专利名称：从成人牙周滤泡组织中收集和分离胚胎样干细胞群的方法
从成人牙周滤泡组织中收集和 分离胚胎样干细胞群的方法
概述
本发明涉及从具有胚胎样抗原特征的人牙泡中分离新的干细胞亚群的 新方法，也涉及其增殖培养的方法。可对所迷分离的细胞进行表征并保存 在细胞收集物中用于实验和治疗用途。
更特别地，本发明描述了 1)从供者牙周滤泡组织分离干细胞；它们 在体外，尤其在能够允许胚胎样分离的培养条件中的生长；它们的建库 (banking)以便保持生活力；它们向不同细胞型的分化；分离的干细胞细 胞型用于细胞治疗和/或供者本身或HLA相容宿主的组织工程化以再生多 种病原学损伤的用途。
背景技术：
目前从人组织中分离干细胞的可能性是有争议的并被广泛讨论。干细 胞的定义本身是能够自我更新并向其来源生物的所有不同细胞型分化的细 胞。该定义不符合迄今为止在人出生后可收集的成体干细胞的抗原和功能 特征。"自我更新，，的一方面，实际上，迄今已分离到的成体干细胞没有显 示出无限制的增殖能力，并且另一方面，分化能力几乎不能超越多能性(分 化为来自相同胚层的所有细胞型的能力)或多潜能性(也能分化为来自不 同胚层的细胞型的能力)，而不能实现全能性(分化为所有细胞型的能力)；
后者是受精卵和胚泡细胞拥有的能力，导致人类发育的第一步。另一方面， 对从人胚胎收集的细胞进行操作用于治疗和研究应用的可能性经常与技 术、伦理和法律难题相抵触。由于这些原因，在成人未分化细胞型中分离 的可能性不仅代表细胞分化的有趣的实验模型，并且对于癌相关组织，还
代表治疗基于组织退化的疾病的重要治疗工具，所述疾病由数量和质量缺 陷引起。
所述干细胞是细胞型，其特征在于
0) 无限制的自我更新；
0) 向多种细胞型的分化能力。
对于由包括滤泡细胞型的WO 03/066840代表的现有4支术，本发明显 示出以下不同
0 )细胞的抗原模式和选择方法。WO 03/066840没有公开任何选择， 然而本发明的方法通过胚胎千细胞的细胞荧光测定法利用抗原检测如 SSEA-4、 TRA1腳60、 TRA1-81、 CD133、 CD卯、flk画l进行选择。以这种 方式可以获得胚胎细胞的均 一群。
0) 培养方法、细胞增殖和分化；实际上WO 03/066840描述了收集 细胞群的技术，所述细胞群含有仅仅一小部分的成体干细胞，然而本发明 的选择方法允许制备均 一 的胚胎样干细胞群。
发明概述
本发明描述了用特异性抗体适当染色后通过FAC分选(FACsorting) 选择从滤泡嚢(follicular sack)分离新的非造血间充质干细胞亚群的方法， 下文中将所述非造血间充质干细胞亚群指作FENC (来自滤泡的胚胎神经 嵴干细l包)。
本发明也提供FENC的培养和增殖方法。通过本发明的方法可得到的 细胞能够分化为来自三种胚层的所有组织，因此使FENC成为全能的/多能 的细胞群。可以FENC保存，保持它们的生活力，使得可以建立细胞库来 保存从成人患者收集的胚胎干细胞。本发明也提供通过FENC进行的细胞 和/或基因组治疗及从FENC分化获得的细胞和组织的临床治疗应用的方 法。
发明详述
本发明涉及分离从成人收集的胚胎干细胞的新细胞型的方法，尤其是 分离这些细胞的方法，包括从滤泡嚢中收集其的方法。
牙泡，作为出牙前在它的形成过程中包被牙齿的组织复合物，由于以
下两个原因而代表未分化细胞的优先来源
1) 每一颗牙齿，恒齿和乳齿，代表出生时的不完全器官。它在它的 发育位点产生了未分化细胞，其在增殖后将变成牙发生细胞。神经峰的胚 胎起源说明了它们的未成熟性。也在牙形成结束时，这些未分化细胞在滤 泡内保持/m /oco直至出牙，因为它们将变成出牙后发育的牙周組织和牙才艮 尖的未来细胞。目前肯定的是牙周膜(Gronthos， Lancet 2004 )和牙髓内
(Gronthos， PNAS 2000; Miura， PNAS2003; Laino， JBMR2005)存 在成体干细胞。
2) 所述牙泡是具有方便的外科通路及具有未分化干细胞和收集的 组织体积间高比例的生物学生态位。因为拔出智齿非常常见并且需要收集 滤泡嚢，用于干细胞收集的组织损失是最小的。干细胞，具有从这些生物 样品获得的胚胎特征，可以保存用于研究和自体治疗应用。
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本发明第 一次提供了具有胚胎特征的均一细胞群从成人中的分离。 该策略呈现这些优势1)使用局部麻醉的低侵入性手术；2)位点的
低发病率；3)由于不存在造血部分，高克隆发生的间充质培养；4)胚胎 细胞从成人中的分离。
FENC的获得-从滤泡嚢中获得的干细胞直接来自间充质细胞，所述 间充质细胞在器官发生过程中起源于神经嵴。它们的起源说明了它们的可 塑性。为了从所述滤泡嚢中分离千细胞，滤泡嚢必须完整，与口腔没有联系。
患者在手术前的本周内必须遵循合适的口腔卫生方案，例如每天用
CHX0.12或类似的试剂冲洗口腔至少两次。对于滤泡嚢的收集，麻醉后， 切开活瓣并打开骨通道(bone door)以到达滤泡嚢包净與的阻生牙。 一旦在
无菌条件下收集，将样品浸在消化液中于37。C下1小时。第一小时结束 时，将所述消化液过滤来去除细胞团块和ECM颗粒。在这之后，终止消 化过程并在MegaCdl培养基(SIGMA-Milan，意大利)中培养细胞。或 者，可以使用胚胎干细胞(ES)的培养基。显微镜观察显示从培养的第一 天开始，可以获得大量细胞，所述细胞附着到烧瓶底部，其产生克隆。5 天后在75 ml烧瓶中可以多大60个克隆。
在第9-10天，去除上清液后，在FAC分选仪上攻击细胞，收集干细 胞标记物呈阳性的细胞克隆。
刺激或无刺激下，分离的FENC分化成不同的细胞型。向培养基中加 入BFGF可能获得没有分化的增殖。
细胞达到合适的数目后，可以将它们冰冻并于-80。C储存在液氮中。
总结步骤如下
1) 在无菌条件下收集滤泡嚢，消化并培养；
2) 如果需要，增殖原代培养物； 3 ) FAC分选；
4) 扩增、水冻和/或细胞分化；
5) FAC分析；
6) 保持在未分化状态；
7) 从分化细胞的组织工程化。
从FENC分化获得的所有细胞类型不仅可以用于细胞治疗，还可以用
于构建不同的组织。
例如，可以使用FENCA来获得表达RUNX-2的成骨前体，从其得到 表达HLA-1、 CD44、 RUNX-2和CD54及骨钙蛋白的成骨细胞。
称作LAB (活自体骨)的骨样基质也可从成骨细胞中获得，增殖并冷 藏。LAB由骨组织样品制成，具有大于lcm的厚度和大于lcn^的体积。 LAB形成(包含活跃产生骨的成骨细胞)的特征在于1)聚簇形成，其 在中央区域内分泌无机晶体、胶原纤维和糖蛋白；2)该结构的3D组织， 建立了矿化骨基质。使用a-MEM培养基在5% C02气氛中37°C下通过培育细胞形成所 述LAB，所述a-MEM培养基中加入了 20 % p/v FBS、 100 pM 2P-抗坏血 酸、2mML-谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100 jig/mL链霉素。LAB的 形成只有由于缺少营养物时被阻断。
使用细胞冷藏的常规技术，可以连续产生所述LAB并且可以保存骨样 组织，在4°C或在低于0。C的温度维持所述成骨细胞。
也可获得含有LAB的3D基质，其中成骨细胞在3D生物相容基质存 在下生长，所述基质被细胞建群。所述生物相容基质在体内可以是可再吸 收的或者不可再吸收的合适基质的实例包括乳l羟基乙酸共聚物 (lactide co-glycolic acid )、合成胶原、HA、生物樹瑚、硫酸钩，然而这 些不能被再吸收的基质包括聚甲基丙烯酸酯、PTFe、钛、紧密HA、双相 HA ( 50 % HA和50 %卩画TCP )、陶瓷。
根据本发明的另外的实施方案，为了获得平滑肌细胞，使用MegaCeH 培养基，FENC也可以分化为成肌细胞，所述Mega Cell培养基中含有FBS p/v2%、 100 jiM 2P-抗坏血酸、2mML-谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100 fig/mL链霉素，其中加入了 10ng/mlTGFp。
为了获得横紋肌，使用C2C12鼠肌管共培养也可以将FENC在体外 分化为成肌细胞。使用如以下培养基含有4mML-谷氨酰胺、1.5g/L碳 酸氢钠、4.5 g/L葡萄糖和1.0 mM丙酮酸钠，加入了 FBS 10%的Dulbecco 改良的Eagle培养基(DMEM， Invitrogen )，其中，用1:10的比例进行 共培养7天。
在力口入了 B27蛋白(Invitrogen,米兰)的Neurobasal A (Invitrogen,
米兰，意大利)中，使用15-30天的培养也可以将FENC在体外分化为 神经元和神经胶质细胞。
可以使用神经胶质细胞的抗GFAP抗体通过FAC分选选择由FENC 分化获得的来自神经元的神经胶质细胞。
通过在a-MEM中培养30天也可以将FENC分化为脂肪细胞，其中 向所述a-MEM中加入了 20% p/vFBS、 100 2P-抗坏血酸、2 mM L-
谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100fig/mL链霉素、1()-81^地塞米松。
为了获得软骨，可以使用a-MEM将FENC细胞培养30天获得FENC
的软骨细胞分化，其中向所述a-MEM中加入了 20% p/v FBS、 100 2P-
抗坏血酸、2mML-谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100ng/mL链霉素，降
低p02 < 40 mmHg。
本发明允许FENC在细胞治疗方案中的自体使用。
尤其是，FENC和来自它们的细胞的自体使用可以用于以下应用
-通过来自FENC的成骨细胞治疗骨駱器官(skeletric apparatus )
病理，像骨缺损。
-通过来自FENC的成肌细胞治疗平滑和横紋肌的肌肉组织退化。
-通过来自FENC的神经元治疗CNS病理学。
-通过来自FENC的神经胶质细胞治疗髓鞘退化。
-当希望形成脂肪组织时，通过来自FENC的脂肪细胞用于整形外科。
-通过来自FENC的软骨细胞用于肿瘤学和整形外科领域。
致癌试验-为了排除致癌作用，在用慢病毒III (Invitrogen,米兰， 意大利)感染后，通过含有GFP(绿色荧光蛋白)cDNA的载体已经将FENC 和分化细胞由此注射进棵鼠中。移植后，监视所述动物30天并将其处死。 在移植位点和主要器官上的组织学观察显示没有癌症发生。
已经激发细胞主要的癌症标记物并进行细胞周期分析使用的所有细 胞都没有癌症迹象。
下面才艮道了 FENC应用的某些实施例。
实施例1细胞的分离和培养
从手术前一周开始，每天两次用CHX0.12 w/v对每一健康的患者进行 口腔清洗处理。对于滤泡嚢的收集，局部麻醉后切开活瓣并打开骨通道以 到达滤泡嚢包被的阻生牙。 一旦用格雷西刮治器(Gracey curette )或牙槽 匙在无菌条件下收集后，将样品浸在消化液中于3丌C下1小时。所述消 化液为PBS (磷酸緩冲溶液pH 7,4 1M )，含有3 mg/mL的I型胶原酶、
4mg/mL分散酶、100U/mL青霉素、100 jig/mL链霉素和500 ng/mL clarytromicin。所述溶液的体积依赖于收集的滤泡嚢的体积，且在8至15 mL间变化。所述样品在溶液中于37。C保持1小时。在第一小时结束时， 用Falcon⑧滤过器70 将消化液过滤来除去ECM的碎片、细胞或大的 团块。如果仍然存在组织碎片，可将样品再次消化30分钟。为了终止消化 作用，向消化液加入等于10倍消化体积的体积并于140 g下离心10分钟。 培养基为Mega Cell ( SIGMA，米兰，意大利)，其中加入了 10% w/v 胎牛血清(FBS) 、 100 nM 2P-抗坏血酸、2mML-谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素、100ng/mL链霉素。离心结束时，从管底收集25ml悬浮液并在 50ml烧瓶中于37。C和5。/。 C02下进行培养，每周两次更换培养基。显微 镜观察显示从培养的第一天开始，贴壁细胞产生细胞克隆。 实施例2生长和表征
在75个烧瓶中的上述培养基或胚胎培养基(ES培养基，Invitrogen， 米兰，意大利)中培养5天后，可计数高达60个克隆。
在第9 - 10天，去除上清液并用无菌PBS洗涤后，从烧瓶底部进行细 胞脱附。用溶解在无Mg/Ca的PBS中的4 mL EDTA0.02 %于37°C脱附 IO分钟并进行FAC分选，收集干细胞标记物呈阳性的细胞克隆。将细胞 沉淀(140 g下10分钟)，于4。C用PBS中的BSA (牛血清白蛋白)0.01 。/。洗涤并在4。C温育30分钟用于用10 jtl贮存液抗体染色。温育后，用lml PBS中的BSA 0.1 %洗涤细胞一次来去除不反应的或非特异性的抗体，并 分析对以下抗体的阳性SSEA-4、 TRAl-60、 TRA1-81、 CD133、 CD卯、 flk-l ( Santa Cruz， CA，美国)。70%比例的细胞对SSEA-4呈阳性并且 80 %对TRA 1-60和TRA 1-81呈阳性。SSEA-4+对TRA 1-60和TRA 1-81 都为阳性。SSEA-4、 TRA 1-60和TRA 1-81是仅仅存在于未分化细胞或胚 胎干细胞(全能ES)和胚胎生殖细胞(多潜能EG)上的表面分子。分选 后，检测小样品的3种转录因子Nanog、 OCT-4和Rex-l，其通常仅在 胚胎未分化细胞上可检测到。先前抗原的阳性证实了所述细胞(ES)的胚 胎性质(Zhang Nature 2003 ) 。 OCT-4阳性在所有分选细胞中为100 % 。
对于Nanog和Rexl分析，在获得适当数目的细胞后，分离RNA并用 RT-PCR进行分析。
实施例3分化类型a (骨、平滑肌和软骨)
如实施例1和2中报道的分离并表征的FENC可以在有刺激或无刺激 下分化，或可以在向培养基中加入8 ng/mL卩FGF时增殖而限制分化。
对于成骨分化，可以用a-MEM培养细胞，所述a-MEM中加入了 FBS 20% w/v、 100 jiM 2P-抗坏血酸、2mML-谷氨酰胺、100U/mL青霉素、 100ng/mL链霉素。细胞在约25天后分化为成骨细胞，建立编织骨(对于 抗I和III型胶原、骨钩蛋白、骨粘连蛋白、BAP的抗体呈阳性)。
对于平滑肌分化，FENC必须用2。/。 Mega Cell ( SIGMA ) (FBSp/v、 2P-抗坏血酸100 nM、 L-谷氨酰胺2mM、青霉素100U/mL、链霉素100 jig/mL,加入10 ng/ml TGF卩)培养。在这些条件下细胞在约4 - 5天内分 化并对SMA抗体染色、平滑肌分化标记物呈阳性。
对于软骨分化，FENC在a-MEM培养基中培养，所述a-MEM培养 基中加入了 20% w/vFBS、 100 nM 2P-抗坏血酸、2mML-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100照/mL链霉素，降低p02 < 40 mmHg并在37。C用5 。/oC02培养。由于细胞浓度高(500,000/15 mL)，软骨构建发生在约30
天内并可以通过n型胶原酶表达的分析来证实。
实施例4 b型分化(神经元和神经胶质细胞)
滤泡细胞可以自发分化或使用加入了 B27蛋白(Invitrogen，米兰， 意大利)的NeurobasalA培养基(Invitrogen,米兰，意大利)分化。培 养进行5 - 7天。在两种情况下获得了大量分化的神经元和神经胶质细胞。 然后可以使用抗GFAP抗体进行细胞荧光测定法来选择并分离两种细胞 型。实际上，分化的细胞是
-当对GFAP抗体呈阳性时为神经胶质细胞；
-当对抗TuJl、抗神经丝、抗Brn3A (转录因子)抗体呈阳性时为 神经元；
-当对抗外周蛋白和抗p75抗体呈阳性时为外周神经元。
实施例5c型分化(横紋肌，脂肪细胞)
可以通过与C2C12鼠肌管共培养来完成FENC分化成横紋肌细胞。 使用已知方法(例如Laino等人，2006)，在如下制备的培养基中用1:10 的比例进行共培养一周Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM， Invitrogen)，其中加入了 4 mM L-谷氨酰胺、1.5g/L碳酸氢钠、4.5 g/L 葡萄糖、1.0 mM丙酮酸钠和FBS 10 % 。共培养后，融合到鼠肌管内的FENC 的百分比可通过抗人核层粘连蛋白来计算。通常，融合的百分比约为15-20%。融合的肌管可以用于移植。
可以在以下培养基中加入地塞米松10_8M 30天获得脂肪细胞分化 (x-MEM，其中加入了20% p/vFBS、 100 2P-抗坏血酸、2 mM L隱谷氨 酰胺、100U/mL青霉素、100jig/mL链霉素。最后，可以观察到大量脂肪 细胞，其可以用苏丹黑或用油红O新鲜染色。
脂肪细胞可以用于整形外科。
实施例6组织工程化和临床应用
FENC —旦分化，也可在Roller装置中通过旋转培养用于组织重建。 成骨细胞分化细胞例如可以接种在乳^/羟基乙酸共聚物(lactide coglycolyc ) ( 85:15 )支架上(其在15天内是可再吸收的)。旋转培养(1/5 秒)在5 % C02培养箱中进行30天。 一旦达到1 cm的厚度，观察3D组织 结构并通过组织学、免疫组织化学和SEM技术来评估。
骨组织可以用于缺损再生。如果可以从患者中获得这些细胞，可以模 拟支架并进行3D培养。20-30天后，就可以将复合的支架-细胞植入患 者的部位。
可使用标准的外科技术完成移植。准备移植部位涉及产生明显的血液 外渗并减少皮质层。因此可以使支架-细胞与宿主的整合变得更容易并且 然后可以进行移才直。
完全整合在40 - 60天内完成。
由于该自体技术，可以使用干细胞实现组织修复。术语
Mega cell-细胞培养基(Sigma-Aldrich，米兰，意大利)
ES-培养基(Invitrogen,米兰，意大利)
I5FGF = p成纤维细胞生长因子
a-MEM = a Medium Essential Medium (Invitrogen)
抗GFAP =针对胶质细胞原纤维酸性蛋白的抗体
GFAP =胶质细胞原纤维酸性蛋白
SMA-平滑肌动蛋白
TGF卩-肿瘤生长因子p
BAP =骨碱性磷酸酶
PFGF =成纤维细胞生长因子P
RT-PCR =逆转录酶聚合酶链式反应
Nanog =早期发育过程中胚胎细胞的转录因子
Rexl -早期发育过程中胚胎细胞的转录因子
OCT-4 =八聚体4
SSEA-4 =阶段特异的胚胎抗原
TRA1 -肿瘤排斥抗原1
CD =分化簇
flk-1 =胎儿肝激酶1
HA =羟基磷灰石
TCP =磷酸三4丐
权利要求
1、分离、增殖和保存属于人牙泡的干细胞群的方法，所述干细胞被称作FENC(来自滤泡的胚胎神经嵴干细胞)，该方法包括:a)在无菌条件下收集滤泡囊，进行消化和原代培养生长和增殖；b)任意扩增；c)FAC分选。
2、 根据权利要求1的方法，其中使用蛋白水解酶和抗体进行所迷消化。
3、 根据权利要求2的方法，其中通过水溶液进行所述酶消化，所迷水 溶液含有PBS中的3 mg/mL I型胶原酶、4 mg/mL分散酶、100 U/mL 青霉素、100ng/mL链霉素、500 ng/mLclarytromicin。
4、 根据权利要求2或3的方法，其中所述酶消化在37。C摇动下进行 1小时。
5、 根据权利要求1-4任何一项的方法，其中通过干细胞特异的培养 基获得原代培养物生长和增殖。
6、 根据权利要求5的方法，其中所述培养基由MEGACell、加入的 10% p/v FBS、2P-抗坏血酸100 nM、L-谷氨酰胺2 mM、青霉素100 U/mL、 链霉素100 pg/mL组成。
7、 根据权利要求5或6的方法，其中所述温育在37。C和5。/。C02的 气氛中进行15-20天，每3天更换所述培养基。
8、 根据权利要求1 - 7任何一项的方法，其中使用SSEA-4、 TRA 1-60、 TRA1-81、 CD133、 CD卯、flk-l作为干细胞标记物进行FAC分选。
9、 通过权利要求1 - 8的方法可得到的FENC用于获得成骨前体、成 骨细胞、成肌细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经元、神经胶质细胞的用途。
10、 成骨前体、成骨细胞、成肌细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经元、 神经胶质细胞用于自体制剂的用途，所述自体制剂用于细胞治疗方案，该 方案用于骨裕器官(skeletric apparatus )病理、肌组织退化、CNS病理、 髓鞘退化、肺瘤疾病的治疗并用于整形外科。
全文摘要
分离、增殖和保存属于人牙泡的干细胞群的方法，所述干细胞被称作FENC(来自滤泡的胚胎神经嵴干细胞)，该方法包括a)在无菌条件下收集滤泡囊，进行消化和原代培养生长和增殖；b)任意扩增；c)FAC分选。
文档编号C12N5/077GK101384708SQ200780006011
公开日2009年3月11日 申请日期2007年2月19日 优先权日2006年2月20日
发明者A·德罗斯, A·格拉齐亚诺, G·帕帕乔, G·拉伊诺, R·达奎诺 申请人:泰斯拉博有限公司