gbFGF/ml溶液。在进一步的实施方案中，所述组合物包含大约33ng VEGF和大约 167ngbFGF/ml溶液。
[0095] 含有上述浓度bFGF的溶液可以导入基质或支架中或者与其组合。
[0096]bFGF可商购。
[0097]NGF
[0098] 本文所述再生牙髓或牙本质的组合物可包含神经生长因子（NGF)。这种组合物可 包含NGF组合其它生物活性剂，如Wnt3a、VEGF、bFGF或BMP-7。
[0099]NGF在本文所述组合物中可以以大约0.lng至大约1，OOOmgNGF/ml溶液的浓度 存在。例如，NGF在本文所述组合物可以以大约0.lng至大约lOOmgNGF/ml溶液的浓度存 在。再例如，NGF在本文所述组合物中可以以大约0.lng至大约10mgNGF/ml溶液的浓度存 在。再例如，NGF在本文所述组合物中可以以大约0.lng至大约lmgNGF/ml溶液的浓度存 在。再例如，NGF在本文所述组合物中可以以大约0.lng至大约0.lmgNGF/ml溶液的浓度 存在。再例如，NGF在本文所述组合物中可以以大约0.lng至大约100ygNGF/ml溶液的浓 度存在。再例如，NGF在本文所述组合物中可以以大约0.lng至大约10ygNGF/ml溶液的 浓度存在。再例如，NGF在本文所述组合物中可以以大约0.lng至大约1ygNGF/ml溶液的 浓度存在。再例如，NGF在本文所述组合物中可以以大约0.lng至大约500ngNGF/ml溶液 的浓度存在。再例如，NGF在本文所述组合物中可以以大约0.lng至大约200ngNGF/ml溶 液的浓度存在。再例如，NGF在本文所述组合物中可以以大约0.lng至大约lOOngNGF/ml 溶液的浓度存在。再例如，NGF在本文所述组合物中可以以大约0.lng至大约10ngNGF/ml 溶液的浓度存在。
[0100] NGF在本文描述的组合物中可以以大约0. 2ng至大约500ngNGF/ml溶液的浓度存 在。例如，NGF在本文描述的组合物中可以以大约0. 5ng至大约lOOngNGF/ml溶液的浓度 存在。再例如，NGF在本文描述的组合物中可以以大约lng至大约10ngNGF/ml溶液的浓 度存在。
[0101] 在一些实施方案中，其中组合物包含BMP-7和NGF，所述组合物包含大约0. 2ng至 10,000ngBMP-7及大约0. 2ng至500ngNGF/ml溶液。在其它实施方案中，所述组合物包含 大约lng至1000ngBMP-7及大约0. 5ng至lOOngNGF/ml溶液。在另外的实施方案中，所 述生物活性成分组合物包含大约5ng至50ngBMP-7及大约lng至10ngNGF/ml溶液。
[0102] 含有上述浓度NGF的溶液可以导入基质或支架中或者与其组合。
[0103]NGF是可商购的。
[0104] 基质或支架
[0105] 本发明一方面提供了适于插入牙髓腔中的基质或支架，其中包含本文所述一或多 种生物活性剂的组合物包含在所述基质或支架之中或之上。包含生物活性剂的组合物的基 质或支架当插入牙髓腔中时可促进所述基质或支架中血管组织形成或者神经形成。在一些 实施方案中，所述基质或支架不包含活细胞。这种材料可用于牙齿、牙髓或根管处理方法 中。
[0106] 如本文所用，"基质"是无定形结构，例如凝胶，其中可以悬浮一或多种生物活性成 分。"支架"应理解为具有二级或三级结构（例如柱形结构或多孔结构，如在典型的胶原蛋 白海绵中，例如具有在大约250-400yM之间的完全一致的孔，其中一或多种生物活性成分 可以渗透）。本发明不限于任何特定的基质或支架。优选所述基质或支架是可生物降解的。
[0107] 在一些实施方案中，基质或支架包含水凝胶。水凝胶应理解为具有聚合物链网络， 其是亲水性的，有时是胶状凝胶，其中水是分散介质。水凝胶可以是高度可吸收的（例如大 约80%、85%、90%、95%、99%或99.9%的以上的水）天然或合成的聚合物。水凝胶由于 其显著的水含量而也可以具有与天然组织相似程度的柔性。水凝胶可包括例如聚乙烯醇、 聚丙烯酸钠、丙烯酸盐聚合物或者具有亲水性基团的共聚物。天然水凝胶可包括琼脂糖、甲 基纤维素、透明质酸或者其它天然衍生的聚合物。
[0108] 包含一或多种生物活性剂的组合物可以通过本领域已知的任何方式与所述基质 或支架组合。例如，包含一或多种生物活性剂的组合物可以注射进基质或支架中。再例如， 包含一或多种生物活性剂的组合物可与基质或支架混合。再例如，包含一或多种生物活性 剂的组合物通过本领域已知的方法可以包囊于基质或支架中，或者化学束缚于或吸附于基 质或支架中。
[0109] 基质或支架可以置于手术制备的牙腔上或者置入除去病变组织，包括腐烂的牙釉 质和牙本质之后的髓腔中。对于置入制备的牙腔中的基质或支架材料如藻酸盐水凝胶，血 液、组织液或水可以被吸收进生物材料中。在基质或支架保留在原位或者在除去材料后，髓 腔可以封闭或者患病的牙齿可以恢复。
[0110] 在一些实施方案中，生物材料装置可以在大约24小时后除去。例如，生物材料装 置可以在大约24至大约48小时后除去。再例如，生物材料装置可以在大约48小时后除去。
[0111] 基质或支架可以提供细胞生长或组织形成的底物。基质或支架的有益性质是多孔 性、生物相容性和可生物降解性、支持细胞生长的能力，或者其用作可控的基因和蛋白质输 送载体的能力（Murphy1999)。由支架提供的三维大分子结构可以指导生物工程化组织的 最终形状（Murphy1999)。
[0112] 本文描述的支架可具有任何哺乳动物牙齿或其中的洞或腔室的形状。例如，支架 可具有人切牙、人尖牙、人双尖牙或人磨牙或者其中的洞或腔室的形状。本文所述基质可适 合任何哺乳动物的天然或人工的洞或腔室。
[0113] 许多研究已经调查外源性生长因子在载体中以输送生长因子至植入部位的地位 和作用。尽管载体也许不提供为组织形成必需的任何另外的因子，但是其仍可以是生长过 程的重要成分（Wozney1990)。载体的功能之一是保持所述因子在植入部位及因此增加其 局部浓度。载体也可以作为环境，在其中组织可以形成，并因此有助于限定新组织可以形 成的区域（Whang1998)。胶原性或合成载体已经用作输送运载体，其物理化学性质以及其 产生的微环境在归纳结果（inductiveoutcome)中起作用。载体可以是固体异种的（例如 轻磷灰石）（Kuboki1995,Murata1998)、固体异质成形的（聚乙稀聚合物）材料（Saito 1998, Isobe1999)或者自生凝胶（Sweeney1995，Schwartz1998)，同种异体的（Bax 1999,Viljanen1997)或者异质成形的来源（Santos1998)，及上述材料的组合（Alpaslan1996)〇
[0114] 基质或支架可进一步包含任何其它生物活性分子，例如抗生素或趋化性生长因 子。在一些实施方案中，基质或支架是加强的，通过加入例如人血清白蛋白（HSA)、羟乙基淀 粉、葡聚糖或者其组合。用于本发明组合物中的这些化合物的合适浓度为本领域技术人员 已知，或者可以不用过度实验而易于确定。
[0115] 基质或支架中化合物的浓度可以根据化合物的性质、其生理学作用及希望的治疗 或诊断效果而变化。治疗有效量通常是治疗剂展示希望的作用而无过度毒性的的足够浓 度。
[0116] 化合物可以通过任何已知方法掺入基质或支架中。在一些实施方案中，化合物是 包埋在凝胶中，例如胶原蛋白凝胶中，掺入基质或支架的孔中，如实施例中所述。
[0117] 或者，化学修饰方法可用于将化合物共价连接在基质或支架表面上。基质或支架 的表面官能团可以与化合物的反应性官能团偶联以形成共价键，使用本领域熟知的偶联剂 如乙醛化合物、碳二亚胺等。此外，间隔分子可用于使表面反应基团和生物分子的反应基团 形成缺口，以使得基质表面上这种分子更灵活。使生物分子与基质内部或外部附着的其它 相似方法为本领域技术人员已知。
[0118] 化合物或者可以通过基于载体（carrier)的系统如包囊载体（vehicle)导入基质 中或其上。这种载体可用作缓释组合物。例如，化合物可以是微囊化的以提供增强的稳定 性或延长的输送时间。包囊化载体包括但不限于微粒、脂质体、微球等，或者任何上述载体 的组合，以提供各种比例的希望的释放模式。控制释放输送制剂的其它方法为本领域技术 人员已知。此外，这些及其它系统可以组合或者调整以优化基质内制剂的整合/释放。
[0119] 聚合物微球可以使用天然发生的或者合成的聚合物产生，其是大小在0. 1-500ym 范围的微粒系统。聚合物微团和聚合物囊泡（polymeromes)是具有与微球相似特性的 聚合物输送载体，也可以促进本文所述化合物的包囊化及基质整合。各种有效载荷的微 球的制造、包囊和稳定在本领域技术范围内（见例如Varde&Pack(2004)ExpertOpin. Biol. 4(1)35-51)。微球的释放速度可以通过聚合物的类型、聚合物分子量、共聚物成分、 加入微球剂型中的赋形剂以及微球的大小而调整。用于形成微球的聚合物材料包括PLA、 PLGA、用DPPC包被的PLGA、DPPC、DSPC、EVAc、明胶、白蛋白、壳聚糖、葡聚糖、DL-PLG、SDLMs、 PEG(例如ProMaxx)、透明质酸钠、二酮哌嗪衍生物（例如Technosphere)、磷酸|丐-PEG 微粒和/或寡糖衍生的DPPG(例如Solidose)。包囊化可以例如使用水/油单一乳化方 法、水-油-水双重乳化方法或者冻干法实现。一些商业包囊化技术是可获得的（例如 ProLease?,.Alkerme) 〇
[0120] 脂质体也可以用于整合化合物与基质或支架。脂质体的制剂携带能力和释放速 度可依赖于脂质成分、大小、电荷、药物/脂质比率及输送方法。常规的脂质体由中性或 阴离子脂质（天然或合成的）组成。常用的脂质是卵磷脂制剂，如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙 醇胺、鞘磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油及磷脂酰肌醇。脂质体包囊方法为本领域已知 (Galovicetal. (2002)Eur.J.Pharm.Sci. 15, 441-448；ffagneretal. (2002)J.Liposome Res. 12,259-270)。靶向脂质体和反应性脂质体也可以用于组合所述制剂和基质。靶向脂 质体具有靶向配体如单克隆抗体或凝集素附着于其表面，使得与特异性受体和/或细胞类 型相互作用。反应性或多态性脂质体包括各种脂质体，其共有性质是其基于特定的相互作 用改变其相和结构的倾向（例如pH-敏感性脂质体）。见例如Lasic(1997)Liposomesin GeneDelivery,CRCPress,FL)〇
[0121] 基质或支架可以由本领域技术人员认可的任何材料制造。合适的基质或支架材 料在例如MaandElisseeff，ed. (2005)ScaffoldinginTissueEngineering,CRC,ISBN 1574445219 ；Saltzman(2004)TissueEngineering:EngineeringPrinciplesforthe DesignofReplacementOrgansandTissues,OxfordISBN019514130X中论述。对于所 有或部分基质或支架潜在可用的材料的非限制性实例包括聚乙二醇、聚交酯、聚乙醇酸、聚 (交酯-共-乙交酯）、聚（己内酯）、聚酐、polyglactin、聚碳酸酯、聚酰胺、聚酐、聚氨基酸、 聚正酯、聚缩醛、聚腈基丙烯酸酯）、聚磷腈、可降解的聚氨酯、聚丙烯酸酯、乙烯-醋酸乙烯 酯聚合物及其它酰基取代的纤维素醋酸酯及其衍生物、聚氨酯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚氟 乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚（乙烯咪唑）、氯磺化聚烯烃、聚氧化乙烯、聚乙烯醇、特氟龙?、 尼龙、琼脂糖、藻酸盐（例如藻酸钙凝胶）、纤维蛋白、纤维蛋白原、纤连蛋白、胶原蛋白（例 如胶原蛋白凝胶）、明胶、透明质酸、壳多糖，及其它合适的聚合物和生物聚合物，或者类似 物、混合物、组合，以及上述材料的衍生物。
[0122] 在一些实施方案中，基质或支架包含天然聚合物。举例的天然聚合物是胶原蛋白、 壳聚糖和多糖。在其它实施方案中，基质或支架包含合成聚合物。举例的合成聚合物是聚 (a-羟基酸）的脂肪族聚酯及聚乙二醇。另外的合成的聚合物是聚乳酸（PLA)、聚乙醇酸 (PGA)以及PLA和PGA的混合物（PLGA)。在一些实施方案中，合成聚合物是包含大约50% PLA和50%PGA的PLGA。在其它实施方案中，基质或支架包含胶原蛋白海绵或PLGA。
[0123]在一些实施方案中，基质或支架由包含骨引导材料的组合物制造。骨引导材料的 非限制性实例是羟磷灰石（HA)。HA多年来由于其良好的生物相容性和高生物活性而用作 骨替代物（Liao2006,Nebahat2006,Lijun2006,Wei2003)。
[0124] 尽管HA具有良好的生物活性和骨引导性，但是其非常易碎及具有不佳的固有的 可拉伸性质。因此，在一些实施方案中，HA与e-聚已酸内酯（PCL)组合。PCL是良好的 骨基质或支架材料，因为其在几年内在体内降解且是生物相容的、相对廉价的及可以大数 量获得（Rich2002,Kim2004)。PCL与HA组合（PCL-HA)提供了生物活性、可生物降解性 及强度的希望的组合（Patcharaporn2005,Rezwan2006,Landis1995,Ziv1994)。复合 的PCL-HA材料被认为具有最佳的基质或支架的生物相容性、细胞粘附、增殖和分化性质 (Zhao2008)。在一些实施方案中，基质或支架包含大约80wt%聚已酸内酯和大约20wt% 羟磷灰石的混合物。在其它实施方案中，基质或支架包含大约60wt%聚已酸内酯和大约 40wt%轻磷灰石至大约95wt%聚已酸内酯和大约5wt%轻磷灰石。例如，基质或支架可包 含大约70wt%聚已酸内酯和大约30wt%轻磷灰石。再例如，基质或支架可包含大约90wt% 聚已酸内酯和大约l〇wt%轻磷灰石。
[0125]在一些实施方案中，基质或支架具有较高多孔性。这种多孔结构提供了细胞迀移、 粘附和新骨组织向内生长的空间（Gazdag1995,Rezwan2006,Mano2004,Shin2003,Kim 2001,Leong2003)〇
[0126]支架的孔和通道可以工程化为各种直径。例如，支架的孔的直径可以是微米至毫 米范围。在一些实施方案中，基质材料的孔包括微通道。微通道的平均直径为大约0.1yrn 至大约1，〇〇〇ym，例如大约50ym至大约500ym(例如大约100ym、150ym、大约200ym、 大约250ym、大约300ym、大约350ym、大约400ym、大约450ym、大约500ym或者大约 550ym)。技术人员了解微通道直径的分布可具有任何分布方式，包括正常分布或非正常分 布。在一些实施方案中，微通道是基质材料的天然存在的特征。在其它实施方案中，微通道 工程化为在基质材料中存在。
[0127]本发明还提供了置换哺乳动物口腔中牙齿的方法。在这些实施方案中，牙齿缺失， 并且口腔中在缺失的牙齿部位有牙槽。所述方法包括在牙槽中植入具有缺失的牙齿形状的 非细胞支架。
[0128] 一些方法用于制造多孔支架，包括粒子沥滤法、气体发泡法、静电纺丝、冷冻干燥、 从衆材料中釉质发泡（foamingofceramicfromslurry)，以及有机泡沫形成（Mikos1994，Mooney1996,Qing2002,Sylvain2006)。然而，通过使用这些方法制备的支架具 有限制孔的结构和互相连接性的缺点，这样会限制其应用于组织工程中的细胞渗透方面 (Yeong2004,Tan2003)〇
[0129] 在一些实施方案中，所述方法进一步包括通过计算机辅助设计（CAD)制作缺失牙 的模型及用生物绘图仪合成支架。这种方法可提供具有较高多孔性和良好互相连接性的支 架。已经提出了快速原型设计（RP)方法如熔融沉积造型术、选择性激光烧结术、3D打印、多 相喷射固化及3D绘图方法（Hutmacher2001，Moroni2006)。
[0130] 快速原型设计的关键特征是自由实体成型（SFF)方法：将3D计算机模型切成系列 薄层，其用于构建复合层叠物体。薄层通过熔融固化、层光聚合作用或者微粒粘合而产生， 使用激光束诱导的烧结（选择性激光烧结）或者特殊的粘合剂进行（Landers2002)。近年 来，已经引进特化快速原型系统（Bioplotter?,EnvisionTec,Germany)，使得可以设计和制 造具有不同内部结构的解剖学形状的支架，从而使得可以精确控制孔大小、多孔性、渗透性 和硬度（Landers2002;Landers2005)。使用Bioplotter?以制造组织特异性PCL-HA支 架的原型设计方法需要靶组织或组织缺陷的3D形态学信息，这可以通过计算机断层检查 (CT)或者磁共振成像（MRI)获得。当缺失的牙齿在口腔另一侧具有对应物时，该对应物可 用作模型以设计缺失牙的支架。
[0131] 然后将上述获得的信息用于通过CAD设计功能性支架，并移至Bioplotter?系 统。在该系统中，Bioplotter?机械熔融并以层叠形式在收集板上分配支架材料（例如 PCL-HA)。孔，例如微通道，可以作为设计的一部分而产生。通过RP系统制造的3D支架产 生明显的细胞渗透，及因此具有理想的支架性质（Heo2007)。这些3D支架可具有临床应用 潜力，通过提供患者用于营养素转运和血管化的组织特异性解剖学形状以及优化的内部微 结构。关于这些方法的更详细的论述在PCT公开W02009/006558中提供，其并入作为参考。
[0132] 本发明另外提供了制作牙齿支架的方法。所述方法包括合成哺乳动物牙齿形状的 无细胞支架并加入本文所述的化合物。在这些方法的一些实施方案中，牙齿被制成与哺乳 动物中缺失的牙齿一样的形状，所述方法进一步包括通过计算机辅助设计制作缺失的牙齿 模型，及用生物绘图仪合成支架。当缺失的牙齿在口腔中有对应牙时，例如磨牙，所述方法 进一步包括进行例如在口腔另一侧的相似磨牙的CT扫描，其中CAD利用第二个磨牙的CT 扫描数据设计支架。
[0133] 在这些方法的一些实施方案中，本文描述的生物活性剂或者编码其的核酸包含在 支架中。
[0134] 在这些方法的一些实施方案中，支架中包含的化合物可以是Wnt3a多肽、血小板 衍生生长因子（PDGF)、内皮细胞生长因子（ECGF)、转化生长因子1 (TGF-P1)、表皮生长 因子（EGF)、肝细胞生长因子（HGF)、基质细胞衍生因子-l(SDFl)、骨形态发生蛋白（BMP)、 TGF-P、生长和分化因子（⑶F)、胰岛素样生长因子-l(IGFl)、血管内皮细胞生长因子 (VEGF)、成纤维细胞生长因子（FGF)、牙本质基质蛋白、牙本质涎蛋白、骨涎蛋白