用于牙组织再生的组合物和方法
【专利说明】用于牙组织再生的组合物和方法
[0001] 相关申请的交叉参考
[0002] 本申请要求2013年6月5日申请的美国临时申请系列号61/831,595及2013年 3月21日申请的美国临时申请系列号61/804, 138的权益，每个申请全文引入本文作参考。
[0003] 关于联邦资助的研究或开发的声明
[0004] 本发明是在政府资助下完成的，所述资助为由NationalInstitutesofHealth/ NationalInstituteofDentalandCraniofacialResearch颁发的基金5RC2DE020767， 及由TheNationalInstitutesofHealth颁发的基金R01DE15391。政府在本发明中具有 一定权利。
[0005] 引入作参考的材料
[0006] 作为本发明的一部分的序列表包括计算机可读形式，其含有本发明的核苷酸和/ 或氨基酸序列。序列表的主题全文引入本文作参考。
[0007] 发明背景
[0008] 牙齿是生物学可存活的，这主要是由于牙髓。目前，患病的、缺失的或创伤的牙髓 是通过用惰性合成材料覆盖或置换。最常用的充填材料是杜仲胶，这是橡胶基质的热塑性 聚合物。在除去已经患病、缺失或创伤的天然牙髓后，将杜仲胶熔化并注入以充填根管。尽 管牙髓或根管处理已经是当代牙科医学领域的常规技术，但是仍具有对于患者的生活质量 有不利影响的一些缺点（Salvietal. 2007)。首先，经根管治疗的牙趋于易碎，且容易断 裂。其次，在根管治疗后通常发生牙齿变色。其经过根管治疗而发生牙齿变色的患者通常 需要额外的高价牙齿美容程序。第三，脱落的牙齿（乳牙）的患病的、缺失的或感染的牙髓 通常缺乏治疗选择，且通常不适于根管治疗。牙髓坏死在85-96 %的撕脱牙及70-100 %侵 入牙（intrudedteeth)中发生。未处理的或不良处理的牙感染可以导致全身性感染（Shay 2002；Brennanetal. 2007)〇
[0009] 理想地，一种改良的用于患病、缺失或创伤牙髓的治疗方式使得生物学活组织得 以恢复。组织工程技术已经用于开发恢复颅面组织和骨的方法和组合物。见例如Alhadlaq andMao, 2003；EdwardsandMason, 2006；Fongetal. , 2005；GoldbergandSmith, 2004 ； HongandMao, 2004；Lovschalletal. , 2001；Maoetal. , 2006；Mathieuetal. , 2006 ； Murrayetal. , 2002；Murrayetal. , 2007；NakashimaandAlamine, 2005；Nakashimaand Reddi, 2003;StosichandMao, 2007;Youngetal. , 2002;美国专利No. 5, 885, 829 ;及美国 专利申请公开20050079470。大多数技术包括使用支架材料，其包含哺乳动物细胞如牙髓干 细胞或者间充质干细胞，和/或生物活性成分如骨形态发生蛋白（BMP)。将细胞接种于支架 材料上的技术具有难以制备和贮存的缺点，因为活细胞必须在支架上接种、培养和维持。此 外，用于组织再生中的细胞的来源和产量不足。
[0010] 将祖细胞诱导成成牙本质细胞（0d)的关键因素尚未知。
[0011] 发明概述
[0012] 在本发明的各个方面中，提供了用于再生牙组织的组合物和方法。
[0013] 本发明一方面提供了用于再生牙组织的组合物。在一些实施方案中，组合物包含 基质或支架（例如包含水凝胶的基质或支架）和治疗有效量的Wnt3a多肽和骨形态发生蛋 白7(BMP-7)。在一些实施方案中，组合物包含治疗有效量的血管内皮生长因子（VEGF)、碱 性成纤维细胞生长因子（bFGF)或者神经生长因子（NGF)。在一些实施方案中，组合物不包 含活细胞。在一些实施方案中，基质或支架包含Wnt3a和BMP-7,及任选存在的VEGF、bFGF 或NGF。所述组合物的其它特征在下文使用方法中论述。本领域技术人员了解这种特征可 同样用于组合物自身。
[0014] 本发明另一方面提供了用于再生牙组织的方法。在一些实施方案中，所述方法包 括提供上述组合物，及将组合物插入哺乳动物牙齿的天然或人工的洞或腔室中。在一些实 施方案中，所述组合物促进祖细胞的成牙本质细胞分化，促进祖细胞迀移至牙组织中，促进 血管发生性、牙发生性、纤维发生性或者神经发生性发育，以再生牙组织。在一些实施方案 中，所述组合物再生血管化牙髓组织或者再生新牙本质（neodentin)。
[0015] 在一些实施方案中，所述支架进一步包括选自如下的化合物：血小板衍生生长因 子（PDGF)、内皮细胞生长因子（ECGF)、转化生长因子1 (TGF-P1)、表皮生长因子（EGF)、 肝细胞生长因子（HGF)、基质细胞衍生的因子-l(SDFl)、除了BMP-7之外的骨形态发生 蛋白（BMP)、TGF-P、生长和分化因子（GDF)、胰岛素样生长因子-l(IGFl)、牙本质基质蛋 白、牙本质涎蛋白、骨涎蛋白、牙釉蛋白、整联蛋白、血管生成素（angiogenin)、血管形成 素-l(angi〇p〇ietin-l)、del-1、卵泡抑素、粒细胞集落刺激因子（G-CSF)、肝细胞生长因 子/散射因子（HGF/SF)、白细胞介素-8 (IL-8)、瘦素、中期因子、胎盘生长因子、血小板衍 生内皮细胞生长因子（PD-ECGF)、血小板衍生生长因子-BB(H)GF-BB)、多营养因子（PTN)、 颗粒蛋白前体、增殖蛋白、转化生长因子-a(TGF-a)、转化生长因子(TGF-P)、肿瘤坏 死因子-a(TNF-a)、基质金属蛋白酶（MMP)、血管形成素1 (angl)、ang2、delta-样配体 4(DLL4)、结缔组织生长因子（CTGF)、脑衍生神经因子（BDNF)、NT-4和NT-3。在一些实施方 案中，支架进一步包含抗生素或镇痛药。
[0016] 在一些实施方案中，将Wnt3a多肽、BMP-7、VEGF、bFGF或NGF注射于、混合于、包囊 于、束缚于（tetheredto)或者吸附于基质或支架中。
[0017] 在一些实施方案中，支架具有人切牙、人尖牙、人双尖牙（bicuspid)或人磨牙或 者其中天然或人工的洞或腔室的形状。
[0018] 在一些实施方案中，基质或支架包括天然聚合物，选自胶原蛋白、明胶、多糖、壳聚 糖、羟磷灰石（HA)及聚羟基脂肪酸酯。在一些实施方案中，基质或支架包括合成的聚合物， 选自聚（a-羟基酸）的脂肪族聚酯及聚乙二醇。在一些实施方案中，基质或支架包括羟磷 灰石。在一些实施方案中，基质或支架包括藻酸盐水凝胶。在一些实施方案中，基质或支架 是生物可降解的。
[0019] 在一些实施方案中，支架包括直径为（i) 50-500ym;或者（ii)大约200ym的微 通道。在一些实施方案中，Wnt3a和BMP-7及任选存在的VEGF、bFGF或NGF被包埋入支架 微通道中的凝胶中。在一些实施方案中，Wnt3a和BMP-7及任选存在的VEGF、bFGF或NGF 包囊于微球中。
[0020] 在一些实施方案中，所述方法进一步包括使用计算机辅助设计（CAD)制作牙齿或 牙洞模型，及用生物绘图仪（bioplotter)合成支架。
[0021] 在一些实施方案中，Wnt3a多肽包含SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3 或 3￡〇10勵:4所示氨基酸序列。在一些实施方案中，1拉3&多肽包括与36〇10勵 ：1、3￡〇10N0:2、SEQIDN0:3或SEQIDN0:4具有至少大约95%序列相同性并具有Wnt3a活性的氨 基酸序列。
[0022] 在一些实施方案中，Wnt3a以大约lng至大约1，OOOmgWnt3a/ml溶液的浓度存在， 其中所述溶液被导入基质或支架中。在一些实施方案中，BMP-7以大约lng至大约l，000mg BMP-7/ml溶液的浓度存在，其中所述溶液被导入基质或支架中。在一些实施方案中，Wnt3a 以大约l〇ng/ml溶液的浓度存在，BMP-7以大约200ng/ml溶液的浓度存在，其中所述溶液 被导入基质或支架中。在一些实施方案中，VEGF以大约lng至大约l，000mgVEGF/ml溶液 的浓度存在。在一些实施方案中，bFGF以大约lng至大约1，OOOmgbFGF/ml溶液的浓度存 在。在一些实施方案中，NGF以大约lng至大约1，OOOmgNGF/ml溶液的浓度存在。在一些 实施方案中，上述溶液被导入基质或支架中。
[0023] 在一些实施方案中，所述方法进一步包括暴露牙髓腔或根管中创伤或患病的牙髓 组织；及用所述组合物覆盖或充填至少一部分牙髓腔或根管，其中在覆盖或充填后新生的 血管化牙髓样组织在牙髓腔或根管中形成。
[0024] 在一些实施方案中，所述方法进一步包括从牙齿中除去创伤或患病的牙髓组织， 以产生基本上没有创伤或患病组织的牙髓腔或根管。在一些实施方案中，所述方法进一步 包括从牙齿中除去基本上所有的牙髓组织。在一些实施方案中，所述方法进一步包括用惰 性材料充填至少一部分牙髓腔。
[0025] 本发明的其它目的和调整在后文将部分显见和点明。
[0026] 附图描述
[0027] 本领域技术人员理解下文所述附图只是举例说明本发明。附图不以任何方式限制 本发明教导的范围。
[0028] 图1是经过临床相同根管处理的成人牙齿照片。经牙髓处理的根管和牙髓腔用无 生物活性成分（a图），或者仅具有碱性成纤维细胞生物活性成分（bFGF) (b图），或者既具 有bFGF也具有血管内皮生物活性成分（VEGF) (c图）的胶原蛋白海绵充填。将牙齿在皮下 植入免疫缺陷的小鼠维持2周，以评估在牙髓处理的根管和牙髓腔内是否发生血管化。与 无生物活性成分处理（仅胶原蛋白海绵）（a)相反，仅bFGF(b)及VEGF和bFGF组合（c)处 理均示出在插入根管中的胶原蛋白海绵中的血管化。
[0029] 图2示出如图1所示处理的成人牙齿切片的显微照片。A图示出植入无生物活性 成分的胶原蛋白海绵的人恒切牙的根管。在免疫缺陷的小鼠中体内植入后，不存在任何宿 主组织从牙根尖孔的向内生长。B图示出具有VEGF-加载的胶原蛋白海绵的人恒切牙的根 管，示出存在血管化（箭头所指）和宿主组织向内生长。浸润的宿主组织附着于牙本质。C 图示出具有bFGF-加载的胶原蛋白海绵的人恒切牙的根管，示出存在血管化（箭头所指） 和宿主组织向内生长。浸润的宿主组织附着于牙本质。D图示出具有VEGF+bFGF-加载的胶 原蛋白海绵的人恒切牙的根管，示出存在血管化（箭头所指）和宿主组织向内生长。浸润 的宿主组织附着于牙本质。
[0030] 图3示出在1 %BSA溶液中TGF3从PLGA微球中的释放动力学图。通过ELISA 检测，TGFf3 3以缓释方式在直至36和42天分别从以50:50或75:25的共聚合物比率的 PLGA微球释放。这两个共聚合物比率均观测到初始的爆发样释放，尽管50:50PLA/PGA比率 比75:25PLA/PGA比率产生更快速的释放速率。
[0031] 图4是扫描电子显微图，示出PLGA微球的制造和降解。A图示出由聚-d-1-乳 酸-共-乙醇酸（PLGA)以50:50PLA/PGA比率制造的包囊有TGFI3 3的微球的代表性SEM 图像。B图示出包囊有TGFP3的PLGA微球在PBS溶液中的预期降解的代表性SEM图像。
[0032] 图5是示出BMP-7从PLGA微球中的累积平均释放的图表。
[0033] 图6是示出NGF从PLGA微球中的累积平均释放的图表。
[0034] 图7是描述collal(2. 3kb)_EGFP小鼠中报道基因表达及成牙本质细胞和成骨细 胞的微阵列分析的一系列图像、散点图和阵列图。图7A是转基因示意图，其含有驱动EGFP 表达的2. 3kbcollal启动子。图7B是分离自转基因小鼠的颂骨的图像，其中GFP信号可 以在骨与牙齿中均检测到。图7C示出经解剖的Collal小鼠的颅盖骨，以及在缝合处和骨 中观测到转基因表达。图7D示出颂骨和磨牙的切片。图7E示出在牙槽骨、牙周膜和成牙 本质细胞中观察到GFP信号。图7F和图7G示出GFP阳性小鼠的切牙，GFP阳性细胞沿着 牙本质表面排成一行，GFP信号位于成牙本质细胞中。图7H示出GFP阳性成牙本质细胞形 成牙本质小管。图71示出GFP阳性成牙本质细胞从Collal-EGFP小鼠牙髓中迀移出。图 7J示出来自皮下接种于胶原蛋白凝胶（0.lml)中的牙髓的10, 000个GFP阳性细胞（基于 GFP分选）。在图7J左侧角插入的X-线图像示出3周后矿化组织形成。图7K示出矿化 组织是GFP阳性的。图7L是示出输送的GFP阳性成牙本质细胞形成与紊乱的牙本质相似 的矿化结构的组织切片。图7M是示出DSP阳性的牙本质样组织的图像（绿色，GFP;红色， 03卩；紫色，04?1)。图7~示出来自接种于肾小囊（0.11111)中的牙髓的10,000个6??阳性 细胞（基于GFP分选）。在图7N的左侧角插入的X-线图像示出3周后矿化组织形成。图 70示出矿化组织的H&E染色。图7P示出细胞形成DSPP阳性矿化组织。图7Q和图7R示 出在Collal-EGFP小鼠中颅盖骨的骨细胞和成骨细胞是GFP阳性的。图7S示出分离自颅 盖骨并在〇頂中培养的细胞，其中GFP细胞在一周内形成结节。图7T和图7U示出分离自 牙（成牙本质细胞）和颅盖骨（成骨细胞）的GFP阳性细胞的mRNA的Agilent全基因组 微阵列分析。所有点的信号强度的散射图。图7U示出一个阵列试验数据的实例（n= 4)。 每个特征的信号强度以圆点表示。
[0035] 图8是示出通过免疫组织化学和原位杂交检测的差异表达的基因的一系列图像。 进行免疫组织化学以检测选择的基因的蛋白质水平。图2A、图8B、图8C、图8E示出在切牙、 磨牙和颅盖骨的成牙本质细胞中高度表达的选择的基因的表达。图8F和图8G示出在成骨 细胞中高度表达的选择的基因的表达（比例尺=20ym) (De:牙本质；P:牙髓）。图8H、图 81和图8J示出通过原位杂交检测的生长因子的表达，因为Wnts和BMP7是分泌的生长因 子，其可以扩散至周围组织（比例尺：A-G，50ym;H、I、J，250ym)。
[0036] 图9是示出通过RT-PCR证实微阵列的一系列条形图。图9A示出在成牙本质细胞 中高度表达的选择的基因。图9B示出在成骨细胞中高度表达的选择的基因。选择的基因 的表达通过实时PCR证实，使用分离自GFP阳性成牙本质细胞和成骨细胞的RNA进行（n= 3)。选择的基因是生长因子或分泌因子及转录因子。
[0037] 图10是示出Wnt3a选择性诱导成牙本质细胞迀移的一系列条形图和图像。图10A 是条形图，示出用于研究响应Wnt3a、BMP-7的细胞迀移的使用PDL细胞进行的Boyden室测 定的结果。将l〇〇k个PDL细胞接种在孔中，并将迀移诱因加入室中。12小时后，将迀移的 细胞经胰蛋白酶消化并计数。然后将细胞铺板及增殖以进一步研究（n= 4*p〈0. 05)。图 10B是在成骨诱导培养基中分化的迀移的细胞的图像，3周后用硝酸银染色（vonKossa)。 图10C和图10D是示出通过PCR检测的标记基因表达的条形图（n= 3*p〈0. 05)。
[0038] 图11是示出通过标准牙髓切除术除去的迷你猪牙髓的一对图像。在牙髓腔做入 口。在根除牙髓组织后，清洁髓腔。根管用手锉成形，直径为〇. 1-2. 5_，并用盐水洗涤。用 无菌纸尖干燥根管。
[0039] 图12是示出Wnt3a或BMP-7再生牙髓和牙本质的一系列图像和条形图。图12A、 图12B、图12C和图12D示出与生长因子（对照物、BMP-7或Wnt3a)组合的可注射的胶原 蛋白凝胶注射进根管中。开放寻开髓室入口（accesscavity)用基材和复合树脂密封。图 12E和图12F是图12D部分的放大图。图12H、图121、图12J和图12K示出在6-8周后收获 及用组织学和微型-CT检验的切牙。图12L和图12M示出新形成的牙本质体积和密度的数 量（p〈0. 05,n= 4)。
[0040] 图13是示出牙髓减压充填膜的一系列图，其中：1是膜；2是复合材料的边缘粘 附；3是备填牙洞；4是可吸附生物材料；5是微孔膜和牙洞的连接；及6是牙髓组织。图13A 示出充填膜的顶视图，其示出膜的中心部分和复合材料的周围部分。图13B示出充填膜的 截面图，其示出复合材料中携带的膜。图13C示出以透视法示出的牙腔密封装置的截面图。 牙腔中炎症的渗出物可以由藻酸盐立即吸收，随后从膜中渗出，而口腔中的细菌被该膜阻 止。图13D示出密封装置与牙的截面图。
[0041] 图14是藻酸盐水凝胶形成的反应示意图。
[0042] 图15是物理交联的藻酸盐水凝胶的泡胀率（％ )条形图。
[0043] 图16是麻醉的迷你猪的口腔照片，其中放置橡皮障以隔离切牙。通过用高速牙钻 机械性开口以触及牙髓腔。
[0044] 图17是迷你猪切牙的组织横切面图，示出在将具有BMP-7 (200ng/ml)的水凝胶注 射进根管和牙髓腔之后4周形成的再生的牙髓（r.p.)、再生的血管（b.v.)、再生的牙本质 (r.d.)和天然的牙本质（n.d.)。
[0045] 图18是迷你猪切牙的组织横切面图，示出在将具有Wnt蛋白质（10ng/ml)的水凝 胶注射进根管和牙髓腔之后4周形成的再生的牙髓（r.p.)、再生的血管（b.v.)、再生的牙 本质（r.d.)和天然的牙本质（n.d.)。
[0046] 图19是迷你猪切牙的组织横切面图，示出在将具有BMP-7 (200ng/ml)和Wnt蛋白 质（10ng/ml)的水凝胶注射进根管和牙髓腔之后4周形成的再生的牙髓（r.p.)、再生的血 管（b.v.)、再生的牙本质（r.d.)和天然的牙本质（n.d.)。
[0047] 发明详述
[0048] 本发明至少部分基于发现患病的、创伤的或缺失的牙髓可以用包含基质或支架及 一或多种生物活性成分的组合物置换，所述组合物促进血管发生性、牙发生性、纤维发生性 或者神经发生性发育。这种组合物可以促进髓腔中血管发生性、牙发生性、纤维发生性或者 神经发生性发育，保持牙齿活力。
[0049] 本发明提供了组合物，其包含用于一或多种生物活性剂，以再生牙髓或牙本质。各 种组合物可包含生物活性剂如Wnt3a、BMP-7、VEGF、bFGF、NGF或者其组合。
[0050] 本发明还提供了一些生物相容的材料以在可复性牙髓炎阶段保持牙髓的活力。如 本文所示，一些可再吸收或不可再吸收的生物材料，包括多孔膜和水凝胶，不仅允许血液、 组织液或水扩散，而且也可以阻止口腔中病原