M。任何上述实施方案的所述变体，其含有一个选自如下取代或取代组合的取代或取代组合20R+95R+97V+98G;29N+102I;29N+118A;29N+163P+324S;29N+163P+324S+395G;29N+234S;29N+324S;29S;29S+45A+69A+99D+110Y+125D+324A+334E+344S+350V;29S+63N+125D+183K+218T+324A+334E+350V+421S;29S+95H+110W+183W+324A+350V;29S+95M+110W+183W+324A+350V;29S+95N+110R+183W+324A+350V;29S+95R+110W+183W+324A+350V;29S+95S+110R+183W+324A+350V;29S+95S+110W+183W+324A+350V;29S+95T+110R+183W+324A+350V;29S+95T+110Y+125D+183W+286S+324A+350V;29S+95T+110Y+152A+156C+157Q+160R+183W+324A+350V;29S+95T+110Y+156R+157Q+183W+324A+350V;29S+95T+110Y+183W+l85A+248A+324A+350V;29S+95T+110Y+183W+185A+248C+324A+350V;29S+95T+110Y+183W+185A+248E+324A+350V;29S+95T+110Y+183W+185A+248H+324A+350V;29S+95T+110Y+183W+185H+248G+324A+350V;29S+95T+110Y+183W+185P+248G+324A+350V;29S+95T+110Y+183W+l85P+248S+324A+350V;29S+95T+110Y+183W+191L+324A+350V;29S+95T+110Y+183W+248D+324A+350V;29S+95T+110Y+183W+324A;29S+95T+110Y+183W+324A+350V;29S+99D+125D+324A+334E+350V;29S+110Y+183W+185N+324A+350V;29S+125D+218T+324A+344S+350V;29S+125D+234K+324A+330R;29S+125D+234K+324A+330R+395G;29S+125D+324A;29S+125D+324A+330R+395G;29S+125D+324A+350V;29S+183A+324A+350V;29S+183G+324A+334E+344S+350V;29S+183W+324A+350V;29S+205S;29S+324A+350V;29T+324L;69A+334E;99D+398T;114A+187G+194R+324S;218T+334G;323A+324S;324S;324S+328T;324S+345D+347Q;324S+395G;330R;334D+343N+344V;334E+344A;345H+347P+350V;和350V。实施例所用化学品至少是试剂级别的商品。实施例l:制备PE-变体，筛选并分离热稳定性和/或比活性提高的变体一般原理用PeniophoralyciiCBS686.96肌醇六磷酸酶作为亲代肌醇六磷酸酶，基于本文所述目标区域，构建多个肌醇六磷酸酶变体文库并在酵母(掺杂文库，及掺入的寡聚物改组文库，下述其实施例)中表达。提高热稳定性的筛选将所述酵母文库如下进行初次筛选(复制，单滤膜)来选择在53。C显示活性的那些菌落。将在53。C显示活性的菌落也如下转到二次筛选(24孔板培养)来建立每个菌落的温度曲线(在可用的37。C,60°C,62°C，64°C,66°C，68°C,70°C，72。C等的活性)。对于比野生型亲代隔孢伏革菌亲代肌醇六磷酸酶表现更好的菌落，将所述质粒分离并重新转化如酵母，并重复所述温度曲线试验。从所述温度曲线试验计算得到下图"60°C/37°C的相对活性"，和/或"62°C/37°C的相对活性"，和/或"65°C/37°C的相对活性"，和/或"68°C/37°C的相对活性"，和/或"70°C/37°C的相对活性，，，和/或"72°C/37°C的相对活性"，等等。在这些比率中，可将首次提及的温度命名为"优选的高温"。基于从二次筛选方法(温度曲线测定)的上清所获得的肌醇六磷酸酶活性值，将这些术语限定为所述肌醇六磷酸酶在高温(例如60或62。C)的活性相对在较低温度(37。C)的肌醇六磷酸酶活性的比率。选择相对活性中的一个活多个比所述亲代肌醇六磷酸酶提高的菌落，测序所述质粒并将相应变体鉴定为本发明改进的肌醇六磷酸酶变体。在第二轮筛选中，选择热稳定的肌醇六磷酸酶变体作为新的亲代肌醇六磷酸酶(骨架)并重复上述(基于新骨架的性能适当调节温度)。另外，构建组合变体，并随机化一些可能的热突变点(hotspot)，并检测变体。在第三轮筛选中，选择进一步改进的新的热稳定的肌醇六磷酸酶变体作为新的骨架并重复上述(再次上(upward)调温度)，例如现在将所述第一轮筛选温度升高到63°C。另外，还分析(construed)—些新的组合变体，并且将其他明显令人感兴趣的位点随机化来发现取代的最佳配对。通常如上述制备其它变体。提高比活性的筛选在初次筛选中，将所述酵母文库涂布在含肌醇六磷酸4丐的SC-葡萄糖平板上，并在30。C培养3天。选择晕圈(halo)较大的克隆并在含YPD培养基的24孔板中培养。在二次筛选中，相对地检查所述孔中上清的活性并且选择活性较高的克隆。在80。C，pH4培养30分钟来去消选择(deselect)热稳定性较低的变体后，检查平板上所选克隆的剩余活性。选择热稳定性较高的克隆并再次在24孔板培养来进行半纯化(semi-purification)。进行半纯化通过将肌醇六磷酸酶结合到conA-sepharose4B(ConcanavalinA在Amershambioscience,Cat.No.17-0440-01的Sepharose4B凝胶基质中)并用0.5M曱基-a-D-甘露吡喃糖苷(mannopyranoside)在PBS+0.1%tween20(PBS为8g/lNaCl,0.2g/lKCl,2.68g/lNa2HP04-7H20，0.24g/lKH2P04(pH7.4)中洗脱；tween20商业上可由Bio-Rad,Cat.no.170-6531得到)。然后在已经调节所述活性到30FYT/ml后将所述半纯化上清上样到火箭免疫电泳分析中。在火箭免疫电泳中使用兔中产生的(raised)的抗-纯化隔孢伏革菌肌醇六磷酸酶的多克隆抗体。选择所述信号较小的克隆作为比活性较高的变体(所述火箭电泳(rocket)的面积与所述抗原(肌醇六磷酸酶)的浓度成比例，即面积越小，肌醇六磷酸酶蛋白质越少，所述比活性越高)。改进的变体实施例见下表1-5所示。这些变体比所述隔孢伏革菌亲代肌醇六磷酸酶显示出更高的比活性和/或热稳定性更高。具体地，就热稳定性而言，所述变体显示"60°C/37°C的相对活性"，和/或"62°C/37°C的相对活性"，和/或"65°C/37°C的相对活性"，和/或"68°C/37°C的相对活性"，和/或"70°C/37°C的相对活性"，和/或"72。C/37。C的相对活性"，和/或"74°C/37°C的相对活性，，等的值更高。(这些结果见表6-1和6-2所示)。由比活性筛选方法得到的选择变体见下表6-3所示。所有这些变体都期望比表8中命名为"N"的所述变体具有甚至更高的比活性。在公开于WO97/35956的米曲霉IFO4177中表达选择的变体并在培养基MDU-2Bp在25°C以220rpm培养所述转化的细胞。从发酵液(fermentationbroth)纯化所述肌醇六磷酸酶变体并进一步如实施例2所述依照热稳定性和/或比活性来定性，显示于表7-8。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>表3<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>表5<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>表6-1<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>表6-3<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>菌抹和质粒将大肠杆菌DH12S(得自GibcoBRL)用于酵母质粒挽救(rescue)。pTMPP2ver2为在TPI启动子控制下的酿酒酵母(S.cerevisiae)和大肠軒菌穿梭(shuttle)载体，从WO00/10038所述的pJC039构建。将它用于文库构建，酵母表达，筛选和测序。酉良酒酵母YNG318:将MATaDpep4[cir+]ura3-52,leu2-D2，his4-539用于构建酵母文库并表达所述肌醇六磷酸酶变体。见J.Biol.Chem.272(15)，9720-9727，1997)所述。<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>用孔径0.20pm的滤膜灭菌上述溶液。琼脂和水(大约761ml)在一起高压灭菌，并且将分开灭菌的SC-葡萄糖溶液加入所述琼脂溶液。YPD20g/lBacto蛋白胨10g/l酵母提取物100ml/l20%葡萄糖(分开灭菌)肌醇六磷酸钠平板100ml/11M醋酸钠緩冲液(pH5.5)5g/l肌醇六磷酸钠30g/l琼脂PEG/LiAc溶液50ml40%PEG4000(通过高压灭菌1ml5M醋酸锂(通过高压灭菌)痕量金属溶液FeS04x7H2013.90g/1MnS04x5H2013.60g/lZnCl26.80g/1CuS04x5H202.50g/lNiCl2x6H200.24g/1柠檬酸xH203.00g/lMDU隱2Bp麦芽糖xH2045g/1酵母提取物7*1MgS04x7H20lg/1NaCllg/1K2S042g/lKH2P0412g/l痕量金属溶液0.5ml/l方法月几醇六磷酸酶活性，初次筛选在SC-葡萄糖平板涂布酵母文库并在30°C温育3天。用硝化滤膜通过使用丝绒布将其复制到新的SC-葡萄糖平板。在30。C温育所述平板1天(或20°C过周末)转移所述滤膜到预热的0.5。/。肌醇六磷酸钠平板(pH5.5)上。在设定的(prescribed)温度，例如53°C,过夜(0/N)温育所述平板。移去所述滤膜并且倒入0.5MCaCl2溶液。发现具有清楚区域的所述酵母克隆。从所述主(master)平板分离候选克隆并接种到新的SC-葡萄糖平板和24孔板中lmlYPD培养基。二次筛选方法在24孔板在25°C以180rpm培养YPD培养基3天。离心所述平板/或仅使它们静置1小时。将5|il和10^1上清加到肌醇六磷酸钠平板。在37°C和53°C温育所述平板过夜。检测清楚区域的直径。用在下面实施例2描述的(如设定的试验温度)所述肌醇六磷酸酶试验，检测那些在53。C保留活性的克隆的上清的温度曲线。构建酵母文库的方法混合0.5|il载体(用EcoRI-NotI消化)和1piPCR片段。在冰上解冻YNG318感受态细胞。在12ml聚丙烯试管(Falcon2059)混合100^1所述细胞，所述DNA混合物和10|xl载体DNA(Clontech)。加入0.6mlPEG/LiAc溶液并轻柔地混合。在30°C和200rpm温育30分钟。在42°C(热休克(heatshock))温育30分钟。转移到eppendorf管并离心5秒。去除所述上清并在3mlYPD中溶解。在30°C以200rpm温育所述细胞悬液45分钟。将所述悬液倒在SC-葡萄糖平板来得到约300克隆/平板。文库构建通过SOE方法构建掺杂文库(通过重叠(Overlap)延伸来剪接，见"PCR:Apracticalapproach",p.207-209，OxfordUniversitypress,eds.McPherson，Quirke,Taylor),之后是酵母重组。其他方法通过电穿孑L(BIO-RADGenePulser)进行大肠杆菌转化用于构建文库和进行亚克隆。通过碱法(MolecularCloning,ColdSpringHarbor)或用所述Qiager^质粒试剂盒制备DNA质粒。用Qiagen凝胶提取试剂盒从琼脂糖凝胶回收DNA片段。通过PTC-200DNAEngine进行PCR。用ABIPRISM310遗传分析仪来确定所有DNA序列。用醋酸锂方法进行酵母转化。通过Nucleicacidsresearchvol.20，No.14(1992)3790所述的Robzyk和Kassir's方法提取酵母总DNA。扩增和测序的通常引物用下述引物通过所述SOE方法制备含任何突变片段的DNA片段，或使用下述引物只扩增整个肌醇六磷酸酶基因。SEQIDNO:3:620AM34GAGTACTATCTTGCATTTGTACTAGGAGTTTAGTGAACTTGCSEQIDNO:4:680AM35ATGGTTATGGATTTCGGGGATTCTTCGAGCGTCCCAAAACCSEQIDNO:5:AM34TAGGAGTTTAGTGAACTTGCSEQIDNO:6:AM35TTCGAGCGTCCCAAAACCSEQIDNO:7:620GAGTACTATCTTGCATTTGTACSEQIDNO:8:680ATGGTTATGGATTTCGGGGAT构建掺杂文库的引物实施例区域229-236与现有实践一致，在下面详明的核苷酸序列中，使用特定的核苷酸编码。从例如，1^0:〃丽\￥丄5"^.6(111/-￥&皿11^/皿.1^1111)可清楚;(寻到这些。例如K指G或T;Y指C或T;R指A或G;并且N指A,C,G或T。T229V丽核芬酸L230INMKR氨基酸S231TVN氨基酸S232VNN核苷酸G233VNN核香酸N234VNN核苷酸A235VNN核芬酸S236AMK氨基酸或只L230INMKR的核芬酸分布:核苷酸碱基1碱基2碱基3G0.03.046.6A12.56.57.7T0.090.445.7C87.50.00.0在区域T229-S236靶向下述引物SEOIDNO:9:掺杂1(62mer):GATATGTGCCCGTTCGAC12K(11)(12)(13)(14)(15)T42K33K11532K5CCCCCTTCTGTGACCTATTTACSEOIDNO:10:掺杂1R(18mer):GTCGAACGGGCACATATC1:A91G3T3C32:C91G3A3T33:G91C3A3T34:T91G3A3C35:T95G511:C88A1212:T90G3A713:G47A8T4514:G9A9115:G83A4T9C4构建掺入的寡聚物改组文库的引物SEOIDNO11:L102TI(43mer):AGTTCGGCGTCGCCGATCTGAYCCCGTTCGGGGCTAACCAATCSEOIDNO12:VE248+251X(53mer):CGACAAGSEOIDNO13:V271AI(45mer):CCGGGAACGCTCTCGGTCCTRYCCAGGGCGTCGGATACGTCAATGSEOIDNO14:G286X(42mer):ATGAGCTGCTTGCACGCTTGACCVNNCAAGCCGTTCGAGACG通过掺杂构建肌醇六磷酸酶变体用下述PCR反应系统和条件，用2个引物对，620AM34及掺杂1R,和掺杂1和上述核香酸混合物及680AM35进行第一个PCR反应PCR反应系统<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>约10吗DNA/250pl与0.8nlDNaseI(GibcoBRL18068-015)及30^110x緩冲液在25°C温育7-10min。加入终浓度10mM的EDTA来终止所述反应。用Whatman玻璃滤膜纯化正确大小的DNA片l殳(50-150bp)。然后用下述PCR反应系统和条件重新装配所述DNase处理的片^殳<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>实施例2:肌醇六磷酸酶变体的纯化和定性纯化肌醇六磷酸酶变体表达选自上表1-5的数个变体的米曲霉(Asperillusoryzae)的发酵培养肉汤(用大写字母A-M命名)，先用一系列Millipore的GF-滤膜然后用0.45HA-滤膜(Millipore)过滤。然后将硫酸铵(AMS)以浓度L35M加入过滤液，并调节pH到pH6。再次过滤所述样品(如上0.45HA-滤膜)并将其上样到70ml(体积取决于上样)在1.35MAMS,20mM琥珀酸盐，pH6平衡的PhenylSepharose柱(XK26,Pharmacia)。用1.35MAMS，20mM琥珀酸盐，pH6洗涤所述柱后，以线性梯度1.35-0MAMS在20mM琥珀酸盐，pH6用10个柱体积洗脱所述肌醇六磷酸酶。将流速设定在6ml/min并收集10ml级分(fraction)。汇集含活性并具有足够纯度(通过SDS-PAGE评估)的级分并用50mM醋酸钠，pH5.5过夜透析。然后向所述含肌醇六磷酸酶的汇集物加入20mMTris-醋酸(aceticacid),pH7.5并在用20mMTris-醋酸，pH7.5平衡的8mlMonoQ或较大Q-Sepharose柱(Pharmacia)中进行阴离子交换层析。以线性梯度0-0.5MNaCl在20mMTris-醋酸，pH7.5用10个柱体积洗脱所述肌醇六磷酸酶。根据柱子刻度调节流速和级分大小。汇集含肌醇六磷酸酶活性并且具有足够纯度的级分并在用50mM醋酸钠，pH5.5透析前在AmiconYMlO膜上浓缩。SDS-PAGE用Novex4-20Tris-甘氨酸根据生产商说明进行SDS-PAGE。如从米曲霉纯化的所述肌醇六磷酸酶变体具有分子量，MW,大约65kDa，对应于大约25%碳水化合物(carbohydrate)。肌醇六磷酸酶活性试验，pH和温度曲线，温度稳定性检测将10|il稀释的酶样品(在0.1M醋酸钠，0.01%Tween20,pH5.5稀释)加入0.1M醋酸钠，0.01%Tween20,pH5.5(在溶解所述力几醇六磷酸钠后调节pH;预热所述底物)中的250^15mM肌醇六磷酸钠(Sigma)并在37°C温育30分钟。通过加入250|al10%TCA来终止所述反应并通过加入500|il100ml钼酸盐(molybdate)试剂中的7.3gFeS04(将8mlH2S04中2.5g(NH4)6Mo7024.4H20稀释到250ml)来测量游离(free)磷酸盐。测量96孔孩史滴板中20(Hil样品在750nm的吸光度。包括底物和酶空白。也包括磷酸盐标准曲线(0-2mM磷酸盐)。1FYT等于在给定条件释放1pmol磷酸盐/min的酶量。通过在50mM数个pH值pH3(甘氨酸-HCl)，pH4-5.5(醋酸钠)，pH6(MES)，pH7-8(Tris-HCl)的緩冲液进行上述试验来获得所述pH-曲线。在不同温度(预热所述底物)进行所述试验获得温度曲线。可通过在测量所述残基活性前，在O.IM磷酸钠，pH5.5在不同温度预温育肌醇六磷酸酶来研究温度稳定性。所述纯化的变体与所述i3/少cz'z'亲代肌醇六磷酸酶显示类似的pH-曲线(所有均具有大约pH4-5的最适pH)。差示扫描量热法(DSC)在不同pH值用MicroCal.的VP-DSC进行DSC。从20-90°C以恒定扫描速率1.5。C/min进行扫描。在进行DSC之前，用在适当緩沖液(例如0.1M甘氨酸-HCl,pH2.5或3.0;0.1M醋酸钠，pH5.5;0.1MTris-HCl，pH7.0)中平衡的NAP-5柱(Pharmacia)将所述肌醇六磷酸酶脱盐。用MicroCalOrigin软件进行数据处理。所得溶解温度，Tm's,见下表7所示。所述变体的热稳定性比所述隔孢伏革菌亲代肌醇六磷酸酶显著提高。所述热稳定性显示为pH依赖性的。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table>实施例3:比活性用在20mM乙酸钠，pH5.5透析的高纯度样品测定选自表1-5的变体(在此命名为N,O和P)的比活性。事前在SDS聚丙烯酰胺凝胶上一企测所述纯度，显示只存在一种成分。通过如下氨基酸分析测定所述蛋白质浓度在110。C在6NHCl，0.1%苯酚中在抽空(evacuated)的玻璃管中水解一等份(aliquot)样品16小时。用AppliedBiosystems420A氨基酸分析系统根据制造商的说明定量所得氨基酸。从所述氨基酸的量，可计算出水解的等份中的蛋白质总质量，并由此也得到所述蛋白质的浓度。以单位FYT测定所述肌醇六磷酸酶活性，并用每mg肌醇六磷酸酶变体酶蛋白质中以单位FYT测定的肌醇六磷酸酶活性来计算比活性。所述结果见下表8所示。所述具体比活性数值是相对于设定为100%的所述隔孢伏革菌亲代肌醇六磷酸酶的比活性。表8肌醇六磷酸酶变体比活性(％)隔孢伏革菌亲代肌醇六磷酸酶100N147O117P114实施例4:包含肌醇六磷酸酶变体的动物饲料和动物饲料添加剂动物伺^+添加剂'将10g1938号肌醇六磷酸酶变体(以肌醇六磷酸酶酶蛋白质计算)力口入下述预混合物(premix)(每千克预混合物):5000000正维生素A1000000正维生素D313333mg维生素E1000mg维生素K3750mg维生素Bl2500mg维生素B21500mg维生素B67666mcg维生素B1212333mg烟酸(Niacin)33333mcg生物素300mg叶酸3000mgCa-D-Panthothenate(D-泛酸4丐)1666mg铜16666mg铁16666mg锌23333mg锰133mg钴66mg碘66mg石西5.8%4丐25%钠动物铜料这是动物饲料的实施例，所述动物饲料包含0.03g/kg(30ppm)的肌醇六磷酸酶变体E(以肌醇六磷酸酶酶蛋白质计算)74.0%小麦20.7%烤豆(roastedsoy)蛋糕5.0%豆油0.3%上述预混合物。混合所述成分，并且在所需温度，例如65,75,80，或甚至85。C将所述飼料制粒。本文公开的具体实施方案不会从范围上限制在此描述和权利要求的发明，因为这些实施方案是为了阐述本发明的各个方面。任何等同实施方案都应在本发明范围。事实上，对于本领域技术人员，从前述说明书得到在那些本文所示和描述之外的本发明的多种改进是显而易见的。这些改进也应落入所附的(appended)权利要求的范围。如有冲突，以包括限定的本文公开为准。本文引用多个文件，全文引入其公开作为参考。序列表<110>诺维信公司(NovozymesA/S)<120>肌醇六磷酸酶变体<130>10261<160>14<170>PatentInversion3.2<210><211><212><213>11320DMPeniophoralycii<220><221><222>sig—peptide(1)…(48)<220><221><222>CDS(49)..(1320)<400>1tgatgtcgagtcttget57SerLeuAla1etacctatecccgca105LeuProlieProAla15atggtttcttcggcattcgc3ccttccatcctacttagctttgageacgcagttcagetttgttgcggcgcagLeuSerThrGinPheSerPheValAlaAlaGin510caaaacacaagtaattgggggcctUcgatcccttctttcccgtcgaa153GinAsnThrSerAsnTrpGlyProTyrAspProPhePheProValGlu20253035ccgUtgcagetccgccggaagggtgcacagtgacacaggtcaacctg201ProTyrAlaAlaProProGluGlyCysThrValThrGinValAsnLeu404550attcagaggcacggcgcgcgttggcccacatecggcgcgeggtcgegg249lieGinArgHisGlyAlaArgTrpProThrSerGlyAlaArgSerArg556065caggtcgccgccgtagcgaagatacaaatggcgcgaccattcacggat297GinValAlaAlaValAlaLyslieGinMetAlaArgProPheThrAsp707580cccaagtatgagttcetcaacgacttcgtgtacaagttcggcgtcgcc345ProLysTyrGluPheLeuAsnAspPheValTyrLysPheGlyValAla859095gatctgetaccgUcggggetaaccaatcgcaccaaaceggcaccgat393AspLeuLeuProPheGlyAlaAsnGinSerHisGinThrGlyThrAsp100105110115atgtatacgcgctacagtacactatttgagggcggggatgtacccttt441MetTyrThrArgTyrSerThrLeuPheGluGlyGlyAspValProPhe120125130gtgcgcgcggetggtgaccaacgcgtcgttgactectcgacgaactgg489ValArgAlaAlaGlyAspGinArgValValAspSerSerThrAsnTrp135140145acggcaggctttggcgatgettctggcgagactgttetcccgacgetc537ThrAlaGlyPheGlyAspAlaSerGlyGluThrValLeuProThrLeu150155160caggttgtgcttcaagaagaggggaactgcacgetctgcaataatatgGinValValLeuGinGluGluGlyAsnCysThrLeuCysAsnAsnMet165170175585tgcccgaatgaagtggatggtgacgaatecacaacgtggctgggggtcCysProAsnGluValAspGlyAspGluSerThrThrTrpLeuGlyVal180185190195633UtgcgccgaacateaccgcgcgattgaacgetgetgcgccgagtgecPheAlaProAsnlieThrAlaArgLeuAsnAlaAlaAlaProSerXla200205210681aacetcteagacagegacgcgetcactetcatggatatgtgcccgUcAsnLeuSerAspSerAspAlaLeuThrLeuMetAspMetCysProPhe215220225729gacactetcagetecgggaacgecagecccUctgtgacetatttaccAspThrLeuSerSer6lyAsnAlaSerProPheCysXspLeuPheThr230235240777gcggaggagtatgtgtegtaxgagtactactatgacetcgacaagtacAla6luGluTyr^alSerTyrGluTyrTyrTyrAspLeuAspLysTyr245250255825tatggcacgggccccgggaacgetetcggtcctgtccagggcgtcggaTyrGlyThrGlyProGlyAsnAlaLeuGlyProValGinGlyValGly260265270275873tacgtcaatgagctgcttgcacgcUgaccggccaagecgttcgagacTyrValAsnfiluLeuLeuXlaArgLeuThrGlyGinAlaValArgAsp280285290921gagacgcagacgaaccgcacgetcgacagegaccctgcaacattcccgGluThrGinThrAsnArgThrLeuAspSerAspProAlaThrPhePro■295300305969ctgaaccgtacgUctacgecgacUctegcatgataacaccatggtgLeuAsnArgThrPheTyrAlaAspPheSerHisAspAsnThrMetVal3103153201017cccateUtgcggcgetcgggetcUcaacgecaccgecetcgacccgProliePheAlaAlaLeuGlyLeuPheAsnAlaThrXlaLeuAspPro3253303351065ctgaagcccgacgagaacaggUgtgggtggactctaagctggUccgLeuLysProAspfiluAsnArgLeuTrpValAspSerLysLeuValPro3403453503551113Uctctgg￡icatatgacggtcgagaagctggcatgttctgggaaggagPheSerGlyHisMetThrValGluLysLeuAlaCysSerGlyLysGlu3603653701161gcggtcagggtgetcgtgaacgacgcggtgcagccgctggagUctgcAlaValArgValLeuValAsnAspAlaValGinProLeuGluPheCys3753803851209ggaggtgttgatggggtgtgcgagcttteggetttcgUgagagecagGlyGlyValAspGlyValCysGluLeuSerAlaPheValGluSerGin3903954001257acgUtgcgegggagaatgggcaaggcgacttcgecaagtgcggcUtThrTyrAlaArgGluAsnGlyGinGlyAspPheAlaLysCysGlyPhe4054104151305gttccgteggaatagValProSerGlu4201320<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>LeuPheThrAlaGluGluTyrValSerTyrGluTyrTyrTyrAspLeu245250255AspLysTyrTyrGlyThrGlyProGlyAsnAlaLeuGlyProValGin260265270GlyValGlyTyrValAsnGluLeuLeuAlaArgLeuThrGlyGinAla275280285ValArgAspGluThrGinThrAsnArgThrLeuAspSerAspProAla290295300ThrPheProLeuAsnArgThrPheTyrAlaAspPheSerHisAspAsn305310315320ThrMetValProliePheAlaAlaLeuGlyLeuPheAsnAlaThrAla325330335LeuAspProLeuLysProAspGluAsnArgLeuTrpValAspSerLys340345350LeuValProPheSerGlyHisMetThrValGluLysLeuAlaCysSer355360365GlyLysGluAlaValArgValLeuValAsnAspAlaValGinProLeu370375380GluPheCysGlyGlyValAspGlyValCysGluLeuSerAlaPheVal385390395400GluSerGinThrTyrAlaArgGluAsnGlyGinGlyAspPheAlaLys405CysGlyPheValProSerGlu420<210〉3<211>42<212>DM<213〉人工序列<220><223〉引物620AM34<220><221>misc—feature<223>引物<400>3gagtacUtcttgcatttgtactagg3gtttagtgaacttgc<210〉4<211>4141041542<212〉DNA<213>人工序列<220><223>引物680AM35<220><221〉misc—feature<223>引物<400>4atggttatggatttcggggattcttcgagcgtccc333axc41<210><211><212><213>520腿人工序列<220〉<223>引物AM34<220〉<221>misc—feature<223>引物<400>5taggagtttagtgaacttgc20<210>6<211〉18<212>腿<213〉人工序列<220><223〉引物AM35<220〉<221>misc—feature<223>引物<400>6ttcgagcgtcccaaaacc18<210><211><212><213>722DNA人工序列<220〉<223>引物620<220><221>misc-feature<223>引物<400>7gagtactatcttgcatttgtac22<210>8<211>21<212>DNA<213〉人工序列<220><223>引物680<220〉<221>misc—feature<223〉引物<400>8atggttatggatttcggggat21<210>9<211>62<212>應<213>人工序列<220><223〉引物Dopel<220><221>misc—feature<222>(19)..(19)<223>N在位点19是91°/A，3°/。G，3订，3°/C<220〉<221>misc—feature<222〉(20)..(20)<223〉N在位点20是91°/。C,3%G,3%\,3CT<220〉<221〉misc—feature<222>(21).■(21)<223>N在位点21是G或T<220><221〉misc-feature<222>(22).(22)<223>N在位点is88%C,12%A<220><221〉misc—feature<222>(23)..(23)<223>N在位点23是90。/。T，3%G,7°M<220><221>misc—feature<222>(24)..(24)<223>N在位点24是47W,8%A，45CT<220〉<221>misc—feature<222>(25)..(25)<223>N在位点25是9。/。G，91°/A<220><221>misc—feature<222>(26),.(26)<223〉N在位点26是83W;，4%A,9%T,4%C<220〉<221〉misc—feature<222>(27)..(27)<223>N在位点27是T<220><221〉misc—feature<222〉(28)..(28)<223>N在位点28是911T，3°/G,3M,3°/。C<220><221〉misc—feature<222〉(29)..(29)<223>N在位点29是91。/。C,3°/。G,3°/A，3°/T<220><221>misc—feature<222>(30)..(30)<223〉N在位点30是G或T<220><221>misc—feature<222>(31)..(31)<223>N在位点31是91%G,3°/C,3'/。A,3%T<220〉<221>misc—feature<222〉(32)..(32)<223〉N在位点32是9WG，3%C,3%A,3%T-<220><221>misc_feature<222>(33)..(33)<223>N在位点33是G或T<220><221>misc—feature<222>(34)..(34)<223>N在位点34是9iy。A,3%G，3%T，3°/。C<220><221>misc—feature<222〉(35)..(35)<223>N在位点35是91。/。A,3°/G,3%T,3%C<220><221>misc—feature<222>(36).(36)<223>N在位点36是95%T，5°/。G<220〉<221>misc—feature<222>(37).(37)<223〉N在位点37是9iy。G，3°/C,3%A,3%T<220><221〉misc—feature<222>(38)(38)<223>N差&点38是91%C,3%G，3°/。A,3%T<220><221>misc—feature<222>(39)..(39)<223>N在位点39是G或T<220〉<221>misc—feature<222〉(40)..(40)<223〉N在位点4Q是95'/。T,5%G<400>9gatatgtgcccgUcgacnnnrmnrmtrmnrmnrmrmnrmcccccttctgtgaccUUt60<210〉<211><212〉<213>1018腿人工序列<220><223>引物DopelR<220><221>misc—feature<223〉引物<400>10gtcgaacgggcscatatc18<210><211><212><213>1143DNA人工序列<220><223>引物L102TI<220><221><222〉<223〉misc—feature(22).(22)N在位点22是C或T<400>11agttcggcgtcgccgatctgancccgttcggggctaaccaatc43<210〉<211〉<212><213〉1253謹人工序列<220><223>引物VE248+251X<220><221><222><223〉<220><221><222><223><220><221><222><223><220><221〉<222〉<223〉<220><221〉<222><223>misc—feature(21)..(21)N在位点21是A或C或Gmisc-feature(22)..(22)N在位点22是A或C或G或Tmisc—feature(23)..(23)N在位点23是A或C或G或Tmisc—feature(30)..(30)N在位点30是A或C或Gmisc—feature(31)..(31)N在位点31是A或C或G或T<220><221〉misc—feature<222〉(32)..(32)<223>N在位点32是A或C或G或T<權>12tatttaccgcggaggagtatnnntcgtacnnntactactatgacctcgacaag53<210〉<211><212><213>1345DNA人工序列<220><223>引物V271AI<220><221><222〉<223>misc—feature(21)..(21)N在位点21是<220><221><222><223〉misc—feature(22).,(22)N在位点22是<楊>13A或G.C或Tccgggaacgctctcggtcctrmccagggcgtcggatacgtcaatg45<210><211><212〉<213〉<220><223〉<220><221><222〉<223〉<220〉<221><222><223>1442DNA人工序列引物G286Xmisc_feature(24)..(24)N在位点24是A或C或Gmisc—feature(25)..(26)N在位点25和26独立地是A或C或G或T<400>14atgagctgcttgcacgcttgaccnrmcaagccgttcgagaeg4权利要求1.亲代肌醇六磷酸酶的变体，包含在位置125的取代，其中(a)所述变体具有肌醇六磷酸酶活性；和(b)每个位置对应于SEQIDNO2的位置；和(c)所述变体与SEQIDNO2具有至少75％的百分比同一性。2.权利要求1的变体，其包含取代125D,其与Pem'oj^ora(y"7CBS686.96肌醇六磷酸酶相比具有改进的热稳定性和/或比活性。3.权利要求1或2的变体，其含有的取代或取代的组合选自下述取代和耳K气的组合(ii〕(iii)29S+99D+125D+324A+334E+350V;(vi)29S+125D+218T+324A+344S+350V;(v)29S+125D+234K+324A+330R;(vi)29S+125D+234K+324A+330R+395G;(vii)29S+125D+324A;(viii)29S+125D+324A+330R+395G;(ix)29S+125D+324A+350V。4.分离的核S交序列，其包含编码权利要求l-3任一变体的核酸序列。5.核酸构建体，其包含权利要求4的核酸序列，所述核酸序列与一或6.重组表达载体，其包含权利要求5的核酸构建体。7.重组宿主细胞，其包含权利要求5的核酸构建体和/或权利要求6的表达载体。8.生产权利要求l-3任一的变体的方法，其包含(a)培养权利要求7的宿主细胞来生产包含所述变体的上清；和(b)回收所述变体。9.转基因植物，或植物部分，其能表达权利要求l-3任一的肌醇六磷酸酶变体，所述植物部分不是繁殖材料且其选自茎，愈伤组织，叶，根，块茎，叶绿体，质外体，线粒体，液泡，过氧化物酶体，胞质和植物细胞。10.转基因非人动物，或产物，或其元件，其能表达权利要求1-3任一的肌醇六磷酸酶变体，所述产物或元件选自体液，器官，肉和动物细胞。11.权利要求10所述的转基因非人动物，或产物，或其元件，其中所述的体液选自奶和血。12.组合物，其包含至少一种权利要求1-3中任一的肌醇六磷酸酶变体，和(a)至少一种脂肪可溶维生素；(b)至少一种水溶维生素；和/或(c)至少一种痕量矿物质。13.权利要求12的组合物，所述的痕量矿物质选自镁，锌，铁，铜，石典，石西和钴。14.权利要求12或13的组合物，其还包含至少一种选自下述酶的酶木聚糖酶，葡聚糖内切酶，内切-1，3(4)-(3葡聚糖酶，和蛋白酶。15.权利要求12-14任一的组合物，其为动物饲料添加剂。16.动物饲料组合物，其粗制蛋白质含量为50-800g/kg，并包含权利要求1-3任一的变体或权利要求12-15任一的组合物。17.提高动物饲料营养价值的方法，其中将权利要求1-3任一的变体或权利要求12-15任一的组合物加到所述饲料。18.降低动物粪便中肌醇六磷酸/盐水平的方法，包含喂给动物有效量的权利要求16的饲料。19.处理植物蛋白质的方法，包含将权利要求l-3任一的变体或权利要求12-15任一的组合物加到至少一种植物蛋白质或蛋白质源中的步骤。20.权利要求1-3任一的变体或权利要求12-15任一的组合物在如下的用途在动物饲料中；在动物伺料制备中；用于提高动物饲料营养价值；降低动物粪便中肌醇六磷酸/盐水平；处理植物蛋白质；或从肌醇六磷酸酶底物释放磷。全文摘要本发明涉及的肌醇六磷酸酶变体来自与Peniophoralycii肌醇六磷酸酶同源的亲代肌醇六磷酸酶，并包括在对应于Peniophoralycii肌醇六磷酸酶位置的数个位置中的至少一个上的至少一个取代。所述变体的性质改进，具体为比活性和/或热稳定性比亲代肌醇六磷酸酶高，例如通过DSC测定，在pH5.5Tm最多为82℃，和/或双倍比活性。本发明也涉及编码所述肌醇六磷酸酶变体的DNA，它们的生产方法，及其，例如在动物饲料和动物饲料添加剂中的用途。文档编号C12N9/16GK101177675SQ20071019628公开日2008年5月14日申请日期2003年2月4日优先权日2002年2月8日发明者克劳斯·C·富格尔桑,松井知子,福山志朗,阿伦·斯文德森申请人:诺维信公司