、牙釉蛋白 或者整联蛋白。
[0135] 在其它实施方案中，支架由包含骨引导材料的组合物制造。如上文论述，可用的骨 引导材料的实例是羟磷灰石。进一步的实例是如上述e-聚己酸内酯与羟磷灰石的混合 物。在这些方法的各种实施方案中，支架包含具有直径为50-500ym的微通道。在另外的 实施方案中，支架进一步包含无孔帽。
[0136] 祖细胞
[0137]如本文所用，祖细胞（例如干细胞）是相对未分化的细胞，能通过细胞有丝分 裂自身更新，也能分化为更特化的细胞类型。如本领域已知，干细胞包括胚胎干细胞，其 是全能的，即能分化为其从中衍生的生物体的所有细胞类型，以及成体干细胞，其是多能 (pluripotent)干细胞（能分化为几乎所有细胞类型，包括所有三个胚层的类型）、多能 (multipotent)干细胞（能分化为细胞密切相关家族的一些细胞类型）或者单能干细胞 (能分化为仅一种细胞类型，但是与非干细胞区别在于通过有丝分裂自我更新的能力）。
[0138]如本文所用，牙干细胞（DSC;也称作牙齿衍生的干细胞，TSC)是衍生自脊椎动物 牙髓的祖细胞。DSC可以来自具有牙齿的任何脊椎动物的任何牙齿。在一些实施方案中，牙 干细胞衍生自乳牙。在其它实施方案中，牙干细胞衍生自前磨牙（premolar)、磨牙、切牙或 尖牙。DSC能分化为所有三个胚层的细胞，因此是多能细胞。
[0139] 牙组织
[0140]如本文所述，牙组织可以在与Wnt3a多肽接触时再生。牙组织可以是牙髓、牙冠 髓（例如咬合面、中央、末梢、颊面、舌面或者底部）、牙根髓、牙尖周组织、牙尖周结缔组织、 牙周组织、副根管、根尖孔、孔（foramina)、Rinaggio区、Weil区、成牙本质细胞层、骨、牙 龈、血管、神经、Raschkow神经丛、牙骨质、牙本质、硬化牙本质、弥补性牙本质、反应性牙本 质、修复性牙本质、牙本质小管、新牙本质，或者含有任何成釉细胞、成纤维细胞、成牙本质 细胞、组织细胞、巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞或浆细胞的组织。
[0141] 配制物
[0142]本文所述制剂和组合物可以通过任何常规方式配制，使用一或多种药物学可接受 的载体或赋形剂，如在Remington'sPharmaceuticalSciences(A.R.Gennaro,Ed. )，21st edition,ISBN: 0781746736 (2005)中描述，并入本文作参考。这种配制物含有治疗有效量的 本文描述的生物活性剂，其可以是纯化形式，以及适量的载体以提供正确给予对象的形式。 这种配制物可以掺入基质或支架之中或之上。
[0143]各个制剂也可以组合一或多种另外的制剂或者与其它生物活性或生物惰性制剂 一起给予。这些生物活性或惰性制剂可以是液体，或者与所述制剂机械性交通，或者通过离 子、共价、范德华、疏水性、亲水性或者其它物理力与所述制剂附着。
[0144]可以配制控制释放的（或者持续释放的）制备物，以扩大制剂的活性及降低给药 频率。控制释放的制备物也可用于影响作用发生时间或者其它特性，如制剂的血液水平，并 因此影响副作用的发生。控制释放的制备物可以设计为最初释放产生希望的治疗作用的量 的制剂，并逐步和持续地释放其它量的制剂以在延长的时间内维持治疗作用水平。为了维 持机体内接近恒定水平的制剂，所述制剂可以以代替被代谢或从机体中排泄的制剂的量的 速度从剂型中释放。制剂的控制释放可以由各种诱因刺激，例如pH变化、温度变化、酶、水 或者其它生理学条件或分子。
[0145]本文描述的制剂或组合物也可以用于组合其它治疗模式，如下文进一步论述。因 此，除了本文描述的治疗方法之外，也可以为对象提供已知对于治疗疾病、失调或病症有益 的其它治疗方法。
[0146] 治疗方法
[0147] 本发明还提供了一种在需要给予治疗有效量的包含Wnt3a、BMP-7、VEGF、bFGF或NGF或其组合的基质或支架的对象中再生牙组织的方法，以促进祖细胞的成牙本质细胞分 化，促进细胞迀移，再生血管化牙髓组织，或者再生新牙本质。
[0148] 本发明还提供了一种在需要给予治疗有效量的Wnt3a多肽的对象中再生牙组织 的方法，以促进祖细胞的成牙本质细胞分化，促进细胞迀移，再生血管化牙髓组织，或者再 生新牙本质。
[0149] 如本文所用，牙科治疗方法可以是涉及牙齿的任何方法。举例的牙科治疗方法包 括牙髓病治疗，其涉及牙髓。根管处理是一种牙科治疗方法，其中全部的牙髓和根管组织均 被除去，并用惰性材料或者本文所述组合物代替，其可以恢复髓腔中活组织。
[0150] 本发明一方面提供了在有需要的哺乳动物牙齿上进行牙齿、牙髓或根管治疗的方 法。所述方法可以包括暴露牙髓腔或根管中创伤或患病的牙髓组织；用包含生物活性成分 的组合物（例如包含生物活性剂的组合物的支架）覆盖或充填至少一部分的牙髓腔或根 管。如本文所述，所述组合物可促进血管发生性、牙发生性、纤维发生性或者神经发生性发 育。在一些实施方案中，所述组合物在覆盖或充填期间不包含活细胞。在一些实施方案中， 所述方法进一步包括从牙齿中除去创伤或患病的牙髓组织，产生基本上没有创伤或患病组 织的牙髓腔或根管。在一些实施方案中，基质或支架含有生物活性剂的组合物，所述基质或 支架插入牙腔或根管中。
[0151] 本发明的一个应用是根管治疗，其中所有牙髓组织均从牙齿中除去。本文描述的 基质或支架可部分或完全代替目前的牙髓充填材料如那些方法中的杜仲胶。目前的方法不 排除组合使用所述基质或支架及目前的材料如杜仲胶。因此，在一些实施方案中，惰性材料 如杜仲胶也插入髓腔中。
[0152] 替代的牙髓可以由于指定进行牙、牙髓或根管处理的任何病症所致。例如，牙髓组 织可以是已经细菌感染。或者，牙髓组织可以是由于创伤而破坏，或者在牙髓组织中存在缺 损。
[0153] 本文所述方法通常对有需要的对象进行。需要本文所述治疗方法的对象可以是患 有、诊断有、疑似患有或者处于发生与牙组织相关的损伤、疾病或病症如牙创伤、牙髓炎或 龋齿等风险中的对象。例如，需要本文所述治疗方法的对象可以是患有、诊断有、疑似患有 或者处于发生可医治的牙髓炎或常规需要随着患病牙髓一起除去健康牙髓的其它疾病或 病症风险中的对象。确定是否需要治疗典型是通过与所述疾病或病症一致的病史和身体检 查而评定。各种通过本文所述方法可治疗的病症的诊断在本领域技术人员技术范围内。对 象可以是动物，包括哺乳动物如马、牛、狗、猫、绵羊、猪、小鼠、大鼠、猴、仓鼠、豚鼠和鸡，以 及人。例如，对象可以是人。
[0154] 通常地，包含Wnt3a、BMP-7、VEG、bFGF或NGF或其组合的基质或支架的安全有效 量是例如在对象中产生希望的治疗作用，同时不希望的副作用最小化的量。在不同实施方 案中，有效量的包含Wnt3a、BMP-7、VEGF、bFGF或NGF或其组合的基质或支架促进祖细胞的 成牙本质细胞分化、促进细胞迀移、再生血管化牙髓组织或者再生新牙本质。
[0155] 通常地，Wnt3a多肽的安全有效量是例如在对象中产生希望的治疗作用，同时不希 望的副作用最小化的量。在不同实施方案中，有效量的Wnt3a多肽促进祖细胞的成牙本质 细胞分化、促进细胞迀移、再生血管化牙髓组织或者再生新牙本质。
[0156] 当在本文所述治疗中使用时，治疗有效量的Wnt3a、BMP-7、VEGF、bFGF或NGF可以 纯化形式应用，其中这种形式以药物学可接受的盐形式存在，有或无药物学可接受的赋形 剂。例如，本发明的化合物可以对于任何医学治疗均适用的合理益处/风险比率以足够量 给予，以促进祖细胞的成牙本质细胞分化、促进细胞迀移、再生血管化牙髓组织或者再生新 牙本质。
[0157] 可以与药物学可接受的载体组合以产生单一剂量形式的组合物的量根据治疗的 宿主和给予的特定模式而不同。本领域技术人员意识到每个剂量形式的单独剂量中包含的 制剂的单位含量其自身不需要组成治疗有效量，因为必需的治疗有效量可以通过给予许多 单独剂量而达到。
[0158] 本文所述的组合物的毒性和治疗效力可以通过标准药物学方法在细胞培养或实 验动物中确定LD5。（半数致死量）和ED5。（半数治疗有效量）而确定。毒性与治疗作用之间 的剂量比率是治疗指数，可以表示为LD5(]/ED5。，其中较大的治疗指数在本领域通常理解为 是最佳的。
[0159] 任何特殊对象的特异性治疗有效量水平依赖于各种因素，包括治疗的疾病 和疾病的严重性，应用的特定化合物的活性，应用的特定组合物，对象的年龄、体重、 一般健康状况、性别和饮食，给予时间，给予途径，应用的组合物的排泄速度，治疗持 续时间，与应用的特定化合物组合或同时使用的药物，以及医药领域已知的其它因素 等（见例如Koda-Kimbleetal. (2004)AppliedTherapeutics:TheClinicalUse ofDrugs,Lippincottffilliams&ffilkins,ISBN0781748453 ；ffinter(2003)Basic ClinicalPharmacokinetics, 4thed. ,Lippincottffilliams&ffilkins,ISBN0781741475 ； Sharqel(2004)App1iedBiopharmaceutics&Pharmacokinetics,McGraw-Hill/ Appleton&Lange,ISBN0071375503)。例如，本领域技术人员熟知所述组合物的起始剂量 在低于需要达到希望的治疗作用所需的水平，及逐步增加剂量直至达到希望的作用。如果 需要，每日有效剂量可以分成多次给予。因此，单一剂量组合物可含有这种量或其约数量 (submultiple)以组成每日剂量。然而，应理解本发明的化合物和组合物的总计每天剂量可 由主治医师在合理的医学判断范围内决定。
[0160] 再次，本文所述的每种病理状态、疾病、失调和病症以及其它病症均可得益于本文 所述的组合物和方法。通常地，治疗病理状态、疾病、失调或病症包括阻止或延迟哺乳动物 中受累于或倾向于所述病理状态、疾病、失调或病症但是仍未经历或显示临床或亚临床症 状的临床症状的出现。治疗也可以包括抑制所述病理状态、疾病、失调或病症，例如阻止或 降低疾病或者其至少一个临床或亚临床症状的发生。此外，治疗可包括解除疾病，例如导致 所述病理状态、疾病、失调或病症或者其至少一个临床或亚临床症状的衰退。对于治疗对象 的益处可以是统计学显著的或者至少为对象或医生所感知。
[0161] 本发明所述组合物的给予可以是一次给予或者在治疗时程中给予。例如，组合物 可以每天、每周、每两周或者每月给予一次。对于急性病症的治疗，治疗时程通常是至少几 天。某些病症可以延长治疗从几天至几周。例如，治疗可以延长超过一周、两周或三周。对 于更慢性的病症，治疗可以从几周延续至几个月甚至一年或更长时间。
[0162] 根据本发明方法的治疗可以在与牙组织相关的损伤、疾病或病症的常规治疗模式 之前、同时或之后进行。
[0163] 本文所述组合物可以与另一制剂如抗生素、抗炎剂或者另一制剂同时或相继给 予。例如，包含Wnt3a、BMP-7、VEGF、bFGF或NGF的基质或支架可以与另一制剂如抗生素或 抗炎剂或者基质或支架之中或之上可包含的其它制剂同时给予。同时给予可以是通过给 予单独的组合物进行，每种组合物含有一或多种的基质或支架、Wnt3a、BMP-7、VEGF、bFGF、 NGF、抗生素、抗炎剂或者上述另一制剂。包含Wnt3a、BMP-7、VEGF、bFGF或NGF的基质或支 架可以与抗生素、抗炎剂或另一制剂相继给予。例如，包含Wnt3a、BMP-7、VEGF、bFGF或NGF 的基质或支架可以在给予抗生素、抗炎剂或另一制剂之前或之后给予。
[0164] 上文列举了Wnt3a多肽。本领域技术人员理解上文论述可相同地用于编码Wnt3a 多肽的核酸。
[0165] 分子工程
[0166] 提供如下定义和方法以更好地定义本发明及指导本领域技术人员实施本发明。除 非特别指出，文中术语是根据相关领域技术人员的常规用法。
[0167] 如本文所用，术语"异源DNA序列"、"外源DNA区段"或者"异源核酸"均是指源自 与特定的宿主细胞不同的来源的序列，或者如果相同来源则从其原始形式加以修饰。因此， 宿主细胞中的异源基因包括特定宿主细胞内源的但是已经通过例如使用DNA改组而修饰 的基因。该术语还包括天然存在的DNA序列的非天然存在的多个拷贝。因此，该术语是指 对于细胞是外源或异源的DNA区段，或者与细胞同源但是在宿主细胞核酸内并非该元件通 常发现的位置。外源DNA区段表达产生外源多肽。"同源"DNA序列是与其导入之中的宿主 细胞天然相关的DNA序列。
[0168] 表达载体、表达构建体、质粒或者重组DNA构建体通常理解为是指通过人工干预 产生的核酸，包括通过重组方式或直接化学合成方式，使用一系列特定的核酸元件允许特 定核酸在例如宿主细胞中转录或翻译。表达载体可以是质粒、病毒或核酸片段的一部分。典 型地，表达载体可包括与启动子可操纵地连接的被转录的核酸。
[0169] "启动子"通常理解为核酸控制序列，其指导核酸的转录。可诱导的启动子通常理 解为是介导可操纵地连接的基因应答特定刺激的转录的启动子。启动子可包括在转录起始 位点附近的必需的核酸序列，如在聚合酶II型启动子的情况中的TATA元件。启动子可任 选包括末端增强子或阻抑物元件，其可位于与转录起始位点几千个碱基对的位置。
[0170] 如本文所用，"可转录的核酸分子"是指能转录为RNA分子的任何核酸分子。已知 以一定方式将构建体导入细胞中，由此可转录的核酸分子被转录为功能性mRNA分子，其被 翻译及因此表达为蛋白质产物。构建体也可以构建为能表达反义RNA分子，以抑制感兴趣 的特定RNA分子的翻译。对于实施本发明，常规组合物和制备及使用构建体和宿主细胞的 方法为本领域技术人员熟知（见例如SambrookandRussel(2006)CondensedProtocols fromMolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory Press,ISBN-10:0879697717；Ausubeletal. (2002)ShortProtocolsinMolecular Biology,5thed.,CurrentProtocols,ISBN-10:0471250929；SambrookandRussel(2001) MolecularCloning:ALaboratoryManual, 3ded. ,ColdSpringHarborLaboratory Press,ISBN-10:0879695773 ；Elhai,J.andWolk,C.P. 1988.MethodsinEnzymology 167, 747-754)。
[0171] "转录起始位点"或者"起始位点"是第一个核苷酸周围的位置，其是转录序列的一 部分，也被定义为位置+1。关于这个位点，基因及其控制区的所有其它序列均可以编号。下 游序列（即3'方向的进一步蛋白质编码序列）可以命名为正，而上游序列（主要是5'方 向控制区）命名为负。
[0172] "可操纵地连接"或者"功能性连接"优选是指单一核酸片段上核酸序列的联合，由 此其功能互相影响。例如，如果两个序列的位置是调节性DNA序列影响编码DNA序列表达 的方式（即编码序列或功能性RNA在启动子的转录控制下），则调节性DNA序列与编码RNA 或多肽的DNA序列是"可操纵地连接"或者"联合"。编码序列与调节序列可以有义或反义 方向可操纵地连接。两个核酸分子可以是单一连续的核酸分子的一部分，且可以是相邻的。 例如，如果启动子调节或介导感兴趣的基因在细胞中转录，则该启动子与感兴趣的基因是 可操纵地连接。
[0173] "构建体"通常理解为任何重组核酸分子如质粒、粘粒、病毒、自主复制核酸分子、 噬菌体，或者线性或环形单链或双链DNA或RNA核酸分子，衍生自任何来源，能基因组整合 或自主复制，包含其中一或多个核酸分子已经可操纵地连接的核酸分子。
[0174] 本发明的构建体可含有与可转录的核酸分子可操纵地连接的启动子，所述可转录 的核酸分子与3'转录终止核酸分子可操纵地连接。此外，构建体可包含但不限于例如3'非 翻译区（3'UTR)的另外的调节核酸分子。构建体可包含但不限于mRNA核酸分子的5'非翻 译区（5'UTR)，其在翻译起始中可起重要作用，并且也可以是表达构建体中的遗传成分。这 些另外的上游和下游调节核酸分子可以衍生自与启动子构建体上存在的其它元件天然或 异源的来源。
[0175] 术语"转化"是指核酸片段移至宿主细胞基因组中，导致遗传稳定的遗传。含有转 化的核酸片段的宿主细胞称作"转基因"细胞，包含转基因细胞的有机体称作"转基因有机 体"。
[0176] "转化的"、"转基因的"和"重组的"是指其中已经导入异源核酸分子的宿主细胞或 有机体，如细菌、蓝细菌、动物或植物。如本领域已知和揭示，核酸分子可以稳定整合进基因 组中（Sambrook1989;Innis1995;Gelfand1995 ;Innis&Gelfand1999)。已知的PCR方 法包括但不限于使用成对引物、成套引物、单一特定引物、降解引物、基因特异性引物、载体 特异性引物、部分错配引物等的方法。术语"未转化的"是指未进行转化程序的正常细胞。
[0177] "野生型"是指天然发现的无任何已知突变的病毒或有机体。
[0178] 具有上述要求的百分比相同性并保留表达的蛋白质要求的活性的变体核苷酸 及其编码的多肽的设计、产生和检测在本领域技术范围内。例如，突变体的定向进化 和快速分离可以根据参考文献中所述的方法进行，包括但不限于Linketal. (2007) NatureReviews5(9), 680-688；Sangeretal. (1991)Gene97(1), 119-123；Ghadessyet al. (2001)ProcNatlAcadSciUSA98(8)4552-4557。因此，本领域技术人员可以产生众 多的核苷酸和/或多肽变体，其与本文所述参考序列相比具有例如至少95-99%相同性，并 根据本领域常规方法针对希望的表型进行筛选。
[0179] 核苷酸和/或氨基酸序列相同性百分比（％ )应理解为是当对比两个序列时，与 参考序列相比候选序列中相同的核苷酸或氨基酸残基的百分比。为了确定百分比相同性， 对序列进行比对，如果需要则导入缺口以实现最大百分比序列相同性。确定百分比相同性 的序列对比程序为本领域技术人员熟知。通常可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST2、ALIGN2或Megalign(DNASTAR)软件用于比对序列。本领域技术人员可确定合适的参数以 测量对比，包括实现在对比的序列全长的最大比对所需的算法。当比对序