一种可引导组织再生的生物膜及其制备方法
【专利摘要】一种可引导组织再生的生物膜及其制备方法，本发明是以胶原膜为支架，具有天然的三维空间结构；在胶原膜的一面有氧化铝或氧化锆颗粒形成的保护层0.01~0.5μm厚；另一面有羟基磷灰石加固层0.01~0.1mm厚。与现有的单纯胶原膜进行拉伸断裂强度检测对比，本发明生物膜的机械强度平均提高约7.5倍；经动物修复实验效果对比，单纯的胶原膜在体内降解时间为3～4w，本发明生物膜在体内降解时间达到12w，并且未发生塌陷，生物膜通过加固层能紧密贴合在修复区域，未发生移位，在体内能够长时间保证新生组织的空间，具有良好的机械强度，能更大程度地为新骨生长提供良好的环境，新骨生成的高度与正常骨一致，明显优于对比的修复效果。
【专利说明】一种可引导组织再生的生物膜及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于组织工程学生物医学材料【技术领域】，具体涉及一种可引导组织再生的生物膜及其制备方法。
【背景技术】
[0002]可引导组织 再生的生物膜主要用于修复组织缺损时的组织再生术，用其作为物理屏障，可以阻止周边组织长入缺损区域，同时作为一种保护膜将缺损区域保护起来，为缺损区的组织生长预留空间。
[0003]早期的引导组织再生膜为不可吸收材料(以聚乙烯为代表)，这类材料使用时需要二次手术取出，给患者增加了痛苦。随后研发出人工合成的可吸收材料(如聚乳酸、脂肪族聚酯等可降解聚合物)，其降解产物呈酸性，会引起严重的炎症反应，不利于组织愈合，影响修复的最终效果。另外，还有一些天然高分子聚合物(如几丁糖和壳聚糖制备的再生膜)，其机械性能和抗水性能较差，在体内降解较快，不能很好地配合新生组织的生长。为解决这些问题，有采用化学交联的方法来提高材料的可降解性，常用的交联剂为戊二醛，但是交联后试剂的残存增加了膜材料的毒性。
[0004]目前，人们把重点集中在异种天然生物材料。这类材料来源于哺乳动物的膜组织，经去抗原处理制备成片状膜，主要成分为胶原蛋白，因此也称胶原膜。胶原膜降解速度较快，在使用过程中随着降解的进行，其韧性降低，并逐渐向缺损区域塌陷，无法有效保持缺损空间，影响了缺损区新生组织的生长及最终修复效果，尤其在缺损较大情况下尤为严重。
[0005]美国专利US058372中公开了一种具有双层结构的胶原膜，采用交联方法来延缓膜的降解，并改善膜的机械性能。由于化学交联会增加试剂残留，而物理交联(如热交联)很难使胶原膜达到理想的机械性能，因此仍无法解决胶原膜降解时间过快，易形成塌陷的问题。中国专利申请201110145229.0中采用丙酮提高膜致密层的致密程度，也未能解决膜的机械性能问题。
[0006]研究发现，膜与缺损部位是否能够充分贴合，直接影响最终的成骨效果，贴合越充分，新骨的生成量及成熟度越好。有临床报道，由于膜表面光滑，使膜固定不充分而发生膜移位导致感染，最终治疗失败。而且膜材料在使用过程中，不能暴露于外界环境，否则会导致材料的加速降解，增加膜下新生组织感染的风险。
[0007]经检索，未发现有关于膜与缺损部位充分贴合技术措施的报道，有报道称采用多层膜覆盖进行预防，这意味着手术费用的增加，对患者造成经济和心理压力。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是提供一种可引导组织再生的生物膜及其制备方法，该生物膜具有天然的三维空间结构和良好的机械性能，能够为新生组织提供充足的空间，在使用过程中不易发生移位现象，并能诱导骨组织再生。
[0009]本发明提出的可引导组织再生的生物膜，是以胶原膜为支架，所述的胶原膜源自动物膜组织，具有天然的三维空间结构，能够为新生组织提供充足的空间；在胶原膜的一面有氧化铝或氧化锆颗粒形成的保护层，厚度为0.01-0.5Mffl ;另一面有羟基磷灰石加固层，厚度为0.01-0.1mm。保护层的作用是避免胶原膜直接暴露在外界环境下而导致加速降解；羟基磷灰石加固层的作用是羟基磷灰石能够与缺损区域的骨组织形成化学键紧密结合，使胶原膜固定在骨组织处,不容易发生移位；同时，保护层和加固层都具有提高胶原膜机械性能的作用。[0010]本发明可引导组织再生的生物膜的制备方法，其特征在于，将动物膜组织经过预处理得到具有天然细胞外基质结构的胶原膜；将氧化锆或氧化铝颗粒采用电泳的方法均匀铺于胶原膜的一个表面，形成保护层；将无水氯化钙和二水磷酸二氢钠及乙醇的混合溶液在脉冲电流作用下电解，再与NaOH反应,于胶原膜的另一表面形成羟基磷灰石加固层，最后经干燥、包装、灭菌后得到可引导组织再生的生物膜。具体步骤包括:
步骤一、膜的预处理:将动物膜组织采用纯水清洗干净后，放入生理盐水或PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液)中振荡清洗，再置入4°C环境中以0.5°C / min的速度降温至_80°C，保持12小时，取出后置入PH 7.5^9.0的碱溶液中振荡解冻，震荡速率8(Tl00rpm ;清洗后置入75%体积比的酒精溶液中浸泡2小时，再以纯水清洗，得到膜材料；
其中，对动物膜组织的冻融处理，使细胞内形成冰结晶，细胞膜破裂，方便细胞碎片溶出，提高后续脱细胞和脱脂的效果；通过控制冷冻过程的降温速率，可避免快速冷冻导致细胞内冰结晶对细胞外基质结构的破坏。
[0011]步骤二、胶原膜的制备
脱脂处理:将获得的膜材料用脱脂棉包裹置于提取容器中，以丙酮为脱脂试剂，加热并控制温度在8(T10(TC，冷凝回流抽提2~3小时；将脱脂后的膜材料用纯水清洗4-8次；
脱细胞处理:将清洗后的膜材料置入含葡聚糖的PBS缓冲液中(葡聚糖浓度按质量比为4~10%)，用塑性袋密封，置入冷等压静压机中，控制温度为1(T30°C，以20Mpa/min的速度逐步加压至500MPa，保持5min，再以同样速度减压，取出膜材料用PBS缓冲液清洗；再置于含0.1-θ.25Μ的NaOH和IM的NaCl的混合溶液中浸泡lh，转入纯水中浸泡lh，如此反复2次；最后用纯水冲洗，得到胶原膜；其中，膜组织若为牛源性，需先在IM的NaOH溶液中浸泡Ih去除病毒，再转入含葡聚糖的PBS缓冲液中浸泡；
脱脂采用索氏抽提法，以脱脂试剂对膜材料中的脂溶性物质连续抽提处理，可以在短时间内将材料中脂肪控制在1%以下；此外，这种方法节约了脱脂时间，并可对试剂回收，降低了脱脂成本。
[0012]脱细胞通过液体加压的方法向膜组织施加压力,可直接破坏组织细胞的细胞膜，释放细胞成分，与细胞外基质分离；据报道，在大于220MPa的压力环境中，加压会使水的凝固点上升，此时细胞内可生成冰结晶(http://zhida0.baidu.com/question/118684849.html?qq-pf-to=pcqq.c2c),从而破坏细胞结构，通过压力、温度以及中间介质浓度的调整，既达到脱细胞效果，还能保护细胞外基质的天然结构。
[0013]最后用NaOH和NaCl的混合溶液使细胞充分脱水，再置于纯水中使细胞溶胀破裂，循环2次可以彻底洗脱组织中的细胞碎片。
[0014]步骤三、制备保护层:将步骤二得到的胶原膜铺于钢板作为电泳阴极，将氧化锆或氧化铝颗粒与去离子水按1: 3~15的质量比混合，以超声分散均匀后作为电泳液；进行电泳(直流电压0.5~10V)，在胶原膜表面形成氧化锆或氧化铝保护层；其厚度可通过电压和电泳液浓度的调节实现，电压和电泳液浓度越高，保护层的厚度越大；
通常，使用胶原膜对伤口进行封闭修复，若出现封闭不严或伤口发炎等导致伤口裂开，使胶原膜暴露于外部环境，会加速胶原膜的降解；而保护层使胶原膜与外部环境隔离，避免加速降解，同时降低了新生组织的感染风险；氧化锆和氧化铝属于生物惰性材料，性质稳定，具有良好的抗压强度，在一定程度上还提高了胶原膜的机械性能。
[0015]步骤四、制备加固层:将步骤三得到的胶原膜有保护层的一面平铺于钢板为负极，碳棒接电源正极，电解液为含有0.004~0.42mol/L的无水氯化钙和0.003~0.25mol/L的二水磷酸二氢钠以及体积比为20%的乙醇的混合溶液；接脉冲直流电，电流密度为2mA/cm2,电压为I~IOOmV,通电I分钟后再断电I分钟，如此反复5~50次，在胶原膜表面形成磷酸钙涂层；再经纯水清洗后，置于质量体积比为0.4%~4%的NaOH溶液中浸泡3h，在胶原膜上形成羟基磷灰石加固层；用纯水清洗后，经真空干燥得到可引导组织再生的生物膜；电解液浓度越大、电压越高、通断电的周期次数越多，加固层的厚度就越大。 [0016]本发明在胶原膜的另一面制备加固层，其目的是:羟基磷灰石具有一定的抗压强度，可以提高胶原膜的机械性能；其次，羟基磷灰石在体内会降解，产生的钙、磷离子可与周围骨组织中的钙、磷离子形成稳定的化学键，因此，加固层可以使胶原膜与骨组织紧密贴合，不易发生移位；另外，钙、磷离子是骨骼和牙齿的主要成分，能被机体吸收、引导骨组织再生。
[0017]本发明制备的可引导组织再生生物膜，针对现有胶原膜材料机械性能差、易塌陷、易移位以及不能暴露于外界环境等缺点，通过在胶原膜的表面形成氧化锆或氧化铝生物惰性材料的涂层，不仅能够保护胶原膜免受外部环境的影响，还很大程度提高胶原膜的机械性能。通过在胶原膜的另一面形成羟基磷灰石加固层，羟基磷灰石中的钙、磷成分溶解后与骨组织形成化学键，可以使胶原膜与骨组织紧密结合，不易发生移位；同时，羟基磷灰石可以诱导活骨组织的生长，加速修复进程。
[0018]通过对本发明制备的可引导组织再生生物膜与现有的单纯胶原膜进行拉伸断裂强度检测，对比结果显示，本发明生物膜的机械强度平均提高约7.5倍。并将这两种膜进行兔颅骨缺损、兔尺骨缺损、犬拔牙窝填充、犬骨下袋的动物修复效果进行对比，发现单纯的胶原膜在体内降解时间为3~4w，本发明生物膜在体内降解时间达到12w，并且未发生塌陷，生物膜通过加固层能紧密贴合在修复区域，未发生移位，在体内能够长时间保证新生组织的空间；有资料显示人类骨形成的正常生理周期为17w，可见本发明生物膜具有良好的机械强度，能更大程度地为新骨生长提供良好的环境，新骨生成的高度与正常骨一致，明显优于对比的修复效果。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]附图1为本发明可引导组织再生生物膜与现有的单纯胶原膜的拉伸断裂强度检测结果对比图。图中a为胶原膜的检测结果，图中b为本发明生物膜的检测结果。本发明生物膜的机械强度比现有的胶原膜提高了 7.5倍。
[0020]附图2为本发明可引导组织再生生物膜与现有的单纯胶原膜用于兔颅骨缺损修复的组织学结果对比照片。图a为胶原膜的修复效果照片，可以看出缺损区域出现凹陷，以及凹陷处完全降解的胶原膜，说明单纯的胶原膜降解过快，不能支撑缺损区域上方，而向缺损区域塌陷，影响了新生骨生成；图b为本发明生物膜的修复效果照片，其缺损区域充满了新生骨纤维组织，无凹陷现象，说明本发明生物膜可以稳定地支撑缺损区域的上方，对缺损区起到保护作用，保证新骨的快速生长。
[0021]附图3为本发明可引导组织再生生物膜与现有的单纯胶原膜用于兔尺骨缺损修复的X线片观察结果对比照片。图a为胶原膜修复的效果照片，可以看出缺损区域与周围正常骨相比有明显凹陷，进一步证明单纯的胶原膜降解过快，不能支撑缺损区域上方，而向缺损区域塌陷，影响了新生骨的生成；图b为本发明生物膜修复的效果照片，其缺损区域与周围正常骨的高度基本一致，证明生物膜可以稳定地支撑缺损区域上方，为新骨的生成提供充足空间，新骨的高度与正常骨基本一致。
[0022]附图4为本发明可引导组织再生生物膜与现有的单纯胶原膜用于犬拔牙窝填充的X线片观察结果对比照片。图a为胶原膜的修复效果，可以看出拔牙区域有明显的凹陷；图b为本发明生物膜的修复效果，其新生骨的高度已基本达到正常骨的水平。说明单纯的胶原膜降解过快导致的塌陷，对新骨生长是重要的影响因素。
[0023]附图5为本发明可引导组织再生生物膜与现有的单纯胶原膜用于犬骨下袋修复的组织学结果对比照片。图a为胶原膜的修复效果，可以看出，缺损区域出现了空白区，其上方有大量的结缔组织侵入，说明单纯胶原膜的降解过快导致塌陷，影响了新骨生成，还会失去阻碍作用，导致结缔组织侵入，形成长的结合上皮；图b为本发明生物膜的修复效果，可以看出，新生骨已填满缺损区，修复效果良好，证明本发明生物膜可以保证新骨的快速生长，与正常骨基本一致。
【具体实施方式】
[0024]以下结合实例对本发明技术方案及效果作进一步说明。实例中所采用的动物膜组织购于屠宰场，在去除膜组织附带的脂肪等杂质后，采用PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液)或生理盐水清洗除去血溃，再用纯水清洗。
[0025]实例中采用的冷等压静压机由太原市中平科技有限公司制造，工作室尺寸230X300mm，最高工作压力600MPa，保压时间压力降(300s内)不超过5% ;电泳槽为北京六一仪器厂生产，型号为DYCZ-21 ;电解槽为河南普乐教育科技公司生产，型号为26023。
[0026]实施例1、
以牛心包膜为原料，按以下步骤制备引导组织再生生物膜。
[0027]步骤一、膜的预处理:将牛心包膜用纯水清洗后，放入生理盐水中振荡清洗，再置入4°C环境中以0.50C / min的速度降温至_80°C，保持12h，取出后置入pH8的碳酸钠溶液中振荡解冻，震荡速率为90rpm ;清洗后置入75%体积比的酒精溶液中浸泡2h，再以纯水清洗，得到膜材料；
步骤二、胶原膜的制备
脱脂处理:将获得的膜材料用脱脂棉包裹置于提取容器中，以丙酮为脱脂试剂，加热并控制温度在85°C ;冷凝回流抽提2h ;取出脱脂后的膜材料，用纯水清洗4次；
脱细胞处理:将清洗后的膜材料先在IM的NaOH溶液中浸泡lh，再置入含葡聚糖的PBS缓冲液中(葡聚糖浓度按质量比为10%)，用塑性袋密封，置入冷等压静压机中，控制温度在10°c,以20Mpa/min的速度逐步加压至500MPa，保持5min，再以同样速度减压，取出膜材料用PBS缓冲液清洗；然后置于含0.25M的NaOH和IM的NaCl的混合溶液中浸泡lh，转入纯水中浸泡lh，如此反复2次；最后用纯水清洗，得到胶原膜；
步骤三、制备保护层:将得到的胶原膜铺于钢板作为电泳阴极，将氧化锆颗粒与去离子水按1: 15的质量比混合，以超声分散均匀后作为电泳液；进行电泳(直流电电压1.0V)，电泳液中氧化锆颗粒逐渐向阴极移动，均匀平铺于胶原膜的表面，形成氧化锆保护层(厚度0.05Mm)；
步骤四、制备加固层:将步骤三得到的胶原膜有保护层的一面平铺于钢板为负极，胶原膜朝上，碳棒接电源正极，电解液为含有0.008mol/L的无水氯化钙和0.005mol/L的二水磷酸二氢钠以及体积比20%的乙醇的混合溶液；接脉冲直流电，电流密度2mA/cm2，电压2mV，通断电各I分钟为一周期，反复50次，在胶原膜表面形成磷酸钙(化学式CaHPO4.2H20)涂层，再经纯水清洗后，置于质量体积比为0.8%的NaOH溶液中浸泡lh，在胶原膜上形成羟基磷灰石(化学式Caltl(PO4)6(OH)2)加固层(厚度0.015_)，用纯水清洗后，经真空干燥得到可引导组织再生的生物膜。
[0028]本实例制得的生物膜厚度为0.12mm,拉伸断裂强度为190~210MPa，与单纯的胶原膜材料相比，机械性能提高约7.5倍(参见附图1)。该材料适用于各种原因引起的小范围骨组织缺损，在修复过程中可以稳定地覆盖在缺损区上方，不会发生移位现象。
[0029]实施例2、
以猪腹膜为原料，按以下步骤制备引导组织再生生物膜。
[0030]步骤一、膜的预处理:将猪腹膜用纯水清洗干净后，放入生理盐水中振荡清洗；再置入4°C环境中以0.50C / min的速度降温至_80°C，保持12h，取出后置入pH8.5的氢氧化钠溶液中振荡解冻，震荡速率为80rpm ;清洗后置入75%体积比的酒精溶液中浸泡2h，再以纯水清洗，得到膜材料；
步骤二、胶原膜的制备
脱脂处理:将获得的膜材料用脱脂棉包裹置于提取容器中，以丙酮为脱脂试剂，加热并控制温度在90°C ;冷凝回流抽提3h ;取出脱脂后的膜材料，用纯水清洗8次；
脱细胞处理:将清洗后的膜材料置入含葡聚糖的PBS缓冲液中(葡聚糖浓度按质量比为6%)，用塑性袋密封，置入冷等压静压机中，控制温度在20°C，以20Mpa/min的速度逐步加压至500MPa，保持5min，再以同样速度减压，取出膜材料用PBS缓冲液清洗；然后置于含
0.15M的NaOH和IM的NaCl的混合溶液中浸泡lh，转入纯水中浸泡lh，如此反复2次；最后用纯水清洗，得到胶原膜；
步骤三、制备保护层:将得到的胶原膜铺于钢板为电泳阴极，将氧化锆颗粒与去离子水按1: 10的质量比混合，以超声分散均匀后作为电泳液；进行电泳(直流电电压5.0V)，电泳液中氧化锆颗粒逐渐向阴极移动，均匀平铺于胶原膜的表面，形成氧化锆保护层(厚度
0.25Mm)；
步骤四、制备加固层:将步骤三得到的胶原膜有保护层的一面平铺于钢板为负极，胶原膜朝上，碳棒接电源正极，电解液为含有0.021mol/L的无水氯化钙和0.013mol/L的二水磷酸二氢钠以及体积比为20%的乙醇的混合溶液；接脉冲直流电，电流密度为2mA/cm2，电压为5mV，通断电各I分钟为一周期，反复40次，在胶原膜表面形成磷酸钙涂层，再经纯水清洗后，置于质量体积比为2%的NaOH溶液中浸泡lh，在胶原膜上形成羟基磷灰石加固层(厚度0.05_)，用纯水清洗后，经真空干燥得到可引导组织再生的生物膜。
[0031]本实例制得的生物膜厚度为0.15mm。其足够厚的保护层增加了材料在暴露时的稳定性，非常适于在口腔中应用。该材料用于犬拔牙窝填充修复实验，牙龈缝合时采取不完全封闭方式，将小部分膜材料暴露于口腔中，一月后取材观察，发现该材料组的新生骨高度仍然可以达到与正常骨一致的效果，而单纯的胶原膜材料组在手术区可以观察到明显的局部骨量生长不足(参见附图2)。
[0032]实施例3、
以猪心包膜为原料，按以下步骤制备引导组织再生生物膜。
[0033]步骤一、膜的预处理:将猪心包膜用纯水清洗干净后，放入生理盐水中振荡清洗，再置入4°C环境中以0.50C / min的速度降温至_80°C，保持12h，取出后置入pH8.5的碳酸钾溶液中振荡解冻，震荡速率为85rpm ;清洗后置入75%体积比的酒精溶液中浸泡2h，再以纯水清洗，得到膜材料；
步骤二、胶原膜的制备
脱脂处理:将获得的膜材料用脱脂棉包裹并置于提取容器中，以丙酮为脱脂试剂，加热并控制温度在90°C ;冷凝回流抽提2.5h ;取出脱脂后的膜材料，用纯水清洗8次；
脱细胞处理:将清洗后的膜材料置入含葡聚糖的PBS缓冲液中(葡聚糖浓度按质量比为5%)，用塑性袋密封，置入冷等压静压机中，控制温度在30°C，以20Mpa/min的速度逐步加压至500MPa，保持 5min，再以同样速度减压，取出膜材料用PBS缓冲液清洗；然后置于含0.2M的NaOH和IM的NaCl的混合溶液中浸泡lh，转入纯水中浸泡lh，如此反复2次；最后用纯水冲洗，得到胶原膜；
步骤三、制备保护层:将得到的胶原膜铺于钢板作为电泳阴极，将氧化铝颗粒与去离子水按1: 15的质量比混合，以超声分散均匀后作为电泳液；进行电泳(直流电电压8.0V)，电泳液中氧化铝颗粒逐渐向阴极移动，均匀平铺于胶原膜的表面，形成氧化铝保护层(厚度0.3Mm)；
步骤四、制备加固层:将步骤三得到的胶原膜有保护层的一面平铺于钢板为负极，胶原膜朝上，碳棒接电源正极，电解液为含有0.136mol/L的无水氯化钙和0.081mol/L的二水磷酸二氢钠以及体积比为20%的乙醇的混合溶液；接脉冲电流，电流密度为2mA/cm2，电压为30mV,通断电各I分钟为一周期，反复8次，在胶原膜的表面形成磷酸钙涂层，再经纯水清洗后，置于质量体积比为2%的NaOH溶液中浸泡2h，在胶原膜上形成羟基磷灰石加固层(厚度0.03_)，用纯水清洗后，经真空干燥得到可引导组织再生的生物膜。
[0034]本实例制得的生物膜厚度为0.15mm，适用于浅层骨组织缺损修复，保护层与加固层增加了材料的稳定性和可塑性，能使材料稳定地支撑在缺损区。将该材料用于兔尺骨缺损修复，一月后的新生骨高度与正常骨一致，并与周围骨组织整合良好，而单纯的胶原膜材料组修复区出现空白，此为材料塌陷所致(参见附图3 )。
[0035]实施例4、
以牛腹膜为原料，按以下步骤制备引导组织再生生物膜。
[0036]步骤一、膜的预处理:将牛腹膜用纯水清洗后，放入PBS缓冲液中振荡清洗；再置入4°C环境中以0.50C / min的速度降温至_80°C，保持12h，取出后置入pH8的碳酸氢钾溶液中振荡解冻，震荡速率为IOOrpm ;清洗后置入75%体积比的酒精溶液中浸泡2h，再以纯水清洗，得到膜材料；
步骤二、胶原膜的制备
脱脂处理:将获得的膜材料用脱脂棉包裹置于提取容器中，以丙酮为脱脂试剂，加热并控制温度在95°C ;冷凝回流抽提2h ;取出脱脂后的膜材料，用纯水清洗5次；
脱细胞处理:将清洗后的膜材料在IM的NaOH水溶液中浸泡lh，然后置入含葡聚糖的PBS缓冲液中(葡聚糖浓度按质量比为4%)，用塑性袋密封，置入冷等压静压机中，控制温度在15°C，以20Mpa/min的速度逐步加压至500MPa，保持5min，再以同样速度减压，取出膜材料用PBS缓冲液清洗；然后置于含0.15M的NaOH和IM的NaCl的混合溶液中浸泡lh，转入纯水中浸泡lh，如此反复2次；最后用纯水冲洗，得到胶原膜；
步骤三、制备保护层:将得到的胶原膜铺于钢板为电泳阴极，将氧化铝颗粒与去离子水按1: 8的质量比混合，以超声分散均匀后作为电泳液；进行电泳(直流电电压3.0V)，电泳液中氧化铝颗粒逐渐向阴极移动，均匀平铺于胶原膜的表面，形成氧化铝保护层(厚度
0.25Mm)；
步骤四、制备加固层:将步骤三得到的胶原膜有保护层的一面平铺于钢板为负极，胶原膜朝上，碳棒接电源正极，电解液为含有0.21mol/L的无水氯化钙和0.125mol/L的二水磷酸二氢钠以及体积比为20%的乙醇的混合溶液；接脉冲直流电，电流密度2mA/cm2，电压50mV，通断电各I分钟为一周期，反复11次，在胶原膜表面形成磷酸钙涂层，再经纯水清洗后，置于质量体积比为3%的NaOH溶液中浸泡2.5h，在胶原膜上形成羟基磷灰石加固层(厚度0.08_)，用纯水清洗后，经真空干燥得到可引导组织再生的生物膜。
[0037]本实例制得的生物膜厚度0.2mm，适用于大范围骨组织缺损的修复，其加固层与骨组织表面之间形成充足的化学键，可以紧贴于缺损区上方，保证新骨的生长空间。将该材料用于兔颅骨缺损修复，一月后取材经组织学观察，其材料仍具有完整结构，新生骨高度与正常骨一致，而单纯的胶原膜材料由于固定不充分导致塌陷，骨量生长不足(参见附图4)。
[0038]实施例5、
以猪小肠粘膜下层为原料，按以下步骤制备引导组织再生生物膜。
[0039]步骤一、膜的预处理:将猪小肠粘膜下层用纯水清洗后，放入PBS缓冲液中振荡清洗；再置入4°C环境中以0.50C / min的速度降温至_80°C，保持12h，取出后置入pH8.5的磷酸钠溶液中振荡解冻，震荡速率为85rpm ;清洗后置入75%体积比的酒精溶液中浸泡2h，再以纯水清洗，得到膜材料；
步骤二、胶原膜的制备
脱脂处理:将获得的膜材料用脱脂棉包裹置于提取容器中，以丙酮为脱脂试剂，加热并控制温度在90°C ;冷凝回流抽提3h ;取出脱脂后的膜材料，用纯水清洗8次；
脱细胞处理:将清洗后的膜材料置入含葡聚糖的PBS缓冲液中(葡聚糖浓度按质量比为5%)，用塑性袋密封，置入冷等压静压机中，控制温度在30°C，以20Mpa/min的速度逐步加压至500MPa， 保持5min，再以同样速度减压，取出膜材料用PBS缓冲液清洗；然后置于含
0.1M的NaOH和IM的NaCl的混合溶液中浸泡lh，转入纯水中浸泡lh，如此反复2次；最后用纯水冲洗，得到胶原膜；
步骤三、制备保护层:将得到的胶原膜铺于钢板作为电泳阴极，将氧化铝颗粒与去离子水按1: 3的质量比混合，以超声分散均匀后作为电泳液；进行电泳(直流电电压10V)，电泳液中氧化铝颗粒逐渐向阴极移动，均匀平铺于胶原膜的表面，形成氧化铝保护层(厚度0.5Mm)；
步骤四、制备加固层:将步骤三得到的胶原膜有保护层的一面平铺于钢板为负极，胶原膜朝上，碳棒接电源正极，电解液为含有0.42mol/L的无水氯化钙和0.25mol/L的二水磷酸二氢钠以及体积比为20%的乙醇的混合溶液；接脉冲直流电，电流密度为2mA/cm2，电压为IOOmV,通断电各I分钟为一周期，反复7次，在胶原膜表面形成磷酸钙涂层，再经纯水清洗后，置于质量体积比为4%的NaOH溶液中浸泡3h，在胶原膜上形成羟基磷灰石加固层(厚度0.1_)，用纯水清洗后，经真空干燥得到可引导组织再生的生物膜。
[0040]本实例制得的生物膜厚度为0.15mm，适用于深层骨组织缺损修复，加固层降解产生的钙、磷离子分布在缺损区域，为新生骨组织的再生起到引导作用，能加快骨组织缺损的修复过程。将该材料 用于犬骨下袋修复实验，一月后取材发现，新生骨与正常骨基本一致，而单纯的胶原膜材料在骨缺损区有大量结缔组织的侵入，影响新骨的生长(参见附图5)。
【权利要求】
1.一种可引导组织再生的生物膜，其特征是以胶原膜为支架，所述的胶原膜源自动物膜组织，具有天然的三维空间结构；在胶原膜的一面有氧化铝或氧化锆颗粒形成的保护层，厚度为0.Ο1~Ο.5Mm ;另一面有羟基磷灰石加固层，厚度为0.Ο1~Ο.1mm。
2.制备权利要求1所述的可引导组织再生生物膜的方法，其特征在于，将动物膜组织经过预处理得到具有天然细胞外基质结构的胶原膜；将氧化锆或氧化铝颗粒采用电泳的方法均匀铺于胶原膜的一个表面，形成保护层；将无水氯化钙和二水磷酸二氢钠及乙醇的混合溶液在脉冲电流作用下电解，再与NaOH反应，于胶原膜的另一表面形成羟基磷灰石加固层，最后经干燥、包装、灭菌后得到可引导组织再生的生物膜。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，具体步骤包括: 步骤一、膜的预处理:将动物膜组织采用纯水清洗干净后，放入生理盐水或PBS缓冲液中振荡清洗，再置入4°C环境中以0.5°C / min的速度降温至-80°C，保持12小时，取出后置入pH 7.5^9.0的碱溶液中振荡解冻，震荡速率8(Tl00rpm ;清洗后置入体积浓度为75%的酒精溶液中浸泡2小时，再以纯水清洗，得到膜材料； 步骤二、胶原膜的制备 脱脂处理:将获得的膜材料用脱脂棉包裹置于提取容器中，以丙酮为脱脂试剂，加热并控制温度在8(T10(TC，冷凝回流抽提2~3小时；将脱脂后的膜材料用纯水清洗4~8次； 脱细胞处理:将清洗后的膜材料置入含葡聚糖的PBS缓冲液中，用塑性袋密封，置入冷等压静压机中，控制温度为1(T30°C，以20Mpa/min的速度逐步加压至500MPa，保持5min，再以同样速度减压，取出膜材料用PBS缓冲液清洗；再置于含0.1~θ.25Μ的NaOH和IM的NaCl的混合溶液中浸泡lh，转入纯水中浸泡lh，如此反复2次；最后用纯水冲洗，得到胶原膜； 步骤三、制备保护层:将步骤二得到的胶原膜铺于钢板作为电泳阴极，将氧化锆或氧化铝颗粒与去离子水按1: 3~15的质量比混合，以超声分散均匀后作为电泳液；进行电泳，在胶原膜表面形成氧化锆或氧化铝保护层； 步骤四、制备加固层:将步骤三得到的胶原膜有保护层的一面平铺于钢板为负极，碳棒接电源正极，电解液为含有0.004~0.42mol/L的无水氯化钙和0.003~0.25mol/L的二水磷酸二氢钠以及体积比为20%的乙醇的混合溶液；接脉冲直流电，电流密度为2mA/cm2，电压为I~IOOmV,通电I分钟后再断电I分钟，如此反复5~50次，在胶原膜表面形成磷酸钙涂层；再经纯水清洗后，置于质量体积比为0.4%~4%的NaOH溶液中浸泡3h，在胶原膜上形成羟基磷灰石加固层；用纯水清洗后，经真空干燥得到可引导组织再生的生物膜。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在步骤二的脱细胞处理中，所述的葡聚糖的浓度按质量比为4~10%。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，若动物膜组织为牛源性，在步骤二的脱细胞处理中，需先在IM的NaOH溶液中浸泡Ih去除病毒，再转入含葡聚糖的PBS缓冲液中浸泡。
【文档编号】A61L31/12GK103721296SQ201310669263
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2013年12月11日 优先权日:2013年12月11日
【发明者】刘芮廷 申请人:陕西瑞盛生物科技有限公司