列时，指定序列A 与指定序列B的百分比序列相同性（可以另外描述为指定序列A具有或包含指定序列B的 一定的百分比序列相同性）可以计算为：百分比序列相同性=X/Y100,其中X是通过A和B 的序列比对程序或算法的比对计数为相同匹配的残基数，Y是B中的残基总数。如果序列A 的长度不等于序列B的长度，则A与B的百分比序列相同性不同于B与A的百分比序列相 同性。
[0180] 通常地，可以在任何位置进行保守取代，只要保留需要的活性。可以进行所谓的保 守置换，其中被置换的氨基酸具有与原始氨基酸相似性质，例如Glu由Asp置换、Gin由Asn 置换、Val由lie置换、Leu由lie置换，以及Ser由Thr置换。缺失是氨基酸由直接键合置 换。缺失的位置包括多肽的末端及单独的蛋白质结构域之间的连接。插入是在多肽链中导 入氨基酸，直接键合由一或多个氨基酸代替。氨基酸序列可以借助于本领域已知的计算机 模拟程序调整，其可以产生具有例如改良的活性或改变的调节作用的多肽。基于这种人工 产生的多肽序列，使用希望的宿主细胞的特定密码子使用可以在体外合成编码这种经调整 的多肽的相应核酸分子。
[0181] "高度严格杂交条件"定义为于65°C在6XSSC缓冲液（即0. 9M氯化钠和0. 09M 柠檬酸钠）中杂交。鉴于这些条件，通过计算两个序列之间DNA双链体的解链温度（TJ 可以确定指定系列的序列是否杂交。如果一特定双链体的解链温度在6XSSC盐条件下低 于65°C，则两个序列将不杂交。另一方面，如果解链温度在相同盐条件下高于65°C，则两 个序列将杂交。通常地，任何杂交的DNA:DNA序列的解链温度可以使用如下公式确定 =81.5°〇+16.6(1(^1。[似 +])+0.41(级分6/(：含量）-0.63(%甲酰胺）-(600/1)。此外， 核苷酸相同性每降低1 %，则DNA:DNA杂交体的Tm降低1-1. 5°C(见例如Sambrookand Russel,2006)。
[0182] 宿主细胞可以使用本领域已知的各种标准技术转化（见例如Sambrook andRussel(2006)CondensedProtocolsfromMolecularCloning:ALaboratory Manual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ISBN-10:0879697717；Ausubel etal. (2002)ShortProtocolsinMolecularBiology, 5thed. ,Current Protocols,ISBN-10:0471250929；SambrookandRussel(2001)Molecular Cloning:ALaboratoryManual, 3ded. ,ColdSpringHarborLaboratory Press,ISBN-10:0879695773 ；Elhai,J.andffolk,C.P. 1988.MethodsinEnzymology 167, 747-754)。这种技术包括但不限于病毒感染、磷酸钙转染、脂质体介导的转染、微粒介 导的输送、受体介导的摄取、细胞融合、电穿孔等。可以选择并增殖转染的细胞以提供重组 宿主细胞，其包含稳定整合进宿主细胞基因组中的表达载体。
[0183] 可以导入宿主细胞中的核酸包括例如来自另一物种的DNA序列或基因，或者甚至 源于或存在于相同物种中但是通过遗传工程方法掺入接受体细胞中的基因或序列。术语 "外源的"是指基因非正常存在于转化的细胞中，或者也许仅仅不是以在转化的DNA区段或 基因中发现的形式、结构等存在，或者正常存在并需要以不同于天然表达模式的方式如过 表达方式表达的基因。因此，术语"外源的"基因或DNA是指被导入受体细胞中的任何基因 或DNA区段，无论这种细胞中是否已经存在相似的基因。外源DNA包含的DNA类型可包括 已经存在于细胞中的DNA，来自相同类型有机体的另一个体的DNA，来自不同有机体的DNA， 或者外部产生的DNA，如含有反义基因信息的DNA序列，或者编码合成或修饰的基因形式的 DNA序列。
[0184] 根据本文所述方法产生的宿主株系可以通过许多已知方式评估（见例如 Studier(2005)ProteinExprPurif. 41(1), 207 - 234 ；Gellissen,ed. (2005)Production ofRecombinantProteins:NovelMicrobialandEukaryoticExpressionSystems,Wile y-VCH,ISBN-10:3527310363 ；Baneyx(2004)ProteinExpressionTechnologies,Taylor&F rancis,ISBN-10:0954523253)〇
[0185] 下调或沉默基因的方法为本领域已知。例如，表达的蛋白质活性可以使用反义寡 核苷酸、蛋白质适配体、核苷酸适配体及RNA干扰（RNAi)(例如小干扰RNAs(siRNA)、短发夹 RNA(shRNA)和微 RNAs(miRNA)等下调或消除（见例如 FanningandSymonds(2〇〇6)Handb ExpPharmacol. 173, 289-303G，描述了锤头核酶和小发夹 RNA;Helene，C.，etal. (1992) Ann.N.Y.Acad.Sci. 660, 27-36;Maher(1992)Bioassays14 (12) : 807-15,描述了 靶向脱 氧核糖核苷酸序列；Leeetal.(2006)CurrOpinChemBiol.10,1-8,描述了适配体； Reynoldsetal. (2004)NatureBiotechnology22 (3)，326-330,描述了 RNAi;Pushparaj andMelendez(2006)ClinicalandExperimentalPharmacologyandPhysiology 33(5-6)，504_510，描述了 RNAi;Dillonetal. (2005)AnnualReviewofPhysiology 67, 147-173,描述了 RNAi;DykxhoornandLieberman(2005)AnnualReviewofMedicine 56, 401-423,描述了 RNAi)。RNAi分子可商购自多个来源（例如Ambion,TX;Sigma Aldrich,M0 ;Invitrogen)。本领域已知使用各种算法的一些siRNA分子设计程序（见例 如 Cenixalgorithm,Ambion；BLOCK-iT?RNAiDesigner,Invitrogen；siRNAWhitehead InstituteDesignTools,Bioinofrmatics&ResearchComputing)〇影响最佳 siRNA序列定 义的性状包括在siRNA末端的G/C含量，siRNA的特定内部结构域的Tm，siRNA长度，CDS(编 码区）中靶序列的位置，以及3'突出端的核苷酸含量。
[0186] 试剂盒
[0187] 本发明还提供了试剂盒。这种试剂盒可包含本文描述的制剂或组合物，及在一些 实施方案中还包含施用说明书。这种试剂盒可便于实施本文所述方法。当以试剂盒提供时， 组合物的不同成分可以包装在单独的容器中，在使用之前即刻混合。组合物成分包括但不 限于基质或支架以及Wnt3a多肽或多核苷酸、BMP-7、VEGF、bFGF或NGF、抗生素、抗炎剂，或 者如上述另一制剂。如果需要，这种单独包装的成分可以存在于一个包装或分配装置中，其 可以含有具有所述组合物的一或多个单位剂量形式。包装可例如包括金属或塑料薄片包装 如泡罩包装。这种单独包装的成分在一些情况中也可以允许长期贮存而不丧失所述成分的 活性。
[0188] 试剂盒也可以包含在单独容器中的试剂，例如无菌水或盐水有待加入单独包装的 冻干的活性成分中。例如密封的玻璃安瓿可含有冻干成分，及在单独的安瓿中具有在中性 非反应性气体如氮气下包装的无菌水、无菌盐水或无菌物。安瓿可以由任何合适材料组成， 如玻璃、有机聚合物如聚碳酸酯、聚苯乙烯、陶瓷、金属或者典型用于容纳试剂的任何其它 材料。合适的容器的其它实例包括瓶，其可以由与安瓿相似物质制成，以及包袋，其可以由 箱片内壁如铝或合金箱片组成。其它容器包括试管、小瓶、烧瓶、瓶、注射器等。容器可具有 无菌入口，如具有可以由皮下注射用注射针头刺穿的塞子的瓶。其它容器可具有由易于抽 取的膜隔开的两个隔间，在将膜除去时成分混合在一起。可除去的膜可以是玻璃、塑料、橡 月父等。
[0189] 在一些实施方案中，试剂盒可以提供说明书。说明书可以印刷在纸上或者其它基 质上，和/或可以以电子可读介质，例如软盘、mini-CD-R0M、CD-R0M、DVD-R0M、Zip盘、录像 带、录音带等提供。详细的说明书也许未与试剂盒在一起；代之以用户可以被指向生产者或 试剂盒的经销商指定的互联网站。
[0190] 如下专利公开以其全部内容并入作参考：美国专利公开 No.2011/0171607,BI0PULP;美国专利公开No.2013/0022989,DENTALSTEMCELL PROGRAMMING;美国专利公开No. 2011/0236977,DENTALSTEMCELLDIFFERENTIATION;美国 专利公开No. 2012/0282573,TOOTHSCAFFOLDS;美国专利公开No. 20110171607,BIOPULP; TO2012/045097,PRODUCTIONOFDENTIN,CEMENTUMANDENAMELBYCELLS。
[0191] 本文所述的组合物和方法利用的分子生物学方法可基于本领域已知的 各种标准技术（见例如SambrookandRussel(2006)CondensedProtocolsfrom MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory Press,ISBN-10:0879697717；Ausubeletal. (2002)ShortProtocolsinMolecular Biology,5thed. ,CurrentProtocols,ISBN-10:0471250929；SambrookandRussel(2001) MolecularCloning:ALaboratoryManual, 3ded. ,ColdSpringHarborLaboratory Press,ISBN-10:0879695773 ；Elhai,J.andffolk,C.P. 1988.MethodsinEnzymology 167, 747-754 ；Studier(2005)ProteinExprPurif.41 (1), 207 - 234；Gellissen,ed. (2005)ProductionofRecombinantProteins:NovelMicrobialandEukaryotic ExpressionSystems,ffiley-VCH,ISBN-10:3527310363；Baneyx(2004)Protein ExpressionTechnologies,Taylor&Francis,ISBN-10:0954523253)〇
[0192] 提供本文所述的定义和方法是为了更好地定义本发明及指导本领域技术人员实 施本发明。除非特别指出，术语是根据相关领域技术人员惯例使用。
[0193] 在一些实施方案中，用于描述和要求本发明的实施方案的表示成分的数量、性质 如分子量、反应条件等的数字应理解为在一些情况中由术语"大约"修正。在一些实施方案 中，术语"大约"用于表示数值包括用于确定数值的装置或方法的平均值的标准偏差。在一 些实施方案中，在说明书和所附权利要求中描述的数值参数是近似值，可以根据由特定实 施方案获得的期望的性质而变化。在一些实施方案中，所述数值参数应根据报道的限制性 数字及应用通常近似技术而解释。尽管描述本发明一些实施方案的宽范围的数值范围和参 数是近似值，具体实施例中的数值如实精确报道。在本发明一些实施方案中存在的数值可 以包括由在其各自测试测量中发现的标准差所必然产生的一些误差。本文对数值的引用仅 仅是作为逐个指代落入该范围内的每个单独数值的简化方法。除非在本文中特别指出，每 个数值均并入本说明书中，就像其在本文中逐个引用一样。
[0194] 在一些实施方案中，在描述特定实施方案的上下文（特别是在下述一些权利要求 上下文）中的术语"一个"和"所述"可以被理解为包括单数和复数，除非另有说明。在一 些实施方案中，包括权利要求，如本文所用，术语"或者"是指"和/或"，除非明确表明仅是 指选择项，或者选择项是互相排斥。
[0195] 术语"包含"、"具有"和"包括"是开放式连接动词。这些动词的任何形式或时态也 是开放式的。例如，"包含"、"具有"或"包括"一或多个步骤的任何方法不限于仅仅具有那 些一或多个步骤，也可以覆盖其他未列出的步骤。类似地，"包含"、"具有"或"包括"一或多 个特征的任何组合为不限于仅仅具有那些一或多个特征，也可以覆盖其他未列出的特征。
[0196] 本文所述方法可以以任何合适顺序进行，除非本文另有说明或者上下文明显矛 盾。本文针对一些实施方案使用任何及全部实施例或者举例语言（例如"例如"）仅仅是更 好描述本发明，不是对本发明范围的限制。说明书中的语言不应被认为是实施本发明的任 何未要求保护的元素。
[0197] 本文描述的本发明的可选元素或实施方案的集合不应被解释为限制。每个集合 成员可以逐个指代或要求保护，或者与该集合的其他成员或者本文发现的其他元素任意组 合。一个集合的一或多个成员可以为方便或可专利性而包括于或从一个集合中删除。当任 何这种包括或删除发生时，本发明的说明书被视为包含经调整的集合，由此满足后续权利 要求书中所用的所有马库什集合的书面描述。
[0198] 本文对参考文献的引用不应认为是承认其是本发明的现有技术。
[0199] 对本发明已经进行详细描述，在不偏离所附权利要求书中限定的本发明范围的前 提下，可以对本发明进行修改、变化和等效的实施方案。此外，应意识到本发明中提供的所 有实施例均是非限制性实施例。 实施例
[0200] 提供如下非限制性实施例以进一步例证本发明。本领域技术人员应意识在后续实 施例中揭示的技术代表发明人已证实在本发明的实施中具有良好功能的方法，并因此可认 为是组成实施本发明的实例模式。然而，本领域技术人员根据本发明应意识到在不偏离本 发明的精神和范围的前提下可以对举例的实施方案进行一些改动，仍可获得相同或相似的 结果。
[0201] 实施例1
[0202] 将拔取的人切牙进行根管处理。然后将有或无bFGF和/或VEGF的胶原蛋白海绵 植入根管中。然后将该切牙皮下植入免疫缺陷的小鼠中。在2周后除去牙齿，评定髓腔和 根管中的血管化。
[0203] 通过肉眼观察，用没有任何生物活性成分的胶原蛋白海绵处理的牙齿无明显的血 管发生（图la)。然而，用具有bFGF或bFGF与VEGF组合的胶原蛋白海绵处理的牙齿在插 入根管中的胶原蛋白海绵中显示血管化（图lb和lc)。
[0204] 上述处理的牙齿的根管通过显微镜进一步评估。用没有任何生物活性成分的胶 原蛋白海绵处理的牙齿示根管中显示无组织生长（图2A)，而用具有bFGF或VEGF或者 bFGF+VEGF组合的胶原蛋白海绵处理的牙齿示出血管化及宿主组织向内生长（图2B-D)。这 些处理中浸润的宿主组织附着于牙本质。
[0205] 实施例2
[0206] 如下实施例证实了牙本质发生性生物活性成分，骨形态发生蛋白-7 (BMP-7)，及神 经发生性生物活性成分，神经生物活性成分（NGF)在生物相容的聚-d-1-乳酸-共-乙醇 酸（PLGA)微球中的包囊化及控制释放。PLGA由50:50(PLA:PGA)制成，缓慢降解。在PLGA微球随着时间降解时，BMP-7和NGF逐渐释放。在4-6周后，BMP-7和NGF的释放模式通过 ELISA确定，并证实累积的释放浓度曲线。这些发现提供了在生物相容的微球中应用BMP-7 和NGF以在体内再生牙髓的观点的证据。
[0207] 由于在累积释放模式上的公开发现而选择50:50PLA/PGA比率的聚-d-1-乳 酸-共-乙醇酸（PLGA,Sigma,St.Louis,M0)微球（Moiolietal.，2006 ;2007a,b;Clark etal.，2007)(图 3)。
[0208] 首先制备lOOmL的0. 1 %PVA，并在导入任何其它成分之前，在450rpm持续搅动 30分钟。使用双重乳化技术（水包油包水）（Moiolietal.，2006;2007a，b;Clarket al.，2007)制备50:50比率。将总共0. 25g的PLGA完全溶解于lmL二氯甲烷中并与在50yL 溶液中稀释的2. 5yg重组人BMP-7或NGF乳化（最大旋动速度）1分钟（油包水）。然后 将初级乳状液与2mL的1 %聚乙烯醇（PVA，30, 000 - 70, 000MW)旋动1分钟（水包油包水）。 然后将该混合物加入搅动中的0. 1%PVA中并搅动1分钟。在最终的乳状液中加入共100mL 的2%异丙醇，在化学通风橱中持续搅动2小时以除去溶剂。含有细胞因子的PLGA微球经 过滤分离（2ym滤膜），用蒸馏水洗涤并在液氮中冷冻30分钟及冻干48小时。在使用之前 将冻干的PLGA微球在-20 °C贮存。
[0209] 牙本质发生性和神经发生性细胞因子包囊的PLGA微球两组均分配4个样品（n= 4)。每组具有在lmL的1%BSA溶液中的10mg包囊的细胞因子，在摇床上于37°C持续搅动。 通过在4-6周每周收集一次全部量的上清而获取数据点。在每次收集后更换lmL的1%BSA 溶液。BMP-7和NGF的量通过使用BMP-7ELISA试剂盒和NGFELISA试剂盒针对每个样品进 行量化测量。
[0210] 结果示出使用50:50比率的PLA/PGA，BMP-7和NGF微球在体外释放直至30-44 天。在第一周期间发现爆发样释放，与先前公开的TGF0 3控制释放结果相比示出相似的释 放模式（图3)。这两种释放模式均示出50:50PLGA可以包囊BMP-7和NGF，并与其它先前 包囊的生物活性成分具有相似的降解速率。
[0211] 表1 :BMP-7随着时间的释放-ELISA数据
[0212]
[0213] 表2:NGFELISA数据，示出从PLGA微球中每周及累积释放
[0214]
[0215] 实施例3
[0216] 原代成牙本质细胞（0d)分离自出生后14天的Collal(2. 3kb)_GFP小鼠切牙的 牙髓，并通过GFP分选与非成牙本质细胞分离。原代成骨细胞（Ob)分离自相同小鼠的颅 盖骨。整体的基因表达模式通过Alilgent-mous